JP5243789B2 - 二本鎖rnaによる遺伝子発現の特異的阻害のための方法及び組成物 - Google Patents
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- C12N2330/00—Production
- C12N2330/30—Production chemically synthesised
Description
本出願は、本明細書に援用される米国仮特許出願第60/553,487号、2004年3月15日出願に関連し、そして35U.S.C.§119(e)により、前記出願に対して優先権を請求する。
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された、助成金番号AI29329及びHL074704のもとで部分的に政府の援助を受けて行った。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明の背景を解明するため、本明細書で用いる刊行物及び他の題材、そして特に実施に関して他の詳細を提供する事例は、本明細書に援用され、そして便宜上、著者及び日付によって以下の本文に引用され、そして付随する参考文献一覧に著者のアルファベット順に列挙される。
二本鎖RNA(dsRNA)による遺伝子発現の抑制が、植物(転写後遺伝子抑制)(Napoliら、1990)、真菌(クエリング(quelling))(Romano及びMarcino、1992)、及び線虫(RNA干渉)(Fireら、1998)を含む多様な系で明らかになった。哺乳動物の系において長いdsRNAを用いて遺伝子発現を同様に抑制しようとする初期の試みは、より低次の生物には存在しないインターフェロン経路が活性化されるために失敗した。インターフェロン応答は、dsRNAによって誘発される(Starkら、1998)。特に、プロテインキナーゼPKRは、30bpより長いdsRNAにより活性化され(Mancheら、1992)、これにより、翻訳開始因子eIF2αがリン酸化されて、タンパク質合成の抑止及び2’5’−オリゴアデニル酸シンテターゼ(2’−5’−OAS)を活性化し、RNA分解がおこる(Minksら、1979)。
第4の態様では、本発明は、細胞において、所望の標的遺伝子由来の遺伝子産物の発現を選択的に低下させる方法、並びに前記遺伝子の発現によって起こる疾患を治療するための方法に関する。1つの実施態様では、前記方法は、dsRNAの十分な部分が細胞の細胞質に移動して、標的遺伝子の発現を低下させるような、本発明のdsRNA量を、細胞環境内に導入する。
本発明は、真核細胞において、標的遺伝子の発現を低下させることが可能な、二本鎖RNA(「dsRNA」)を含有する組成物、及び前記組成物の調製法に関する。dsRNAの鎖の一方は、標的遺伝子から転写されるRNAを破壊することも可能な約19〜約30ヌクレオチドの範囲の長さのヌクレオチド配列領域を含有する。
オリゴヌクレオチド合成及び精製
標準的技術(Damha及びOlgivie、1993;Wincottら、1995)を用い、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて、RNAオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護し、そしてNAP−5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)上で脱塩した。15分間工程の直線勾配を用いて、Amersham Source 15Qカラム(1.0cmx25cm)(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)上、イオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE−HPLC)を用いて、オリゴマーを精製した。勾配は、90:10緩衝液A:Bから、52:48緩衝液A:Bで変化させて、緩衝液Aは100mM Tris pH8.5であり、そして緩衝液Bは100mM Tris pH8.5、1M NaClであった。260nmで試料をモニターし、そして全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールし、NAP−5カラム上で脱塩し、そして凍結乾燥した。
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH7.5からなる二重鎖緩衝液中、100μM濃度に再懸濁した。相補的センス鎖及びアンチセンス鎖を等モル量で混合して、50μM二重鎖の最終溶液を得た。試料を95℃に5分間加熱し、そして使用前に室温に冷却させた。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを凍結乾燥して保存するか、又はヌクレアーゼ不含水中で−80℃で保存した。
一貫性を保つため、明細書及び実施例全体で、以下の命名法を使用している。二重鎖の名称は、オリゴマーの長さ及び突出の存在又は非存在を示す。「21+2」二重鎖は、どちらも長さ21ヌクレオチドの2つのRNA鎖を含有し、21量体siRNA二重鎖ともいい、そして3’で2塩基が突出する。「21−2」設計は、5’で2塩基が突出する21量体siRNA二重鎖である。21−0設計は、突出がない(平滑)21量体siRNA二重鎖である。「21+2UU」は、3’で2塩基が突出し、そして3’末端の2塩基がどちらもU残基である(標的配列とのミスマッチを生じうる)21量体二重鎖である。「25/27」は、25塩基のセンス鎖で3’で2塩基が突出する27塩基のアンチセンス鎖がある非対称性二重鎖である。「27/25」は、27塩基のセンス鎖及び25塩基のアンチセンス鎖がある非対称性二重鎖である。
本実施例は、驚くべきことに、25ヌクレオチド以上の長さの鎖のdsRNAが、哺乳動物系で、既知の21量体〜23量体のsiRNAよりも効力が高まることを示す。
トランスフェクションの1日前、DMEM培地中、60%の集密度(confluency)になるように、HEK293細胞を24穴プレートに分割した。各RNAのアリコットを添加した後、レポーター・ベクターを含有する50μlのOpti培地を添加した。次に、1.5μlのリポフェクタミン2000(Invitrogen)を含有する50μlのOpti培地を混合し、そして15分間インキュベーションした。次いで、細胞を0.4mlのDMEM培地に添加した。トランスフェクション効率を標準化するため、各アッセイは、ホタル(firefly)・ルシフェラーゼ又は赤色蛍光タンパク質(RFP)レポーター・プラスミド(他のアッセイすべて)と共に、標的及び/又は二重鎖RNAの同時トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼ・アッセイに関しては、製造者の指示(Promega)にしたがって、Steady Gloルシフェラーゼ・アッセイキットを用いた。RFP同時トランスフェクションに関しては、示す量のEGFPレポーター・プラスミド(pLEGFP−C1ベクター、Clontech)を20ngのRFPレポーター・プラスミド(pDsRed2−C1、BD Science)と共にトランスフェクションした。24時間後、蛍光顕微鏡でRFP発現をモニターした。トランスフェクション効率は、>90%であった(RFP発現によって評価)実験のみを評価した。24時間後、EGFP発現を測定した。FACS(生存細胞)によって、又は蛍光光度計読み取り値(細胞抽出物)によって決定したEGFP蛍光細胞の中央値数から、EGFP発現を決定した。
レポーター系は、トランスフェクション・プラスミド・ベクターpEGFP−C1(Clontech、カリフォルニア州パロアルト)として、又はNIH 3T3細胞株の安定形質転換体としてのいずれかのEGFPを使用した。Genbank寄託番号U55763のEGFPのコード配列を表1に示す。ATG開始コドン及びTAA停止コドンを太字フォントで強調し、そして本実施例及び他の実施例における、siRNA試薬の標的部位を下線で示す。
EGFPのヌクレオチド配列
部位1:5’GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGC3’(配列番号2)であった。
オリゴヌクレオチド試薬、EGFP部位1の概説
EGFP中の「部位1」を標的化するモデル系(Kimら、2003)において、相対的な効力に関して、3’突出、5’突出又は平滑端を含有する多様な長さの合成RNA二重鎖の広範なセットを試験した。50nMの多様なRNA二重鎖を用いて最初のトランスフェクションを行った(図1A)。トランスフェクションをナノモル未満の濃度で行った場合にのみ、より長い二重鎖の真の効力が示された。200pM(図1B)及び50pM(図1C)の二重鎖RNA濃度を用いると、長さと共に効力が高まることが観察された。平滑端、5’突出端及び3’突出端は、同様の効力であった。EGFPを安定して発現するNIH3T3細胞においてでさえ、より長い二重鎖RNAの効力が高まることが観察された(図1F)。27ntより長い二重鎖を合成してRNAi有効性を試験した(図1D)。27bpの長さの二重鎖で、最大阻害活性が見られた(図1D)。二重鎖が長くなるほど、機能性RNAi活性は漸進的に損失し、そして40〜45bpまでには、試験した濃度では完全に不活性になり、これはまた、ダイサーによるこれらの二重鎖のin vitro切断が劣っていることとも相関した(図1E)。
本実施例は、dsRNAがダイサー基質として機能するか否かを決定する方法を示す。
in vitroダイサー切断アッセイ
RNA二重鎖(100pmol)を、1単位の組換えヒト・ダイサー(Stratagene)を含む、20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2の20μl中で24時間インキュベーションした。各反応の3μlのアリコット(15pmol RNA)を、15%非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、GelStar(Ambrex)で染色し、そしてUV励起を用いて視覚化した。
21bp〜27bpのRNA二重鎖を組換えヒト・ダイサーとインキュベーションすると、23量体、25量体及び27量体二重鎖の切断が生じたが、21量体二重鎖は切断されなかった(図2A)。本反応の反応速度が遅いため、供給者に推奨されるin vitro条件下では、ダイサー切断の相対的な効率を決定できなかった。30bpより長いdsRNAは、ダイサーの優れた基質となるため、マイクロRNAプロセシング酵素であるDroshaによってあらかじめプロセシングされる必要がありうるという可能性を別にして、これらの、dsRNAが長いとダイサーの基質としては劣り、そしてまたRNAiの誘発因子として劣るのはなぜであるのかは、説明できない。
実施例3に記載するin vitroダイサー切断アッセイを用いて、dsRNAの末端修飾の影響を試験した。
本実施例は、27量体dsRNAがin vivoでダイサーによってプロセシングされることを確認する。
上記のように、6穴プレート中、10nMで、RNA二重鎖をHEK293細胞にトランスフェクションした。14時間後、総RNAを以下のように調製した。最初に、20μgの総RNAを75℃で10分間加熱し、そして32P 5’端標識オリゴヌクレオチドプローブ(5’−ACCCTGAAGTTCATCTGCACC−3’;配列番号73)と混合し、そして150mM NaCl、50mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA中、24℃でハイブリダイズさせた。7.5%非変性ポリアクリルアミドゲル上に試料を装填し、そして200V、4℃で3時間分離し、そしてゲルをX線フィルムに曝露した。32P末端標識27量体及び21量体二重鎖RNAオリゴをサイズ標準として用いた。
27量体dsRNAがin vivoでダイサーによってプロセシングされることを確認するため、HEK293細胞に、10nMの二重鎖3(未修飾)又は二重鎖5(両方の3’端が6FAMで修飾されている)をトランスフェクションした。14時間後、総RNAを単離し、そして32P末端標識21量体プローブオリゴ(S鎖)とハイブリダイズさせた。非変性PAGEによってRNAを分離し、そしてオートラジオグラフィーで視覚化した(図2E)。in vitroダイサー切断で見られる結果と同様、二重鎖3(未修飾27量体)をトランスフェクションした細胞から調製したRNAにおいて、21量体二重鎖マーカーと共に、より小さい種が移動するのが観察され、これはダイサー切断産物と一致した。本21量体の種は、二重鎖5(3’末端で修飾された27量体)をトランスフェクションした細胞由来のRNAでは検出されなかった。
本実施例は、ダイサーによる27量体の潜在的な切断産物の効力を調べる。
ダイサーによる27量体の切断は、切断がどこで起こるかに応じて、多様な別の21量体を生じる;これらの21量体の1つ又は混合物が、比較のための標準として用いた特定の21量体よりも、有意により強力である可能性もある。本可能性を試験するため、伝統的な21+2設計を用いて、アンチセンス鎖に沿って1塩基段階でウォーキングし、EGFPS1 27+0二重鎖に由来しうる、7つの異なる21量体を合成した。HEK293細胞同時トランスフェクションアッセイにおいて、RNAi活性に関して、これらの7つの二重鎖を、個々に又はプールとして試験した(図3A)。50又は200pMの濃度では、個々の21量体二重鎖も、また7つの21量体二重鎖のプールしたセットも、27量体二重鎖に匹敵する活性を示さなかった。トランスフェクション前に27量体をin vitroでダイサー切断すると、有効性は有意に高まらなかった(図3B)。他の対照として、中央に配置した4つの連続ミスマッチ塩基を宿する突然変異EGFP 27量体二重鎖(表2)、EGFPS1−27+0/mutをトランスフェクションした。ミスマッチは実質的に、いかなるRNAi活性も排除した(図3B)。
本実施例は、質量分析によって、in vitroダイサー切断産物を分析した。
ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータプロセシング・ソフトウェア及びParadigm MS4 HPLC(Michrom BioResources)からなるオリゴHTCSシステム(Novatia)を用いて、ダイサーでの処理前及び処理後の二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI−LCMS)を行った。質量分析計への注入前に液体クロマトグラフィー工程を使用すると(LC−MS)、核酸と複合体形成している陽イオンのほとんどが除去され;ある程度のナトリウムイオンはRNAに結合したままであることもあり、そして少量の+22又は+44種として視覚化され、水素に対するナトリウムの置換で見られる正味質量獲得を反映する。
エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI MS)を用いて、EGFPS1 27+0二重鎖と組換えダイサーをin vitroでインキュベーションすることによって実際に産生される種を同定した(図4A及び4B)。in vitroダイサー切断から生じうる各消化産物に関して、計算上の質量を表3に示す。in vitro切断産物のESI MS分析は、本酵素の既知の活性と一致する。
ダイサー・プロセシングによって、27量体二重鎖から得られる、ありうる21量体二重鎖の分子量
EGFP標的を安定して発現する細胞において、27量体dsRNAの阻害特性をさらに特定するため、EGFPを発現する安定トランスフェクションNIH3T3細胞に、21+2及び27+0 dsRNA二重鎖(どちらも5nM)をトランスフェクションした。遺伝子抑制期間の定量的な概算値を得るため、経時実験を行って、トランスフェクション2日後、4日後、6日後、8日後及び10日後のEGFP発現を観察した。細胞抽出物を調製し、そして蛍光光度計を用いて、EGFP蛍光に関して測定した(図5A)。21+2 siRNAを用いると、EGFP抑制は、およそ4日間続き、先の観察と一致し(Persengievら、2004)、一方、27+0 dsRNAでの阻害は、10日まで持続した。「高機能性」21+2 siRNAクラスが、類似のサイレンシング期間延長を示すことが報告されている(Reynoldsら、2004);が、これらの配列はまれで、発見又は予測することが困難である。27量体dsRNA設計を用いると、より多様な標的部位で、RNAiはより長く、より強力になる。
あらゆる遺伝子の発現を体系的に阻害するツールとしてRNAiを用いる際にしばしば起こる問題は、すべての標的部位が、siRNAによる抑制に等しく感受性ではないため(Sherer及びRossi、2004)、有効な部位を予測するためには、複雑な設計アルゴリズムが要求されることである(Reynoldsら、2004;Ui−Teiら、2004;Amarzguioui及びPrydz、2004)。したがって、我々は、27量体dsRNAの効力増加が、伝統的な21量体siRNAを用いた際には活性でない部位を有効に標的化するか否かを検討した。どちらも、標準的siRNAを用いると、RNAiに不応性であることが示された、EGFP中の2つの部位(「EGFP−S2」及び「EGFP−S3」)(Kime及びRossi、2003)に対して、21+2及び27+0の設計の二重鎖RNAを作製した。
上記配列番号1のように、レポーター系はEGFPを使用した。EGFP中の部位2(不良部位1ともいう)及び部位3(不良部位2ともいう)を標的化した。実施例1で記載したように、RNA二重鎖を合成して調製した。本実施例のため、EGFPにおいて、siRNA標的化に用いた部位2及び部位3は:
部位2:5’UGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUG3’(配列番号74)及び
部位3:5’UGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAU3’(配列番号75)であった。
表4
オリゴヌクレオチド試薬、EGFP部位2の概要
1nM及び10nMの同時トランスフェクションアッセイ形式(図5B)を用いて、HEK293細胞に二重鎖をトランスフェクションした。これらの用量では、標準的21+2 siRNAは、どちらの部位でも無効であり、一方、27量体dsRNAは、EGFP発現を、EGFP−S2で80〜90%減少し、そしてEGFP−S3で50%(1nM)及び80%(10nM)減少した。ダイサー基質dsRNAの効力増加にもかかわらず、RNAiに関して、最も高感度な標的を発見するには、標的部位の実験的な試験がいまだに有用である。これに関して、いくつかの27量体のダイサー産物が、機能が劣るsiRNAを生じたことは重要である。ダイサー基質優先性をよりよく理解することによって、所望の21量体を生じるであろう基質RNAを設計することができるはずである。我々は、27量体の一方の端のみにある2塩基の3’突出が、ダイサーを優先的に導いて、2塩基の3’突出の21〜23nt上流を切断させることを観察している。
27量体dsRNAの効力増加が、レポーター構築物を標的化するアーチファクトでないことを確かめるため、我々は、2つの内因性転写物、ヒトhnRNP H mRNA(Markovtsovら、2000)及びLaタンパク質をコードするmRNA(Wolin及びCedervall、2002)を標的化した。
6穴プレート中に、30%集密度になるように、HEK293細胞をプレーティングした。翌日、示した量のdsRNAを細胞にトランスフェクションし、そして翌日、培地を交換した。トランスフェクション72時間後、300μlのPBS中に細胞を採取した。EGFPアッセイに関して上記のように抽出物を調製した。ウェスタンブロットのため、2μlの細胞抽出物を10%SDS−PAGEゲル上に装填した。ウサギ・ポリクローナル抗hnRNP H抗体(Markovtsovら、2000)、及びアルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化した抗ウサギ抗体(Sigma)を用いて、内因性hnRNP Hを検出した。マウス由来抗アクチン抗体(Sigma)及びアルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化した抗マウス抗体(Sigma)を用いて、β−アクチンを検出した。ノーザンブロット分析のため、採取した細胞をRNA STAT−60(Tel−Test B)と混合し、そして製造者のプロトコルにしたがって総RNAを抽出した。6%変性ポリアクリルアミドゲル中でRNAを電気泳動して、ナイロン膜に転写し、そして32P末端標識オリゴ(La、5’−CCAAAGGTACCCAGCCTTCATCCAGTT−3’(配列番号84);β−アクチン、5’−GTGAGGATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCG−3’(配列番号85))で探査した。10mlのハイブリダイゼーション溶液(1ml 50xデンハルト、3ml 20xSSPE、0.5ml 10%SDS)中、37℃で3時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、2xSSPEを用いて、37℃で3回、ブロットを洗浄した。
ヒトヘテロ核リボヌクレオタンパク質H(hnRPH)mRNA(Genbank寄託番号NM_005520)のコード配列を表5に示す。ATG開始コドン及びTAA停止コドンを太字フォントで強調し、そしてsiRNA試薬の標的部位を下線で示す。
HNRPHのヌクレオチド配列
Laタンパク質のヌクレオチド配列
表7
オリゴヌクレオチド試薬の概説
ヒトhnRNP H mRNA(ウェスタンブロッティングによって分析)及びLaタンパク質をコードするmRNA(ノーザンブロッティングによって分析)において、ランダムに選択した部位を標的化するため、RNA二重鎖を合成した(図5C及び5D)。両方の標的に関して、27量体の二重鎖は、これらのメッセージを標的化する21量体siRNAより強力であった。
27量体dsRNAの配列特異性に関する試験として、EGFP標的mRNAに対して1つ、2つ又は3つのミスマッチがある、一連の27+0 dsRNAを合成して同時トランスフェクションアッセイにおいて、0nM、1nM及び200pMの濃度で試験した(図6)。突然変異27+0 dsRNAの配列を表2に示す。200pMでは、各ミスマッチ配列は、野生型27量体dsRNAより強力でなく;三重ミスマッチ27量体dsRNAは、試験したすべての濃度で、RNAiを誘発するのに完全に無効であった。EGFPの「部位2」を標的化する27量体dsRNAを用いて、類似の結果を得た。
本実施例は、本発明のdsRNA二重鎖が、インターフェロン応答を活性化しないことを示す。
上記のように、293細胞に20nMの各RNAをトランスフェクションした後、24時間後に培地を収集し、そして上記のように、インターフェロンα及びβのELISAアッセイに用いた(Kimら、2004)。上記のように、PKR活性化アッセイを行った(Gunnery及びMathews、1998)。示したRNAの同時インキュベーションによって、溶解物中のPKRをまず活性化し、そして自己キナーゼ反応によって放射標識した。次いで、分析のため、放射標識PKRを免疫沈降した。あらかじめ活性化しない細胞溶解物中のPKR活性を決定するため、dsRNAを省いた。反応を30℃で20分間インキュベーションした。ポリクローナル抗体を用いて、反応由来のPKRを免疫沈降した。ポリクローナル抗体を反応に添加して、次いでこれを氷上に1時間置き、その後、IPP500(10mM Tris、pH8、500mM NaCl、0.1% Nonidet P−40)中の10%プロテインA−セファロース50μlを添加した。本混合物を4℃で30分間振盪した。プロテインA−セファロース・ビーズを1mlのIPP100緩衝液(10mM Tris、pH8、100mM NaCl、0.1% Nonidet P−40)で5回洗浄した。最後の洗浄後、タンパク質試料緩衝液中でビーズを煮沸してSDS−ポリアクリルアミドゲル上に装填した後、オートラジオグラフィーを行った。
より長いdsRNAを使用する際、潜在的な問題は、PKRの活性化及びインターフェロンの誘導である(Mancheら、1992)。したがって、我々は、トランスフェクションした27量体dsRNAが、インターフェロン−α(図7A)又はインターフェロン−β(図7B)を活性化するかどうかを評価した。インターフェロン誘導の陽性対照として、以前報告されたように(Kimら、2004)、インターフェロン−α及びβを強力に活性化する、三リン酸含有一本鎖RNAをトランスフェクションした。21+2 siRNA又は27+0 dsRNAいずれを用いた場合も、どちらのサイトカインも検出されなかった。本観察は、EGFP−S2及びEGFP−S3部位に特異的な2つの他の27量体にも該当した。上記のように(Gunnery及びMathews、1998)、細胞溶解物中のPKR活性化もまたアッセイした。示したRNAで溶解物を処理し、その後、免疫沈降した。陽性対照の長いdsRNAはPKR活性化を誘発したが、より短いRNAはいずれもPKRを活性化しなかった(図7C)。
本実施例は、27量体に対するダイサー作用によって、多数の種が産生されること、27量体の設計及び/又は塩基修飾の包含により、これらの分解パターンがおこり、不均一性が制限され、最終産物を予測できることを示す。
RNA二重鎖(100pmol)を、1単位の組換えヒト・ダイサー(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)を含む、20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2の20μl中で12〜24時間インキュベーションした。ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータプロセシング・ソフトウェア及びParadigm MS4TM HPLC(Michrom BioResources、カリフォルニア州オーバーン)からなるオリゴHTCSシステム(Novatia、ニュージャージー州プリンストン)を用いて、ダイサーでの処理前及び処理後、二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI−LCMS)を行った。質量分析計への注入前に液体クロマトグラフィー(LC−MS)工程を使用すると、核酸と複合体形成している陽イオンのほとんどが除去され;ある程度のナトリウムイオンはRNAに結合したままの場合もあり、そして少量の+22又は+44種として視覚化されて、水素に対するナトリウムの置換で見られる正味質量獲得を反映する。本アッセイの正確性は、本サイズのオリゴヌクレオチドではほぼ+/−2ダルトンである。
EGFPS1−27+0二重鎖をダイサーで消化して、そして消化前(図8A)及び消化後(図8B)のマススペクトルを得た。一般的に、ダイサーは、27量体二重鎖を、5’−リン酸塩を含む、長さ21量体の断片に切断する。通常、より少量の22量体もまた生成する。ときには、少量の20量体及び23量体もまた、観察される。観察された質量を出発配列と比較することによって、本ダイシング反応において、3’に2塩基の突出及び5’−リン酸塩を含む4つの二重鎖が産生したと推定できる。これらの種は、2つの主要な切断産物に相当し、どちらも21量体及び22量体の二重鎖を生じた。小文字「p」はリン酸基に相当する。in vitroダイサー切断から生じる各消化産物に関して、計算上の質量を表8に示す。
ダイサー・プロセシングにより、27量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量
二重鎖の分子量
ダイサー・プロセシングによって、27量体/25量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量
二重鎖の分子量
ダイサー・プロセシングによって、27量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量
二重鎖の分子量
ダイサー・プロセシングによって、25量体/27量体二重鎖から得られる、可能な二重鎖の分子量
二重鎖の分子量
本実施例は、一方の側に3’で2塩基が突出し、そして他方の側が3塩基の3’−DNA修飾がある平滑端である、本発明が教示する新規非対称性RNA二重鎖は、平滑27量体二重鎖よりも効力を改善できることを示す。
トランスフェクションした二重鎖
トランスフェクションした二重鎖
25/27 R二重鎖>27/25 L二重鎖>27量体。
本実施例は、哺乳動物において、本発明のdsRNAの有効用量を決定するための方法を示す。dsRNAをコードする配列を含有する、治療的に有効な量の組成物(すなわち有効投薬量)は、標的遺伝子の産物の発現を少なくとも10パーセント阻害する量である。特定の状況では、より高い阻害パーセント、例えば20、50、90、95、99パーセント又はそれ以上が望ましい場合もある。典型的な用量には、被験者又は試料重量のキログラムあたり、分子のミリグラム又はマイクログラム量があげられる(例えばキログラムあたり約1マイクログラム〜キログラムあたり約5ミリグラム、キログラムあたり約100マイクログラム〜キログラムあたり約0.5ミリグラム、又はキログラムあたり約1マイクログラム〜キログラムあたり約50マイクログラム)。主治医が必要とするように、組成物を、週1回以上、約1〜10週間、例えば約2〜8週間、又は約3〜7週間、あるいは約4、5、又は6週間投与することもできる。治療的有効量の組成物での被験者の治療には、単回の治療又は一連の治療があげられる。
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Claims (40)
- 5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖並びに5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAであって、前記第1及び第2のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴクレオチド鎖は少なくとも25ヌクレオチドを含み、かつ、生物学的条件で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第2のオリゴクレオチドは25〜30ヌクレオチドからなり、前記第2鎖の3'末端は、前記第1鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進する、前記二本鎖RNA。
- 5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖並びに5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAであって、前記第1及び第2のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴクレオチド鎖は25〜30ヌクレオチドからなり、かつ、生物学的条件で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第2のオリゴクレオチド鎖は少なくとも25ヌクレオチドを含み、かつ、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する、前記二本鎖RNA。
- 二本鎖RNAがインビトロで哺乳類細胞中の標的遺伝子の発現を、少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される発現量(%)を低下させる、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 二本鎖RNAが哺乳類細胞中で内因的に切断されて、長さが19〜23の範囲のヌクレオチドである二本鎖RNAを産生し、この二本鎖RNAは標的遺伝子発現を低下させる、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記切断がダイサーにより行われる、請求項4に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端で最初のヌクレオチド(位置1)から始めて、位置1、2及び/又は3が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 位置1、2及び/又は3が、デオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド又は蛍光ヌクレオチドで置換される、請求項6に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端の位置1が、デオキシリボヌクレオチド又はアシクロヌクレオチドで置換される、請求項6に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端の位置1が、デオキシリボヌクレオチドで置換される、請求項8に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記第1及び第2の鎖のそれぞれの長さが、少なくとも26及び最大で30である、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記第2の鎖が標的mRNAと完全に相補的である、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 二本鎖RNAが化学修飾を含み、前記化学修飾が場合によっては:2'-デオキシ又は非環基である糖修飾であり;ホスホン酸、ホスホロチオエート又はホスホトリエステルであるリン酸骨格の修飾であり;2'-O-アルキル修飾ピリミジン、2'-フルオロ修飾ピリミジン又は脱塩基糖である塩基の修飾である;請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3'-デオキシアデノシン(コーディセピン)、3'-アジド-3'-デオキシチミジン(AZT)、2',3'-ジデオキシイノシン(ddI)、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン(3TC)、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン(d4T)、3'-アジド-3'-デオキシチミジン(AZT)のヌクレオチド1リン酸、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン(3TC)のヌクレオチド1リン酸、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン(d4T)のヌクレオチド1リン酸、4-チオウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、5-(3-アミノアリル)-ウラシル、2'-O-アルキルリボヌクレオチド、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-アミノリボヌクレオチド、2'-フルオロリボヌクレオチド及びロックされた核酸からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 第2の鎖又は第1の鎖のヌクレオチドがダイサー切断の配向性に対する修飾ヌクレオチドで置換された、請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNA。
- 請求項1または2に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第2の鎖及び第1の鎖のヌクレオチドの相対的な長さが:第2鎖の長さが26〜29ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが25ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが27〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが26ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが28〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが27ヌクレオチド残基、第2鎖の長さが29〜30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが28ヌクレオチド残基、そして第2鎖の長さが30ヌクレオチド残基のときに第1鎖の長さが29ヌクレオチド残基からなる群から選択される、前記二本鎖RNA。
- 請求項15に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第1の鎖の長さが25ヌクレオチド残基であり、前記第2の鎖の長さは27ヌクレオチド残基で、かつ、第1の鎖よりも3'末端が2ヌクレオチド長い、前記二本鎖RNA。
- 請求項15または16に記載の単離された二本鎖RNAであって、前記第1の鎖の長さは25ヌクレオチド残基であり、前記第1のオリゴヌクレオチドの3'末端で第1のヌクレオチド(位置1)が始まる場合、位置1及び位置2はデオキシリボヌクレオチドで置換され、かつ、前記第2の鎖の長さは27ヌクレオチド残基で第1の鎖よりも3'末端が2ヌクレオチド長い、前記二本鎖RNA。
- 前記鎖の少なくとも一方または共に5'-リン酸基を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA。
- 前記標的RNAが標的mRNAである、請求項1〜18のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA。
- 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを包含する哺乳類細胞。
- 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNA及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAがインビトロで哺乳類細胞に導入される場合に、標的遺伝子の発現を、少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される発現量(%)を低下させるのに有効な量で存在する、前記製剤。
- 請求項22記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAは、200ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に、前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
- 請求項22記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAは、50ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に、前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
- 請求項1〜19のいずれか1項記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記二本鎖RNAが哺乳類の対象の細胞に導入される場合に標的遺伝子の発現を少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される発現量(%)を低下させるのに有効な量で存在し、前記二本鎖RNAは、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAよりも標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
- 請求項25記載の単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記有効な量は、1マイクログラム〜5ミリグラム/前記対象のkg/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.01〜5マイクログラム/kg及び0.10〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量である、前記製剤。
- リボヌクレオチドを含み5'末端及び3'末端を有する第1のオリゴクレオチド鎖及びリボヌクレオチドを含み5'末端及び3'末端を有する第2のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖RNAを含む製剤であって、前記第1及び第2の鎖の長さは各々少なくとも25及び最大で30ヌクレオチドであり、前記第2鎖の3'末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、かつその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と平滑末端を形成し、前記第2のオリゴクレオチド鎖は、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNA試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、そして前記二本鎖RNAはヒトDicerにより切断され、それにより切断された第2のオリゴヌクレオチド鎖のRISCへの取り込みを促進し、前記二本鎖RNAは前記製剤中に、前記二本鎖RNAが哺乳細胞中に導入される場合に標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で存在し、かつ、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
- 前記二本鎖RNAが、200ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの少なくとも19が同一のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項27の製剤。
- 前記二本鎖RNAが、50ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの少なくとも19が同一のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項27の製剤。
- 標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項1〜19のいずれか1項記載の二本鎖RNAを含む医薬組成物。
- 標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項20〜29のいずれか1項記載の製剤。
- 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて1ナノモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
- 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて200ピコモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
- 標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖RNAの量が、前記細胞環境中にて50ピコモル又はそれ以下である、請求項30の医薬組成物または請求項31の製剤。
- 単離された二本鎖RNAが、1ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的RNAの同一の少なくとも19のヌクレオチドに向けられた単離された21merのsiRNAより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項30〜34のいずれか1項記載の医薬組成物または製剤。
- 単離された二本鎖RNAの用量単位が1マイクログラム〜5ミリグラム/当該哺乳類のkg/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg及び0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量である、請求項30〜34のいずれか1項記載の医薬組成物または製剤。
- 医薬組成物が静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、輸液、経皮送達、噴霧、直腸送達、膣内送達、局所送達、経口送達及び吸入送達からなる群から選択される態様により対象に送達するために製剤化される、請求項30〜34のいずれか1項に記載の医薬組成物または製剤。
- 請求項1の単離された二本鎖RNAを調製する方法であって、以下の工程:
少なくとも19ヌクレオチドを含む標的遺伝子のRNAの標的配列を選択する工程;
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する25〜30ヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程;
生物学的条件下で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる少なくとも25ヌクレオチドを含む第1のオリゴクレオチド鎖であって前記第2の鎖の3’末端が前記第1の鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、そして第1の鎖と第2の鎖とがアニーリングする場合にその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程;及び
それにより請求項1に記載の二本鎖RNAを調製する工程;
を含む、前記方法。 - 請求項2の単離された二本鎖RNAを調製する方法であって、以下の工程:
少なくとも19ヌクレオチドを含む標的遺伝子のRNAの標的配列を選択する工程;
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19ヌクレオチド長で標的RNAと十分に相補的で、前記二本鎖RNAを哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する少なくとも25ヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程;
生物学的条件下で前記第2のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる25〜30ヌクレオチドを含む第1のオリゴクレオチド鎖であって前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも1〜3個のヌクレオチド長く、そして第1の鎖と第2の鎖とがアニーリングする場合にその5'末端にて前記第1鎖の3'末端と塩基対を形成した平滑末端を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程;及び
それにより請求項2に記載の二本鎖RNAを調製する工程;
を含む、前記方法。 - 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜30ヌクレオチドからなる、請求項39に記載の方法。
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