CN110981943A

CN110981943A - 多肽及其在制备药物中的用途和药物

Info

Publication number: CN110981943A
Application number: CN201911214716.0A
Authority: CN
Inventors: 陈永湘; 李方翊; 李艳梅
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110981943B

Abstract

本发明提出了多肽及其在制备药物中的用途和药物，所述多肽包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段的N端与第二肽段的C端相连；其中，所述第一肽段选自与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的C端前5～20个氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列；所述第二肽段适用于使所述多肽聚集于细胞膜表面。本发明的多肽可以与K‑Ras4B蛋白竞争性地结合细胞膜上的结合位点，从而改变细胞中K‑Ras4B蛋白的定位，抑制由K‑Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

Description

多肽及其在制备药物中的用途和药物

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及多肽及其在制备药物中的用途和药物。

背景技术

K-Ras4B蛋白是癌症相关蛋白Ras蛋白中最重要的亚型，其必须与细胞膜内侧相结合才可发挥相应功能，对K-Ras4B所介导信号通路的抑制对于癌症的治疗具有重要的作用。

然而，目前具有抑制K-Ras4B所介导信号通路的物质仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段的N端与第二肽段的C端相连；其中，所述第一肽段选自与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的C端前5～20个氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列；所述第二肽段适用于使所述多肽聚集于细胞膜表面。

根据本发明实施例的多肽中第一肽段可以模仿K-Ras4B蛋白在细胞膜上的定位特征，特异性地与结合到细胞膜的结合位点上。但是，第一肽段相较于K-Ras4B蛋白长度较短，很难与肽链长度较大的K-Ras4B蛋白竞争性地结合到结合位点上。因此，在第一肽段的N端连接上具有可聚集于细胞膜表面功能的第二肽段，在其作用下可以使众多第一肽段聚集于细胞膜上，以便于有足量的第一肽段与K-Ras4B蛋白竞争性地与结合位点结合，从而改变细胞中K-Ras4B蛋白的定位。并且，该多肽并不具有可激活由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路的功能，因此，可以有效地抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

根据本发明的实施例，所述多肽还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述第一肽段中的赖氨酸均为D构型。

根据本发明的实施例，所述第一肽段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQID NO：2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

根据本发明的实施例，所述第二肽段具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与SEQID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

根据本发明的实施例，所述第一肽段的C端最后一个氨基酸上具有第一修饰基团和第二基团，其中，所述第一修饰基团选自甲基；所述第二修饰基团选自多聚异戊二烯基，聚合度为1～4的整数。

根据本发明的实施例，所述第三肽段选自法尼基或香叶基香叶基，优选法尼基。

根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO：4所示的序列。

在本发明的另一方面，本发明提出了前面所述的多肽在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。如前所述，根据本发明实施例的多肽可以改变细胞中K-Ras4B蛋白的定位，抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

根据本发明的实施例，所述药物用于抑制癌细胞的增殖。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗由KRAS基因依赖的癌细胞所引发的癌症。

根据本发明的实施例，所述药物用于改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位。

根据本发明的实施例，所述药物用于抑制由K-Ras4B蛋白所介导的信号通路。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述的多肽。由此，根据本发明实施例的药物组合物可以改变细胞中K-Ras4B蛋白的定位，抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin的设计示意图；

图2显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin的合成路线示意图；

图3显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin对细胞内荧光标记的K-Ras4B蛋白定位的影响及选择性的实验结果示意图；

图4显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin改变K-Ras4B定位的机制的实验结果示意图；

图5显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin对肿瘤细胞内Ras信号通路的抑制实验结果示意图；

图6显示了根据本发明的实施例的式I所示化合物Memrasin抗癌效果表征结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了多肽及其在制备药物中的用途及药物组合物，下面将分别对其进行详细描述。

多肽

在本发明的一个方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，该多肽包括相连的第一肽段和第二肽段，其中，第一肽段选自与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的C端前5～20个氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列；第二肽段适用于使所述多肽聚集于细胞膜表面。

根据最新研究成果的报道，参见图1，细胞内的K-Ras4B蛋白可以锚定在细胞膜内侧脂不规整(liquid disordered，l_d)微区，同时K-Ras4B蛋白会在其所定位的细胞膜ld微区内聚集形成蛋白纳米簇。形成K-Ras4B蛋白的多肽(SEQ ID NO：1)具有接近200个氨基酸，发明人在此多肽链上进行深入研究，发现在其C端的第1个至第5～20个氨基酸之间的肽段能够特异性地结合到细胞膜的膜微区。进而，采用这部分肽段作为第一肽段，以模仿K-Ras4B蛋白在细胞膜上的定位特性，以便于使多肽可以竞争性地结合细胞膜上的结合位点。若第一肽段过长，会影响其吸收和发挥药性，同时，也不容易制备，容易出现副产物，难于分离，导致纯度低；由于K-Ras4B蛋白的结合位点位于细胞膜内侧，需要多肽也具有跨膜能力，若第一肽段过短，会影响其跨膜效果，也会影响其与K-Ras4B蛋白的竞争能力。

但是，相较于K-Ras4B蛋白的多肽长度而言，第一肽段的长度较短，很难与K-Ras4B蛋白相竞争。进而，发明人在第一肽段的N端连接上连接具有可聚集于细胞膜表面功能的第二肽段，在其作用下可以使众多第一肽段聚集于细胞膜上，以便于有足量的第一肽段与K-Ras4B蛋白竞争性地与结合位点结合，从而改变细胞中K-Ras4B蛋白的定位。并且，该多肽并不具有可激活由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路的功能，因此，可以有效地抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAGQEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL PSRTVDTKQAQDLARSYGIP FIETSAKTRQ GVDDAFYTLV REIRKHKEKM SKDGKKKKKK SKTKCVIM(N端→C端，SEQID NO：1)

根据本发明的实施例，所述第一肽段中的赖氨酸均为D构型。K-Ras4B多肽的C端第6～11个氨基酸均为L构型的赖氨酸。发明人发现，将L构型的赖氨酸替换为D构型的赖氨酸，可以有效地减少多肽在细胞内被蛋白酶降解，从而可以更好地竞争性抑制K-Ras4B蛋白与细胞膜上的结合位点相结合，改变K-Ras4B蛋白的定位，抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路。需要说明的是，本发明中所涉及的氨基酸序列中大写K代表L构型的赖氨酸，小写k代表D构型的赖氨酸。

根据本发明的实施例，第一肽段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同源性的序列。由此，可以有效地模拟K-Ras4B蛋白在细胞膜上的定位特征，从而有效地与K-Ras4B蛋白竞争性地结合到细胞膜上的结合位点上，同时，也可以减少在此过程中被蛋白酶所降解。

kkkkkkSkTkC(N端→C端，SEQ ID NO：2)

根据本发明的实施例，第二肽段具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同源性的序列。该第二肽段具有较高的跨膜效率并可在细胞膜表面形成聚集体，从而使得多肽能够高效的进入细胞并在进入细胞后在K-Ras4B蛋白所在处的膜微区中相应位置聚集，以竞争K-Ras4B蛋白在细胞膜上的结合位点并改变K-Ras4B蛋白的细胞内定位。并且，该第二肽段可以促进多肽溶酶体释放多肽，从而发挥相应的功能。

GLFDIIKKIAESF(N端→C端，SEQ ID NO：3)

根据本发明的实施例，第一肽段的C端最后一个氨基酸上具有第一修饰基团和第二基团，其中，第一修饰基团选自甲基；第二修饰基团选自多聚异戊二烯基，聚合度为1～4的整数。发明人惊奇地发现，在第一肽段C端最后一个氨基酸上修饰烷基和萜类化合物基团，可以与第一肽段相互协同，更好地实现膜锚定，提高膜微区的选择性。

根据本发明的实施例，第二修饰基团选自法尼基或香叶基香叶基，优选法尼基。由此，以便于更好地实现膜锚定，提高膜微区的选择性。

根据本发明的实施例，多肽具有SEQ ID NO：4所示的序列。由此，该多肽可以与K-Ras4B蛋白竞争性地结合到细胞膜的结合位点上，抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

GLFDIIKKIAESF kkkkkkSkTkC(Far)-OMe(N端→C端，Far为法尼基，SEQ ID NO：4)

多肽在制备药物中的用途

在本发明的另一方面，本发明提出了前面所述的多肽在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于治疗癌症。如前所述，根据本发明实施例的多肽可以改变细胞中K-Ras4B蛋白的定位，抑制由K-Ras4B蛋白介导的下游信号通路，以便抑制癌细胞的增殖或生长，起到治疗癌症的目的，具有重要的科学研究和临床应用价值。

根据本发明的实施例，药物用于抑制癌细胞的增殖。

根据本发明的实施例，药物用于治疗由KRAS基因依赖的癌细胞所引发的癌症。如前所述，K-Ras4B蛋白必须与细胞膜结合才可发挥相应功能，多肽能够与K-Ras4B蛋白竞争性地结合到细胞膜的结合位点上，从而阻断K-Ras4B蛋白与细胞膜结合，以便于抑制癌细胞增殖或生长。

根据本发明的实施例，药物用于改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位。如前所述，K-Ras4B蛋白必须与细胞膜结合才可发挥相应功能，多肽能够与K-Ras4B蛋白竞争性地结合到细胞膜的结合位点上，从而改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位。

根据本发明的实施例，药物用于抑制由K-Ras4B蛋白所介导的信号通路。如前所述，K-Ras4B蛋白必须与细胞膜结合才可发挥相应功能，多肽能够与K-Ras4B蛋白竞争性地结合到细胞膜的结合位点上，从而改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位，抑制由K-Ras4B蛋白所介导的信号通路。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果，例如抑制癌细胞生长、导致癌细胞死亡或改善疾病或病症。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指癌症)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防癌症)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物组合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述多肽的药物给予有需要的个体。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽所描述的特征和优点，同样适用于该多肽在制备药物中的用途，在此不再赘述。

药物组合物

根据本发明的实施例，药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。本发明对于辅料的种类不做严格限定，可以根据情况灵活选择。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的辅料中赋形剂和稀释液的可以包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的另一些实施例，本发明的辅料还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1化合物的制备

用于固相合成的第一个氨基酸Fmoc-Cys-OMe可以通过商业化购买的氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH通过两步反应纯化后制得，并与固相合成的2-Cl Chlorotrityl树脂在有机碱DIPEA的作用下相连(参见文献Diaz-Rodriguez V.,et al.,Synthesis of PeptidesContaining C-Terminal Methyl Esters Using Trityl Side-Chain Anchoring:Application to the Synthesis of a-Factor and a-Factor Analogs.OrganicLetters,2012,14(22),5648-5651.)，并通过Fmoc固相合成的方法得到所需的多肽序列，接下来，使用TFA/苯甲硫醚/H₂O/苯酚/1,2-乙二硫醇(82.5/5/5/5/2.5，v/v)的混合试剂将多肽从树脂上切下来并脱除掉所有氨基酸的保护基，在乙醚沉淀得到多肽粗品后，将所得粗肽溶于DMF/BuOH/H₂O(2/1/1，v/v)，加入5倍当量比的法尼基溴和5倍当量比的醋酸锌后用乙酸将体系的pH调至3左右，室温搅拌过夜后用高效液相色谱的方法(色谱柱：C18填料制备柱(购于ymc公司)，流动相：乙腈/水混合体系，流速：12ml/min，检测波长215nm)进行纯化，得到法尼基化修饰抗癌多肽(即式I所示化合物，合成路线示意图见图2，所有试剂均通过商业化购买)。

另外，通过固相合成的方法制备的对照多肽C1、C2和C3的结构及序列见表1(k表示D构型的赖氨酸)。

表1化合物结构

实施例2法尼基化抗癌多肽调控K-Ras4B定位的实验

一、稳定表达mCitrine荧光蛋白标记的K-Ras4B蛋白的细胞系的构建及相关表征

将带有mCitrine-K-Ras4B基因的质粒通过转染试剂(lipofectamine 2000，购于Thermo公司)转染进MDCK细胞系，并通过流式细胞仪分选得到单克隆细胞并挑选合适的细胞系进行扩大培养，得到稳定表达荧光蛋白标记的K-Ras4B蛋白的细胞系。将上述细胞系接种到放有盖玻片的6孔板中(接种密度100％)，并将制备得到的法尼基化抗癌多肽Memrasin加入到含血清培养基中配制成终浓度0、5、10、20、40、60、80μM的溶液后加入对应的细胞，37℃孵育10分钟后将Memrasin溶液的工作液吸出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，固定封片后在共聚焦显微镜(蔡司LSM 780，EGFP通道)下观察荧光标记的K-Ras4B蛋白定位的变化。同时，将上述细胞系接种于15cm规格的细胞培养皿中，并将Memrasin多肽配置成为0、5、10μM的溶液后加入细胞中，37℃孵育10分钟后用Cell fractionation kit(CST公司)将细胞胞质组分和膜组分的蛋白分别抽提，对应浓度及组分的通过Western Blot的实验方法检测K-Ras4B蛋白的分布变化，结果如图3a所示。结果表明Memrasin可以有效的改变细胞内荧光蛋白标记的K-Ras4B蛋白的定位，且此行为具有浓度依赖性。

将上述构建的细胞系接种到放有盖玻片的6孔板中并将多肽Memrasin及对照肽C1、C2和C3分别配制成为浓度为80μM的工作液加入对应的细胞，37℃孵育12小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后固定封片并在共聚焦显微镜(型号同前)下观察荧光标记的K-Ras4B蛋白定位的变化，结果如图3b所示，其中“+”代表添加了该化合物。结果表明仅Memrasin可有效改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位，分子中脂肪链的修饰必不可少且分子中两个片段的共价连接是其作用发挥的必不可少的条件。

二、稳定表达mCitrine荧光蛋白标记的H-Ras蛋白的细胞系的构建及相关表征

H-Ras蛋白为Ras家族中另一亚型，与K-Ras4B同定位于细胞膜内壁，但位于不同的细胞膜微区。与之前实施例2一中的方法类似，将带有mCitrine-H-Ras基因的质粒通过转染试剂(lipofectamine 2000，购于Thermo公司)转染进MDCK细胞系，并通过流式细胞仪分选得到单克隆细胞并挑选合适的细胞系进行扩大培养，得到稳定表达荧光蛋白标记的H-Ras蛋白的细胞系。将构建的稳定表达荧光标记H-Ras蛋白和K-Ras4B蛋白的细胞系分别接种到放有盖玻片的6孔板中并将多肽Memrasin分别配制成为浓度为0、80μM的工作液再加入对应的细胞，37℃孵育12小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后固定封片并在共聚焦显微镜(型号同前)下观察荧光标记蛋白定位的变化，结果如图3c。结果说明Memrasin可以选择性的改变细胞内荧光标记的K-Ras4B蛋白而非其另一亚型H-Ras蛋白，这一现象的原因与修饰的第一肽段对膜微区的选择性密切相关。

由图3的结果可以看出本发明的法尼基化抗癌多肽可以有效改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位而不影响位于细胞膜不同微区的H-Ras蛋白的定位，这一效果与多肽中两个片段的共同作用密不可分。

实施例3法尼基化抗癌多肽改变K-Ras4B定位的机制实验

一、法尼基化抗癌多肽的细胞内定位

合成了荧光素标记的FAM-Memrasin多肽用以观察细胞内法尼基化抗癌多肽的定位，多肽序列为H-GLFDIIKKIAESF-K(FAM)K₅SMTKC(Far)-OMe。将A549细胞接种到放有盖玻片的6孔板里并将FAM-Memrasin多肽溶于细胞培养基配制成为终浓度为1μM的工作液加入细胞，37℃孵育10分钟后用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后固定封片并在共聚焦显微镜下观察荧光多肽在细胞内的定位，结果如图4a。结果显示荧光标记的Memrasin多肽在细胞膜上有清晰的定位，而且在细胞的内膜中也有一定的分布。

二、法尼基化抗癌多肽改变K-Ras4B定位的体外实验

采用荧光极化的手段验证了Memrasin多肽及对照多肽在模型体系中改变K-Ras4B定位的能力。首先合成了荧光素标记的FAM-C1多肽用以代表K-Ras4B蛋白的膜锚定区域，多肽序列为H-K(FAM)K₅SMTKC(Far)-OMe，并配成多肽工作液。然后制备了100nm直径的脂质体溶液(二油酰基卵磷脂/二油酰磷脂酰甘油/二棕榈酰磷脂酰胆碱/1,2-棕榈酰磷脂酰甘油/胆固醇，15/10/40/10/25，摩尔比)(采用Avanti polar lipids公司的Extruder kits制备)，将FAM-C1(终浓度0.1μM)和脂质体溶液(终浓度60μM)加入黑色96孔板后分别加入Memrasin多肽和对照多肽的溶液(终浓度0、0.1、0.5、1、2、3、6、8μM)，室温孵育10分钟后用酶标仪(BioTek公司)测量极化值的变化，结果如图4b。结果表明Memrasin多肽能够在体外有效的改变K-Ras4B的定位而对照多肽的效果并不十分显著。

三、法尼基化抗癌多肽对膜微区选择性的表征

采用Avanti polar lipids公司的Extruder kits制备了100nm直径的脂质体溶液(二油酰基卵磷脂/二油酰磷脂酰甘油/二棕榈酰磷脂酰胆碱/1,2-棕榈酰磷脂酰甘油/胆固醇；20/5/45/5/25，摩尔比)并滴加在云母片上，70℃孵育一小时形成铺展的平面磷脂双分子层，用原子力显微镜(Bruke公司，ScanAsyst模式)观察其表面形貌。将云母片表面的液体替换为2μM浓度的Memrasin多肽，室温孵育5分钟后再次用原子力显微镜观察膜表面形貌，结果如图4c。结果表明Memrasin多肽倾向在膜的脂不规整(l_d)微区形成多肽聚集体。

实施例4法尼基化抗癌多肽对肿瘤细胞内Ras信号通路的抑制实验

一、法尼基化抗癌多肽对Ras信号通路的抑制实验

将NCI-H358细胞系和A549细胞系分别接种到多个6cm细胞培养皿，待细胞生长到合适密度时将Memrasin用不含血清的培养基配制成为浓度分别为0、2、4、6μM的工作液并加入细胞，37℃孵育10分钟后再用人表皮生长因子(hEFG，终浓度100ng/ml)37℃处理10分钟后用磷酸盐缓冲液清洗细胞并制备细胞裂解液，之后用Western Bot的方法检测K-Ras4B的量及Ras下游通路中MEK、ERK和Akt蛋白的总量及磷酸化水平的变化，结果如图5a。结果表明Memrasin在0-6μM的浓度范围内可以有效抑制Ras相关的信号通路。

二、法尼基化抗癌多肽对肿瘤细胞内K-Ras4B蛋白定位的影响

将NCI-H358细胞系和A549细胞系分别接种到多个15cm细胞培养皿，待细胞生长到合适密度时将Memrasin用培养基配制成为浓度分别为0、2、4μM的工作液并加入细胞，37℃孵育10分钟后用磷酸盐缓冲液冲洗细胞收集细胞，用Cell fractionation kit(CST公司)将不同浓度下不同样品所得细胞的胞质组分和膜蛋白组分分别进行抽提，并用WesternBlot的方法检测K-Ras4B蛋白定位分布的变化，结果如图5b。结果表明Memrasin在0-4μM的浓度范围内可以明显改变细胞内的K-Ras4B蛋白定位。

实施例5法尼基化抗癌多肽的抗癌效果表征

一、法尼基化抗癌多肽对癌细胞杀伤效果的表征

将A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H358和NCI-H441细胞系分别接种到96孔板，将Memrasin多肽配制成终浓度为0、1、2、4、6、8、10μM的工作液并加入细胞，37℃孵育24小时候加入Cell Titer-Go试剂(Promega公司)并使用酶标仪(BioTek公司)对Memrasin的杀伤效果进行表征，结果如图6a。结果说明Memrasin在0-10μM范围内可以在不同程度上有效抑制癌细胞的生长。

二、法尼基化抗癌多肽毒性回复实验的表征

将HCI-441细胞系接种到6孔板中，通过脂质体(X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent，罗氏公司)将带有激活状态的Ras通路下游蛋白ERK(Addgene39197#)和Akt(Addgene 10841#)及其空载的质粒对细胞转染36小时，然后将顺转后的各组细胞分别接种到96孔板并将Memrasin配制成为工作液，加入细胞后在37℃下孵育24小时候用Cell Titer-Glo的方式检测Memrasin对细胞杀伤效果的差异，同时也将带有mCitrine-K-Ras4B基因及其空载的质粒对细胞转染进行转染并测量了Memrasin的杀伤效果，结果如图6b。结果表明上调Ras通路的下游基因以及提升细胞中K-Ras4B蛋白的表达水平都可以降低Memrasin的杀伤效果，进而说明了Memrasin是通过影响K-Ras4B蛋白的定位并抑制相应的信号通路而发挥的抗癌作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 多肽及其在制备药物中的用途和药物

<130> PIDC3196332

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：1

<400> 1

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys

165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met

180 185

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：2

<400> 2

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：3

<400> 3

Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：4

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> 被Far基团和Me基团取代

<400> 4

Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe Lys Lys Lys

1 5 10 15

Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys

20

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：5

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> 被Far基团和Me基团取代

<400> 5

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：6

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 被氨基取代

<400> 6

Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO：7

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> 被Me基团取代

<400> 7

Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe Lys Lys Lys

1 5 10 15

Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys

20

Claims

1.一种多肽，其特征在于，包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段的N端与第二肽段的C端相连；

其中，

所述第一肽段选自与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的C端前5～20个氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列；

所述第二肽段适用于使所述多肽聚集于细胞膜表面。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一肽段中的赖氨酸均为D构型。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一肽段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第二肽段具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一肽段的C端最后一个氨基酸上具有第一修饰基团和第二基团，

其中，所述第一修饰基团选自甲基；所述第二修饰基团选自多聚异戊二烯基，聚合度为1～4的整数；

任选地，所述第二修饰基团选自法尼基或香叶基香叶基，优选法尼基。

6.根据权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：4所示的序列。

7.权利要求1～6任一项所述多肽在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物用于抑制癌细胞的增殖；

任选地，所述药物用于治疗由KRAS基因依赖的癌细胞所引发的癌症；

任选地，所述药物用于改变细胞内K-Ras4B蛋白的定位；

任选地，所述药物用于抑制由K-Ras4B蛋白所介导的信号通路。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1～6任一项所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学上可接受的辅料。