JP5243789B2 - 二本鎖ｒｎａによる遺伝子発現の特異的阻害のための方法及び組成物 - Google Patents

Description

関連出願に関するクロス・リファレンス
本出願は、本明細書に援用される米国仮特許出願第６０／５５３，４８７号、２００４年３月１５日出願に関連し、そして３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）により、前記出願に対して優先権を請求する。

連邦政府が資金援助した研究及び開発に関する言及
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された、助成金番号ＡＩ２９３２９及びＨＬ０７４７０４のもとで部分的に政府の援助を受けて行った。政府は、本発明に特定の権利を有する。

発明の分野
本発明の背景を解明するため、本明細書で用いる刊行物及び他の題材、そして特に実施に関して他の詳細を提供する事例は、本明細書に援用され、そして便宜上、著者及び日付によって以下の本文に引用され、そして付随する参考文献一覧に著者のアルファベット順に列挙される。

本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）エフェクター分子によって、遺伝子発現を遺伝子特異的に阻害するための組成物及び方法に関する。前記組成物及び方法は、治療的適用、診断的適用、標的の確認、及びゲノム探索を含む多様な用途において、遺伝子発現を調節するのに有用である。

発明の背景
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子発現の抑制が、植物（転写後遺伝子抑制）（Ｎａｐｏｌｉら、１９９０）、真菌（クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ））（Ｒｏｍａｎｏ及びＭａｒｃｉｎｏ、１９９２）、及び線虫（ＲＮＡ干渉）（Ｆｉｒｅら、１９９８）を含む多様な系で明らかになった。哺乳動物の系において長いｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を同様に抑制しようとする初期の試みは、より低次の生物には存在しないインターフェロン経路が活性化されるために失敗した。インターフェロン応答は、ｄｓＲＮＡによって誘発される（Ｓｔａｒｋら、１９９８）。特に、プロテインキナーゼＰＫＲは、３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡにより活性化され（Ｍａｎｃｈｅら、１９９２）、これにより、翻訳開始因子ｅＩＦ２αがリン酸化されて、タンパク質合成の抑止及び２’５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ（２’−５’−ＯＡＳ）を活性化し、ＲＮＡ分解がおこる（Ｍｉｎｋｓら、１９７９）。

ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞及び細胞抽出物において、１５０ｂｐ以上の長さのｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導するのが観察される一方、より短いｄｓＲＮＡの効果はなかった（Ｔｕｓｃｈｌら、１９９９）。しかし、長い二本鎖ＲＮＡは、活性エフェクター分子ではなく；長いｄｓＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）とよばれるＲＮアーゼＩＩＩクラスの酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１）によって、２塩基の３’で突出する、非常に短い２１〜２３ｂｐの二重鎖に分解される（Ｚａｍｏｒｅら、２０００）。これらの短いＲＮＡ二重鎖は、ｓｉＲＮＡとよばれ、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡｉ応答を導き、そして本設計の化学的に合成した短いｓｉＲＮＡ二重鎖のトランスフェクションは望ましくないインターフェロン応答を誘発せずに、哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉ法を用いて、遺伝子発現を抑制することを可能にする（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ）。ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）において標的ｍＲＮＡを分解するため、エンドリボヌクレアーゼ機能の活性を導く配列特異的ガイドとして働く（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ショウジョウバエ胚抽出物におけるＲＮＡｉに関して、サイズ制限を研究すると、外部から供給した二本鎖ＲＮＡ、並びに長さ３６、３０、及び２９ｂｐの二重鎖を用いたＲＮＡ干渉の活性化では、ほぼ３８ｂｐの二本鎖ＲＮＡの、より低い閾値が確立された（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ）。短い３０塩基ＲＮＡは、活性である２１〜２３塩基ｓｉＲＮＡに切断されず、それゆえ、ＲＮＡｉで使用するには不活性であると考えられた（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ）。その後、同一グループが、ショウジョウバエ胚抽出物系で研究を続けて、ＲＮＡｉ経路においてｓｉＲＮＡとして機能するための、化学的に合成した短いＲＮＡ二重鎖に必要な構造的特徴を注意深く概説した。２塩基の３’突出がある長さ２１ｂｐのＲＮＡ二重鎖が最も有効であり、長さ２０、２２及び２３ｂｐの二重鎖では、効力はわずかに減少したが、ＲＮＡｉが仲介するｍＲＮＡ分解がおこり、そして２４及び２５ｂｐの二重鎖は不活性であった（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ）。

これら初期の研究の結論のいくつかは、使用したショウジョウバエの系に特異的である可能性もある。他の研究者らは、ヒト細胞において、より長いｓｉＲＮＡが作動できることを立証した。しかし、２１〜２３ｂｐの範囲の二重鎖は、より活性であることが示されており、そして認められた設計となった（Ｃａｐｌｅｎら、２００１）。本質的に、長い二重鎖ＲＮＡのダイサー分解から生じた天然産物を模倣する、化学的に合成した二重鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉにおける使用に好ましい化合物であると同定された。線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）におけるＲＮＡｉのサイズ制限を研究する研究者らは、反対の方向から本問題に取り組み、マイクロインジェクションした２６ｂｐのＲＮＡ二重鎖は、遺伝子発現を抑制するように機能するが、８１ｂｐの二重鎖に比較して、濃度が２５０倍高める必要があることを見出した（Ｐａｒｒｉｓｈら、２０００）。

近年、ＲＮＡｉ研究が注目されているにもかかわらず、本分野は未だに発展の初期段階にある。すべてのｓｉＲＮＡ分子が、細胞において、相補的ＲＮＡの分解を標的とできるわけではない。その結果、有効であろうＲＮＡｉ分子を設計するために、複雑なルールのセットが発展している。当業者は、機能的な組成物を発見するため、多数のｓｉＲＮＡ分子を試験することを予測する（Ｊｉら、２００３）。１回の研究で、サイレンシングを得る機会を高めるため、いくつかのｓｉＲＮＡ調製物をプールする当業者もいる（Ｊｉら、２００３）。ｓｉＲＮＡ分子が、１ｎＭ以下の濃度で作動できる（Ｈｏｌｅｎら、２００２）という事実にもかかわらず、こうしたプールは、典型的には、２０ｎＭ以上のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖混合物を含有する（Ｊｉら、２００３）。本技術により、他の細胞性ＲＮＡとｓｉＲＮＡ配列の相互作用によって引き起こされるアーチファクト（「オフ・ターゲット効果」）がおこる（Ｓｃｈｅｒｅｒら、２００３）。オフ・ターゲット効果は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが意図せぬ標的に相同性がある場合、又はＲＩＳＣ複合体が、ＲＮＡｉ二重鎖から意図せぬ鎖を取り込む場合に生じる（Ｓｃｈｅｒｅｒら、２００３）。一般的に、これらの効果は、ＲＮＡｉ二重鎖の濃度が高いほどより顕著であるという傾向がある（Ｓｃｈｅｒｅｒら、２００３）。

さらに、有効なＲＮＡｉ処理の効果の期間は、約４日間に限定される（Ｈｏｌｅｎら、２００２）。したがって、研究者らは、ｓｉＲＮＡ二重鎖を用いたトランスフェクションの２〜３日以内にｓｉＲＮＡ実験を行うか、あるいはより長期のサイレンシングを得るために、プラスミド又はウイルス発現ベクターを用いて研究しなければならない。

本発明は、遺伝子発現を阻害するためのＲＮＡｉにおいて有用な組成物を提供し、そしてこれらを使用するための方法を提供する。さらに、本発明は、効力を最大限にし、「オフ・ターゲット効果」を最小限にしつつ、作用期間を潜在的に増加させ、そして部位選択基準を緩和するように設計した、ＲＮＡｉ組成物及び方法を提供する。本発明のこれらの利点及び他の利点、並びに他の本発明の特徴は、本明細書で提供する本発明の説明から明らかである。

本発明は、真核細胞において、所望の標的遺伝子由来の遺伝子産物の発現を選択的に低下させる組成物及び方法、並びに前記遺伝子の発現により起こる疾患を治療するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、真核細胞において、標的遺伝子の発現を低下させることができる、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含有する組成物、及びそれらを調製するための方法に関する。

したがって、第１の態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための新規組成物を提供する。前記組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち、本発明のｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡを産生する。ｄｓＲＮＡはダイサーによってプロセシングされて、標的遺伝子のＲＮＡ干渉のため、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれる活性ｓｉＲＮＡになる。前駆体分子はまた、本明細書において、前駆体ＲＮＡｉ分子ともいう。

１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子は、ダイサーにプロセシングされて、ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さとなる。本実施態様により、ｄｓＲＮＡは、２６〜約３０ヌクレオチドの長さである第１のオリゴヌクレオチド配列（センス鎖ともいう）、及び生物学的条件下、例えば細胞の細胞質に見られる条件下で、第１の配列にアニーリングする第２のオリゴヌクレオチド鎖（アンチセンス鎖ともいう）を含む。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の一方の領域、特にアンチセンス鎖の領域は、ＲＮＡｉ応答を誘発するために標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的な、少なくとも１９ヌクレオチド、例えば約１９〜約２３ヌクレオチド、例えば２１ヌクレオチドの長さの配列である。

第２の実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子は、ダイサーによるプロセシングを促進する特性がいくつかある。本実施態様により、ｄｓＲＮＡは、ダイサーにプロセシングされて、ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さとなり、そして以下の特性の少なくとも１つを有する：（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばアンチセンス鎖上の３’が突出する、及び（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサー結合の配向、及び活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングを導くため、センス鎖上に修飾３’端がある。本実施態様により、センス鎖は２２〜２８ヌクレオチドを含み、そしてアンチセンス鎖は、２４〜３０ヌクレオチドを含む。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’端が突出する。別の態様では、センス鎖は、ダイサー結合及びプロセシングのため、センス鎖の３’端に位置する適当な修飾因子により修飾されている。適当な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、及び蛍光分子等の立体障害分子があげられる。ヌクレオチド修飾因子を用いる場合、ｄｓＲＮＡの長さが変わらないように、ｄｓＲＮＡ中でリボヌクレオチドを置換する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’端が突出し、センス鎖が、ダイサー・プロセシングのため修飾されている。別の実施態様では、センス鎖の５’端にはリン酸塩がある。センス鎖及びアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば細胞の細胞質で見出られる条件下でアニーリングする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の一方の領域、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列であり、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接した２１ヌクレオチド領域内にあり、そして標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。さらに、本実施態様にしたがい、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子はまた、以下の他の特性を１以上を有する：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体から右にシフトしている（すなわち標準的な２１量体に比較して、アンチセンス鎖には、分子の右側のヌクレオチドが含まれる）、（ｂ）鎖は完全に相補的でなくてもよい、すなわち鎖に単純なミスマッチ対があってもよい、及び（ｃ）ロック化核酸（単数又は複数）などの塩基修飾が、センス鎖の５’端に含まれていてもよい。

第３の実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子は、ダイサーによるプロセシングを促進する特性がいくつかある。本実施態様により、ｄｓＲＮＡは、ダイサーにプロセシングされて、ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さであり、以下の特性の少なくとも１つがある：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばセンス鎖上に３’が突出している、及び（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサー結合の配向、及び活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングを導くため、アンチセンス鎖上の３’端は修飾されている。本実施態様により、センス鎖は、２４〜３０ヌクレオチドを含み、そしてアンチセンス鎖は、２２〜２８ヌクレオチドを含む。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’端が突出する。別の実施態様では、アンチセンス鎖は、ダイサー結合及びプロセシングのため、アンチセンス鎖の３’端に位置する適当な修飾因子により修飾されている。適当な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、及び蛍光分子等の立体障害分子があげられる。ヌクレオチド修飾因子を用いる場合、ｄｓＲＮＡの長さが変わらないように、ｄｓＲＮＡ中でリボヌクレオチドを置換する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’端が突出し、ダイサー・プロセシングのためアンチセンス鎖は修飾されている。１つの実施態様では、アンチセンス鎖は、５’リン酸塩を有する。センス鎖及びアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば細胞の細胞質で見られる条件下でアニーリングする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の一方の領域、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列で、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接し、そして標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。さらに、本実施態様により、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子はまた、以下の他の特性の１以上を有する：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体から左にシフトしている（すなわち典型的な２１量体に比較して、アンチセンス鎖には分子の左側のヌクレオチドが含まれる）、及び（ｂ）鎖は完全に相補的でなくてもよい、すなわち鎖に単純なミスマッチ対があってもよい。

第２の態様では、本発明は、ダイサーによるプロセシングが促進したｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子を作製するための方法を提供する。本方法により、慣用的な技術及びアルゴリズムを用いて、既定の標的遺伝子に関して、少なくとも１９ヌクレオチドの長さであるアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡを選択する。１つの実施態様では、５’端に５〜１１リボヌクレオチドを含むように、アンチセンスｓｉＲＮＡを修飾して、２４〜３０ヌクレオチドの長さを供与する。アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドの長さである場合、５’端に３〜９ヌクレオチド、又は４〜７ヌクレオチド又は６ヌクレオチドを付加する。付加するリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的でもよいが、標的配列及びアンチセンスｓｉＲＮＡの間の相補性は完全でなくてもよい。すなわち、生じるアンチセンスｓｉＲＮＡは、標的配列と十分に相補的である。次いで、２２〜２８ヌクレオチドであるセンス鎖を産生する。センス鎖は、生物学的条件下で、アンチセンス鎖にアニーリングするように、アンチセンス鎖に実質的に相補的である。１つの実施態様では、アンチセンス鎖のダイサー・プロセシングをおこす修飾３’端を含有するように、センス鎖を合成する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’が突出する。他の実施態様では、ダイサー結合及びプロセシングのため、修飾３’端を含有するセンス鎖を合成し、そしてｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’が突出する。

本方法の第２の実施態様では、５’端に１〜９リボヌクレオチドを含むように、アンチセンスｓｉＲＮＡを修飾して、２２〜２８ヌクレオチドの長さとする。アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドの長さである場合、３’端に１〜７リボヌクレオチド、又は２〜５リボヌクレオチド及び又は４リボヌクレオチドを付加する。付加するリボヌクレオチドはいかなる配列でもよい。付加するリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的であってもよいが、標的配列及びアンチセンスｓｉＲＮＡの間の相補性は完全でなくてもよい。すなわち、生じるアンチセンスｓｉＲＮＡは、標的配列と十分に相補的である。次いで、２４〜３０ヌクレオチドのセンス鎖を産生する。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニーリングするように、アンチセンス鎖に実質的に相補的である。１つの実施態様では、ダイサー・プロセシングを導く修飾３’端を含有するようにアンチセンス鎖を合成する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は３’が突出する。他の実施態様では、ダイサー結合及びプロセシングのため、修飾３’端を含有するアンチセンス鎖を合成し、そしてｄｓＲＮＡのセンス鎖は３’が突出する。

第３の態様では、本発明は、開示するｄｓＲＮＡ組成物を含有する薬剤組成物を提供する。
第４の態様では、本発明は、細胞において、所望の標的遺伝子由来の遺伝子産物の発現を選択的に低下させる方法、並びに前記遺伝子の発現によって起こる疾患を治療するための方法に関する。１つの実施態様では、前記方法は、ｄｓＲＮＡの十分な部分が細胞の細胞質に移動して、標的遺伝子の発現を低下させるような、本発明のｄｓＲＮＡ量を、細胞環境内に導入する。

前記組成物及び方法は、予期せぬレベルの効力のＲＮＡｉ効果がある。本発明は、本発明が作動すると考えられる、根本的な理論によって限定されることは意図されないが、本レベルの作用の効力及び期間は、前記ｄｓＲＮＡがダイサーの基質として機能し、標的遺伝子由来のＲＮＡの分解に直接関与するＲＩＳＣ複合体へ、ｄｓＲＮＡ由来の１つの配列の取り込みが促進されるという事実によって生じると考えられる。

発明の詳細な説明
本発明は、真核細胞において、標的遺伝子の発現を低下させることが可能な、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含有する組成物、及び前記組成物の調製法に関する。ｄｓＲＮＡの鎖の一方は、標的遺伝子から転写されるＲＮＡを破壊することも可能な約１９〜約３０ヌクレオチドの範囲の長さのヌクレオチド配列領域を含有する。

第１の態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための新規組成物を提供する。前記組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち、本発明のｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでプロセシングされて、活性ｓｉＲＮＡを産生する。ｄｓＲＮＡはダイサーによってプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡになり、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれる。前駆体分子はまた、本明細書において、前駆体ＲＮＡｉ分子ともいう。本明細書において、活性ｓｉＲＮＡとの用語は、各鎖がＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（単数若しくは複数）又はＲＮＡ及びＤＮＡを含む、二本鎖核酸を示す。ｓｉＲＮＡは１９〜２３の間のヌクレオチドを含むか、又は２１ヌクレオチドを含む。活性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ中の二重鎖領域が１７〜２１ヌクレオチド、又は１９ヌクレオチドを含むように、各鎖の３’端に２ｂｐの突出がある。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列と十分に相補的である。

「二重鎖領域」との語は、相補的であるか又は実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にする、ワトソン・クリック塩基対形成又は他の態様によって、互いに塩基対を形成する、２つの相補的な又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を示す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成できるが、「二重鎖領域」が１９塩基対からなるように、各鎖上の１９塩基のみが相補的であるか又は実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’の及び３’の突出として存在する。さらに、二重鎖領域内で、１００％相補性でなくてもよく；二重鎖領域内で実質的に相補性であればよい。実質的な相補性は、鎖が生物学的条件下でアニーリングできるような、鎖間の相補性をいう。生物学的条件下で、２つの鎖がアニーリングするか否かを実験的に決定するための技術は当該技術分野で周知である。あるいは、２つの鎖を合成して共に生物学的条件下で添加し、これらが互いにアニーリングするかどうかを決定することもできる。

本明細書において、標的ｍＲＮＡ配列に「十分に相補的な」配列であるｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）又はＲＮＡｉプロセスによって、標的ｍＲＮＡの破壊を誘発するのに十分な配列であることを意味する。アンチセンス鎖のすべての残基が、標的分子中の残基に相補的であるように、ｓｉＲＮＡ分子を設計する。あるいは、安定性を高め、そして／又は前記分子のプロセシング活性を促進するように、分子内で置換を行う。鎖内で置換を行うこともできるし、また鎖の末端の残基に置換を行ってもよい。

本発明の第１態様の１の実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子は、ダイサーによってプロセシングされてｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さである。本実施態様により、適当なｄｓＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチド、及び約３０ヌクレオチドを超えない長さの１つのオリゴヌクレオチド配列である、第１の配列を含有する。ＲＮＡの本配列の長さは、約２６〜２９ヌクレオチドである。本配列の長さは、約２７若しくは２８ヌクレオチド、又は２７ヌクレオチドである。ｄｓＲＮＡの第２の配列は、生物学的条件下、例えば真核細胞の細胞質内で、第１の配列にアニーリングすればいかなる配列でもよい。一般的に、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列との相補的塩基対が少なくとも１９あり、より典型的には、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列との相補的塩基対が、約２１以上、又は約２５以上である。１つの実施態様では、第２の配列は、第１の配列と同じ長さでｄｓＲＮＡは平滑端である。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡの末端は突出している。

第１の実施態様の特定の態様では、ｄｓＲＮＡの第１及び第２のオリゴヌクレオチド配列は、別のオリゴヌクレオチド鎖上にあり、化学的に合成でき、典型的には化学的に合成する。ある実施態様では、鎖の長さは共に２６〜３０ヌクレオチドである。他の実施態様では、鎖の長さは共に２５〜３０ヌクレオチドである。１つの実施態様では、どちらの鎖の長さも２７ヌクレオチドであり、完全に相補的かつ平滑端である。ｄｓＲＮＡは、分子内アニーリングを経由する単一のＲＮＡオリゴヌクレオチド由来でもよく、より典型的には、第１及び第２の配列は、別のＲＮＡオリゴヌクレオチド上に存在する。１つの実施態様では、一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖は、ダイサーの基質となる。他の実施態様では、遺伝子発現を阻害する際の二本鎖ＲＮＡ構造的効果を最大にするように、ダイサーが二本鎖ＲＮＡ構造に結合することを促進する、少なくとも１つ修飾されている。ｄｓＲＮＡには１以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換があってもよい。

２つの別のオリゴヌクレオチドを含有する適当なｄｓＲＮＡ組成物を、化学的連結基により、アニーリング領域の外部で化学的に連結してもよい。多くの適当な化学的連結基が当該技術分野で公知であり、使用できる。適当な基は、ｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの破壊に干渉しないであろう。あるいは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングにおいてヘアピン構造が産生され、ｄｓＲＮＡ組成物が作製されるように、２つの別のオリゴヌクレオチドを第３のオリゴヌクレオチドによって連結することもできる。ヘアピン構造は、ｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの破壊に干渉しないであろう。

第１及び第２のオリゴヌクレオチドは完全に相補的でなくてもよい。実際、１つの実施態様では、センス鎖の３’末端はミスマッチが１以上ある。１つの態様では、約２のミスマッチがセンス鎖の３’末端に取り込まれる。別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ分子であり、各々のオリゴヌクレオチドの長さは２７ヌクレオチドであり、互いにアニーリングした際、平滑端となり、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）の２ヌクレオチドがミスマッチとなる。おそらく、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入にともない、何らかの律速巻き戻し段階に影響が及ぶことにより、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するか又は援助するため、ミスマッチ又は熱力学的安定性の低下（特に３’‐センス／５’‐アンチセンス位で）の使用が提唱されている（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３）。したがって、活性２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するためのアルゴリズムの設計には末端塩基組成が含まれる（Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４）。本実施態様のｄｓＲＮＡはダイサーに切断されて、ミスマッチを含有する小さい末端配列は、アンチセンス鎖と対を作らずに残る（３’突出の一部となる）か、又は最終的には２１量体ｓｉＲＮＡから完全に切断されるであろう。したがって、これらの「ミスマッチ」は、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ構成要素において、ミスマッチとして存続しない。驚いたことに、ダイサー基質のセンス鎖の３’端の塩基ミスマッチ又はセグメントの不安定化は、おそらく、ダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおいて、合成二重鎖の効力を改善することが見出された。

２５〜約３０ヌクレオチドのこれらのより長いｄｓＲＮＡ種が、効力及び作用期間に関して、予期せぬ有効な結果を生じることが実験的に見出された。本発明の根本的な理論に束縛されることは望ましくないが、より長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の細胞質において、酵素ダイサーの基質として働くと考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、標的遺伝子由来の細胞質ＲＮＡの破壊に関与するＲＩＳＣ複合体に、切断ｄｓＲＮＡ由来の一本鎖切断産物が取り込まれるのを促進すると考えられる。本明細書記載の研究は、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種の切断可能性が、ｄｓＲＮＡ種の効力及び作用期間の増加に対応することを示している。

本発明の第１の態様の第２の実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子には、ダイサーによるプロセシングを増進するいくつかの特性がある。本実施態様により、ｄｓＲＮＡは、ダイサーにプロセシングされて、活性ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さであり、そして以下の特性の少なくとも１つを有する：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばアンチセンス鎖上の３’が突出する、及び（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサー結合の配向、及び活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングを導くため、センス鎖上の３’端が修飾されている。本実施態様により、ｄｓＲＮＡ中の最も長い鎖は、２４〜３０ヌクレオチドである。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖が２２〜２８ヌクレオチドであり、そしてアンチセンス鎖が２４〜３０ヌクレオチドであるような非対称性である。したがって、生じるｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’端が突出する。突出は、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた、５’リン酸塩があってもよい。

別の実施態様では、センス鎖は、センス鎖の３’端に位置する適当な修飾因子によるダイサー・プロセシングのため修飾され、すなわち、ダイサー結合の配向及びプロセシングを導くように、ｄｓＲＮＡを設計する。適当な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、及び蛍光分子等の立体障害分子があげられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドがあげられる。１つの実施態様では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として用いる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１‐３ヌクレオチド修飾因子、又は２ヌクレオチド修飾因子は、センス鎖の３’端でリボヌクレオチドを置換する。立体障害分子を利用する場合、アンチセンス鎖の３’端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、鎖の長さは、修飾因子の取り込みによっては変化しない。別の実施態様では、本発明は、アンチセンス鎖のダイサー・プロセシングの配向を導くため、ｄｓＲＮＡ中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを意図する。本発明の他の実施態様では、２つの末端ＤＮＡ塩基は、センス鎖の３’端及びアンチセンス鎖の５’端に二重鎖平滑端を形成するセンス鎖の３’端の２つのリボヌクレオチドを置換して、アンチセンス鎖の３’端に、２ヌクレオチドのＲＮＡが突出する。これは、平滑端にＤＮＡを、そして突出端にＲＮＡ塩基を有する非対称性組成物である。

センス鎖及びアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば細胞の細胞質に見られる条件下でアニーリングする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の一方の領域、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列で、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接した２１ヌクレオチド領域内にあり、そして標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。

さらに、本実施態様により、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子はまた、以下の他の１以上の特性を有する：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体から右にシフトしている、（ｂ）鎖は完全に相補的でなくてもよく、すなわち鎖に単純なミスマッチ対があってもよい、及び（ｃ）ロック化核酸（単数又は複数）などの塩基修飾が、センス鎖の５’端に含まれていてもよい。慣用技術を用いて、「典型的な」２１量体ｓｉＲＮＡを設計する。１つの技術で、一般的に、多様な部位を、平行して、又は試薬の１つが有効であることを期待して、同一標的に特異的ないくつかの別のｓｉＲＮＡを含有するプールで試験することは有効である（Ｊｉら、２００３）。他の技術は、設計規則及びアルゴリズムを用いて、活性ＲＮＡｉエフェクター分子を得る見込みを高める（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４；Ｋｒｏｌら、２００４；Ｙｕａｎら、２００４；Ｂｏｅｓｅら、２００５）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選択もまた、開発されている（本明細書で援用する、米国公開特許出願第２００５／００４２６４１ Ａ１号）。二次構造予測によって、潜在的な標的部位もまた分析できる（Ｈｅａｌｅら、２００５）。次いで、本２１量体を用いて、２１量体の５’端に３〜９の他のヌクレオチドを含む、右のシフトを設計する。これらの他のヌクレオチド配列は、いかなる配列でもよい。１つの実施態様では、他のリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施態様でさえ、標的配列及びアンチセンスｓｉＲＮＡの相補性は完全でなくてもよい。

第１及び第２のオリゴヌクレオチドの相補性は完全でなくてもよい。これらは、生物学的条件下でアニーリングし、そして標的配列に十分に相補的なｓｉＲＮＡを産生する、ダイサーの基質を提供するため、実質的に相補的でありさえすればよい。ロック化核酸、又はＬＮＡは、当業者に周知である（Ｅｌｍａｎら、２００５；Ｋｕｒｒｅｃｋら、２００２；Ｃｒｉｎｅｌｌｉら、２００２；Ｂｒａａｓｃｈ及びＣｏｒｅｙ、２００１；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄら、２０００；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、２０００）。１つの実施態様では、ＬＮＡはセンス鎖の５’端に取り込まれる。別の態様では、ＬＮＡは、アンチセンス鎖の３’が突出するように設計された二重鎖中のセンス鎖の５’端に取り込まれる。

１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは非対称構造であり、センス鎖の長さが２５塩基対であり、アンチセンス鎖が、３’で２塩基突出した、２７塩基対の長さである。別の態様では、非対称構造である本ｄｓＲＮＡは、さらに、センス鎖の３’端に、２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つのデオキシヌクレオチドを含有する。

２つの別のオリゴヌクレオチドを含有する適当なｄｓＲＮＡ組成物を第３の構造によって連結することもできる。第３の構造は、ｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの、指定される破壊に干渉しないであろう。１つの実施態様では、第３の構造は、化学的連結基である。多くの適当な化学的連結基が当該技術分野で公知であり、使用できる。あるいは、第３の構造は、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際してヘアピン構造が産生され、ｄｓＲＮＡ組成物が作製されるような態様で、２つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドである。ヘアピン構造はｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの、指定される破壊に干渉しないであろう。

本発明の第１の態様の第３の実施態様では、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子には、ダイサーによるプロセシングを促進するいくつかの特性がある。本態様により、ｄｓＲＮＡは、ダイサーにプロセシングされて、ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さとなり、そして以下の特性を少なくとも１つ有する：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばセンス鎖上の３’が突出する、及び（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサー結合の配向、及び活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングを導くため、アンチセンス鎖上の３’端が修飾される。本実施態様により、ｄｓＲＮＡ中の最も長い鎖は２４〜３０ヌクレオチドである。１つの実施態様では、センス鎖は２４〜３０ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は２２〜２８ヌクレオチドである。したがって、生じるｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’端が突出する。突出は、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。アンチセンス鎖はまた、５’リン酸塩を有する。

別の実施態様では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’端に位置する適当な修飾因子によるダイサー・プロセシングのため修飾され、すなわち、ダイサー結合の配向及びプロセシングを導くように、ｄｓＲＮＡを設計する。適当な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、及び蛍光分子等の立体障害分子があげられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドがあげられる。１つの実施態様では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として用いる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１〜３ヌクレオチド修飾因子、又は２ヌクレオチド修飾因子は、アンチセンス鎖の３’端でリボヌクレオチドを置換する。立体障害分子を利用する場合、アンチセンス鎖の３’端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、鎖の長さは、修飾因子の取り込みによっては変化しない。別の実施態様では、本発明は、ダイサー・プロセシングの配向を導くため、ｄｓＲＮＡ中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを意図する。他の発明において、アンチセンス鎖の３’端の２つのリボヌクレオチドの代わりに２つの末端ＤＮＡ塩基を配置して、センス鎖の５’端及びアンチセンス鎖の３’端に二重鎖平滑端を形成し、そして２ヌクレオチドのＲＮＡが、センス鎖の３’端に突出する。これは、平滑端にＤＮＡがあり、そして突出端にＲＮＡ塩基がある、非対称性組成物である。

センス鎖及びアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば細胞の細胞質に見られる条件下でアニーリングする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の一方の領域、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列があり、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接し、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。

さらに、本実施態様により、ｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子はまた、以下の他の特性の１以上があってもよい：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体から右にシフトしている、及び（ｂ）鎖は完全に相補的でなくてもよい、すなわち鎖に単純なミスマッチ対があってもよい。上記の慣用的な技術を用いて、「典型的な」２１量体ｓｉＲＮＡを設計する。次いで、本２１量体を用いて、２１量体の５’端に１〜７の他のヌクレオチドを含む、右のシフトを設計する。これらの他のヌクレオチド配列は、いかなる配列があってもよい。付加するリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的であってもよいが、標的配列及びアンチセンスｓｉＲＮＡの相補性は完全でなくてもよい。すなわち、生じるアンチセンスｓｉＲＮＡは標的配列と十分に相補的である。第１及び第２のオリゴヌクレオチドの相補性は完全でなくてもよい。これらは、生物学的条件下でアニーリングし、そして標的配列に十分に相補的なｓｉＲＮＡを産生する、ダイサーの基質を提供するため、実質的に相補的であればよい。

１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは非対称構造であり、アンチセンス鎖が長さ２５塩基対であり、そしてセンス鎖は、３’で２塩基が突出し、長さが２７塩基対である。別の実施態様では、非対称構造を有する本ｄｓＲＮＡは、さらに、アンチセンス鎖の３’端に、２つのデオキシヌクレオチドを含有する。

２つの別のオリゴヌクレオチドを含有する適当なｄｓＲＮＡ組成物を第３の構造によって連結することもできる。第３の構造は、ｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの、指定される破壊に干渉しないであろう。１つの実施態様では、第３の構造は化学的連結基である。多くの適当な化学的連結基が当該技術分野で公知であり、使用できる。あるいは、第３の構造は、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際してヘアピン構造を産生する方式で、ｄｓＲＮＡの２つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドである。ヘアピン構造は、ｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、そして標的遺伝子から転写されるＲＮＡの、指定される破壊に干渉しないであろう。

本発明のｄｓＲＮＡ組成物の１つの特徴は、ダイサーの基質として機能することである。典型的には、本発明のｄｓＲＮＡ組成物は、ダイサー、他のＲＮアーゼ、又はこれらを含有する抽出物で処理されていない。本発明において、この種の前処理は、ダイサー・アニーリングを防止する。ｄｓＲＮＡ組成物がダイサーの基質として機能するか否かを決定するためのいくつかの方法が知られ、用いられる。例えば、製造者の指示にしたがって、組換えダイサー酵素キット（ＧＴＳ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでダイサー活性を測定することができる。ｄｓＲＮＡで細胞を処理して２４時間保持後に採取し、ＲＮＡを単離することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでダイサー活性を測定する。製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙ^ＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるなど、標準的方法を用いて、ＲＮＡを単離することもできる。単離したＲＮＡを、１０％ＰＡＧＥゲル上で分離し、これを用いて標準的ＲＮＡブロットを調製し、本ブロットを、Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴ標識システム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）で標識したオリゴヌクレオチドなどの、適当な標識デオキシオリゴヌクレオチドで、探査（ｐｒｏｂｅｄ）する。

ｄｓＲＮＡの細胞に対する影響は、細胞それ自体に依存する。ある状況では、ｄｓＲＮＡは、ある細胞種でアポトーシス又は遺伝子サイレンシングを誘導可できるが、別の細胞種では誘導できない。したがって、ｄｓＲＮＡは、ある細胞で使用するのに適しており、そして別の細胞では適してない可能性もある。「適当な」ｄｓＲＮＡ組成物と見なすためには、使用しうる可能なすべての状況下で適切でなくてもよく、むしろ特定のセットの状況下で適切であればよい。

ｄｓＲＮＡ組成物がダイサーの基質として機能することが修飾によって妨げられない限り、本発明のｄｓＲＮＡ、すなわち前駆体ＲＮＡｉ分子に、修飾を施してもよい。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡのダイサー・プロセシングを増進するように、１以上の修飾を行う。第２の態様では、より有効なＲＮＡｉ生成を生じるように、１以上の修飾を行う。第３の態様では、より大きいＲＮＡｉ効果を援助するように、１以上の修飾を行う。第４の態様では、細胞に送達しようとするｄｓＲＮＡ分子ごとに、より大きい効力を生じるように、１以上の修飾を行う。修飾を、３’末端領域、５’末端領域、３’末端及び５’末端領域の両方、又はある場合、配列内の多様な位置に取り込むことができる。上記制限を念頭において、いかなる数及び組み合わせの修飾をｄｓＲＮＡに取り込むこともできる。多数の修飾が存在する場合、これらは同一であっても、異なっていてもよい。塩基、糖部分、リン酸主鎖に対する修飾、及びその組み合わせが意図される。どちらの５’末端がリン酸化されていてもよい。

リン酸主鎖に意図される修飾の例には、メチルホスホネートを含むホスホネート、ホスホロチオエート、及びアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾等があげられる。糖部分に意図される修飾の例には、２’−Ｏ−メチルなどの２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノ、及びデオキシ修飾等があげられる（例えばＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、２００３を参照されたい）。塩基基に意図される修飾の例には、無塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び５−（３−アミノアリル）−ウラシル等があげられる。ロック化核酸、又はＬＮＡもまた、取り込まれる。多くの他の修飾が公知であり、そして上記の基準を満たす限り、これらの修飾を用いることができる。修飾の例示はまた、各々、本明細書に援用される、米国特許第５，６８４，１４３号、第５，８５８，９８８号、及び第６，２９１，４３８号、並びに米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５ Ａ１号にも開示される。他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら（２０００）、Ｓｔｅｉｎら（２００１）及びＶｏｒｏｂｊｅｖら（２００１）に開示される。

さらに、ダイサー切断から生じるオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害するのに最も有効であるオリゴヌクレオチドの部分であることを確実にするように、ｄｓＲＮＡ構造を最適化することもできる。例えば、本発明の１つの実施態様では、遺伝子発現を阻害すると予想される２１〜２２ｂｐのセグメントが、アンチセンス鎖の３’端に位置する、ｄｓＲＮＡ構造の２７ｂｐオリゴヌクレオチドを合成する。アンチセンス鎖の５’端に位置する残りの塩基は、ダイサーによって切断され、そして廃棄される。本切断部分は相同である（すなわち標的配列の配列に基づく）か、また非相同であってもよく、核酸鎖を延長するため、付加されてもよい。

酵素的に又は部分的／完全有機合成によって、ＲＮＡを産生し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素合成又は有機合成によって、修飾リボヌクレオチドを導入することもできる。１つの実施態様では、各鎖を化学的に調製する。ＲＮＡ分子を合成する方法が当該技術分野で公知であり、特に、Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）に記載される、又は本明細書に記載するような化学合成法がある。

知られているように、ＲＮＡｉ法は、非常に多様な生物において、非常に多様な遺伝子に適用可能であり、そしてこれらの各々の状況において、開示する組成物及び方法を利用することができる。開示する組成物及び方法によってターゲティング可能な遺伝子の例には、細胞に対して天然の遺伝子である内因性遺伝子、又は通常、細胞に対して天然ではない遺伝子があげられる。これらの遺伝子には、限定なく、オンコジーン、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、血管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、接着分子の遺伝子、細胞表面受容体の遺伝子、転移に関与するタンパク質の遺伝子、プロテアーゼの遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞周期調節遺伝子、ＥＧＦ及びＥＧＦ受容体を発現する遺伝子、多剤耐性遺伝子、例えばＭＤＲ１遺伝子があげられる。

より具体的には、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞性タンパク質（例えば核、細胞質、膜貫通、又は膜結合タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。別の実施態様では、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば細胞外基質タンパク質又は分泌タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。本明細書において、タンパク質の「アミノ酸配列を特定する」との語は、ｍＲＮＡ配列が、遺伝暗号の規則にしたがって、アミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下の種類のタンパク質を、例示のために列挙する：発生タンパク質（例えば接着分子、サイクリン・キナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、Ｗｉｎｇｅｄらせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカイン及びその受容体、増殖因子／分化因子及びその受容体、神経伝達物質及びその受容体）；オンコジーンをコードするタンパク質（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ Ｉ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）；腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢ Ｉ、ＴＰ５３、及びＷＴＩ）；及び酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ（ｐｙｒｏｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ）、ＡＴＰアーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン・シンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、顆粒結合デンプン・シンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ（ｈｅｒｎｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ）、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポオキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン・シンターゼ、オクトピン・シンターゼ、ペクチン・エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ）。

１つの態様では、本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、病的状態と関連するタンパク質のアミノ酸配列を特定する。例えば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（例えば宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝播、又は感染維持に関与するウイルスタンパク質）、あるいは病原体の宿主への進入、病原体もしくは宿主による薬剤代謝、病原体ゲノムの複製もしくは組込み、宿主における感染の確立もしくは伝播、又は次世代の病原体の組み立てを促進する宿主タンパク質である。病原体には、ＲＮＡウイルス、例えばフラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルス、あるいはＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヘパドナウイルス、又はその他があげられる。他の病原体には、細菌、真菌、ぜん虫、住血吸虫及びトリパノソーマがあげられる。他の種類の病原体には、哺乳動物転移因子が含まれうる。あるいは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質又は自己免疫疾患関連タンパク質である。

標的遺伝子は、いかなる生物に由来、また含有されていてもよい。生物は、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス又は真菌である。例えば、本明細書に援用される米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。

別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡを含む薬剤組成物を提供する。ｄｓＲＮＡ試料を適切に処方して、そして遺伝子サイレンシングが起こる場合には、試料の十分な部分が、細胞に進入して、本サイレンシングを誘導できるいずれかの手段によって、ｄｓＲＮＡ試料を細胞の環境に導入する。ｄｓＲＮＡのための多くの処方が当該技術分野で公知であり、作用できるようにｄｓＲＮＡが標的細胞に進入する限り、こうした処方を使用できる。例えば、各々、本明細書に援用される、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５ Ａ１号及び第２００５／００５４５９８ Ａ１号を参照されたい。例えば、ｄｓＲＮＡをリン酸緩衝生理食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液中で処方することもできる。陽イオン性脂質とｄｓＲＮＡの処方を用いて、細胞へのｄｓＲＮＡのトランスフェクションを促進することもできる。例えば、リポフェクチン（本明細書に援用される、米国特許第５，７０５，１８８号）、陽イオン性グリセロール誘導体などの陽イオン性脂質、及びポリリジン（本明細書に援用される、公開ＰＣＴ国際出願ＷＯ ９７／３０３７１）などのポリカチオン性分子を用いることもできる。適当な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、コロラド州ボールダー）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）があげられ、これらはすべて、製造者の指示にしたがって使用できる。

細胞環境にｄｓＲＮＡを導入する方法は、細胞の種類及びその環境に依存することが認識できる。例えば、細胞が液体内で見いだされる場合、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミン等の脂質配合があり、そしてｄｓＲＮＡを細胞の液体環境に直接添加することもできる。また、脂質製剤を、静脈内、筋内、又は腹腔内注射によるか、あるいは経口又は吸入又は当該技術分野で公知の他の技術等で動物に投与することもできる。製剤が、動物、例えば哺乳動物及びより具体的にはヒトに投与するのに適している場合、前記製剤はまた、薬学的に許容しうる。オリゴヌクレオチドを投与するための、薬学的に許容しうる製剤が知られ、用いることもできる。ある例では、卵母細胞での研究のように、ｄｓＲＮＡを緩衝液又は生理食塩水溶液中で処方し、ｄｓＲＮＡを細胞内に直接注入する。ｄｓＲＮＡ二重鎖の直接注入もまたできる。ｄｓＲＮＡを導入するのに適した方法に関しては、本明細書に援用される、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５ Ａ１号を参照されたい。

ｄｓＲＮＡの適当な量を導入できるはずであり、標準的方法を用いて、これらの量を実験的に決定することもできる。典型的には、細胞環境における個々のｄｓＲＮＡ種の有効濃度は、約５０ナノモル以下又は１０ナノモル以下であろうし、あるいは約１ナノモル以下の濃度の組成物を使用することもできる。他の態様では、方法は、約２００ピコモル以下の濃度を利用し、そして多くの状況では、約５０ピコモル以下の濃度さえ使用できる。

十分量のｄｓＲＮＡが細胞に進入してその効果を発揮できるように、ｄＲＮＡ組成物を処方する条件で、細胞が生存可能な細胞外マトリックスいずれかにｄｓＲＮＡ組成物を添加することによって、前記方法を行うこともできる。例えば、前記方法は、液体培地又は細胞増殖培地などの液体に存在する細胞、組織外植片、又は哺乳動物及び特にヒトなどの動物を含む生物全体で使用するのに適している。

該技術分野で現在公知か、又はいずれ開発される、適当な方法のいずれかによって、標的遺伝子の発現を決定することもできる。標的遺伝子の発現を測定するのに用いる方法は、標的遺伝子の性質に依存することが認識できる。例えば、標的遺伝子がタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、その遺伝子に由来するタンパク質又は転写物を示す。こうした例では、標的遺伝子に対応するｍＲＮＡの量を測定することによって、又はそのタンパク質の量を測定することによって、標的遺伝子の発現を決定する。染色又はイムノブロッティングによるか、あるいはタンパク質が測定可能な反応を触媒するならば、反応速度を測定する等で、タンパク質をタンパク質アッセイで測定できる。こうした方法はすべて、当該技術分野で公知であり、使用できる。遺伝子産物がＲＮＡ種である場合、遺伝子産物に対応するＲＮＡの量を決定することによって、発現を測定することもできる。遺伝子発現を検出するためのいくつかの具体的な方法を実施例１に記載する。測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物又は他の適当な供給源物質いずれかに対して行うこともできる。

標的遺伝子の発現が減少しているかどうかの決定は、信頼性があり遺伝子発現の変化を検出可能な、適当ないずれ方法による。典型的には、ｄｓＲＮＡの少なくとも一部が細胞質に進入するように、細胞環境内に、未消化ｄｓＲＮＡを導入し、次いで、標的遺伝子の発現を測定することによって、測定を行う。同一の未処理細胞に対して、同一測定を行い、各測定から得た結果を比較する。

ｄｓＲＮＡを、薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡ及び薬学的に許容しうる担体を含む、薬剤組成物として処方することもできる。薬理学的又は治療的に有効な量は、意図する薬理学的、治療的又は防止的結果を生じるのに有効なｄｓＲＮＡの量をいう。「薬理学的に有効な量」及び「治療的に有効な量」又は単に「有効な量」との語は、意図する薬理学的、治療的又は予防的結果を得るのに有効なＲＮＡの量をいう。例えば、既定の臨床的治療が、疾患又は障害と関連する測定可能なパラメータの少なくとも２０％減少すると有効と見なされるならば、その疾患又は障害の治療のための薬剤の治療的に有効な量は、そのパラメータを少なくとも２０％減少させるのに必要な量である。

「薬学的に許容しうる担体」との語は、治療剤を投与するための担体をいう。典型的な担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせがあげられる。経口投与される薬剤として、薬学的に許容しうる担体には、限定されるわけではないが、薬学的に許容しうる賦形剤、例えば不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、フレーバー剤、着色料及び保存剤があげられる。適当な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びにラクトースがあげられ、一方、コーンスターチ及びアルギン酸が適当な崩壊剤である。結合剤には、デンプン及びゼラチンがあげられ、一方、潤滑剤は、存在する場合、一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。望ましい場合、錠剤を、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの物質でコーティングして、胃腸管における吸収を遅延させる。開示するｄｓＲＮＡ組成物の薬学的に許容しうる担体は、ミセル構造、例えばリポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセル、又はポリマー性ミクロカプセルである。

ポリマー性ナノカプセル又はミクロカプセルは、前記カプセルに被包又は結合したｄｓＲＮＡの細胞への輸送又は放出を促進する。これらには、ポリマー性物質又はモノマー性物質があげられ、特にポリブチルシアノアクリレートがあげられる。物質及び製造法の概要が公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ、１９９１を参照されたい）。モノマー性及び／又はオリゴマー前駆体から、重合／ナノ粒子生成工程で形成されるポリマー性物質は、先行技術から自体公知であり、ナノ粒子を製造する分野の当業者が、通常の技術にしたがって適切に選択できる、ポリマー性物質の分子量及び分子量分布もまた公知である。

静脈内、筋内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣、及び局所（頬側及び舌下を含む）投与を含む非経口経路等の当該技術分野で公知のいずれかの手段によって、本発明の適切に処方された薬剤組成物を投与することもできる。ある実施態様では、静脈内又は腹腔内（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）注入又は注射によって、薬剤組成物を投与する。

一般的に、ｄｓＲＮＡの適当な投薬量単位は、１日あたり、レシピエントのキログラム体重あたり、０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲内、又は１日あたり、キログラム体重あたり、０．０１〜２０マイクログラムの範囲内、又は１日あたり、キログラム体重あたり、０．０１〜１０マイクログラムの範囲内、又は１日あたり、キログラム体重あたり、０．１０〜５マイクログラムの範囲内、又は１日あたり、キログラム体重あたり、０．１〜２．５マイクログラムの範囲内である。ｄｓＲＮＡを含む薬剤組成物を毎日１回投与することもできる。しかし、１日において適当な間隔で投与される、２、３、４、５、６又はそれより多い低用量の投薬単位で治療剤を投与してもよい。その場合、各低用量に含有するｄｓＲＮＡは、総１日投薬単位を得るため、それに応じて、より低量でなければならない。投薬量単位はまた、例えば、数日の期間に渡ってｄｓＲＮＡを、持続し、一貫して放出するような慣用的徐放製剤を用いて、数日に渡る単一用量用に混合する。徐放製剤は当該技術分野で周知である。本態様では、投薬単位は、１日用量に応じた倍数を含む。配合に関わりなく、薬剤組成物は、治療する動物又はヒトにおいて、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のｄｓＲＮＡを含有しなければならない。ｄｓＲＮＡの多くの単位の合計が十分な用量を含有するように、前記組成物を混合する。

細胞培養アッセイ及び動物研究からデータを得て、ヒトに適した投薬量範囲を処方することもできる。本発明の組成物の投薬量は、ＥＤ_５０（既知の方法によって決定されるようなもの）を含む、毒性をほとんど又はまったくない循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用する投薬型及び利用する投与経路に応じて、本範囲内で多様にできる。本発明の方法で用いるいずれの化合物に関しても、まず、細胞培養アッセイから治療的有効用量を概算する。動物モデルにおいて、細胞培養で決定するようなＩＣ_５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するように用量を処方する。こうした情報を用いて、ヒトで有用な用量をより正確に決定する。標準的方法、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって、血漿中のｄｓＲＮＡのレベルを測定する。

他の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現によって起きる疾患に罹患した又はこうした疾患が進行するリスクがある被験者を治療するための方法に関する。本態様では、ｄｓＲＮＡは、細胞増殖及び／又は分化の障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心臓血管障害、肝臓障害、ウイルス疾患、又は代謝障害の１以上を制御するための新規治療剤として機能する。前記方法は、標的遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の薬剤組成物を、患者（例えばヒト）に投与する。特異性が高いため、本発明のｄｓＲＮＡは、疾患細胞及び組織の標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的化する。

疾患予防において、標的遺伝子は、疾患の開始又は維持に必要なもの、あるいは疾患に罹患する、より高いリスクと関連すると同定されているものである。疾患治療において、ｄｓＲＮＡを、疾患を示す細胞又は組織と接触させることもできる。例えば、癌と関連する突然変異遺伝子、又は腫瘍細胞において高レベルで発現されているもの、例えばオーロラ・キナーゼのすべて又は一部と実質的に同一であるｄｓＲＮＡを、癌性細胞又は腫瘍遺伝子と接触させるか、又はこれらの内部に導入する。

細胞性増殖障害及び／又は分化障害の例には、癌、例えば上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、転移性障害又は造血新生物性障害、例えば白血病があげられる。転移性腫瘍は、多数の原発腫瘍型から生じ、こうした腫瘍型には、限定されるわけではないが、前立腺、結腸、肺、乳房及び肝臓由来のものがあげられる。本明細書において、「癌」、「過剰増殖性」、及び「新生物性」との用語は、自律性増殖能、すなわち迅速に増殖する細胞増殖を特徴とする状態の異常な状況にある細胞をいう。これらの用語は、組織病理学的な型又は侵襲性段階に関わりなく、すべての種類の癌性増殖又は発癌プロセス、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織又は臓器を含むことを意味する。増殖性障害にはまた、造血新生物性障害も含まれ、これらには、造血起源の過形成性／新生物性細胞を伴う疾患、例えば骨髄、リンパ系、又は赤血球細胞系譜、又はそれらの前駆体細胞から生じるものがあげられる。

本発明はまた、多様な免疫障害、特に、遺伝子の過剰発現又は突然変異体遺伝子の発現に関連する障害を治療するために用いる。造血障害又は疾患の例には、限定なしに、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む））、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚ループスエリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｃｌｉｔｉｓ）、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症、移植片対宿主病、移植の症例、及びアレルギーがあげられる。

別の実施態様では、本発明は、限定されないが、ヒトパピローマウイルス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ポリオウイルス、及び痘瘡ウイルスを含む、ウイルス疾患を治療する方法に関する。本明細書に記載するように、ウイルスの発現配列を標的化する、本発明のｄｓＲＮＡを調製してウイルス活性及び複製を改善する。前記分子を、動物及び植物両方のウイルス感染組織の治療及び／又は診断に用いる。また、こうした分子を、ウイルス関連癌腫、例えば肝細胞癌の治療に用いる。

本発明のｄｓＲＮＡを用いて、多剤耐性１遺伝子（「ＭＤＲ１」）の発現を阻害する。「多剤耐性」（ＭＤＲ）は、広範に、関連しない化学構造及び異なる作用機構がある、多様な化学治療薬剤に対する耐性のパターンをいう。ＭＤＲの原因は多因子性であるが、ＭＤＲ薬剤の輸送を仲介する膜タンパク質である、Ｐ−糖タンパク質（ＰｇＰ）の過剰発現が、実験室モデルにおいて、ＭＤＲの根本的な最も一般的な改変でる（Ｃｈｉｌｄｓ及びＬｉｎｇ、１９９４）。さらに、Ｐｇｐの発現は、ヒト癌、特に白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、及び柔組織肉腫におけるＭＤＲの発展と結びついている（Ｆａｎら）。近年の研究によって、ＭＤＲ関連タンパク質（ＭＲＰ）（Ｃｏｌｅら、１９９２）、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）（Ｓｃｈｅｆｆｅｒら、１９９５）及びＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの突然変異（Ｂｅｃｋ、１９８９）を発現する腫瘍細胞もまた、ＭＤＲを生じうることが示された。

本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の慣用的な技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， 定期的な最新版を含む）；Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， オックスフォード）；Ａｎａｎｄ， １９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ及びＦｉｎｋ， １９９１；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｊａｋｏｂｙ及びＰａｓｔａｎ， １９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；全書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ監修， １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， 第１５４巻及び第１５５巻（Ｗｕら監修）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ロンドン， １９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修， １９８６）；Ｒｉｏｔｔ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第６版， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， オックスフォード， １９８８；Ｈｏｇａｎら， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ， Ｍ．， Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ． Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ），（第４版， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ユージーン， ２０００）を参照されたい。

本発明は、以下の実施例を参照することによって記載され、前記実施例は例示のために提供され、そしていかなる態様においても、本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野に周知の標準的技術又は以下に具体的に記載する技術を利用した。

二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成及び精製
標準的技術（Ｄａｍｈａ及びＯｌｇｉｖｉｅ、１９９３；Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５）を用い、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護し、そしてＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で脱塩した。１５分間工程の直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍｘ２５ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上、イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて、オリゴマーを精製した。勾配は、９０：１０緩衝液Ａ：Ｂから、５２：４８緩衝液Ａ：Ｂで変化させて、緩衝液Ａは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５であり、そして緩衝液Ｂは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌであった。２６０ｎｍで試料をモニターし、そして全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、そして凍結乾燥した。

Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フラートン）上、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、各オリゴマーの純度を決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径であり、そしてｓｓＤＮＡ １００Ｒゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有した。典型的には、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場で泳動し、そして２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出した。Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから、変性Ｔｒｉｓ−ホウ酸−７Ｍ尿素泳動緩衝液を購入した。以下に記載する実験に使用するため、ＣＥによって評価した際、オリゴヌクレオチドは少なくとも９０％純粋であった。製造者が推奨するプロトコルにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ^ＴＭ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）上で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって、化合物同一性を検証した。すべてのオリゴマーの相対的分子量は、予測した分子量の０．２％以内であった。

二重鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５からなる二重鎖緩衝液中、１００μＭ濃度に再懸濁した。相補的センス鎖及びアンチセンス鎖を等モル量で混合して、５０μＭ二重鎖の最終溶液を得た。試料を９５℃に５分間加熱し、そして使用前に室温に冷却させた。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを凍結乾燥して保存するか、又はヌクレアーゼ不含水中で−８０℃で保存した。

命名法
一貫性を保つため、明細書及び実施例全体で、以下の命名法を使用している。二重鎖の名称は、オリゴマーの長さ及び突出の存在又は非存在を示す。「２１＋２」二重鎖は、どちらも長さ２１ヌクレオチドの２つのＲＮＡ鎖を含有し、２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖ともいい、そして３’で２塩基が突出する。「２１−２」設計は、５’で２塩基が突出する２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖である。２１−０設計は、突出がない（平滑）２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖である。「２１＋２ＵＵ」は、３’で２塩基が突出し、そして３’末端の２塩基がどちらもＵ残基である（標的配列とのミスマッチを生じうる）２１量体二重鎖である。「２５／２７」は、２５塩基のセンス鎖で３’で２塩基が突出する２７塩基のアンチセンス鎖がある非対称性二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基のセンス鎖及び２５塩基のアンチセンス鎖がある非対称性二重鎖である。

２５量体の効力の増進
本実施例は、驚くべきことに、２５ヌクレオチド以上の長さの鎖のｄｓＲＮＡが、哺乳動物系で、既知の２１量体〜２３量体のｓｉＲＮＡよりも効力が高まることを示す。

バクテリオファージＴ７のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により作製したｄｓＲＮＡ（Ｋｉｍら、２００４）の異なる５’端及び３’端の構造の影響を調べていたとき、いくつかが、同一標的部位に向けられる合成２１量体ｓｉＲＮＡよりも効力が強く、そして本特性が長さに相関することが観察された。本現象をさらに検討するため、我々は、異なる長さ及び設計の化学的に合成した二重鎖ＲＮＡのサイレンシング特性を体系的に研究した。

細胞培養、トランスフェクション、及びＥＧＦＰアッセイ
トランスフェクションの１日前、ＤＭＥＭ培地中、６０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）になるように、ＨＥＫ２９３細胞を２４穴プレートに分割した。各ＲＮＡのアリコットを添加した後、レポーター・ベクターを含有する５０μｌのＯｐｔｉ培地を添加した。次に、１．５μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０μｌのＯｐｔｉ培地を混合し、そして１５分間インキュベーションした。次いで、細胞を０．４ｍｌのＤＭＥＭ培地に添加した。トランスフェクション効率を標準化するため、各アッセイは、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）・ルシフェラーゼ又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）レポーター・プラスミド（他のアッセイすべて）と共に、標的及び／又は二重鎖ＲＮＡの同時トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼ・アッセイに関しては、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがって、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏルシフェラーゼ・アッセイキットを用いた。ＲＦＰ同時トランスフェクションに関しては、示す量のＥＧＦＰレポーター・プラスミド（ｐＬＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を２０ｎｇのＲＦＰレポーター・プラスミド（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１、ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）と共にトランスフェクションした。２４時間後、蛍光顕微鏡でＲＦＰ発現をモニターした。トランスフェクション効率は、＞９０％であった（ＲＦＰ発現によって評価）実験のみを評価した。２４時間後、ＥＧＦＰ発現を測定した。ＦＡＣＳ（生存細胞）によって、又は蛍光光度計読み取り値（細胞抽出物）によって決定したＥＧＦＰ蛍光細胞の中央値数から、ＥＧＦＰ発現を決定した。

ＥＧＦＰを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたＥＧＦＰアッセイに関しては、励起フィルターＤ４９０及び発光フィルターＤ５２０を用い、ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ蛍光光度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、測定値を決定した。トランスフェクション前、細胞を２４穴プレートに、およそ３０％の集密度になるように播種した。第０日、上記のように、細胞にトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの１日後、培地を交換した。第３日に、最初のＥＧＦＰアッセイを行った。抽出物調製のため、１ｘ１０^５細胞を採取し、そして第６日のＥＧＦＰアッセイのため、１ｘ１０^４細胞をさらに増殖させた。第６日及び第９日に、同一方法を反復した。

ＥＧＦＰの抽出物測定値を以下のように得た：１ｘ１０^５細胞を３００μｌのＰＢＳに懸濁し、そして１０秒間超音波処理した後、２分間微量遠心分離した。蛍光測定のため、上清を用いた。未処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した抽出物に比較して、ＥＧＦＰ発現のパーセンテージを決定した。

核酸試薬
レポーター系は、トランスフェクション・プラスミド・ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）として、又はＮＩＨ ３Ｔ３細胞株の安定形質転換体としてのいずれかのＥＧＦＰを使用した。Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ５５７６３のＥＧＦＰのコード配列を表１に示す。ＡＴＧ開始コドン及びＴＡＡ停止コドンを太字フォントで強調し、そして本実施例及び他の実施例における、ｓｉＲＮＡ試薬の標的部位を下線で示す。

表１
ＥＧＦＰのヌクレオチド配列

本実施例に関して、ＥＧＦＰ中のｓｉＲＮＡターゲティングに用いた部位１は：
部位１：５’ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣ３’（配列番号２）であった。

実施例１に記載したように、ＲＮＡ二重鎖を合成して調製した。ＥＧＦＰ部位１を標的化するＲＮＡ二重鎖を表２に概説する。いくつかの配列は、センス鎖の３’端に位置する二ヌクレオチド配列「ＵＵ」であった（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｈｏｈｊｏｈ、２００２）。３’末端「ＵＵ」を含むことから生じるミスマッチ、又はミスマッチが意図的に配置される箇所を太字及び下線で強調する。

表２
オリゴヌクレオチド試薬、ＥＧＦＰ部位１の概説

結果
ＥＧＦＰ中の「部位１」を標的化するモデル系（Ｋｉｍら、２００３）において、相対的な効力に関して、３’突出、５’突出又は平滑端を含有する多様な長さの合成ＲＮＡ二重鎖の広範なセットを試験した。５０ｎＭの多様なＲＮＡ二重鎖を用いて最初のトランスフェクションを行った（図１Ａ）。トランスフェクションをナノモル未満の濃度で行った場合にのみ、より長い二重鎖の真の効力が示された。２００ｐＭ（図１Ｂ）及び５０ｐＭ（図１Ｃ）の二重鎖ＲＮＡ濃度を用いると、長さと共に効力が高まることが観察された。平滑端、５’突出端及び３’突出端は、同様の効力であった。ＥＧＦＰを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞においてでさえ、より長い二重鎖ＲＮＡの効力が高まることが観察された（図１Ｆ）。２７ｎｔより長い二重鎖を合成してＲＮＡｉ有効性を試験した（図１Ｄ）。２７ｂｐの長さの二重鎖で、最大阻害活性が見られた（図１Ｄ）。二重鎖が長くなるほど、機能性ＲＮＡｉ活性は漸進的に損失し、そして４０〜４５ｂｐまでには、試験した濃度では完全に不活性になり、これはまた、ダイサーによるこれらの二重鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断が劣っていることとも相関した（図１Ｅ）。

ダイサー基質
本実施例は、ｄｓＲＮＡがダイサー基質として機能するか否かを決定する方法を示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断アッセイ
ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１単位の組換えヒト・ダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の２０μｌ中で２４時間インキュベーションした。各反応の３μｌのアリコット（１５ｐｍｏｌ ＲＮＡ）を、１５％非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ＧｅｌＳｔａｒ（Ａｍｂｒｅｘ）で染色し、そしてＵＶ励起を用いて視覚化した。

結果
２１ｂｐ〜２７ｂｐのＲＮＡ二重鎖を組換えヒト・ダイサーとインキュベーションすると、２３量体、２５量体及び２７量体二重鎖の切断が生じたが、２１量体二重鎖は切断されなかった（図２Ａ）。本反応の反応速度が遅いため、供給者に推奨されるｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下では、ダイサー切断の相対的な効率を決定できなかった。３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡは、ダイサーの優れた基質となるため、マイクロＲＮＡプロセシング酵素であるＤｒｏｓｈａによってあらかじめプロセシングされる必要がありうるという可能性を別にして、これらの、ｄｓＲＮＡが長いとダイサーの基質としては劣り、そしてまたＲＮＡｉの誘発因子として劣るのはなぜであるのかは、説明できない。

ダイサー活性に対する末端修飾の影響
実施例３に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断アッセイを用いて、ｄｓＲＮＡの末端修飾の影響を試験した。

２７量体二重鎖に関して、ダイサー活性及びＲＮＡｉサイレンシングを誘発する能力に対する、フルオレセイン末端修飾の影響を試験した。６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）が５’端に付着したセンス（Ｓ）鎖、３’端に付着したＳ鎖、５’端に付着したアンチセンス（ＡＳ）鎖及び３’端に付着したＡＳ鎖を用いて、ＥＧＦＰＳ１部位に対して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。対を組み合わせて、二重鎖ＲＮＡを作製した（図２Ｂ）。二重鎖３は、非修飾野生型ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０二重鎖であった。６ＦＡＭ修飾二重鎖の構造を表２に示す。ＲＮＡ二重鎖を、組換えヒト・ダイサーと２４時間インキュベーションし、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、染色し、そしてＵＶ励起によって視覚化した（図２Ｃ）。ＲＮＡ二重鎖が２４時間のインキュベーション中に完全に切断された（図２Ａ）始めの実験とは異なり、修飾した二重鎖はすべて、ダイサーによる切断に対してある程度の抵抗性を示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー反応において、非修飾野生型配列（二重鎖３）のみが、完全に切断された。Ｓ鎖上に３’−６ＦＡＭ及びＡＳ鎖上に３’−６ＦＡＭがある二重鎖（二重鎖５）は、これらの条件下で、切断に完全に抵抗性であった。ＥＧＦＰ同時トランスフェクションアッセイにおいて、２００ｐＭ ＲＮＡ濃度を用いて、これら５つの二重鎖の機能効力を比較した（図２Ｄ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断に関して見られるパターンと平行して、６ＦＡＭ修飾端がある２７量体二重鎖はすべて、ＥＧＦＰ発現が減少すると、非修飾二重鎖より、効力が低かった。組換えダイサーによる部分的切断を示した二重鎖１、２及び４は、ＲＮＡｉ活性が３〜６倍に減少した。二重鎖５は、組換えダイサーによる切断を示さず、ＲＮＡｉ活性は最小であり、細胞培養で、ダイサーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断及びＲＮＡｉの相対的有効性の間に直接の相関関係が確立された。

ダイサーによるｉｎ ｖｉｖｏプロセシング
本実施例は、２７量体ｄｓＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでダイサーによってプロセシングされることを確認する。

２７量体ＲＮＡの細胞内プロセシングに関するアッセイ
上記のように、６穴プレート中、１０ｎＭで、ＲＮＡ二重鎖をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。１４時間後、総ＲＮＡを以下のように調製した。最初に、２０μｇの総ＲＮＡを７５℃で１０分間加熱し、そして^３２Ｐ ５’端標識オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’；配列番号７３）と混合し、そして１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、２４℃でハイブリダイズさせた。７．５％非変性ポリアクリルアミドゲル上に試料を装填し、そして２００Ｖ、４℃で３時間分離し、そしてゲルをＸ線フィルムに曝露した。^３２Ｐ末端標識２７量体及び２１量体二重鎖ＲＮＡオリゴをサイズ標準として用いた。

結果
２７量体ｄｓＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでダイサーによってプロセシングされることを確認するため、ＨＥＫ２９３細胞に、１０ｎＭの二重鎖３（未修飾）又は二重鎖５（両方の３’端が６ＦＡＭで修飾されている）をトランスフェクションした。１４時間後、総ＲＮＡを単離し、そして^３２Ｐ末端標識２１量体プローブオリゴ（Ｓ鎖）とハイブリダイズさせた。非変性ＰＡＧＥによってＲＮＡを分離し、そしてオートラジオグラフィーで視覚化した（図２Ｅ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断で見られる結果と同様、二重鎖３（未修飾２７量体）をトランスフェクションした細胞から調製したＲＮＡにおいて、２１量体二重鎖マーカーと共に、より小さい種が移動するのが観察され、これはダイサー切断産物と一致した。本２１量体の種は、二重鎖５（３’末端で修飾された２７量体）をトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡでは検出されなかった。

ｄｓＲＮＡの効力
本実施例は、ダイサーによる２７量体の潜在的な切断産物の効力を調べる。
ダイサーによる２７量体の切断は、切断がどこで起こるかに応じて、多様な別の２１量体を生じる；これらの２１量体の１つ又は混合物が、比較のための標準として用いた特定の２１量体よりも、有意により強力である可能性もある。本可能性を試験するため、伝統的な２１＋２設計を用いて、アンチセンス鎖に沿って１塩基段階でウォーキングし、ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０二重鎖に由来しうる、７つの異なる２１量体を合成した。ＨＥＫ２９３細胞同時トランスフェクションアッセイにおいて、ＲＮＡｉ活性に関して、これらの７つの二重鎖を、個々に又はプールとして試験した（図３Ａ）。５０又は２００ｐＭの濃度では、個々の２１量体二重鎖も、また７つの２１量体二重鎖のプールしたセットも、２７量体二重鎖に匹敵する活性を示さなかった。トランスフェクション前に２７量体をｉｎ ｖｉｔｒｏでダイサー切断すると、有効性は有意に高まらなかった（図３Ｂ）。他の対照として、中央に配置した４つの連続ミスマッチ塩基を宿する突然変異ＥＧＦＰ ２７量体二重鎖（表２）、ＥＧＦＰＳ１−２７＋０／ｍｕｔをトランスフェクションした。ミスマッチは実質的に、いかなるＲＮＡｉ活性も排除した（図３Ｂ）。

ダイサー切断産物の分析
本実施例は、質量分析によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断産物を分析した。

エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析
ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータプロセシング・ソフトウェア及びＰａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４ ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）からなるオリゴＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ）を用いて、ダイサーでの処理前及び処理後の二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を行った。質量分析計への注入前に液体クロマトグラフィー工程を使用すると（ＬＣ−ＭＳ）、核酸と複合体形成している陽イオンのほとんどが除去され；ある程度のナトリウムイオンはＲＮＡに結合したままであることもあり、そして少量の＋２２又は＋４４種として視覚化され、水素に対するナトリウムの置換で見られる正味質量獲得を反映する。

結果
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）を用いて、ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０二重鎖と組換えダイサーをｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションすることによって実際に産生される種を同定した（図４Ａ及び４Ｂ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断から生じうる各消化産物に関して、計算上の質量を表３に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断産物のＥＳＩ ＭＳ分析は、本酵素の既知の活性と一致する。

表３
ダイサー・プロセシングによって、２７量体二重鎖から得られる、ありうる２１量体二重鎖の分子量

^＊２７量体の分子量は、ヒドロキシル端がある、元来の化学合成二重鎖である。２１量体の計算上の重量は、ダイサー・プロセシング後、各鎖上に５’リン酸塩があると仮定する。

^＊＊は、図４Ｂ中の視覚化されたピークと一致した質量を示す。

２７量体ｄｓＲＮＡの阻害特性の他の特定
ＥＧＦＰ標的を安定して発現する細胞において、２７量体ｄｓＲＮＡの阻害特性をさらに特定するため、ＥＧＦＰを発現する安定トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞に、２１＋２及び２７＋０ ｄｓＲＮＡ二重鎖（どちらも５ｎＭ）をトランスフェクションした。遺伝子抑制期間の定量的な概算値を得るため、経時実験を行って、トランスフェクション２日後、４日後、６日後、８日後及び１０日後のＥＧＦＰ発現を観察した。細胞抽出物を調製し、そして蛍光光度計を用いて、ＥＧＦＰ蛍光に関して測定した（図５Ａ）。２１＋２ ｓｉＲＮＡを用いると、ＥＧＦＰ抑制は、およそ４日間続き、先の観察と一致し（Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖら、２００４）、一方、２７＋０ ｄｓＲＮＡでの阻害は、１０日まで持続した。「高機能性」２１＋２ ｓｉＲＮＡクラスが、類似のサイレンシング期間延長を示すことが報告されている（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４）；が、これらの配列はまれで、発見又は予測することが困難である。２７量体ｄｓＲＮＡ設計を用いると、より多様な標的部位で、ＲＮＡｉはより長く、より強力になる。

部位選択に対する２７量体ｄｓＲＮＡの影響
あらゆる遺伝子の発現を体系的に阻害するツールとしてＲＮＡｉを用いる際にしばしば起こる問題は、すべての標的部位が、ｓｉＲＮＡによる抑制に等しく感受性ではないため（Ｓｈｅｒｅｒ及びＲｏｓｓｉ、２００４）、有効な部位を予測するためには、複雑な設計アルゴリズムが要求されることである（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４；Ｕｉ−Ｔｅｉら、２００４；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ及びＰｒｙｄｚ、２００４）。したがって、我々は、２７量体ｄｓＲＮＡの効力増加が、伝統的な２１量体ｓｉＲＮＡを用いた際には活性でない部位を有効に標的化するか否かを検討した。どちらも、標準的ｓｉＲＮＡを用いると、ＲＮＡｉに不応性であることが示された、ＥＧＦＰ中の２つの部位（「ＥＧＦＰ−Ｓ２」及び「ＥＧＦＰ−Ｓ３」）（Ｋｉｍｅ及びＲｏｓｓｉ、２００３）に対して、２１＋２及び２７＋０の設計の二重鎖ＲＮＡを作製した。

核酸試薬
上記配列番号１のように、レポーター系はＥＧＦＰを使用した。ＥＧＦＰ中の部位２（不良部位１ともいう）及び部位３（不良部位２ともいう）を標的化した。実施例１で記載したように、ＲＮＡ二重鎖を合成して調製した。本実施例のため、ＥＧＦＰにおいて、ｓｉＲＮＡ標的化に用いた部位２及び部位３は：
部位２：５’ＵＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣＡＡＧＵＣＣＧＣＣＡＵＧ３’（配列番号７４）及び
部位３：５’ＵＧＡＡＧＵＵＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＵＧＧＵＧＡＡＣＣＧＣＡＵ３’（配列番号７５）であった。

ＥＧＦＰ部位２及びＥＧＦＰ部位３を標的化するＲＮＡ二重鎖を表４に概説する。
表４
オリゴヌクレオチド試薬、ＥＧＦＰ部位２の概要

結果
１ｎＭ及び１０ｎＭの同時トランスフェクションアッセイ形式（図５Ｂ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に二重鎖をトランスフェクションした。これらの用量では、標準的２１＋２ ｓｉＲＮＡは、どちらの部位でも無効であり、一方、２７量体ｄｓＲＮＡは、ＥＧＦＰ発現を、ＥＧＦＰ−Ｓ２で８０〜９０％減少し、そしてＥＧＦＰ−Ｓ３で５０％（１ｎＭ）及び８０％（１０ｎＭ）減少した。ダイサー基質ｄｓＲＮＡの効力増加にもかかわらず、ＲＮＡｉに関して、最も高感度な標的を発見するには、標的部位の実験的な試験がいまだに有用である。これに関して、いくつかの２７量体のダイサー産物が、機能が劣るｓｉＲＮＡを生じたことは重要である。ダイサー基質優先性をよりよく理解することによって、所望の２１量体を生じるであろう基質ＲＮＡを設計することができるはずである。我々は、２７量体の一方の端のみにある２塩基の３’突出が、ダイサーを優先的に導いて、２塩基の３’突出の２１〜２３ｎｔ上流を切断させることを観察している。

本実施例は、本発明のｄｓＲＮＡが、公知の方法によって、以前は、劣った標的と見なされていたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を効率的に標的化できることを示す。したがって、本発明の方法を用いると、ＲＮＡｉのための部位選択及び設計基準が簡素化される。本実施例はまた、センス鎖の３’末端に、ミスマッチを意図的に配置すると、２７量体二重鎖の効力が高まることも示す。

他の遺伝子に対する２７量体ｄｓＲＮＡの影響
２７量体ｄｓＲＮＡの効力増加が、レポーター構築物を標的化するアーチファクトでないことを確かめるため、我々は、２つの内因性転写物、ヒトｈｎＲＮＰ Ｈ ｍＲＮＡ（Ｍａｒｋｏｖｔｓｏｖら、２０００）及びＬａタンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｗｏｌｉｎ及びＣｅｄｅｒｖａｌｌ、２００２）を標的化した。

ｈｎＲＮＰ Ｈ及びＬａに対するＲＮＡｉアッセイ
６穴プレート中に、３０％集密度になるように、ＨＥＫ２９３細胞をプレーティングした。翌日、示した量のｄｓＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、そして翌日、培地を交換した。トランスフェクション７２時間後、３００μｌのＰＢＳ中に細胞を採取した。ＥＧＦＰアッセイに関して上記のように抽出物を調製した。ウェスタンブロットのため、２μｌの細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填した。ウサギ・ポリクローナル抗ｈｎＲＮＰ Ｈ抗体（Ｍａｒｋｏｖｔｓｏｖら、２０００）、及びアルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化した抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、内因性ｈｎＲＮＰ Ｈを検出した。マウス由来抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）及びアルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化した抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、β−アクチンを検出した。ノーザンブロット分析のため、採取した細胞をＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｂ）と混合し、そして製造者のプロトコルにしたがって総ＲＮＡを抽出した。６％変性ポリアクリルアミドゲル中でＲＮＡを電気泳動して、ナイロン膜に転写し、そして^３２Ｐ末端標識オリゴ（Ｌａ、５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴ−３’（配列番号８４）；β−アクチン、５’−ＧＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧ−３’（配列番号８５））で探査した。１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（１ｍｌ ５０ｘデンハルト、３ｍｌ ２０ｘＳＳＰＥ、０．５ｍｌ １０％ＳＤＳ）中、３７℃で３時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＰＥを用いて、３７℃で３回、ブロットを洗浄した。

核酸試薬
ヒトヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ（ｈｎＲＰＨ）ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５５２０）のコード配列を表５に示す。ＡＴＧ開始コドン及びＴＡＡ停止コドンを太字フォントで強調し、そしてｓｉＲＮＡ試薬の標的部位を下線で示す。

表５
ＨＮＲＰＨのヌクレオチド配列

Ｌａタンパク質ｍＲＮＡのコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５５２０）を表６に示す。ＡＴＧ開始コドン及びＴＡＡ停止コドンを太字フォントで強調し、そしてｓｉＲＮＡ試薬の標的部位を下線で示す。

表６
Ｌａタンパク質のヌクレオチド配列

実施例１に記載したように、ＲＮＡ二重鎖を合成して調製した。ＨＮＲＰＨ１を標的化するＲＮＡ二重鎖を表７に概説する。
表７
オリゴヌクレオチド試薬の概説

結果
ヒトｈｎＲＮＰ Ｈ ｍＲＮＡ（ウェスタンブロッティングによって分析）及びＬａタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ノーザンブロッティングによって分析）において、ランダムに選択した部位を標的化するため、ＲＮＡ二重鎖を合成した（図５Ｃ及び５Ｄ）。両方の標的に関して、２７量体の二重鎖は、これらのメッセージを標的化する２１量体ｓｉＲＮＡより強力であった。

２７量体の配列特異性
２７量体ｄｓＲＮＡの配列特異性に関する試験として、ＥＧＦＰ標的ｍＲＮＡに対して１つ、２つ又は３つのミスマッチがある、一連の２７＋０ ｄｓＲＮＡを合成して同時トランスフェクションアッセイにおいて、０ｎＭ、１ｎＭ及び２００ｐＭの濃度で試験した（図６）。突然変異２７＋０ ｄｓＲＮＡの配列を表２に示す。２００ｐＭでは、各ミスマッチ配列は、野生型２７量体ｄｓＲＮＡより強力でなく；三重ミスマッチ２７量体ｄｓＲＮＡは、試験したすべての濃度で、ＲＮＡｉを誘発するのに完全に無効であった。ＥＧＦＰの「部位２」を標的化する２７量体ｄｓＲＮＡを用いて、類似の結果を得た。

インターフェロン応答の欠如
本実施例は、本発明のｄｓＲＮＡ二重鎖が、インターフェロン応答を活性化しないことを示す。

インターフェロン及びＰＫＲアッセイ
上記のように、２９３細胞に２０ｎＭの各ＲＮＡをトランスフェクションした後、２４時間後に培地を収集し、そして上記のように、インターフェロンα及びβのＥＬＩＳＡアッセイに用いた（Ｋｉｍら、２００４）。上記のように、ＰＫＲ活性化アッセイを行った（Ｇｕｎｎｅｒｙ及びＭａｔｈｅｗｓ、１９９８）。示したＲＮＡの同時インキュベーションによって、溶解物中のＰＫＲをまず活性化し、そして自己キナーゼ反応によって放射標識した。次いで、分析のため、放射標識ＰＫＲを免疫沈降した。あらかじめ活性化しない細胞溶解物中のＰＫＲ活性を決定するため、ｄｓＲＮＡを省いた。反応を３０℃で２０分間インキュベーションした。ポリクローナル抗体を用いて、反応由来のＰＫＲを免疫沈降した。ポリクローナル抗体を反応に添加して、次いでこれを氷上に１時間置き、その後、ＩＰＰ５００（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）中の１０％プロテインＡ−セファロース５０μｌを添加した。本混合物を４℃で３０分間振盪した。プロテインＡ−セファロース・ビーズを１ｍｌのＩＰＰ１００緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）で５回洗浄した。最後の洗浄後、タンパク質試料緩衝液中でビーズを煮沸してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に装填した後、オートラジオグラフィーを行った。

結果
より長いｄｓＲＮＡを使用する際、潜在的な問題は、ＰＫＲの活性化及びインターフェロンの誘導である（Ｍａｎｃｈｅら、１９９２）。したがって、我々は、トランスフェクションした２７量体ｄｓＲＮＡが、インターフェロン−α（図７Ａ）又はインターフェロン−β（図７Ｂ）を活性化するかどうかを評価した。インターフェロン誘導の陽性対照として、以前報告されたように（Ｋｉｍら、２００４）、インターフェロン−α及びβを強力に活性化する、三リン酸含有一本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした。２１＋２ ｓｉＲＮＡ又は２７＋０ ｄｓＲＮＡいずれを用いた場合も、どちらのサイトカインも検出されなかった。本観察は、ＥＧＦＰ−Ｓ２及びＥＧＦＰ−Ｓ３部位に特異的な２つの他の２７量体にも該当した。上記のように（Ｇｕｎｎｅｒｙ及びＭａｔｈｅｗｓ、１９９８）、細胞溶解物中のＰＫＲ活性化もまたアッセイした。示したＲＮＡで溶解物を処理し、その後、免疫沈降した。陽性対照の長いｄｓＲＮＡはＰＫＲ活性化を誘発したが、より短いＲＮＡはいずれもＰＫＲを活性化しなかった（図７Ｃ）。

非対称性２７量体二重鎖設計及び塩基修飾により、ダイシング・パターンが影響を受けて２７量体の知能的設計が可能となる
本実施例は、２７量体に対するダイサー作用によって、多数の種が産生されること、２７量体の設計及び／又は塩基修飾の包含により、これらの分解パターンがおこり、不均一性が制限され、最終産物を予測できることを示す。

実施例６、図３Ａ及び３Ｂにおいて、ＥＧＦＰＳ１ ２７量体二重鎖に対するダイサー作用によって産生する個々の２１量体はすべて、ＥＧＦＰを抑制する際に、２７量体二重鎖よりも、強力でないことが示された。にもかかわらず、どの２１量体が産生されるかということが、最終的な効力に影響を及ぼしうる。エレクトロスプレー質量分析アッセイを用いて、どの２１量体が、ダイサーによる２７量体基質ＲＮＡの酵素消化から生じる実際の産物であるかを決定した。２７量体のダイサー消化から１より多い２１量体が生じる。ダイシング・パターンを調節して、知能的設計をすることができる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏダイシング反応のエレクトロスプレー質量分析アッセイ
ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１単位の組換えヒト・ダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を含む、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の２０μｌ中で１２〜２４時間インキュベーションした。ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータプロセシング・ソフトウェア及びＰａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４^ＴＭ ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、カリフォルニア州オーバーン）からなるオリゴＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ、ニュージャージー州プリンストン）を用いて、ダイサーでの処理前及び処理後、二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を行った。質量分析計への注入前に液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）工程を使用すると、核酸と複合体形成している陽イオンのほとんどが除去され；ある程度のナトリウムイオンはＲＮＡに結合したままの場合もあり、そして少量の＋２２又は＋４４種として視覚化されて、水素に対するナトリウムの置換で見られる正味質量獲得を反映する。本アッセイの正確性は、本サイズのオリゴヌクレオチドではほぼ＋／−２ダルトンである。

結果
ＥＧＦＰＳ１−２７＋０二重鎖をダイサーで消化して、そして消化前（図８Ａ）及び消化後（図８Ｂ）のマススペクトルを得た。一般的に、ダイサーは、２７量体二重鎖を、５’−リン酸塩を含む、長さ２１量体の断片に切断する。通常、より少量の２２量体もまた生成する。ときには、少量の２０量体及び２３量体もまた、観察される。観察された質量を出発配列と比較することによって、本ダイシング反応において、３’に２塩基の突出及び５’−リン酸塩を含む４つの二重鎖が産生したと推定できる。これらの種は、２つの主要な切断産物に相当し、どちらも２１量体及び２２量体の二重鎖を生じた。小文字「ｐ」はリン酸基に相当する。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断から生じる各消化産物に関して、計算上の質量を表８に示す。

表８
ダイサー・プロセシングにより、２７量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量

実施例２、図１Ａ〜１Ｃにおいて、平滑端二重鎖及び５’に突出がある二重鎖は、３’に突出がある二重鎖と同様か又はより高い効力を示すことが示された。これらの研究において、二重鎖の両端は対称性であった（すなわち両端が平滑であるか、両端の３’が突出しているか、又は両端の５’が突出していた）。同様の研究において、一方の端に２塩基のミスマッチがある平滑２７量体二重鎖が、試験した対称性平滑種、３’突出種、又は５’突出種よりも効力が高いことが見出された。一方の端に２塩基のミスマッチがある平滑二重鎖は、一方の端の３’の２塩基が突出し、そして他方の端が平滑である非対称性二重鎖の態様を模倣する。この種の非対称性２７量体二重鎖を試験して、これらの効力は高く、ダイシング産物（より少ない不均一性）がより少ないことが見出され、これらのパターンはより予測可能であった。

多くの酵素の二本鎖ＲＮＡ結合ドメインは、しばしば、ＲＮＡを特異的に認識するが、ＤＮＡ又はある修飾ＲＮＡは認識しない。平滑２７量体二重鎖の末端へのＤＮＡ残基の挿入を研究した。一方の鎖の３’端にＤＮＡ残基がある非対称性設計では、ダイシング産物（より少ない不均一性）はより少なく、一般的に、非対称性３’突出設計のものと反対に、パターンは予測可能であった。

一方の側に非対称性に３’が突出し、そして他方の側の３’端に２つのＤＮＡ塩基を有するように、ＥＧＦＰＳ１−２７＋０二重鎖を修飾した。ダイサー・プロセシングを模倣するため、陥凹鎖の３−突出上に５−リン酸塩を配置した。元来の平滑２７量体と並列させて、本設計の最終二重鎖を、以下に示す。小文字「ｔ」は、ＤＮＡ ｄＴ塩基に相当し、小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。計算上の質量を表９に示す。

表９
二重鎖の分子量

消化前（図８Ｃ）及び消化後（図８Ｄ）のマススペクトルを得た。修飾非対称性二重鎖から作製したダイシング産物の分析は、対称性二重鎖に関するものよりはるかに単純であった（図８Ｂを図８Ｄと比較されたい）。単一切断産物が観察されたが、これは、ほとんど２１量体二重鎖で、少量の２２量体も検出された。小文字「ｔ」は、ＤＮＡ ｄＴ塩基に相当し、そして小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。計算上の質量を表１０に示す。

表１０
ダイサー・プロセシングによって、２７量体／２５量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量

単一の２塩基３’突出及びＤＮＡ残基の選択的取り込みを伴う非対称性設計を使用することで、ダイシング反応が単純化されて、単一の主要な切断産物が得られる。本設計により、さらに、ダイシングパターンの予測ができ、特定の所望の２１量体がダイシングから産生できるような２７量体の知能的設計ができる。立証として、ＥＧＦＰＳ１−２７−Ｌ配列と重複する、第２の２７量体二重鎖、ＥＧＦＰＳ１−２７−Ｒを研究した。計算上の質量を表１１に示す。

表１１
二重鎖の分子量

消化前（図９Ａ）及び消化後（図９Ｂ）のマススペクトルを得た。ＥＧＦＰＳ１−２７＋０ Ｒ二重鎖から作製されたダイシング産物を分析すると、ＥＧＦＰＳ１−２７＋０ Ｌ二重鎖で見られたものと類似の複雑なパターンが示された。２つの主要な切断産物が観察され、２１量体及び２２量体種ともに存在した。非常に少量の２０量体種もまた見られた。小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー切断から生じうる各消化産物に関して、計算上の質量を表１２に示す。

表１２
ダイサー・プロセシングによって、２７量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量

ＥＧＦＰＳ１−２７＋０−Ｒ二重鎖を、以下に示す、ＤＮＡ修飾非対称性２５／２７量体二重鎖に変換して、本二重鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏダイシング・アッセイにおいて研究した。小文字「ｃｇ」は、ＤＮＡ ｄＣｄＧ塩基に相当し、そして小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。計算上の質量を表１３に示す。

表１３
二重鎖の分子量

消化前（図９Ｃ）及び消化後（図９Ｄ）のマススペクトルを得た。ＤＮＡ修飾非対称性ＥＧＦＰＳ１−２５／２５ Ｒ二重鎖は、表１４に概説するように、明確な単一のダイシングされた２１量体種を示した。小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。

表１４
ダイサー・プロセシングによって、２５量体／２７量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量

図８Ｄ及び９Ｄの結果を比較すると、２つの異なる非対称性二重鎖ＥＧＦＰＳ１−２７／２５ Ｌ及びＥＧＦＰＳ１−２５／２７ Ｒの消化により、同一２１量体種、ＥＧＦＰＳ１−２１（３）が形成したことがわかる。小文字「ｔ」又は「ｃｇ」は、ＤＮＡ塩基に相当し、そして小文字「ｐ」は、リン酸基に相当する。計算上の質量を表１５に示す。

表１５
二重鎖の分子量

したがって、本発明が教示する、ＤＮＡ修飾非対称性二重鎖設計を使用すると、２７量体ＲＮＡ種に対するダイシング反応が複雑でなくなり、所望の部位を特異的に標的化できるような、ＲＮＡｉで使用する２７量体を知能的に設計することができる。ダイサーで基質２７量体を切断すると、ユニークで予測可能な２１量体が生じるが、ここで２１量体の一方の端は、基質２７量体の３’突出端と一致する。

塩基修飾をした非対称性２７量体二重鎖を設計すると、平滑２７量体よりも効力を改善できる
本実施例は、一方の側に３’で２塩基が突出し、そして他方の側が３塩基の３’−ＤＮＡ修飾がある平滑端である、本発明が教示する新規非対称性ＲＮＡ二重鎖は、平滑２７量体二重鎖よりも効力を改善できることを示す。

実施例１３、図８Ａ〜８Ｄ、及び９Ａ〜９Ｄにおいて、非対称性二重鎖を使用すると、ダイシングが導かれ、単一の主要な２１量体切断産物が生じることが示された。さらに、２７／２５ Ｌ及び２５／２７ Ｒ非対称性二重鎖は共に、ダイシング後、同一の２１量体二重鎖が生じる。同一の２１量体二重鎖が２つの非対称性２７量体の各々から産生されるため、当業者であれば、これらの化合物の効力が機能的に類似であることを予期するであろう。本実施例においては、この場合にあてはまらず、予期せぬことに、２７／２５ Ｌ二重鎖及び平滑２７＋０二重鎖の両方に比較して、２５／２７ Ｒ設計の効力が高いことが示される。

上記方法により、ＥＧＦＰＳ２を標的化するＲＮＡ二重鎖を、ＥＧＦＰ発現プラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションし、そして２４時間インキュベーションした後、ＥＧＦＰ活性をアッセイした。トランスフェクションした二重鎖を表１６に示す。小文字「ｐ」はリン酸基に相当し、そして小文字塩基「ｃｃ」及び「ｇｔ」はＤＮＡ塩基に相当し、一方、大文字塩基はＲＮＡに相当する。

表１６
トランスフェクションした二重鎖

上記実施例９で、ＥＧＦＰＳ２−２１＋２及びＥＧＦＰＳ２−２７＋０ ＲＮＡ二重鎖を使用した。ＥＧＦＰＳ２−２７／２５ Ｌ及びＥＧＦＰＳ２−２５／２７ Ｒ二重鎖は、本発明により設計した新規非対称性ｄｓＲＮＡであり、同一部位、ＥＧＦＰの部位ＩＩを標的化する。実施例１３に記載するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏダイシング・エレクトロスプレー質量分析アッセイにおいて、ＥＧＦＰＳ２−２７／２５ Ｌ及びＥＧＦＰＳ２−２５／２７ Ｒの二重鎖はどちらも、ＥＧＦＰＳ２−２１＋２二重鎖と同様、ダイサーによる消化後、同一２１量体産物を生じる。

トランスフェクション結果を図１０Ａに示す。上記のように、ＥＧＦＰＳ２−２１＋２二重鎖は、ＥＧＦＰ発現を抑制する際に最小の活性があり、一方、２７＋０二重鎖は有意な阻害を示した。２７／２５ Ｌ二重鎖は、２７＋０二重鎖よりわずかにより効力が低く、そして２５／２７ Ｒ二重鎖が最も強力であった。非対称性二重鎖ともに、ダイシング後、同一２１量体種を産生するため、先行技術の教示に基づくと、本知見は予期せぬものである。

ＥＧＦＰＳ１二重鎖、２７／２５ Ｌ及び２５／２７ Ｒを用いて、同様のトランスフェクションを行った。これらの二重鎖は、ダイシング後、同一２１量体産物、ＥＧＦＰＳ１−２１（３）二重鎖を生じる（実施例１３）。トランスフェクションした二重鎖を表１７に示す。小文字「ｐ」はリン酸基に相当し、そして小文字塩基「ｔｔ」はＤＮＡ塩基に相当し、一方、大文字塩基はＲＮＡに相当する。

表１７
トランスフェクションした二重鎖

トランスフェクション後のＥＧＦＰ発現を図１０Ｂに示す。以前と同様、２５／２７ Ｒ二重鎖は、ＥＧＦＰ発現を減少させる際に、２７／２５ Ｌ二重鎖よりも有意により強力であった。平滑端２７量体を２５／２７ Ｒ二重鎖及び２７／２５ Ｌ二重鎖と比較する、類似の実験において、ｄｓＲＮＡの効力が以下のようであることが見出された：
２５／２７ Ｒ二重鎖＞２７／２５ Ｌ二重鎖＞２７量体。

２７量体二重鎖ＲＮＡは、標的化する遺伝子の発現を抑制する際、２１量体二重鎖より、効力がわずかにより高い。平滑２７量体は、ダイシング後、多様な２１量体種を生じる可能性もあり、したがって、平滑２７量体二重鎖の正確な性能は、常に予測できるわけではない。二重鎖の一方の側は３’で２塩基が突出し、そして他方の側が平滑であり、そして３’端に塩基修飾、例えばＤＮＡがある、本発明の新規非対称性二重鎖は、正確な２１量体が生じるような予測可能な方式で、ダイシングが起こるようにする。これらの非対称性二重鎖、すなわち２７／２５ Ｌ及び２５／２７ Ｒはまた、各々、２１量体より強力である。非対称性２５／２７ Ｒ設計は、本発明の最も強力な態様である。

図１１は、本発明の態様の比較を示す。標的遺伝子配列を配列番号１１６に示す。ｓｉＲＮＡ分子として用いる「典型的な」親２１量体を、標的遺伝子配列と並列して示す。センス鎖上の３’に突出を、アンチセンス鎖の３’端に２つのＤＮＡ塩基を含有する、Ｌ２７量体、ｖ２．１を、標的遺伝子及び親２１量体配列と並列させる。ダイシングした切断産物もまた示す。このように並列することにより、これらの前駆体ＲＮＡｉ分子の設計において左のシフトが示される。アンチセンス鎖上の３’に突出を、そしてセンス鎖の３’端に２つのＤＮＡ塩基を含有するＲ２７量体、ｖ２．１もまた、標的遺伝子及び親２１量体配列と並列させる。ダイシングした切断産物もまた示す。このように並列することより、これらの前駆体ＲＮＡｉ分子の設計において右のシフトが示される。

有効用量の決定
本実施例は、哺乳動物において、本発明のｄｓＲＮＡの有効用量を決定するための方法を示す。ｄｓＲＮＡをコードする配列を含有する、治療的に有効な量の組成物（すなわち有効投薬量）は、標的遺伝子の産物の発現を少なくとも１０パーセント阻害する量である。特定の状況では、より高い阻害パーセント、例えば２０、５０、９０、９５、９９パーセント又はそれ以上が望ましい場合もある。典型的な用量には、被験者又は試料重量のキログラムあたり、分子のミリグラム又はマイクログラム量があげられる（例えばキログラムあたり約１マイクログラム〜キログラムあたり約５ミリグラム、キログラムあたり約１００マイクログラム〜キログラムあたり約０．５ミリグラム、又はキログラムあたり約１マイクログラム〜キログラムあたり約５０マイクログラム）。主治医が必要とするように、組成物を、週１回以上、約１〜１０週間、例えば約２〜８週間、又は約３〜７週間、あるいは約４、５、又は６週間投与することもできる。治療的有効量の組成物での被験者の治療には、単回の治療又は一連の治療があげられる。

特定のｄｓＲＮＡ組成物の適当な用量は、調節する発現又は活性に対する分子の効力に応じる。これらの分子の１以上を動物、特に哺乳動物、そして特にヒトに投与して、１以上の標的遺伝子の発現又は活性を調節する。医師は、例えば、最初に相対的に低い用量を処方し、続いて、適当な応答が得られるまで、用量を増加させてもよい。さらに、特定の被験者いずれかに対する特定の用量レベルは、疾患の重症度、以前の治療措置、罹患している他の疾患、活性剤のオフ・ターゲット効果、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、及び食餌、投与時間、投与経路、排出率、薬剤の組み合わせいずれか、並びに調節する発現又は活性の度合いを含む、多様な他の要因に依存する。

標的遺伝子ｍＲＮＡの量（例えばリアルタイムＰＣＲを用いる）又はウェスタンブロット分析によるなどで標的遺伝子がコードする産物の量を測定することによって、治療の有効性をモニターする。さらに、主治医は、患者が罹患している疾患又は障害に関連する症状をモニターし、治療開始前に記録した症状と比較する。

近年の研究で、ＲＮＡｉの効果が、完全に特異的ではなく、ｓｉＲＮＡの濃度に応じたレベルで、望ましくない「オフ・ターゲット」効果が生じうることが明らかである（Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖら、２００４）。新規ダイサー基質ｄｓＲＮＡアプローチにより、伝統的な２１量体ｓｉＲＮＡで要求される濃度より低い二重鎖ＲＮＡを用いることができる。公開されたデータから、「オフ・ターゲット」効果は、２１量体ｓｉＲＮＡを用いた、特定の細胞株で生じることが明らかであるが（Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖら、２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００３）、これらはまた、ナノモル以下の範囲の少量で有効である試薬を用いることによって、最小限にすることもできる（Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖら、２００４）。ダイサー基質ｄｓＲＮＡを用いた「オフ・ターゲット」効果の可能性を調べるため、各々、ＥＧＦＰ部位１を標的化する、ｓｉＲＮＡ ２１量体と２７量体を比較する、マイクロアレイ分析を行った。ＥＧＦＰを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、有効な標的ノックダウンを生じる濃度のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした（図２Ａ、図７Ｄ）。トランスフェクション２４時間後及び４８時間後に、細胞から総細胞ＲＮＡを調製し、そして図７Ｄに記載するようなオリゴヌクレオチド・マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって分析した。分析した１６，２８２マウス遺伝子のうち、対照値を超えるか、又は対照値より低い、２倍以上の上方制御又は下方制御を示したのは、ごく一部であった（図７Ｄ）。２７量体及び２１量体は、有効なＲＮＡｉ濃度で匹敵する結果を生じた。２７量体をより高い２５ｎＭ濃度で用いた際には、上方制御される転写物の数が増加したが、２４時間後対４８時間後、及び５ｎＭ対２５ｎＭで、影響を受ける標的を比較すると、重複していなかった。これらの変化は、特異的な「オフ・ターゲット」効果よりも、調べた１６，２８２遺伝子の間の統計的な散乱とより一致する。ＥＧＦＰ−Ｓ２ ２７＋０二重鎖ＲＮＡを用いて同一アッセイを反復して、匹敵する結果を得た。

２１＋２ ｓｉＲＮＡに比較して、２７量体ｄｓＲＮＡの効力が高かったが、本観察は、以前には報告されていないことは興味深い。他の研究者らが、哺乳動物細胞でのＲＮＡｉ研究のため、２７ｂｐまでのｄｓＲＮＡを用いているが（Ｂｏｈｕｌａら、２００３；Ｃａｐｌｅｎら、２００１）、伝統的な２１＋２二重鎖に比較して、有効性の相違は報告されなかった。先の研究及び我々自身の結果のこのような相違は、単に、試験したｄｓＲＮＡの濃度が相違するためである可能性もある。２１量体ｓｉＲＮＡに関して「優れた」部位は、ナノモル範囲で効力がある（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４）。高濃度のトランスフェクションＲＮＡで、「優れた」部位を試験すると、２１量体ｓｉＲＮＡ及び２７量体ｄｓＲＮＡの間の相違は小さく、そして容易に見過ごしうる可能性が非常に高い。効力の顕著な相違は、低いナノモル又はピコモル濃度で試験することで、最適に示されるが、多くの実験室で日常的に行われるものではない。

これまで、２７量体ｄｓＲＮＡ設計は、試験したすべての部位で、２１＋２ ｓｉＲＮＡに比較して、ＲＮＡｉ効力が高い。しかし、にもかかわらず、本明細書で研究した２７量体のセット内で、同一遺伝子内の異なる標的部位間に、効力はさまざまな範囲である（図３Ｂ）。我々は、完全に最適化された設計規則が存在しなくても、ダイサー基質ｄｓＲＮＡアプローチを用いると、伝統的な２１＋２ ｓｉＲＮＡに比較して、ＲＮＡｉ効力が高まることを示した。さらに、２７量体ｄｓＲＮＡを使用すると、伝統的な２１量体ｓｉＲＮＡの抑制には不応性である既定の配列内のある部位を標的化することができる。ＲＮＡｉを誘発するのに、ダイサー基質ｄｓＲＮＡを使用すると、有効性が高まり、２１＋２適用で必要とされる濃度より少量のＲＮＡで、より長期間にわたりＲＮＡｉが生じるはずである。ダイサー切断をＲＮＡｉ有効性増進と結びつける、我々の結果と一致するものとして、最近、ダイサーの基質である、化学的に合成されたヘアピンＲＮＡが、慣用的なｓｉＲＮＡよりも、より強力なＲＮＡｉ誘導因子であり、そしてさらに、３’での２塩基の突出によりダイサー切断をおこることが示されている（Ｓｉｏｌａｓら、２００５）。

本発明を記載する文脈において（特に請求項の記載において）、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示対照の用語は、本明細書に別に示すか、又は文脈によって明らかに否定しない限り、単数形及び複数形共に含むと見なする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」との用語は、別に記載しない限り、制限のない用語（すなわち「限定されるわけではないが、含む」を意味する）と見なす。本明細書の値の範囲の詳述は、本明細書に別に示さない限り、単に、本範囲内に属する別の値に、個々に言及する簡便な方法であると意図し、各々の別の値は、本明細書に個々に列挙するように、本明細書に取り込まれる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書に別に示さない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、適当な順序のいずれかで実行できる。あらゆる実施例、又は本明細書で提供する例示の用語（例えば「など」）の使用は、単に、本明細書をよりよく例示するよう意図され、そして別に請求しない限り、本発明の範囲に対して限定をするものではない。明細書中の用語には、本発明の実施に必須であるが、請求されないいかなる要素も示すと解釈すべきものはない。

本発明を実施するため、発明者が理解する最適な様式を含めて、本発明の態様を本明細書に記載する。一般の当業者であれば、上記説明を読むことによりこれらの態様の変形が明らかになる。本発明の発明者は、当業者がこうした変形を適切に使用することを予測し、本明細書に具体的に記載した以外でも本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律で認可されるような、添付した請求項に列挙する主題のすべての修飾及び同等物が含まれる。さらに、本明細書に別に示すか、又はそうでなければ文脈によって明らかに否定されない限り、上記要素のいかなる組み合わせも、可能な変形すべてにおいて、本発明に含まれる。

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図１Ａ〜１Ｆは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。５０ｎＭの示したｄｓＲＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。 図１Ｂは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。２００ｐＭの示したｄｓＲＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。 図１Ｃは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。５０ｐＭの示したｄｓＲＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。 図１Ｄは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。より長いｄｓＲＮＡの用量−反応試験。示した濃度のｄｓＲＮＡを用いてトランスフェクションを行った。 図１Ｅは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。同一のより長いＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー反応を示す。濃度及び条件は、実施例に記載したとおりであった。 図１Ｆは、２７量体ｄｓＲＮＡが、２１＋２ ｓｉＲＮＡより強力なＲＮＡｉのエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。安定してＥＧＦＰを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションしたｄｓＲＮＡの用量−反応曲線。各グラフ点は、３つの別の測定値の平均（ｓ．ｄ．を伴う）を示す。 図２Ａは、ダイサー・プロセシングがＲＮＡｉ活性と相関することを示す。組換えダイサーによるｄｓＲＮＡの切断。各ＲＮＡ二重鎖を、組換えヒト・ダイサーの存在下又は非存在下で２４時間インキュベーションし、非変性ＰＡＧＥを用いて分離して視覚化した（実施例を参照されたい）。 図２Ｂは、ダイサー・プロセシングがＲＮＡｉ活性と相関することを示す。本試験で用いたＲＮＡ二重鎖。円で示すように、オリゴの５’端、３’端、又は両端を６ＦＡＭとコンジュゲート化した。上部及び下部の線は、二重鎖立体配置のセンス鎖及びアンチセンス鎖を示し、センス鎖は５’から３’配向（左から右）であり、そしてアンチセンス鎖は３’から５’配向（左から右）である。 図２Ｃは、ダイサー・プロセシングがＲＮＡｉ活性と相関することを示す。６ＦＡＭ端修飾は、ｉｎ ｖｉｔｒｏダイサー活性に影響を及ぼす。ＲＮＡ二重鎖を０．５単位の組換えヒト・ダイサーと８時間インキュベーションして７．５％非変性ポリアクリルアミドゲル上で、産物を分離した。エチジウムブロミド染色によって、ＲＮＡを視覚化した。 図２Ｄは、ダイサー・プロセシングがＲＮＡｉ活性と相関することを示す。６ＦＡＭ修飾は、ＲＮＡｉ活性に影響を及ぼす。２００ｐＭのＲＮＡ二重鎖をＥＧＦＰ発現プラスミドと同時トランスフェクションし、そして記載するように、ＥＧＦＰ蛍光に関して、２４時間アッセイした。ＥＧＦＰ発現の報告値は、２つの別の実験の平均に相当する。蛍光の相対レベルを、ルシフェラーゼに関するものに対して標準化した。 図２Ｅは、ダイサー・プロセシングがＲＮＡｉ活性と相関することを示す。２７量体二重鎖ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで２１量体にプロセシングされる。１０ｎＭの二重鎖３及び二重鎖５をトランスフェクションした細胞から総ＲＮＡを調製した。ＲＮＡを２１量体^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせた試料を、非変性ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィーによって視覚化した。サイズマーカーは^３２Ｐ末端標識２１量体及び２７量体ＲＮＡ二重鎖である。 図３Ａ〜３Ｂは、多様な２１＋２ ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を示す。図３Ａ：２７量体ｄｓＲＮＡのダイシングから予測される、７つのありうる２１＋２ ｓｉＲＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＧＦＰレポーター構築物を用いた同時トランスフェクションアッセイにおいて、個々に、又はプールとして試験した。各グラフは、２つ組実験の平均を示す。図３Ｂ：無傷の（ｉｎｔａｃｔ）２７量体ｄｓＲＮＡに対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでダイシングした２７量体ｄｓＲＮＡの、ＲＮＡｉに関する比較。各ＲＮＡを、示したｄｓＲＮＡ濃度で、図４Ａにおけるように同時トランスフェクションした。ダイシングする産物に関しては、１μＭ ２７量体ｄｓＲＮＡを、ダイサーの非存在下（第３列）又は存在下（第４列）、ダイサー反応緩衝液中で、３７℃で１２時間インキュベーションした。混合物を水中で希釈し、そしてＥＧＦＰレポーターとの同時トランスフェクション用に直接用いた。希釈混合物中、残渣ダイサーのありうるアーチファクトに関して調整するため、トランスフェクション前に、第４列の試料をフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿させた（第５列）。 図４Ａは、ダイサーとのインキュベーション前（の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０のＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖は一本鎖に分離され、そして測定した各鎖の質量を示す。高塩存在下でダイサー消化を行い、そしていくつかの「シャドー」ピークは、＋１又は＋２ Ｎａ種に相当する。 ４Ｂは、ダイサーとのインキュベーション後の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０のＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖は一本鎖に分離され、そして測定した各鎖の質量を示す。高塩存在下でダイサー消化を行い、そしていくつかの「シャドー」ピークは、＋１又は＋２ Ｎａ種に相当する。 図５Ａは、ＲＮＡｉにおける２７量体ｄｓＲＮＡの特徴を示す。２７量体ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの存続期間増進。ＥＧＦＰを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、５ｎＭの２１＋２ ｓｉＲＮＡ又は２７量体ｄｓＲＮＡをトランスフェクションした後、ＥＧＦＰレベルを測定した。２７量体ｄｓＲＮＡに比較した際の、２１＋２ ｓｉＲＮＡに仲介されるＥＧＦＰサイレンシングのグラフ提示。示した日に２つ組試料を採取し、そして蛍光光度分析でＥＧＦＰ発現を測定した。 図５Ｂは、ＲＮＡｉにおける２７量体ｄｓＲＮＡの特徴を示す。２１量体ｓｉＲＮＡに不応性の部位を標的化する２７量体ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘発できる。ｄｓＲＮＡをＥＧＦＰレポーター構築物と共にトランスフェクションし、そしてＥＧＦＰ発現を測定した（方法）。第１列、モック；第２列、ＥＧＦＰＳ２を標的化する２１＋２ ｓｉＲＮＡ；第３列、ＥＧＦＰＳ２を標的化する２７量体ｄｓＲＮＡ；第４列、ＥＧＦＰＳ３を標的化する２１＋２ ｓｉＲＮＡ；第５列、ＥＧＦＰＳ３を標的化する２７量体ｄｓＲＮＡ。 図５Ｃは、ＲＮＡｉにおける２７量体ｄｓＲＮＡの特徴を示す。内因性転写物の下方制御における２１量体ｓｉＲＮＡ及び２７量体ｄｓＲＮＡの比較。ｈｎＲＮＰ Ｈ ｍＲＮＡ（図５Ｃ）中の部位を標的化する、２１＋２ ｓｉＲＮＡ及び２７＋０ ｄｓＲＮＡ用のＲＮＡを設計した。ｈｎＲＮＰ Ｈノックダウンをウェスタンブロットによってアッセイし、そしてＬａノックダウンをノーザンブロット分析によってアッセイした。示した濃度でｄｓＲＮＡを用いた。どちらの実験でも、内部特異性標準及び装填標準として、β−アクチンを用いた。 図５Ｄは、ＲＮＡｉにおける２７量体ｄｓＲＮＡの特徴を示す。内因性転写物の下方制御における２１量体ｓｉＲＮＡ及び２７量体ｄｓＲＮＡの比較。Ｌａ ｍＲＮＡ中の部位を標的化する、２１＋２ ｓｉＲＮＡ及び２７＋０ ｄｓＲＮＡ用のＲＮＡを設計した。ｈｎＲＮＰ Ｈノックダウンをウェスタンブロットによってアッセイし、そしてＬａノックダウンをノーザンブロット分析によってアッセイした。示した濃度でｄｓＲＮＡを用いた。どちらの実験でも、内部特異性標準及び装填標準として、β−アクチンを用いた。 図６は、ダイサー基質２７量体ｄｓＲＮＡの配列特異性を示す。多様な２７量体ｄｓＲＮＡを、示した濃度で、ＥＧＦＰ発現プラスミドと共に、ＨＥＫ９３細胞に同時トランスフェクションし、そしてＥＧＦＰ蛍光に関してアッセイした。 図７Ａは、ｓｉＲＮＡ及びダイサー基質ｄｓＲＮＡが、インターフェロンを誘導せず、またＰＫＲを活性化せず、また特異的「オフ・ターゲット効果」を生じないことを示す。インターフェロン・アルファアッセイ：第１列、ＩＦＮ誘導の陽性対照（Ｋｉｍら、２００４）；第２列、ＲＮＡなし；第３列、化学的に合成した２１＋２ ｓｉＲＮＡ；第４列、化学的に合成した２７＋０ ｄｓＲＮＡ。 図７Ｂは、ｓｉＲＮＡ及びダイサー基質ｄｓＲＮＡが、インターフェロンを誘導せず、またＰＫＲを活性化せず、また特異的「オフ・ターゲット効果」を生じないことを示す。インターフェロン・ベータアッセイ：第１列、ＩＦＮ誘導の陽性対照（Ｋｉｍら、２００４）；第２列、ＲＮＡなし；第３列、化学的に合成した２１＋２ ｓｉＲＮＡ；第４列、化学的に合成した２７＋０ ｄｓＲＮＡ。 図７Ｃは、ｓｉＲＮＡ及びダイサー基質ｄｓＲＮＡが、インターフェロンを誘導せず、またＰＫＲを活性化せず、また特異的「オフ・ターゲット効果」を生じないことを示す。ＰＫＲ活性化アッセイ。ＰＫＲ活性化に用いる長い（ｌｏｎｄ）ｄｓＲＮＡ（Ｋｉｍら、２００４）及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＫＲ活性化アッセイ（Ｍａｎｃｈｅら、１９９２）は上記した。示すように二重鎖ＲＮＡをトランスフェクションした。 図７Ｄは、ｓｉＲＮＡ及びダイサー基質ｄｓＲＮＡが、インターフェロンを誘導せず、またＰＫＲを活性化せず、また特異的「オフ・ターゲット効果」を生じないことを示す。マイクロアレイ分析の概要。 図８Ａは、ダイサーとのインキュベーション前の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０ ＬのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図８Ａ〜８Ｂは、ダイサーとのインキュベーション後の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０ ＬのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図８Ｃは、ダイサーとのインキュベーション前の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７／２５ ＬのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図８Ｄは、ダイサーとのインキュベーション後の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７／２５ ＬのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図９Ａは、ダイサーとのインキュベーション前の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０ ＲのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図９Ｂは、ダイサーとのインキュベーション後の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２７＋０ ＲのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図９Ｃは、ダイサーとのインキュベーション前の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２５／２７ ＲのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図９Ｄは、ダイサーとのインキュベーション後の、２７量体二重鎖ＥＧＦＰＳ１ ２５／２７ ＲのＥＳＩマススペクトルを示す。二重鎖を一本鎖に分離して測定した各鎖の質量を示す。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ダイサー・プロセシングを促進するように設計した二重鎖が、ＲＮＡｉの強力なエフェクターであることを示す。固定量のＥＧＦＰ発現プラスミド及び多様な濃度のｄｓＲＮＡでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクションした後、ＥＧＦＰ発現レベルを測定した。図１０Ａ：二重鎖ＥＧＦＰＳ２−２１＋２、ＥＧＦＰＳ２−２７＋０、ＥＧＦＰＳ２−２７／２５ Ｌ及びＥＧＦＰＳ２−２５／２７ Ｒの効力を比較する。図１０Ｂ：二重鎖ＥＧＦＰＳ１−２７／２５ Ｌ及びＥＧＦＰＳ１−２５／２７ Ｒの効力を比較する。 図１１は、標的配列に対する本発明の２つの実施態様、並びに標的配列及び各実施態様間の関係を示す例示である。

Claims (40)

1. 5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖並びに5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAであって、前記第1及び第2のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴクレオチド鎖は少なくとも25ヌクレオチドを含み、かつ、生物学的条件で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第2のオリゴクレオチドは25〜30ヌクレオチドからなり、前記第2鎖の3'末端は、前記第1鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進する、前記二本鎖RNA。
2. 5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖並びに5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAであって、前記第1及び第2のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴクレオチド鎖は25〜30ヌクレオチドからなり、かつ、生物学的条件で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第2のオリゴクレオチド鎖は少なくとも25ヌクレオチドを含み、かつ、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する、前記二本鎖RNA。
3. 二本鎖RNAがインビトロで哺乳類細胞中の標的遺伝子の発現を、少なくとも10％、少なくとも50％及び少なくとも80〜90％からなる群から選択される発現量（％）を低下させる、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
4. 二本鎖RNAが哺乳類細胞中で内因的に切断されて、長さが19〜23の範囲のヌクレオチドである二本鎖RNAを産生し、この二本鎖RNAは標的遺伝子発現を低下させる、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
5. 前記切断がダイサーにより行われる、請求項4に記載の単離された二本鎖RNA。
6. 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端で最初のヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2及び／又は3が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
7. 位置1、2及び／又は3が、デオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド又は蛍光ヌクレオチドで置換される、請求項6に記載の単離された二本鎖RNA。
8. 前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端の位置1が、デオキシリボヌクレオチド又はアシクロヌクレオチドで置換される、請求項6に記載の単離された二本鎖RNA。
9. 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端の位置1が、デオキシリボヌクレオチドで置換される、請求項8に記載の単離された二本鎖RNA。
10. 前記第1及び第2の鎖のそれぞれの長さが、少なくとも26及び最大で30である、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
11. 前記第2の鎖が標的mRNAと完全に相補的である、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
12. 二本鎖RNAが化学修飾を含み、前記化学修飾が場合によっては：2'-デオキシ又は非環基である糖修飾であり；ホスホン酸、ホスホロチオエート又はホスホトリエステルであるリン酸骨格の修飾であり；2'-O-アルキル修飾ピリミジン、2'-フルオロ修飾ピリミジン又は脱塩基糖である塩基の修飾である；請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
13. デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3'-デオキシアデノシン（コーディセピン）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）のヌクレオチド1リン酸、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）のヌクレオチド1リン酸、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）のヌクレオチド1リン酸、4-チオウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、5-（3-アミノアリル）-ウラシル、2'-O-アルキルリボヌクレオチド、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-アミノリボヌクレオチド、2'-フルオロリボヌクレオチド及びロックされた核酸からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
14. 第2の鎖又は第1の鎖のヌクレオチドがダイサー切断の配向性に対する修飾ヌクレオチドで置換された、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
15. 請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第2の鎖及び第1の鎖のヌクレオチドの相対的な長さが：第2鎖の長さが26〜29ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが25ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが27〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが26ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが28〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが27ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが29〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが28ヌクレオチド残基、そして第2鎖の長さが30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが29ヌクレオチド残基からなる群から選択される、前記二本鎖RNA。
16. 請求項15に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第1の鎖の長さが25ヌクレオチド残基であり、前記第2の鎖の長さは27ヌクレオチド残基で、かつ、第1の鎖よりも3'末端が2ヌクレオチド長い、前記二本鎖RNA。
17. 請求項15または16に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第1の鎖の長さは25ヌクレオチド残基であり、前記第1のオリゴヌクレオチドの3'末端で第1のヌクレオチド（位置1）が始まる場合、位置1及び位置２はデオキシリボヌクレオチドで置換され、かつ、前記第2の鎖の長さは27ヌクレオチド残基で第1の鎖よりも3'末端が2ヌクレオチド長い、前記二本鎖RNA。
18. 前記鎖の少なくとも一方または共に5'-リン酸基を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA。
19. 前記標的RNAが標的mRNAである、請求項1〜18のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA。
20. 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを包含する哺乳類細胞。
21. 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
22. 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAがインビトロで哺乳類細胞に導入される場合に、標的遺伝子の発現を、少なくとも10％、少なくとも50％及び少なくとも80〜90％からなる群から選択される発現量（％）を低下させるのに有効な量で存在する、前記製剤。
23. 請求項22記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAは、200ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に、前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
24. 請求項22記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAは、50ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に、前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
25. 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAが哺乳類の対象の細胞に導入される場合に標的遺伝子の発現を少なくとも10％、少なくとも50％及び少なくとも80〜90％からなる群から選択される発現量（％）を低下させるのに有効な量で存在し、前記二本鎖RNAは、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
26. 請求項25記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記有効な量は、1マイクログラム〜5ミリグラム／前記対象のkg／日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム／kg、0.001〜0.25ミリグラム／kg、0.01〜20マイクログラム／kg、0.01〜10マイクログラム／kg、0.01〜5マイクログラム／kg及び0.10〜2.5マイクログラム／kgからなる群から選択される用量である、前記製剤。
27. リボヌクレオチドを含み5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖及びリボヌクレオチドを含み5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記第1及び第2の鎖の長さは各々少なくとも25及び最大で30ヌクレオチドであり、前記第2鎖の3'末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と平滑末端を形成し、前記第2のオリゴクレオチド鎖は、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNA試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進し、前記二本鎖RNAは前記製剤中に、前記二本鎖RNAが哺乳細胞中に導入される場合に標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で存在し、かつ、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
28. 前記二本鎖RNAが、200ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの少なくとも19が同一のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項27の製剤。
29. 前記二本鎖RNAが、50ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの少なくとも19が同一のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項27の製剤。
30. 標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項1〜19のいずれか1項記載の二本鎖RNAを含む医薬組成物。
31. 標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項20〜29のいずれか1項記載の製剤。
32. 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて1ナノモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
33. 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて200ピコモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
34. 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて50ピコモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
35. 単離された二本鎖RNAが、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項30〜34のいずれか1項記載の医薬組成物または製剤。
36. 単離された二本鎖RNAの用量単位が1マイクログラム〜5ミリグラム／当該哺乳類のkg／日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム／kg、0.001〜0.25ミリグラム／kg、0.01〜20マイクログラム／kg、0.01〜10マイクログラム／kg、0.10〜5マイクログラム／kg及び0.1〜2.5マイクログラム／kgからなる群から選択される用量である、請求項30〜34のいずれか1項記載の医薬組成物または製剤。
37. 医薬組成物が静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、輸液、経皮送達、噴霧、直腸送達、膣内送達、局所送達、経口送達及び吸入送達からなる群から選択される態様により対象に送達するために製剤化される、請求項30〜34のいずれか1項に記載の医薬組成物または製剤。
38. 請求項1の単離された二本鎖RNAを調製する方法であって、以下の工程：
    少なくとも19ヌクレオチドを含む標的遺伝子のRNAの標的配列を選択する工程；
    前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する25〜30ヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；
    生物学的条件下で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる少なくとも25ヌクレオチドを含む第1のオリゴクレオチド鎖であって前記第2の鎖の3’末端が前記第1の鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、そして第1の鎖と第2の鎖とがアニーリングする場合にその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；及び
    それにより請求項1に記載の二本鎖RNAを調製する工程；
    を含む、前記方法。
39. 請求項2の単離された二本鎖RNAを調製する方法であって、以下の工程：
    少なくとも19ヌクレオチドを含む標的遺伝子のRNAの標的配列を選択する工程；
    前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する少なくとも25ヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；
    生物学的条件下で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる25〜30ヌクレオチドを含む第1のオリゴクレオチド鎖であって前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、そして第1の鎖と第2の鎖とがアニーリングする場合にその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；及び
    それにより請求項2に記載の二本鎖RNAを調製する工程；
    を含む、前記方法。
40. 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜30ヌクレオチドからなる、請求項39に記載の方法。

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