JP4980716B2 - 遺伝子サイレンシングに有用な保存されたhbv及びhcv配列 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が本明細書に参照により援用されている2003年6月12日出願の米国仮特許出願第60/478,076号の利益を主張するものである。
本発明は、翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)及び転写遺伝子サイレンシング(TGS)を含む、2本鎖RNA媒介遺伝子サイレンシングを介して、哺乳動物細胞内のHBV及び/又はHCVの発現を変調させるべく、既知のB型肝炎ウイルス(HBV)菌株及び既知のC型肝炎ウイルス(HCV)菌株の保存された遺伝子配列を利用する方法及び組成物に関する。
(課題を解決するための手段)
出願人の発明は、UがTに置換されている、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9及び配列番号10から成る群から選択された配列内の少なくとも19個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む2本鎖RNAエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法を提供している。該方法の好ましい実施形態においては、2つ以上の配列番号の配列由来のエフェクタ配列を同じ細胞に投与することができかつ/又は同じ配列番号の配列内の2つ以上のエフェクタ配列を同じ細胞に投与することができる。
配列番号1〜配列番号10はB型肝炎ゲノムの保存された領域を表わす。
配列番号11及び配列番号12は、C型肝炎ゲノムの保存された領域を表わす。
配列番号13は、ヒトU6プロモータのヌクレオチド配列を表わす。
配列番号14及び配列番号15は、配列番号5内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号16及び配列番号17は、配列番号4内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号18は、配列番号10内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号19〜配列番号22は、配列番号3内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号23及び配列番号24は、配列番号2内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号25及び配列番号26は、配列番号1内にHBV配列マッピングを有するeiRNAを表わす。
配列番号27は、HCV3’UTRの「X」領域を表わす。
配列番号28〜配列番号36は、HCV3’UTRに対するsiRNAマッピングを表わす。
配列番号37〜配列番号44は、HCV3’UTRの「X」領域に対するsiRNAマッピングを表わす。
配列番号45は、HCVコアに対するsiRNAマッピングを表わす。
配列番号46は、ラミンに対するsiRNAマッピングを表わす。
配列番号47は、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を表わす。
配列番号48は、ヘヤピンRNAをコードするT7−ベースのeiRNAベクターを表わす。
RNA干渉(RNAi)は、サイレンシングを受けた遺伝子と配列が相同である2本鎖RNA(dsRNA)によって開始される、動物及び植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング又は転写遺伝子サイレンシングのプロセスである。RNA干渉は配列特異的に作用することから、薬物として使用されるRNAi分子はその標的に対し特異的であるにちがいない。ウイルスゲノムは、環境内の変化に対する耐性に対処するように可変的である。HBV及びHCVがRNAiのための望ましいウイルス標的であるものの、これらのウイルスは、その可変性及び突然変異可能性及びその高い転写速度のため、あらゆる治療的及び/又は予防的アプローチにとっての難しい標的となっている。RNAiを用いてウイルスゲノム複製をノックダウンするためには、ウイルスゲノム内の保存されたユニークな領域を同定する必要がある。それと同時に、遺伝子サイレンシングのために選ばれたあらゆる配列がヒトゲノムに存在しないことが、毒性を回避するために非常に重要である。
本発明に従ったサイレンシングのために、ターゲティングされた保存ウイルス配列が、天然に発生し、通常に機能する不可欠のあらゆるヒトポリヌクレオチド配列に対し実質的に相同でなく、かくして、dsRNA分子が、本発明の方法において使用された場合に不可欠の天然に発生するいずれの哺乳動物ポリヌクレオチド配列にも不利な影響を及ぼさないようにすることが同様に重要である。このような天然に発生する機能的哺乳動物ポリヌクレオチド配列としては、所望のタンパク質をコードする哺乳動物配列ならびに非コーディング配列であるものの健康な哺乳動物の体内では不可欠な調節配列を提供する哺乳動物配列が含まれる。基本的に、本発明において有用であるRNA分子は、本発明の方法のいずれかが実施された後その機能が妨害されないように意図されているあらゆる哺乳動物ポリヌクレオチド配列と充分に配列が異なっていなければならない。RNA分子ポリヌクレオチド配列と正常な哺乳動物配列の間の不可欠な相同性欠如を画定するために、コンピュータアルゴリズムを使用することができる。
HBV保存領域1
GAACATGGAGA[A(89%)/G(11%)]CA[T(76%)/C(24%)][C(78%)/A(20%)/T(2%)][A(78%)/G(21%)/T(1%)]CATCAGGA[T(65%)/c(35%)]TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGG[G(88%)/t(12%)]GT[T(89%)/G(11%)]TTTCT[T(94%)/C(6%)]GTTGACAA[G(64%)/A(36%)]AATCCTCACAATACC[A(56%)/G(43%)/T(1%)]CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG[G(92%)/A(5%)/T(3%)]A[A(41%)/G(30%)/T(18%)/C(11%)][C(90%)/T(10%)]
TGGATGTGTCT[G(99%)/A(1%)]CGGCGTTTTATCAT
AAGGCCTTTCT[A(43%)/G(43%)/C(14%)][T(56%)/A(37%)/C(7%)]GT[A(87%)/C(13%)]AACA[A(57%)/G(43%)]TA[T(59%)/C(41%)][C(59%)/A(41%)]TG[A(92%)/C(8%)][A(93%)/C(7%)]CCTTTACCCCGTTGC[T(54%)/C(46%)][C(92%)/A(8%)]GGCAACGG[C(74%)/T(24%)]C[A(50%)/T(43%)/c(7%)]GG[T(87%)/C(13%)]CT[G(70%)/C(19%)/T(7%)/A(4%)]TGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGG[C(48%)/T(38%)/A(14%)]TGGGGCTTGG[C(84%)/T(16%)][C(84%)/T(12%)/G(4%)]AT[A(47%)/T(23%)/G(17%)/C(13%)]GGCCATC[A(83%)/G(17%)][G(92%)/C(8%)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84%)/C(13%)/T(3%)][T(92%)/A(4%)/C(3%)/G(1%)]G[G(78%)/T(22%)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88%)/T(9%)/G(1%)/C(1%)]GC[C(57%)/A(35%)/T(6%)/G(2%)]GC[T(92%)/C(7%)/G(1%)]TGTTT[T(88%)/C(12%)]GCTCGCAGC[C(64%)/A(36%)]GGTCTGG[A(87%)/G(13%)]GC
[C(62%)/T(38%)]ACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTT[G(88%)/A(12%)]GG[G(92%)/A(8%)]CATGGACATTGAC[C(92%)/A(8%)]C[T(65%)/G(35%)]TATAAAGAATTTGGAGCT[A(65%)/T(35%)]CTGTGGAGTTACTCTC[G(62%)/T(35%)/A(3%)]TTTTTGCCTTC[T(92%)/C(8%)]GACTT[C(92%)/T(8%)]TTTCCTTC
[C(69%)/del(31%)][G(69%)/del(31%)]A[G(85%)/T(11%)/C(4%)]GCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG[C(61%)/A(39%)]G[A(62%)/G(38%)]TCTCAATCG[C(88%)/A(12%)]CGCGTCGCAGAAGATCTCAAT[C(92%)/T(8%)]TCGGGAATCT[C(88%)/T(12%)]AATGTTAGTAT
TTGG[C(84%)/t(16%)][C(84%)/t(12%)/g(4%)]AT[A(47%)/t(23%)/g(17%)/c(13%)]GGCCATC[A(83%)/g(17%)][G(92%)/c(8%)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84%)/c(13%)/t(3%)][T(92%)/a(4%)/c(3%)/g(1%)]G[G(78%)/t(22%)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88%)/t(9%)/g(1%)/c(1%)]GC[C(57%)/a(35%)/t(6%)/g(2%)]GC[T(92%)/c(7%)/g(1%)]TGTTT[T(88%)/c(12%)]GCTCGCAGC[C(64%)/a(36%)]GGTCTGG[A(87%)/g(13%)]GC
CTGCCAACTGGAT[C(86%)/T(10%)/A(4%)]CT[C(69%)/T(25%)/A(6%)]CGCGGGACGTCCTTTGT[T(75%)/C(25%)]TACGTCCCGTC[G(93%)/A(7%)]GCGCTGAATCC[C(86%)/T(7%)/A(7%)]GCGGACGACCC[C(52%)/G(25%)/T(19%)/A(4%)]
[A(74%)/G(19%)/T(7%)][G(82%)/A(15%)/T(3%)]ATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT[C(92%)/T(7%)]GTGCAGC[C(89%)/T(10%)]TCCAGG[A(76%)/T(14%)/C(8%)/G(1%)]CCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCC[A(90%)/G(9%)]GGA[C(78%)/T(16%)/A(5%)]GACCGGGTCCTTTCTTGGAT[G(78%)/T(11%)/A(10%)]AACCCGCTC[A(94%)/T(5%)]ATGCC[T(90%)/C(9%)]GGA[G(91%)/C(4%)/A(4%)]ATTTGGGCGTGCCCCCGC[G(85%)/A(14%)]AGAC[T(94%)/C(5%)]GCTAGCCGAGTAG[T(92%)/C(7%)]GTTGGGT[C(94%)/T(5%)]GCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCA[C(62%)/T(30%)/A(8%)]CATGAGCAC[A(50%)/G(50%)][A(92%)/C(8%)][A(89%)/T(11%)]TCC[T(92%)/A(5%)/C(3%)]AAACC[T(84%)/C(14%)/A(2%)]CAAAGAAAAACCAAA[C(84%)/A(16%)]G[T(84%)/A(16%)]AACACCAACCG[C(77%)/T(23%)]CGCCCACAGGACGT[C(81%)/T(18%)/A(1%)]AAGTTCCCGGG[C(89%)/T(11%)]GG[T(80%)/C(20%)]GG[T(80%)/C(17%)/A(3%)]CAGATCGTTGG[T(91%)/C(8%)/G(1%)]GGAGT[T(87%)/A(11%)/C(2%)]TAC[C(74%)/T(20%)/G(6%)]TGTTGCCGCGCAGGGGCCC[C(87%)/T(8%)/A(4%)/G(1%)][A(92%)/C(8%)][G(92%)/A(5%)/C(2%)][G(87%)/A(12%)/T(1%)]TTGGGTGTGCGCGCGAC[T(78%)/G(13%)/A(7%)/C(2%)]AGGAAGACTTC[C(90%)/G(5%)/T(5%)]GA[G(90%)/A(10%)]CGGTC[G(79%)/C(12%)/A(8%)/T(1%)]CA[A(86%)/G(14%)]CC[T(88%)/A(6%)C(6%)]CG[T(82%)/C(9%)A(9%)]GG[A(87%)/T(8%)/G(3%)/C(2%)]AG
ATGGC[T(76%)/A(12%)/C(10%)/G(2%)]TGGGATATGATGATGAACTGG[T(81%)/C(19%)]C
以下の配列は、37CFR1.821に基づいて提供されたコードを用いてWIPO規格ST.25(1998)によって要求されている書式で提示されている。配列番号1〜配列番号10はHBVゲノム配列番号11から誘導され、配列番号12はHCVゲノムから誘導される。
GAACATGGAGArCAyhdCATCAGGAyTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGkGTkTTTCTyGTTGACAArAATCCTCACAATACCdCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGdAny
TGGATGTGTCTrCGGCGTTTTATCAT
AAGGCCTTTCTvhGTmAACArTAymTGmmCCTTTACCCCGTTGCymGGCAACGGyChGGyCTnTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGhTGGGGCTTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGC
yACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTrGGrCATGGACATTGACmCkTATAAAGAATTTGGAGCTwCTGTGGAGTTACTCTCdTTTTTGCCTTCyGACTTyTTTCCTTC
CGAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
AbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
CAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
GAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
TTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGC
CTGCCAACTGGAThCThCGCGGGACGTCCTTTGTyTACGTCCCGTCrGCGCTGAATCChGCGGACGACCCn
DdATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTyGTGCAGCyTCCAGGnCCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCrGGAhGACCGGGTCCTTTCTTGGATdAACCCGCTCwATGCCyGGAvATTTGGGCGTGCCCCCGCrAGACyGCTAGCCGAGTAGyGTTGGGTyGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCAhCATGAGCACrmwTCChAAACChCAAAGAAAAACCAAAmGwAACACCAACCGyCGCCCACAGGACGThAAGTTCCCGGGyGGyGGhCAGATCGTTGGbGGAGThTACbTGTTGCCGCGCAGGGGCCCnmvdTTGGGTGTGCGCGCGACnAGGAAGACTTCbGArCGGTCnCArCChCGhGGnAG
ATGGCnTGGGATATGATGATGAACTGGyC
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるHBV複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明:Huh7細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスRNAの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るHBVの感染性分子クローンでトランスフェクトする[1−3]。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号V01460の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のHBVプラスミドの転写が、HBV複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスmRNAの翻訳、転写されたプレゲノムRNAのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムRNAの逆転写及び、ビリオン及びHBsAg(B型肝炎表面抗原)粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のHBV複製の大部分の局面を再現し、従って、HBV発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
以下に記すのは、ジェンバンク受入れ番号V01460から誘導された配列をコードするeiRNAベクターを用いて実施された実験の一実施例である。これらの記述されているeiRNAベクター内のHBV配列は、同様にsiRNAとしての活性も示す、本書の他の箇所で記述された通りに同定されたきわめて保存度の高い配列であった(パシャクC.、「RNAi標的及びエフェクタ分子の評価のための方法及び構築物(Methods and Constructs for Evaluation of RNAi targets and Effector Molecules)」、2004年2月25日出願PCT米国特許第2004/005065号明細書を参照のこと)。この実験のために使用される特定のeiRNA主鎖ベクターは、コードされたRNAの発現を駆動するべくU6プロモータを含む独自に開発したベクターであった。各ベクターは、1つの短かいヘヤピンRNA(shRNA)のみをコードした。shRNAコーディング配列の後には、RNApolIII終端配列が続いていた。U6プロモータ、RNApolIII終端シグナル及びコードされたshRNAの配列は全て、該実施例の終りに示されている。U6プロモータ及びRNApolIII終端シグナルを含む類のベクターは、プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン(Madison、Wis)製の「siLentGene+2クローニング系」ベクターなどのように商業的に入手可能である。当業者であれば、本書で示されている情報に従ってこれらを作り上げることもできる。その他の発現及びプロモータ系特にU6でないRNApolIIIプロモータ例えばH1プロモータ又は7SKプロモータを伴うベクターを用いて類似の結果を得ることもできるであろうと予想されている。
RPMI−1640培地の中で培養されたHuh7細胞を3×105細胞/ウェルの密度で6ウェル平板内に播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン(Lipofectamine)(商標)(インビトロェン(InVitrogen)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad、Cal))を用いた細胞播種の翌日に行なった。この実験においては、細胞を500ngの感染性HBVプラスミドayw亜型(「pHBV2」)(ジェンバンク受入れ番号V01460)及び500ng、300ng、250ng、120ng、100ng、50ng又は10ngのeiRNA構築物でのトランスフェクションに付した。トランスフェクション中の合計DNAを2.5μgにした量で不活性プラスミドDNA、pGL3−ベーシック(Basic)(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)を含み入れることにより、DNAを1日のトランスフェクションにつき2.5μgで一定に保持した。例えば、500ngのHBVDNA及び500ngのeiRNA構築物を受容するトランスフェクションにおいては、トランスフェクションに対し1.5μgのpGL3を添加した。トランスフェクションに先立って、培地を細胞から除去し、細胞をOpti−MEM(登録商標)(インビトロジェンライフテクノロジー(InVitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド)で洗浄した。次に、各々の細胞ウェルに800μlのOpti−MEM(登録商標)を添加しその後トランスフェクション混合物を添加した。トランスフェクションから17〜19時間後に、トランスフェクション混合物及びOpti−MEM(登録商標)を細胞から除去し、1ウェルあたり2mLの培地と交換した。トランスフェクションから3、6及び10日後に、細胞から培地を除去し−70℃で保管した。3日目及び6日目に2mLの新鮮な培地で培地を交換した。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。2セットの対照トランスフェクションすなわち、HBVDNA単独(500ngのHBVDNAプラス2μgのpGL3)及び対照eiRNA構築物を伴うHBVDNA(500ngのHBVDNA、1μgの対照eiRNA構築物及び1.0μgのpGL3DNA)、も同様に実施した。
トランスフェクションに続いてHBsAg分泌を測定することによりHBV発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視した。トランスフェクションから3日、6日及び10日後に、トランスフェクションを受けた細胞の培地(及び培地対照)を検定することにより、細胞を監視した。アボット研究所(Abbott Labs)(イリノイ州アボットパーク(Abbott Park、III))から商業的に入手可能であるアラスザイム(Auszyme)(登録商標)ELISAを用いて、メーカーの指示事項に従って表面Ag(sAg)を検出した。表面Agがウイルス複製によってのみならず、インビボでの感染中に産生されたHBVcccDNAから及びトランスフェクションを受けた感染性HBVクローン内での表面AgシストロンのRNAポリメラーゼIIで開始された転写を用いても会合させられることから、sAgを測定した。表面Ag合成は、HBV複製の不在下での有害な効果を伴って続行し得ることから、ウイルス複製のみならずsAgの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。
この実施例の終りで記述されているHBV特異的eiRNA構築物でのトランスフェクションを受けた細胞は、全て、対照に比べsAgレベルの減少を誘発した。表2から表8にみられるデータに対応する添付図2から図8にレベル阻害が示されている。788〜808及び807〜827として同定された配列が、500ngの用量でそれぞれ30%及び50%だけ表面Agレベルを低下させたにすぎないという点に留意されたい。これらは、sAgmRNAをターゲティングしない2つだけのeiRNAである;代りにこれらは3.1KbのHBVmRNAをターゲティングし、従ってsAgレベルを間接的に減少させる。これらその他のHBV RNAがターゲティングされた場合に観察された30%〜50%のsAg減少は、これらのeiRNA構築物に効能があることを強く示すものとみなされる。
eiRNAベクターは、表1で列挙されているHBV配列をコードする。ジェンバンク受入れ番号V01460について配列がそれらの地図座標と共に示されている。表の最も右側には、これらの配列が内部でマッピングする配列番号がある。コードされたRNAの配列は5’GGTCGAC(それ自体は重要でないものの使用された特定のベクターのポリリンカー配列から誘導されている配列)とそれに続く第1のセンス又はアンチセンスHBV配列とそれに続くループ配列(表1中下線あり)とそれに続く、第1のHBV配列に対する相補配列である第2のHBV配列である。ループ構造が固定された配列又は長さである必要はなく、我々は複数のループ配列を使用し、eiRNA構築物の機能にはいかなる有意な影響もなかったという点に留意されたい。第2のHBV配列には、RNApolIIIのための終結シグナルとして機能する例えば1、2、3又はそれ以上のTといった一連のT残基が後続している。
以上で記述され、表2から表8中のデータに対応する図2から図8の中でプロットされているとおりに、HBsAgを測定した。eiRNA構築物の量は、eiRNA構築物の名前のカッコ内に示され、μg単位の量である。例えば2791(0.5)は、トランスフェクションにおいて、0.5μg又は500ngのeiRNA構築物2791−2811(表1参照)が使用されたことを意味している。対照に比べた阻害パーセントも同様に下表に示されており、これは、10日目の測定に特定的なものである。1299が500ngで評価されたこの実施例中の4番目のデータセットが、10日目で評価が実施されなかったために3日目及び6日目という2つの時点のみを有することに留意されたい。この実験についての阻害パーセントは、6日目のデータについて示された。データは、sAgを測定するのに使用されたアウスザイムELISA検定キットのメーカーが記述した通りに収集した粗ODデータとして示されている。示されていないのは2791−2811についての50ngデータ及び1907−1927についての10ngデータである。これらの用量は各々、対照に比べて約50%だけHBsAg発現を阻害した。
背景:2つのeiRNA構築物を付加した相加効果を評価するために同じ細胞培養モデルを使用した。この実験においては、2791−2811及び2919−2939を評価した。これらを10ng及び25ngという2つの用量で別々に、そして10ng(5ngの2791−2811プラス5ngの2919−2939)及び25ng(12.5ngの2791−2811プラス12.5ngの2919−2939)で組合わせた形で評価した。例えば、25ngの2791−2811で見られた阻害の半分プラス25ngの2919−2939で見られた阻害の半分が25ngの組合せ用量で見られた阻害にほぼ等しい場合、相加効果が観察される。このことは、25ng用量での単一のeiRNA構築物の使用に比べて阻害を増してはいないかもしれないが、2つ以上のeiRNA配列の使用は、ウイルスエスケープ突然変異の生成を防止する上できわめて重要であることから、重要である。
Huh7細胞を3×105細胞/ウェルの密度で6ウェル平板内に播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン(商標)(インビトロェン))を用いた細胞播種の翌日に行なった。この実験においては、細胞を500ngの感染性HBVプラスミドayw亜型(ジェンバンク受入れ番号V01460)及び25ng又は10ngの2つの別々のeiRNA構築物又は合計25ng又は10ngでのこれらの2つのeiRNA構築物の組合せでのトランスフェクションに付した。トランスフェクション中の合計DNAを2.5μgにした量で不活性プラスミドDNA、pGL3を含み入れることにより、DNAを1日のトランスフェクションにつき2.5μgで一定に保持した。例えば、500ngのHBVDNA及び10ngのeiRNA構築物を受けるトランスフェクションにおいては、次にトランスフェクションに対し1.99μgのpLUCを添加した。トランスフェクションに先立って、培地を細胞から除去し、細胞をOpti−MEM(登録商標)(インビトロジェンライフテクノロジー)で洗浄した。次に、各々の細胞ウェルに800μlのOpti−MEM(登録商標)を添加しその後トランスフェクション混合物を添加した。トランスフェクションから17〜19時間後に、トランスフェクション混合物及びOpti−MEM(登録商標)を細胞から除去し、1ウェルあたり2mLの培地と交換した。トランスフェクションから4、8及び11日後に、細胞から培地を除去し−70℃で保管した。4日目及び8日目に2mLの新鮮な培地で培地を交換した。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。2セットの対照トランスフェクションすなわち、HBVDNA単独(500ngのHBVDNAプラス2μgのpGL3)及び対照eiRNA構築物を伴うHBVDNA(500ngのHBVDNA、500ngの対照eiRNA構築物及び1.5μgのpGL3DNA)、も同様に実施した。
結果は、表9及び図10に見られる対応するグラフに示されている。2791−2811及び2919−2939を組合わせることで、2791−2811又は2919−2939単独の投与に少なくとも等しい効果が示された。同じ及び/又は異なるHBV遺伝子からの異なるHBV配列に導かれた2つ以上のdsRNAを組合わせることによって、類似の利点が見られることになると予想されている。
マウスモデルにおけるHBVのサイレンシング
要約:確認実験1の中で記述されているeiRNAベクターのうちの2つを、マウスモデル内でHBVレプリコンをサイレンシングするそれらの能力について査定した。これらのベクターは、2791−2811及び1907−1927ベクターであった。両方のベクター共、マウスモデル内で、それらが細胞培養モデル内でサイレンシングしたのと同じ程度でHBVをサイレンシングすることがわかった。その他の療法によりマウス体内でこのHBVレプリコンをサイレンシングする能力は、ヒトでの効能の予測判断材料であることが実証されてきた[4]。
チンパンジーは、ヒトHBV感染力を研究すべき唯一の動物モデルである。しかしながらHBV発現及び複製が発生するマウスモデルも利用可能である。このモデルは、ウイルス複製に対してのみならず抗原のRT非依存性発現に対してもターゲティングされた抗−HBV治療剤の評価にとって価値のないものであった。このモデルでは、複製応答能あるHBVはエピソームHBVDNAから過渡的に発現されている。このモデルは、流体力学的送達によりマウスの肝臓内に複製応答能あるHBVDNAを導入することによって作り出される[1]。
流体力学的送達研究:実験3
全ての動物に7.5μgの感染性HBVaywプラスミド(確認実施例1に記述)を流体力学的に注入した。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからのHBVaywの転写が、HBV複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた[1]。これらの事象には、転写されたウイルスmRNAの翻訳、コア粒子内への転写されたプレゲノムRNAのパッケージング、プレゲノムRNAの逆転写、及びビリオン及びHBsAg粒子の組立て及び注射された動物の血清内への分泌が含まれる。実験動物には、10μgの2791−2811を同時注射した。対照動物の第2グループには10μgの無関係のeiRNA構築物を注射した。同様に、全ての動物に2.5μgのGFPレポータプラスミドを同時注射した(クローンテック(Clontech)、カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto、Cal))。注射を受けたマウスの肝臓中のGFPmRNAの発現は、マウスモデルのトランスフェクション効率に対抗して結果を正規化するための対照として役立った。動物に注射した全DNA量は、不活性フィラーDNAであるpGL3(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)を含み入れることによってつねに20μgに保った。全てのDNAは、ヤング(Yang)ら[1]の中で記述された方法に従って処方し注射した。1グループあたりの動物数は5匹であった。動物1匹あたりの注射されたDNA及びその量は、表10に示されている。
この実験は、2つのeiRNA構築物つまり2791−2811及び1907−1927が評価されたという点を除いて、実施例1の実験3と同様であった。この実験では、本書ですでに記述された検定を用いて1日目及び4日目にHBsAgを測定した。
RNAiの治療的開発のためのC型肝炎配列
実験1
簡単な導入:
C型肝炎ウイルス(HCV)は、非A非B型輸血関連肝炎の主たる原因であり、世界中で2億人を超える肝炎症例を数えている。HCVゲノムは高度の配列可変性を有する。50を超える亜型を含む6つの主要な遺伝子型が存在し、擬種に代表される著しい異種性が患者間で見い出されている。組換え型ポリメラーゼ又は細胞ベースのサブゲノムレプリコン系を用いることによって、HCV複製を理解する上で大幅な進歩が見られた。レプリコン細胞系を用いることにより、HCV特異的siRNAは、HCVタンパク質発現及びRNA複製を抑圧できることが実証されてきた。5’NTR及び構造的及び非構造的の両方の遺伝子の配列がうまくターゲティングされてきた。3’NTR配列は、その非常に高度に保存された性質のため、siRNAをベースとする療法のためのきわめて魅力ある標的となっている。しかしながら、3’NTRを使用することの実現可能性を調べるために、いかなる研究もなされていない。ここでは、サブゲノムレプリコン系内でHCVタンパク質での発現を阻害できる複数のsiRNAの設計及び試験について報告する。外因的に合成されたHCV特異的siRNAをHCVレプリコン細胞系列内に以下で記述される通りにトランスフェクトした。
ヘパトーマHuh7細胞内のHCVレプリコンを、10%のウシ胎児血清(インビトロジェン)、1%のペニシリン−ストレプトマイシン、1%の非必須アミノ酸及び0.5mg/mLのジェネチシン(Geneticin)を含有するダルベッコ修正イーグル培地(「DMEM」)(インビトロジェン)内で培養した。細胞を、分裂に先立ち75%の集密度まで成長させた。
レプリコン細胞由来の合計細胞溶解物を1×LDS緩衝液(インビトロジェン)中でレプリコン細胞から収集した。10%のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル(インビトロジェン)上で電気泳動の前にベータ−メルカプトエタノールの存在下で5分間90℃で溶解物を加熱した。タンパク質をPVDF(インビトロジェン)膜に移した。トランスファの後、0.5%のTween−20(PBS−Tween)を含有するPBSで1回膜を洗浄し、5%の脱脂粉乳を含むPBS−Tween内で1時間遮断した。PBS−Tweenでの洗浄後、膜を室温で1時間、1:1500の希釈度で一次α−NS5A抗体(チェン・リウ(Chen Liu)博士より寄贈)と共にインキュベートした。1:5000で希釈したHRP抱合α−マウスIgG二次抗体(アマーシャム(Amersham)でのインキュベーションに先立ち、PBS−Tween20中でブロットを洗浄した。二次抗体インキュベーションの後、ブロットを再度洗浄し、メーカーのプロトコルに従ってECL(アマーシャム)で処理した。
Rneasy(登録商標)キット(キアゲン(Qiagen))を用いて、全細胞RNAを抽出した。グオ(Guo)ら、のプロトコルに従ってノーザンブロット分析を行なった。簡単に言うと、5μgの全RNAを、2.2Mのホルムアルデヒドを含有する1.0%のアガロースゲルを通して電気泳動させ、ナイロン膜に移し、UV架橋(ストラタジーン(Stratagene))によって固定化した。58℃で16時間、50%の脱イオンホルムアミド、5×SSC(750mMの塩化ナトリウム、750mMのクエン酸ナトリウム)、デンハルト(Denhardt)の溶液、0.02Mのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(「SDS」)、100μgのせん断変性サケ精子DNA/ml及び100μgの酵母RNA/mlを含有する溶液中のα−[32P]CTP−標識されたネオマイシンRNAを用いて、ハイブリダイゼーションを実施した。室温で30分間2×SSC/0.1%SDS中で一度そして68℃で30分間0.1×SSC/0.1%SDS中で2度、膜を洗浄した。膜をX線フィルムに暴露した。
レプリコン細胞中へのsiRNAのトランスフェクションのためには、ユーザーマニュアルに従って、リポフェクタミン(登録商標)2000試薬(インビトロジェン)を使用した。簡単に言うと、0.5mLのDMEM中の2×104個の細胞を、トランスフェクションの前日に24ウェル平板内に播種した。指示された量のsiRNAを50μLのOptiMEM中で希釈し、希釈したリポフェクタミン(登録商標)2000試薬(50μLのオプチメム(Optimem)中1μL)と混合した。混合物を室温で20分間インキュベートしてから、細胞単層上に適用した。トランスフェクションの48〜72時間後に、細胞をPBS中で洗浄し、100μLのSDSサンプル緩衝液中に溶解させた。
1. HCVコア(正の対照):配列番号45
2. HCVNS5Bをターゲティングする表14に示された#12、同様に正の対照
3. ラミン配列(負の対照):配列番号46。
トランスフェクションのために下表15に記されている配列(及びその相補配列)を含むsiRNAR1−R8が使用されたという点を除いて、RNAiの治療的開発のためのC型肝炎−配列の実験1で記述された通りに、実験2を実施した。ここで実施されたウェスタンブロット検定は実施例2、実験1に記述されている通りであった。正の対照として使用された対照HCVコアsiRNAは、前出のHCV実験1内で記述されたsiRNAである。全てのsiRNAは、0、3、9ピコモルのレベルでトランスフェクションを受けた対照「コア」siRNAを除き、濃度0、9及び20ピコモルの濃度でトランスフェクションを受けた。R1、R2、R3、R5、R7及びR8は全て、図14のウェスタンブロット内で見られたように、HCVの有意な阻害を示した。
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるHBVの複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明
Huh7細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスRNAの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るHBVの感染性分子クローンでトランスフェクトする[1−3]。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号V01460及びJ02203の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のHBVプラスミドの転写が、HBV複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスmRNAの翻訳、転写されたプレゲノムRNAのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムRNAの逆転写及び、ビリオン及びHBsAg(B型肝炎表面抗原)粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のHBV複製の大部分の局面を再現し、従って、HBV発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
トランスフェクションの時点で80〜90%の集密度となるように6ウェル平板内にHuh7細胞を播種する。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン(商標)(インビトロジェン)を用いて実施される。この実験においては、50ngの感染性HBVプラスミド、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド(以下のプラスミドの説明)、配列番号1(以下で記述)から誘導された配列から成るヘヤピンRNAをコードする600ngのeiRNAベクター及び配列番号5(以下で記述)に由来する配列から構成されるヘヤピンRNAをコードする600ngのeiRNAベクターを用いて細胞をトランスフェクトする。50ngのHBVプラスミド及び1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドで対照細胞をトランスフェクトする。不活性フィラーDNA、pGL3−ベーシック(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)を全てのトランスフェクションに付加してトランスフェクションあたりの全DNAを2.5μgDNAにする。
トランスフェクションの後、HBsAg分泌及びDNA含有ウイルス粒子分泌を測定することにより、HBV発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視する。dsRNAの投与後2日目に始めてその後隔日で3週間、トランスフェクションを受けた細胞の培地を検定することによって細胞を監視する。アボット研究所(Abbott Labs)(イリノイ州アボットパーク(Abbott Park、IL))から商業的に入手可能であるアウスザイムELISAを用いてB型肝炎表面抗原(HBsAg)を検出する。HBsAgは、ウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性HBVクローン内での表面抗原シストロンのRNAポリメラーゼIIで開始された転写とも結びつけられることから、HBsAgを測定する。HBsAg合成はHBV複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、HBsAgの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。包膜されたHBVゲノムDNAを含有するビリオン粒子の分泌も測定する。包膜DNAを含有するビリオン粒子の喪失は、HBV複製の喪失を表わす。ビリオン分泌の分析には、裸の未成熟コア粒子と外被感染性HBVビリオンの間を弁別する技術が関与する[6]。簡単に言うと、培養した細胞の培地由来のペレット化されたウイルス粒子をプロティナーゼK消化に付してコアタンパク質を分解させる。プロティナーゼKの不活性化の後、試料をRQ1DNアーゼ(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)と共にインキュベートして、コア粒子から遊離されたDNAを分解させる。SDSの存在下でプロティナーゼKを用いて試料を再消化させて、DNアーゼを不活性化しかつ感染性外被ビリオン粒子を分断させかつ分解させる。その後フェノール/クロロホルム抽出によりDNAを精製し、エタノールで沈降させる。HBV特異的DNAをゲル電気泳動とそれに続くサザンブロット分析で検出する。
T7RNAポリメラーゼ遺伝子の配列
配列番号47は、pCEP4(インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド)といったような哺乳動物の発現ベクター内にクローニングされるT7のRNAポリメラーゼ遺伝子を表わす。クローニングは、当業者によって容易に行なうことができる。当業者であれば、コザック配列を伴うリーダー配列がT7RNAポリメラーゼ遺伝子から直ぐ上流側でクローニングされる必要があるということにも気づくことだろう。
該ベクターは、上述の通りT7ベースである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号#SV01460及びJ02203の座標3004−2950(約55bp)からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。ヘヤピンの1つの領域は、該配列のセンスバージョンをコードし、ヘヤピンの第2の領域はこの配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘヤピンは、当業者によって容易に設計され作製され得る。
該ベクターは、上述の通りT7ベースである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号#SV01460及びJ02203の座標730−786からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。該ヘヤピンは、配列番号1からの配列をコードするヘヤピンについて記述されたとおりに設計される。
マウスモデルについての論理的根拠
チンパンジーは、ヒトHBV感染性を研究すべき唯一の動物モデルである。しかしながら、ヒトHBVの発現及び複製が起こるマウスモデルも利用可能である。これらのモデルは、抗HBV治療剤の評価用としては非常に貴重なものであり、ヒトにおけるこれらの作用物質の効能の予測判断材料であることが示されてきた[4]。これらのモデルのうちの最初のものは、内部でHBVゲノム又は選択されたHBV遺伝子が発現されるトランスジェニックマウスモデルである[7、8]。該マウスゲノム内にHBVが組込まれることから、これらの動物は、ウイルス複製についてのみならず抗原のRT非依存性発現についてもモデルとして役立つ。内部でエピソームHBVDNAから過渡的に複製応答能あるHBVが発現される類似のモデルが存在する。このモデルは、複製応答能あるHBVDNAを流体力学的送達によってマウスの肝臓内に導入することによって作り上げられる[1]。トランスジェニック動物とは異なり、これらのマウスはHBV抗原に対し免疫寛容性がなく、HBVのトランスフェクションを受けた肝細胞の免疫媒介型寛容性を研究することができる。
対照B10.D2マウスに対し、ウイルスRNAの全てを転写し感染性ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るHBV(ayw亜型)の感染性分子クローンを流体力学的に注射する[1、2、3]。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからのHBVaywプラスミドの転写が、HBV複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた[1]。これらの事象には、転写されたウイルスmRNAの翻訳、コア粒子内への転写されたプレゲノムRNAのパッケージング、プレゲノムRNAの逆転写及び、ビリオン及びHBsAg粒子の組立て及び注射された動物の血清内への分泌が含まれる。動物には、HBVレプリコンプラスミドの4つの用量(1μg、3μg、5μg及び10μg)を注射する。これらの用量が選択されたのは、それらが流体力学的送達の後レポータプラスミドの検出可能な発現を惹起する能力をもつ非飽和用量を表わすからである。動物には、各グループ内の動物が合計DNA用量が20μgとなるように特定のエフェクタ構築物を10〜19μg用量受けるような形で、エフェクタdsDNA発現ベクター(eiRNA)の同時注射を行なう。例えば、HBVレプリコンを3μg用量受けるマウスにおいては、合計20μgのDNAが注射されるように、17μgの選択されたeiRNAベクターを注射する。従って、この用量は、使用されたHBVプラスミドの用量に左右される。対照動物は、HBVレプリコンの注射を受けるがeiRNAベクターの注射は受けない。その代り、対照動物には、処方中の合計DNA量が20μgとなるような形で不活性フィラーDNA、pGL3−ベーシック(プロメガ、WI、マディソン)を同時注射する。この研究におけるeiRNAベクターは、U6ベースの発現プラスミド、例えばアンビオン株式会社(Ambion,Inc.)米国テキサス州オースティン(Austin、TX、USA))である。これらのベクターは、配列番号1及び配列番号4から誘導された短かいヘヤピンRNAをコードする。これらのベクターによりコードされる精確な配列が以下で記述されている。ベクターは等量(重量で)で同時注射される。本書の他の箇所で記述されているとおりのその他の発現及びプロモータ系及び/又は代替的構造(すなわち2重鎖)をコードするベクターを用いても類似の結果が得られることになると予想される。
HBVレプリコン及びeiRNA構築物を注射したマウスは、対照動物に比べてHBV特異的RNA及びHBsAg及びHBVウイルス粒子が減少しているはずである。個々の動物において、減少は約70%〜ほぼ100%の範囲となる。
トランスジェニックマウス研究:背景
我々は、チサリ博士の研究所で開発されたHBVトランスジェニックマウスモデルを使用する予定である[8]。これらのマウスは、かなりの量のHBVDNAを複製し、ヒトの効能の予測判断材料である抗ウイルススクリーンとしてのその有用性を実証した[4]。これらの動物は、同様に、それらが抗原のHBV−成分媒介型発現のためのモデルでありかくしてウイルス複製のみならず抗原のRT非依存性発現についてもモデルとして役立ち得るという点で、理想的である。我々はウイルス複製のみならず、成分媒介型抗原発現をもターゲティングすることに関心があることから、これは重要である。
参考文献[8]に記述されているマウスに、流体力学的送達例に記述されているeiRNAベクターを含有する処方を静脈内注射することになる。これらは、配列番号1及び配列番号4から誘導された配列を含有するヘヤピンをコードするU6ベースのeiRNAベクターである。
DNAを、2003年5月6日出願のPCT米国特許第03/14288号明細書、「核酸送達方法(Methods for Delivery of Nucleic Acids)」サティシュチャンドラン(Satishchandran)の中で記述されている通りに、トリラクトシルスペルミン及びコレステリルスペルミンを用いて処方する。簡単に言うと、全て1.2の電荷比(正対負の電荷)を用いて、3つの処方を作製する。ただし、0.8〜1.2の間の電荷をもつ処方が全て効能を示すものと予想されている、ということを指摘しておくべきである。各プラスミドについてのDNA出発原液は、4mg/mlである。2つのプラスミド原液を、各プラスミドが2mg/mlとなるように等量で混合する。このプラスミド混合物を最終処方のために使用する。処方は、PCT米国特許第03/14288号明細書(前出)に記述されている通りである。すなわち処方A)35%のトリラクトシルスペルミン、65%のコレステリルスペルミン、処方B)50%のトリラクトシルスペルミン、50%のコレステリルスペルミン及び処方C)80%のトリラクトシルスペルミン、20%のコレステリルスペルミン。結果としての処方は全て、現在1mg/mlで各プラスミドを含有する。
HBV特異的RNAレベル、HBsAg及びウイルス含有DNA粒子は、処方A、B及びCグループにおいて対照に比べ減少しているはずである。
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるHBV複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明:
Huh7細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスRNAの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るHBVの感染性分子クローンでトランスフェクトする[1−3]。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号AF090840の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のHBVプラスミドの転写が、HBV複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスmRNAの翻訳、転写されたプレゲノムRNAのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムRNAの逆転写及び、ビリオン及びHBsAg粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のHBV複製の大部分の局面を再現し、従って、HBV発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
トランスフェクションの時点で80〜90%の集密度となるように6ウェル平板内にHuh7細胞を播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン(商標)(インビトロジェン)を用いて実施された。この実験においては、A)50ngの感染性HBVプラスミドadw亜型、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド(実施例3中のプラスミドの説明)及び1.5μgのHBV特異的eiRNAベクター(以下で記述);B)50ngの感染性HBVプラスミド、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド及び1.5μgの無関係のdsRNA発現ベクター;C)125ngの感染性HBVプラスミド、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド及び1.4μgのHBV特異的eiRNAベクター;及びD)125ngの感染性HBVプラスミド、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド及び1.4μgの無関係のdsRNA発現ベクターで細胞をトランスフェクトした。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。この実験では、トランスフェクションB及びDは対照として役立った。トランスフェクションから4日後に、トランスフェクションした細胞から培地を取出し、HBsAgの存在について検定した(以下参照)。背景対照として、トランスフェクションを受けていない細胞からの培地も検定した。
トランスフェクションの後、HBsAg分泌を測定することにより、HBV発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視した。dsRNAの投与後4日目に、トランスフェクションを受けた細胞の培地(及び培地対照)を検定することによって細胞を監視した。アボット研究所(イリノイ州、アボットパーク)から商業的に入手可能であるアウスザイムELISAを用いてB型肝炎表面抗原(HBsAg)を検出した。HBsAgはウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性HBVクローン内での表面AgシストロンのRNAポリメラーゼIIで開始された転写とも結びつけられることから、これを測定した。HBsAg合成はHBV複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、HBsAgの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。
HBV特異的eiRNA構築物でのトランスフェクションを受けた細胞は、対照トランスフェクションに比べ、4日の時点でHBsAgの82−93%の減少を示した。
eiRNAベクターは、ジェンバンク受入れ番号AF090840の座標2027−2674に対しマッピングするdsRNAをコードする。従って、該配列は、配列番号1及び配列番号2の両方から誘導された配列を含む。より特定的には、該配列は、配列番号2の全て及び配列番号1から誘導された134bpを含む。
細胞培地レプリコンモデル内のHCVのダウンレギュレーション
簡単な説明
この実験においては、機能的HCVレプリコンを発現する細胞系列が作製される。該細胞系列の作製は、ローマン(Lohmann)ら、に詳述されている通りである[10]。この実施形態においては、Huh7細胞を親細胞系列として使用するが、理論的には、任意のヒト肝細胞由来の細胞系列を使用することができる。その後、細胞をHCV特異的eiRNAベクターでトランスフェクトする。HCV特異的RNAの存在をeiRNAのトランスフェクションから3〜7日目にローマンら[10]に記述されている通りノーザンブロット分析により確認する。
トランスフェクションの時点で80〜90%の集密度となるように6ウェル平板内にHCVレプリコンを発現するHch7細胞を播種する。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン(商標)(インビトロジェン)を用いて実施される。この実験においては、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド(実施例3に記述されたプラスミド)及び1.5μgの配列番号11から誘導された配列から成るヘヤピンRNAをコードするT7ベースのeiRNAベクター(実施例の終りに記述されているベクター)で細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、1μgのT7RNAポリメラーゼ発現プラスミド及び1.5μgの実施例3で記述されたHBV特異的(配列番号1特異的)でT7ベースのeiRNAベクターでトランスフェクトする。トランスフェクションを受けていないレプリコン発現HuH7細胞を第2の対照として含み入れる。1つの混合物につき10回のトランスフェクションを実施してその結果合計20回のトランスフェクション(1混合物あたり10回)がもたらされ得るような形で、各々のトランスフェクション混合物を作る。3、4、5、6及び7日目に、各トランスフェクションにつき2つの細胞のウェルを溶解させ、標準的技術を用いてRNAを抽出する。試料を、ローマンら[10]に記述されている通りにHCV特異的RNAの存在についてノーザンブロット分析により同時に分析する。
HCV特異的eiRNAベクターでのトランスフェクションを受けた細胞は、分析された全ての時点で対照細胞に比べて減少したHCV特異的RNAレベルを示すことになる。
eiRNAベクターはT7ベースであり、ヘヤピンRNAをコードする。該ヘヤピンの一方の側は配列番号48を含む。
HBV/HCV同時感染の治療
簡単な説明
この実施例では、HBV及びHCVレプリコンの両方を複製する細胞が、HBV及びHCV特異的eiRNAの両方をコードするeiRNAベクターでのトランスフェクションを受ける。
HBV及びHCVレプリコンの両方を含む細胞系列の作製
HuH7細胞をまず処理して機能的HCVレプリコンを発現させる。細胞系列の作製はローマンら、[10]で詳述されている通りである。細胞系列の確立の後、細胞を実施例3及び以下の「細胞のトランスフェクション」の節で記述されている通りに感染性HBVレプリコンプラスミドでトランスフェクトさせる。この実施例においては、ジェンバンク受入れ番号V01460及びJ02203に見られるウイルス配列からレプリコンを誘導する。理論的には、まずはHBVレプリコンを安定した形で発現する細胞系列をまず作り上げ、次にこの細胞系列を用いて同じくHCVレプリコンを発現する細胞系列を作り上げることも同様に可能である。同様に、HBV及びHCVレプリコンの両方で同時に細胞をトランスフェクトし、HBV及びHCVレプリコンの両方を複製している細胞を選択し増殖させることも可能である。
この実施例では、HBV及びHCVeiRNAが同じベクター内の別々のシストロンによってコードされる。ただし、eiRNAが同じシストロン内にコードされるか又は別々のベクターによって提供される場合でも、類似の結果が予想される。この実施例では、各々のシストロンからの転写はT7RNAポリメラーゼプロモータ及びT7RNAポリメラーゼによって駆動される。各プロモータの後にはヘヤピンeiRNAが続いており、このヘヤピンeiRNA自体にはT7ターミネータが後続している(図1)。この実施例中のシストロンは、収束性であるが、発散性シストロンを使用することも可能である。同様に、これらのRNAを産生するためにその他の発現系(ウイルス系を含む)を使用することもでき、さらに又例えば本書の他の箇所で記述されている通り著しく効能に影響を及ぼすことなくこれらのRNAの発現を駆動するべくその他のプロモータを使用することも可能である、ということも指摘しておくべきである。適切な発現系及びプロモータの選択は、当業者の技能範囲内に入る。同じく、例えば本書の他の箇所で記述されているような、及びこの分野の文献中に記述されているようなその他のeiRNA構造を発現することもできる。この実施例では、HBVeiRNAベクターは配列番号1から誘導された配列をコードし、HCVeiRNAベクターは配列番号11から誘導された配列をコードする。ベクターインサートの記述は、この実施例の最後に見られる。
トランスフェクションの後、HBsAg分泌及びDNA含有ウイルス粒子分泌を測定することにより、HBV発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視する。dsRNAの投与後2日目に始めてその後隔日で3週間、トランスフェクションを受けた細胞の培地を検定することによって細胞を監視する。アボット研究所(イリノイ州アボットパーク)から商業的に入手可能なアウスザイムELISAを用いてB型肝炎表面抗原(HBsAg)を検出する。HBsAgは、ウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性HBVクローン内での表面AgシストロンのRNAポリメラーゼIIで開始された転写とも結びつけられることから、HBsAgを測定する。HBsAg合成はHBV複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、HBsAgの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。包膜されたHBVゲノムDNAを含有するビリオン粒子の分泌も測定する。包膜DNAを含有するビリオン粒子の喪失は、HBV複製の喪失を表わす。ビリオン分泌の分析には、裸の未成熟コア粒子と外被感染性HBVビリオンの間を弁別する技術が関与する[6]。簡単に言うと、培養した細胞の培地由来のペレット化されたウイルス粒子をプロティナーゼK消化に付してコアタンパク質を分解させる。プロティナーゼKの不活性化の後、試料をRQ1DNアーゼ(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)と共にインキュベートして、コア粒子から遊離されたDNAを分解させる。SDSの存在下でプロティナーゼKで再び試料を消化させて、DNアーゼを不活性化しかつ感染性外被ビリオン粒子を分断させかつ分解させる。その後フェノール/クロロホルム抽出によりDNAを精製し、沈降させる。HBV特異的DNAをゲル電気泳動とそれに続くサザンブロット分析で検出する。
HBV−HCV特異的eiRNAベクターでのトランスフェクションを受けた細胞は、分析された全ての時点で対照細胞に比べHCV特異的RNAレベルの減少を示すことになる。さらに、HBsAg及びHBVウイルス粒子のレベルも同様に、対照トランスフェクションに比べ減少することになる。
eiRNAベクターはT7ベースのものであり、ヘヤピンRNAをコードする。該ヘヤピンの一方の側は配列番号48を含む。
ベクターは上述のとおりのT7ベースのものである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号V01460及びJ02203の座標3004−2950(約55bp)からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。該ヘヤピンの1つの領域は、配列のセンスバージョンをコードし、該ヘヤピンの第2の領域は、この配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘヤピンは当業者により容易に設計、作製され得る。
2.グイドッティ(Guidotti)L.G.ら、急性HBV感染中の感染した細胞の破壊の無いウイルスクリアランス(Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection)、サイエンス(Science9、1999年、284(5415):p.825−9
3.シム(Thimme)、R.ら、CD8(+)T細胞が、急性B型肝炎ウイルス感染中のウイルスクリアランス及び疾病病原性を媒介する(CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection)、ウイルス学ジャーナル(J Virol)、 2003年、77(1):p.68−76
4.モーレイ(Morrey)J.D.ら、「B型肝炎感染についての化学療法モデルとしてのトランスジェニックマウス(Transgenic mice as a chemotherapeutic model for Hepatitis B infection)」「ウイルス性肝炎療法(Therapies for Viral Hepatitis)」、シナジ(Schinazi)R.F.、ソマドッシ(Sommadossi)、J−P.及びトーマス(Thomas)H.C.編中、インターナショナルメディカルプレス(International medical Press)、英国ロンドン、ホルボーン(Holborn、London)WC 1V6QA、UK、1998年
5.リュー(Liu)F.、Y.ソン(Song)及びD.リュー(Liu)、プラスミドDNAの全身投与による動物の体内の流体力学ベースのトランスフェクション(Hydrodynamics−based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA)、遺伝子療法(Gene Ther)、1999年、6(7):p.1258−66
6.ディレニー(Delaney)W.E.t及びH.C.アイソム(Isom)、B型肝炎ウイルス組換え型バキュロウイルスにより媒介されるヒトHepG2細胞中のB型肝炎ウイルス複製(Hepatitis B virus replication in human HepG2 cells mediated by hepatitis B virus recombinant baculovirus)、肝臓学(Hepatology)、1998年、28(4):p.1134−46
7.チサリ(Chisar)F.V.ら、慢性B型肝炎表面抗原担体状態のトランスジェニックマウスモデル(A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state)、サイエンス、1985年、230(4730):p.1157−60
8.グイドッティ L.G.ら、トランスジェニックマウス体内の高レベルB型肝炎ウイルス複製(High−level hepatitis B virus replication in transgenic mice)、ウイルス学ジャーナル(J Virol)、1995年、69(10):p.6158−69
9.リー(Lee)NS、ドージマ(Dohjima)T.、バウアー(Bauer)G.、リー(Li)H.リー(Li)M.J.、イーサニ(Ehsani)A.、サルバテーラ(Salvaterra)P.及びロッシ(Rossi)J.、ヒト細胞内のHIV−1rev転写物に対してターゲティングされた小型干渉RNAの発現(Expression of small interfering RNAs targeted against HIV−1 rev transcripts in human cells)、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、2002年、p.500−505
10.ローマン(Lohmann)V.、コーナー(Korner)F.、コッホ(Koch)J.−O.、ヘリアン(Herian)U.、テイルマン(Theilmann)L.及びバルテンシュレーガー(Bartenschlager)R.、ヘパトーマ細胞系列におけるサブゲノムC型肝炎ウイルスRNAの複製(Replication of Subgenomic Hepatits C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line)、サイエンス、1999年、285:110−113
Claims (12)
- 哺乳動物細胞中でB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための医薬を製造するための、2本鎖RNAエフェクタ分子の使用であって、
前記2本鎖RNAエフェクタ分子は、UがTに置換されている、配列番号18で表される配列を有するヌクレオチドからなる分子である、使用。 - 哺乳動物細胞中でB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための医薬を製造するための、1つ以上の発現ベクターの使用であって、
前記発現ベクターは、UがTに置換されている、配列番号18で表される配列を有するヌクレオチドからなる2本鎖RNAエフェクタ分子の前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物を含む、使用。 - 前記1つ以上の発現ベクターがさらに、T7ポリメラーゼプロモータ、SP6ポリメラーゼプロモータ及びRNAポリメラーゼIIIプロモータから選択されるプロモータを含み、前記プロモータが前記ヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項2に記載の使用。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の使用。
- UがTに置換されている、配列番号18で表される配列を有するヌクレオチドからなる2本鎖RNAエフェクタ分子を哺乳動物細胞に投与することを含む、哺乳動物細胞中でB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法であって、
前記哺乳動物細胞は、ヒトを除く哺乳動物の細胞またはin vitroで培養されている細胞である、方法。 - 前記投与が、UがTに置換されている、配列番号18で表される配列を有するヌクレオチドからなる2本鎖RNAエフェクタ分子の前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物を含む1つ以上の発現ベクターを提供することによって達成される、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上の発現ベクターがさらに、T7ポリメラーゼプロモータ、SP6ポリメラーゼプロモータ及びRNAポリメラーゼIIIプロモータから選択されたプロモータを含み、前記プロモータが前記ヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項6に記載の方法。
- UがTに置換されている、配列番号18で表される配列を有するヌクレオチドからなる2本鎖RNAエフェクタ分子を含む、インビボにて哺乳動物細胞中でB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項8に記載の組成物。
- (a)配列番号18で表される配列からなるヌクレオチド
(b)(a)の相補配列からなるヌクレオチド、
(c)(a)及び(b)の混合物、
から成る群から選択されたヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞内のB型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。 - 請求項8に記載の2本鎖RNAエフェクタ分子または請求項10に記載のヌクレオチドの前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物。
- 請求項11に記載の発現構築物を含む哺乳動物細胞。
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