KR101692880B1 - 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체 - Google Patents

다가 ｒｎａ-나노입자 구조체 Download PDF

Info

Publication number
KR101692880B1
KR101692880B1 KR1020117014393A KR20117014393A KR101692880B1 KR 101692880 B1 KR101692880 B1 KR 101692880B1 KR 1020117014393 A KR1020117014393 A KR 1020117014393A KR 20117014393 A KR20117014393 A KR 20117014393A KR 101692880 B1 KR101692880 B1 KR 101692880B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rna
nanoparticle
polynucleotide
nanoparticles
delete delete
Prior art date
Application number
KR1020117014393A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110089433A (ko
Inventor
채드 에이. 머킨
데이비드 에이. 길조한
드와잇 세페로스
앤드류 이. 프리고디치
파이널 씨. 파텔
Original Assignee
노오쓰웨스턴 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노오쓰웨스턴 유니버시티 filed Critical 노오쓰웨스턴 유니버시티
Publication of KR20110089433A publication Critical patent/KR20110089433A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101692880B1 publication Critical patent/KR101692880B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

본 발명은 유전자 조절을 비롯하여 다양한 용도를 가지는, 듀플렉스 RNA로 관능화된 나노입자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 안정성 및 활성 증가를 달성하기 위한, RNA를 나노입자에 접합하는 새로운 전략을 제공한다.

Description

다가 ＲＮＡ-나노입자 구조체{POLYVALENT RNA-NANOPARTICLE COMPOSITIONS}
정부 이해 관계에 대한 진술
본 발명은 국립 암 연구소/암 나노기술 우수 센터(NCI/CCNE)가 지원한 과제 번호 제 5U54 CA119341호 및 국립 보건원(NIH)이 지원한 과제 번호 제 5DP1 OD000285호에 따라 미국 정부의 지원으로 완성된 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 소정의 권리를 가진다.
본 발명은 듀플렉스(duplex) RNA로 관능화된 나노입자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 나노입자에 RNA를 접합하는 방법을 제공한다.
RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 세포 안에 존재할 때 이중 가닥 RNA 중 하나의 가닥에 충분히 상보적인 서열을 가진 유전자의 발현을 저해하는 현상이다. 유전자 발현의 저해는 타겟 유전자로부터 전사된 메신저 RNA(mRNA)의 분해에 의한 것이다 [Sharp et al., Genes and Development 15: 485-490 (2001)]. RNAi를 유발하는 이중 가닥 RNA를 간섭 RNA라고 한다. dsRNA가 RNAi를 매개하는 기전과 세포 기구는 유전자적 방법과 생화학적 방법으로 조사되고 있다. 생화학적 분석에서는, 세포의 세포질로 도입된 dsRNA가 먼저 21-25개의 뉴클레오티드 길이의 RNA 단편으로 가공되는 것으로 보고 있다 [Hammond et al., Nature 404: 293-296 (2000); Hamilton et al., Science 286: 950-952 (1999); Zamore et al., Cell 101: 25-33 (2000); Yang et al., Current Biology 10: 1191-1200 (2000); Parrish et al., Molecular Cell 6: 1077-1087 (2000)]. 소형 간섭 RNA(siRNA)라고 하는 이러한 dsRNA는 RNase III 유사 효소인 Dicer에 의해 적어도 한가지 이상의 기전에 의해 만들어지는 것으로, 시험관내 연구에서 확인되었다 [Hammond et al., Nature 404: 293-296 (2000)]. 타겟 mRNA는 특정 siRNA에 혼성화되는 영역내 센터 위치에서 절단되기 때문에, 이러한 siRNA는 mRNA 절단의 가이드로서 작용할 것으로 보인다 [Sharp 2001]. 생화학적 증거로는, siRNA가 RNA-유도성 침묵 복합체(RISC)라고 하는 다중인자 뉴클레이즈 복합체의 일부인 것으로 추측되고 있다 [Hammond et al., Nature 404: 293-296 (2000)]. 이러한 복합체를 구성하는 단백질들 중 한가지인 Argonaute2는 argonaute 유전자 패밀리의 산물로서 동정되었다 [Sharp et al., Genes and Development 15: 485-490 (2001)]. 이 단백질은 마우스 발생에 필수적이며, Argonaute2 결핍 세포는 siRNA에 대한 실험 반응을 나타낼 수 없다. 고세균의 argonaute 단백질과 구조 비교를 통해 동정된 바에 의하면, Argonaute2에서 숨겨져 있는 리보뉴클레이즈 H 도메인내 돌연변이가, RISC를 불활성화한다. 즉, argonaute는 RISC에 "슬라이서(slicer)" 활성을 제공하여, RNAi에 촉매 엔진을 제공한다 [Liu et al., Science 305(5689): 1437-1441 (2004)].
유전자 연구에서는, 케노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans, C. elegans) 상동체 rde -1 및 관련 유전자, 네우로스포라 크라사(N. crassa) 상동체 qde-2 및 아라비돕시스 상동체 arg -1도 포함하는, 이러한 유전자 패밀리가 RNAi에 필요한 것으로 확인되었다 [Sharp et al., Genes and Development 15: 485-490 (2001); Hammond et al., Nature 404: 293-296 (2000); Hamilton et al., Science 286: 950-952 (1999)]. 케노랍디티스 엘레강스를 유전자 스크리닝하여, RNAi에 필수적인 것으로서 mut -7 유전자를 동정하게 되었다. 이 유전자는 RNAse D와 비슷하여, 이의 유전자 산물이 mRNA 분해 단계에 작용하는 것으로 추측된다 [Sharp et al., Genes and Development 15: 485-490 (2001)].
과거 십년간, 연구자들은 다가 DNA-관능화된 금 나노입자(DNA-Au NP)를 설계하고, 합성하고, 연구하고, 적용하여 왔다 [Mirkin et al., Nature 382: 607 (1996)]. 이러한 노력들로, 하이브리드 나노구조 [Demers et al., Anal. Chem. 72: 5535 (2000); Jin et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 1643 (2003); Lytton-Jean et al., J. Am. Chem Soc 127: 12754-12754 (2005); Storhoff et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 4640 (2000); You et al., Soft Matter 2: 190 (2006); Wang et al., Nanomed. 1: 413 (2006)], 중요한, 특정 경우에서는, 상업적으로 실용적인 검출 및 진단 분석 [Nam et al., Science 301: 1884 (2003); Stoeva et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 8378 (2006); Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 12298 (2004); Faulds et al., Anal. Chem. 76: 412 (2004)], 및 DNA 신톤(synthon)을 사용한 물질의 어셈블리 프로그램을 작성하는 능력 [Mirkin et al., Nature 382: 607 (1996); Park et al., Nature 451: 553 (2008); Nykypanchuk et al., Nature, 451: 549 (2008)]에 대한 새로운 기초적인 지식을 얻게 되었다. 다가 DNA-Au NP는 급격하게 승온된 융점[Jin et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 1643 (2003)], (동일한 서열 가닥이 없는 경우와 비교하여) 결합 특성의 강화[Lytton-Jean et al., J. Am. Chem Soc 127: 12754-12754 (2005)], 및 거리-의존적인 광학 특성[Elghanian et al., Science 277: 1078 (1997)]과 같은 몇 가지 독특한 특징들을 가지고 있다. 다가 분자 시스템에 대한 연구와 부합하여[Gestwicki et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 14922 (2002)], DNA의 높은 표면 밀도와, 나노입자의 여러 자리 상호작용(multidentate interaction)을 이행하는 능력이 이러한 독특한 특성의 근원인 것으로 제시된다.
본 발명은, 구조체가 유전자 조절에 유용하도록 구조체에 물리적 특성을 부여하는 RNA 단일층이 조합된, 나노입자 구조체를 기술한다. 세포에 RNA를 도입하기 위한 다른 물질과는 대조적으로, 상기한 구조체는 단순히 RNA 전달 도구가 아니라, 표면 리간드의 배열과 고밀도로 인해 발생되는 협력적 특성의 이점을 가지는, 단일체(single entity agent)이다. 본원에 기술되는 구조체는 형질감염 물질 없이도 세포에 도입되며, 기존의 폴리머 담체와 비교하여 넉-다운 활성을 강화하는 방식으로 내분해성을 가진다.
따라서, 일부 측면에서, 나노입자 구조체는 나노입자와 조합된 형태로 하나 이상의 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드에는 폴리펩타이드 상호작용 부위가 있으며, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 듀플렉스(duplex)를 형성하는데 적합한 조건에서 듀플렉스를 형성하는 서열을 가지고 있으며, 상기 듀플렉스는, 적절한 엄격 조건 하에서 상기 하나의 가닥과 타겟 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 허용할 만큼 타겟 폴리뉴클레오티드의 서열과 충분히 상보적인 도메인 하나 이상을, 듀플렉스 중 하나의 가닥에 가지고 있으며, 상기 듀플렉스의 도메인과 타겟 폴리뉴클레오티드의 서열 간의 혼성화로 폴리펩타이드에 의해 인지되는 기질 부위가 형성되며, 나노입자와 조합된 RNA 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위와 나노입자에 대해 오리엔테이션 특이적인 방식(orientation specific manner)으로 배치된다.
일부 측면에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드가 나노입자와 공유 결합으로 조합된 형태인, 나노입자 구조체를 제공한다. 다른 측면에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드가 나노입자와 공유 결합으로 조합되어 있지 않은 형태인, 나노입자 구조체를 제공한다.
다른 측면에서, 상기 나노입자와 조합된 각각의 RNA 폴리뉴클레오티드가 동일한 서열을 가지는, 나노입자 구조체를 제공한다. 다른 측면에서, 상기 나노입자와 조합된 2종 이상의 RNA 폴리뉴클레오티드가 상이한 서열을 가지는 나노입자 구조체를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 듀플렉스가 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 형성된 헤어핀 구조를 포함하는, 나노입자 구조체를 제공한다.
본원에 기술된 방법은, 듀플렉스 형성에 적절한 조건 하에서 RNA 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 허용할 만큼 상기 RNA 폴리뉴클레오티드 서열과 충분히 상보적인 서열을 가지고 있는 추가적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 나노입자 구조체에 관한 것이다.
일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 다른 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA)이다.
다른 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 나노입자에 공유 결합으로 조합되어 있다. 일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 나노입자에 공유 결합으로 조합되어 있지 있다.
일부 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위는 RNA 폴리뉴클레오티드의 중심에서 나노입자에 가까운 쪽에 위치되어 있다.
다른 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위는 RNA 폴리뉴클레오티드의 중심에서 나노입자에 먼 쪽으로 위치되어 있다.
상기 방법에 대한 일부 측면들에서, 나노입자 구조체에서, RNA의 표면 밀도는 적어도 약 2 pmol/cm2 - 약 1000 pmol/cm2이다.
다양한 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위는 RNase H, RNase D, RNase L, RNase III, Dicer, Argonaute, Argonaute2, 및 인간 면역결핍 바이러스 전사 촉진 반응 RNA-결합성 단백질(TRBP: transactivating response RNA-binding protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질과 조합된다.
상기 방법의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드의 도메인이 뉴클레오티드 약 10개 길이를 가지는, 나노입자 구조체를 제공한다.
일부 구현예들에서, 나노입자 구조체에서, RNA 폴리뉴클레오티드는 타겟 폴리뉴클레오티드의 제2 서열과 충분히 상보적인 제2 도메인을 포함하며, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드의 제2 도메인이 타겟 폴리뉴클레오티드의 제2 서열에 혼성화되면 제2 폴리펩타이드에 의해 인지되는 추가적인 기질 부위가 형성된다. 일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 도메인은 약 10개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 기질 부위와 추가적인 기질 부위는 동일하다. 다른 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 기질 부위와 추가적인 기질 부위는 상이하다.
일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, RNA 폴리뉴클레오티드와 추가적인 폴리뉴클레오티드는 혼성가능한 충분한 길이에 걸쳐 서로 상보적이다. 다른 측면에서, 나노입자 구조체에서, RNA 폴리뉴클레오티드와 추가적인 폴리뉴클레오티드는 전체 길이가 서로 상보적이다.
일부 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 티오 연결을 통해 나노입자에 접합된다.
일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 나노입자에 조합되어 있지 않은 동일한 RNA 폴리뉴클레오티드의 반감기와 적어도 실질적으로 동일한 반감기를 갖는다. 다른 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 나노입자에 조합되어 있지 않은 동일한 RNA의 반감기 보다 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배이상, 약 5배 이상 긴 반감기를 갖는다.
다양한 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 나노입자 구조체에서, 나노입자는 금이다. 일부 측면에서, 나노입자 구조체에서, 나노입자는 은이다.
일부 측면에서, 티올화된 RNA 폴리뉴클레오티드 이중 가닥과 나노입자의 혼합물을, 약 0.1 M NaCl을 포함하는 1차 용액에서 시작하여, 앞 단계 용액에 비해 소듐 클로라이드(NaCl) 농도가 증가된 각각의 용액들로 구성된, 일련의 용액으로 에이징(aging)하여, RNA 폴리뉴클레오티드를 나노입자에 조합하는 단계를 포함하는, 나노입자에 RNA 폴리뉴클레오티드를 조합하는 방법을 제공한다. 관련 측면으로, 상기 방법은, 최종 에이징 단계 후 혼합물을 초음파 처리하는 단계를 더 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 나노입자를 분리하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 RNA를 나노입자에 조합하는 방법을 제공한다:
(a) 약 0.1 M 소듐 클로라이드(NaCl)를 포함하는 용액에, 티올화된 RNA 이중 가닥과 나노입자를 혼합하는 단계;
(b) 각각 앞 단계 용액 보다 NaCl 농도가 높은 용액으로 구성된, 일련의 염 용액으로 상기 혼합물을 에이징하는 단계;
(c) 상기 혼합물을 초음파 처리하는 단계; 및
(d) 접합된 나노입자를 정제하는 단계.
상기 방법의 다양한 측면에서, 상기 일련의 염 용액은 약 0.1 M 내지 약 0.3 M NaCl이다.
본 발명은, 일부 측면에서, 나노입자의 표면에 올리고(에틸렌 글리콜) 티올(OEG)을 부동태화(passivating)하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 타겟 폴리뉴클레오티드를 본원의 나노입자 구조체의 도메인과 혼성화시켜, 폴리펩타이드에 대한 기질 부위를 형성하는 단계를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 혼성화에 의해 타겟 폴리뉴클레오티드는 분해된다. 다양한 측면으로, 상기 폴리펩타이드는 RNase H, RNase D, RNase L, RNase III, Dicer, Argonaute, Argonaute2, 및 TRBP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가적인 측면들은 하기에 제공되는 상세한 설명을 통해 명확해질 것이다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 사상 및 범위내에서의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 상세한 설명으로부터 자명하므로, 본 발명의 바람직한 구현예들을 나타내고 있는 하기 상세한 설명과 실시예들은 단순한 예에 불과한 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 금 나노입자(NP)의 특징을 나타낸 것이다. 자동 멸균 전(a)과 후(b)의 나노입자의 흡광 스펙트럼 및 TEM 이미지. 막대의 크기는 50 nm이다.
도 2는 금 나노입자의 용액내 RNase의 존재를 나타낸 것이다. 무처리 Au NP에서는 양성 신호가 나타나며, RNase 활성을 제거하도록 처리된 입자는 RNase 미함유 상태가 된다.
도 3은 컨플루언트 HeLa 세포의 광 현미경 사진이다. RNA 나노입자 구조체 합성시, 30μmol/mL 올리고에틸렌 글리콜-티올(OEG-thiol)을 표면 부동태화 리간드로서 RNA 이중 가닥 첨가 후에 첨가한다. 이러한 첨가가 배양물에서 입자 침강을 방지하는 것으로 보인다. (a) 세포 배양물 중의 OEG-티올 무첨가된 RNA-나노입자 구조체에서 입자 침강(블랙)이 확인된다. (b) 세포 배양물 중의 OEG-티올 첨가된 RNA-나노입자 구조체. 막대의 크기는 30 ㎛이다.
도 4는 RNA-Au NP의 세포 흡수를 나타낸 것이다. (a) RNA-Au NP(Cy5 표지된 RNA)와 함께 6시간 배양한 HeLa 세포의 형광 현미경 사진. 막대의 크기는 20 ㎛이다. (b) RNA-Au NP 처리 세포 대 무처리 대조군을 비교한, 유세포 측정 분석 결과.
도 5는 (a) 4일간의 루시퍼레이즈 발현 넉-다운과, (b) RNA-Au NP의 안정성을 나타낸 것이다. dsRNA(■)와 RNA-Au NP(▲) 안정성을 10% 혈청 중에서 비교함.
도 6은 2개의 가닥 또는 하나의 가닥의 헤어핀 RNA로 관능화된 RNA-Au NP에 대한 RNase III의 활성을 나타낸 것이다. 2가지 시스템 모두 기질로서 RNase III에 의해 인지된다. 최대 형광 차이는 부분적으로는 로딩(loading) 차이로 인한 것이다(표 1 참조). 효소를 첨가하지 않은 반응을 백그라운드 보정용으로 사용하였다.
도 7은 2 가닥(센스/FITC AS, AS/FITC 센스) 또는 단일 가닥의 헤어핀 RNA(FITC HP)로 관능화된 RNA-Au NP에 대한 Dicer의 활성을 나타낸 것이다. 2가지 시스템 모두 기질로서 Dicer에 의해 인지되지만, 센스 가닥이 고정된 경우에 더 높은 활성을 관찰할 수 있다. 최대 형광 차이는 부분적으로는 로딩(loading) 차이로 인한 것이다(표 1 참조). 효소를 첨가하지 않은 반응을 백그라운드 보정용으로 사용하였다.
도 8은 고정된 센스, 안티센스 및 헤어핀 RNA-Au NP에 대한 RNase III 활성을 나타낸 것이다. 이 효소에 대한 높은 활성은 센스 가닥이 고정된 경우에 관찰할 수 있다.
지금까지, RNA의 세포막을 통한 유입 및 수송에 다가 입자와 이의 특수한 특성을 이용한 방법들은 개발되지 않았다. 실제, RNA와 관련된 가장 난제 중 한가지, 특히 이의 화학적 불안정성을 해결하는 합성 경로와 물질의 개발이 필요하다.
RNAi에 의해 타겟 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 능력은 당연히 유익하다. 예를 들면, 많은 질병들은 특정 유전자나 유전자 그룹의 비정상적인 발현으로 인해 생긴다. RNAi는 유해한 유전자의 발현을 저해하는데 사용하여, 질병의 증상을 완화시키거나, 심지어 치유할 수 있다. 예컨대, 암성 상태나 바이러스 복제에 기여하는 유전자를 저해할 수 있다. 또한, 근긴장 디스트로피(myotonic dystrophy)와 같은, 우성 유전 질환을 야기하는 돌연변이 유전자를 저해할 수도 있다. 관절염과 같은 염증 질환들 역시 사이클로옥시게네이즈 또는 사이토카인 등의 이러한 유전자를 저해함으로써 치료할 수 있다. 타겟이 되는 장기의 예로는, 간, 췌장, 비장, 피부, 뇌, 전립선, 심장 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, RNAi를 이용함으로써, 유전자 기능을 연구하기 위한, 실제 유전자 "넉-아웃" 동물을 모방한 동물을 제조할 수 있다. 용도와 타겟에 대한 추가적인 내용은 아래에 제공된다.
또한, 약물 개발 역시 RNA 기법에 의해 촉진될 수 있다. 타겟 검증을 위한 RNA 방법은 잠재적인 약물 타겟을 탐색하는 보다 신속하고 비용이 적게 드는 방법을 제공한다. 약물의 타겟팅 정보는, 잠재적인 약물 타겟을 저해시키고, 저해되는 단백질, 즉 경로가 현저한 표현형 측면에서 효과가 있는지를 결정함으로써 수득한다. 예를 들어, LDL 수용체의 발현 저해시, 혈장내 LDL의 농도가 상승되어야 하며, 이는, 수용체의 상향 조절이 치료학적으로 유익함을 시사한다. 발현 어레이를 사용함으로써, 타겟 유전자 또는 경로 이외의 다른 유전자의 발현에 대한 반응성 저해 효과를 측정할 수 있다 [Sharp et al., Genes and Development 15: 485-490 (2001)]. 이로써 기능적 경로 및 네트워크(상호작용하는 경로)에 참여하는 유전자 산물이 찾아지게 된다.
RNA 올리고뉴클레오티드로 관능화된 금 나노입자는, 올리고뉴클레오티드의 표면 관능화로 인해 생기는 총체적인 특성을 이용하여, 촉매적 RNA 상호작용 경로에 대한 작용력을 유지하면서, 결합된 RNA의 안정성과 효능을 증가시킨다.
다가 RNA-나노입자 구조체(나노입자가 금인 경우, RNA-Au NP)의 합성시, 모든 물질들에는 RNA 리간드를 분해하여 Au 표면을 노출시킴으로써 Au NP 상호작용을 불안정하게 하는, RNase와 같은 뉴클레이즈가 함유되어 있지 않아야 한다. RNase 미함유성 유기 성분 및 용액을 제조하는 조건은 잘 확립되어 있으며, 본 발명에서는 RNase 미함유성 무기 금 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용됨을 유념해야 한다. 또한, 용어 "접합된" 및 "관능화된" 역시 본원에서 상호 호환적으로 사용됨을 유념해야 한다.
본원에서, "기질 부위"는 폴리펩타이드에 의해 인지되고 폴리펩타이드에 의해 작용되는, 폴리뉴클레오티드(단일 가닥 또는 이중 가닥) 상의 위치이다. 본원에서, "에 의해 작용되는"은 기질 부위를 인지하여 기질 부위에 결합되는 폴리펩타이드에 의해 수행되는 임의의 효소적 기능을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에서, "폴리펩타이드 상호작용 부위"는 폴리펩타이드에 의해 인지되는 폴리뉴클레오티드(단일 가닥 또는 이중 가닥) 상의 부위이다. 폴리펩타이드에 의해 상호작용 부위가 인지되면, 여러가지 측면에서, 폴리뉴클레오티드가 절단된다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 상호작용 부위를 인지하는 폴리펩타이드 자체가 폴리뉴클레오티드에 작용하거나, 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 인지 부위를 인지하는 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드의 활성이 상기 폴리뉴클레오티드에 작용하게끔 한다.
본원에서, 용어 "타겟" 또는 "타겟 폴리뉴클레오티드"는 주어진 RNA 폴리뉴클레오티드가 안내(directing)될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서, "RNA"는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에서, "듀플렉스(duplex)"는 왓슨-크릭 염기 쌍 결합 또는 그외 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥들 간에 안정적인 듀플렉스를 허용하는 방식에 의해, 서로 염기 쌍을 형성하고 있는 2개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 영역을 지칭한다. 예컨대, 21개의 뉴클레오티드 유닛을 가지는 폴리뉴클레오티드 가닥은, 21개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된 다른 폴리뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룰 수 있지만, 각 가닥에서 19개의 염기만 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적이면, "듀플렉스"는 19개의 염기 쌍으로 구성된다. 나머지 염기들은, 예컨대 5' 및 3' 오버행(overhang)으로서 존재할 수 있다. 또한, 듀플렉스에서 100% 상보성이 필수적인 것은 아니며, 실질적인 상보성도 듀플렉스에서 용인된다. 실질적인 상보성은 75% 이상의 상보성을 의미한다. 예를 들어, 19개의 염기 쌍으로 이루어진 듀플렉스에서 하나의 미스매치가 있으면, 이의 상보성은 94.7%이며, 듀플렉스에 실질적인 상보성이 부여된다.
나노입자
이에, 폴리뉴클레오티드가 부착되어 관능화된 나노입자를 제공한다. 나노입자의 크기, 형태 및 화학적 구성은 제조되는 폴리뉴클레오티드-관능화된 나노입자의 특성에 기여한다. 이러한 특성은, 예를 들어, 광학 특성, 광전자 특성, 전기화학적 특성, 전자 특성, 다양한 용액에서의 안정성, 자기 특성 및 포어와 채널 크기의 편차를 포함한다. 여러가지 크기, 형태 및/또는 화학적 구성을 가지는 나노입자들의 혼합물, 그리고 동일한 크기, 형태 및 화학적 조성을 가지는 나노입자의 용도, 및 따라서 특징의 혼합이 고려된다. 적합한 입자의 예로는, 미국 특허 7,238,472 및 국제 특허 WO 2003/08539에 언급된 바와 같은, 입자 응집체, 등방성 입자(예, 구형 입자), 이방성 입자(예, 비-구형 로드, 사변체 및/또는 프리즘) 및 코어-셀 입자가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 나노입자는 금속이며, 다양 측면에서 나노입자는 콜로이드 금속이다. 즉, 다양한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 금속(예컨대, 비제한적으로, 은, 금, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈 또는 나노입자를 형성할 수 있는 그외 모든 금속), 반도체(예컨대, 비제한적으로, CdSe, CdS, 및 ZnS로 코팅된 CdS 또는 CdSe), 및 자기(예, 강자성체) 콜로이드 물질을 포함한다.
또한, 미국 특허 공개번호 2003/0147966에 언급된 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 상업적으로 이용가능한 것, 뿐만 아니라 합성, 예컨대 용액에서의 점진적인 핵형성(progressive nucleation)(예, 콜로이드 반응에 의해)으로 제조되거나 또는 스퍼터링 증착(sputter deposition)과 같은 다양한 물리적 및 화학적 증기 증착 과정에 의해 합성되는 것을 포함한다. 예로, HaVashi, Vac. Sci. Technol. A5(4) :1375-84 (1987); Hayashi, Physics Today, 44-60 (1987); MRS Bulletin, January 1990, 16-47을 참조한다. 미국 출원 공개번호 2003/0147966에서 추가로 언급된 바와 같이, 다른 방법으로 당해 기술 분야의 공지된 방법을 이용하여, HAuCl4 및 사이트레이트-환원제를 이용하여 나노입자를 생산하는 것도 포함한다. 예로, Marinakos et al ., Adv. Mater. 11:34-37(1999); Marinakos et al ., Chem. Mater. 10: 1214-19(1998); Enustun & Turkevich, J. Am. Chem. Soc. 85: 3317(1963)을 참조한다.
나노입자의 크기 범위는 평균 직경(mean diameter) 약 1 nm - 약 250 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 240 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 230 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 220 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 210 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 200 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 190 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 180 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 170 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 160 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 150 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 140 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 130 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 120 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 110 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 100 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 90 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 80 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 70 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 60 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 50 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 40 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 30 nm, 평균 직경 또는 약 1 nm - 약 20 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 10 nm일 수 있다. 다른 측면에서, 나노입자의 크기는 약 5 nm - 약 150 nm (평균 직경), 약 5 - 약 50 nm, 약 10 - 약 30 nm, 약 10 - 150 nm, 약 10 - 약 100 nm, 또는 약 10 - 약 50 nm이다. 나노입자의 크기는 약 5 nm - 약 150 nm (평균 직경), 약 30 - 약 100 nm, 약 40 - 약 80 nm이다. 본 발명에 사용되는 나노입자의 크기는 이 입자의 용도 또는 적용에 따라 변경된다. 크기 변화는 나노입자의 특정 물리적 특징, 예컨대 광학 특징 또는 본원에 기술된 바와 같이 유도체화될 수 있는 표면적의 크기를 최적화하는데 유용하게 이용된다.
나노입자에 대한 폴리뉴클레오티드의 부착
듀플렉스 RNA가 나노입자에 조합되어 있는, 폴리뉴클레오티드가 부착된 나노입자를 제공한다. 일부 측면에서, 나노입자에 조합되어 있는 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 듀플렉스 RNA와 나노입자의 조합은 다양한 방식으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법에서, 사이트레이트-안정화된 금 나노입자를 합성하고, 이 입자에 12시간 동안 교반하면서 0.1% 디에틸피로카르보네이트(DEPC)를 처리한 다음, 121℃에서 60분간 자동멸균한다. 일부 측면에서, 나노입자에 DEPC의 처리는 약 1시간 동안 수행된다. 다양한 측면에서, 나노입자에 DEPC의 처리는 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 9.5시간, 약 10시간, 약 10.5시간, 약 11시간, 약 11.5시간, 약 12시간, 약 12.5시간, 약 13시간, 약 13.5시간, 약 14시간, 약 14.5시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 25시간, 약 30시간, 약 3일, 약 7일 또는 그 이상 동안 수행된다.
일 구현예에서, 단일 가닥 RNA 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 본원에 기술된 스페이서를 통해 나노입자에 직접 연결된다. 단일 가닥 RNA 폴리뉴클레오티드가 나노입자에 부착되는 상기한 측면에서, RNA 폴리뉴클레오티드는 헤어핀 구조 형성에 적합한 조건 하에서 2 부분이 서로 혼성화가능하게 충분히 상보적인 2 부분을 포함한다.
다른 구현예에서, 듀플렉스 RNA는 듀플렉스 RNA의 하나의 가닥만 나노입자에 직접 부착되도록, 선택적으로 본원에 언급된 스페이스를 통해, 나노입자에 직접 고정된다.
다른 구현예에서, 나노입자에 부착되는 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. DNA가 나노입자에 부착되는 경우, 나노입자에 부착된 DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 듀플렉스의 단일 가닥 영역 간에 혼성화가 이루어져, 상기 RNA 듀플렉스가 나노입자에 조합되도록, 상기 DNA는 RNA 듀플렉스의 단일 가닥 영역에 충분히 상보적인 서열을 포함한다. 일 측면에서, RNA 듀플렉스의 단일 가닥 영역은 오버행잉 엔드(overhanging end)이다. DNA는 다양한 측면에서 단일 가닥이거나 이중 가닥이며, 단, 이중 가닥 분자 역시 RNA 듀플렉스의 단일 가닥 영역에 혼성하는 단일 가닥 영역을 포함하고 있다.
폴리뉴클레오티드의 오리엔테이션
센스 대 안티센스
일부 측면에서, 나노입자에 부착되는 RNA의 가닥은 "센스" 가닥이고, RNA 듀플렉스에 대해 상보적인 가닥은 상기 센스 가닥에 혼성화되어 있지만, 나노입자에 부착되어 있진 않다. 다른 측면에서, 나노입자에 부착된 RNA의 가닥은 "안티센스" 가닥이고, RNA 듀플렉스에 대해 상보적인 가닥은 상기 안티센스 가닥에 혼성화 되어 있지만, 나노입자에 부착되어 있진 않다. 본원에서, "센스" 가닥은 타겟 폴리뉴클레오티드와 동일한 가닥이고, "안티센스" 가닥은 타겟 폴리뉴클레오티드에 상보적인 가닥이다. 나노입자에 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 부착은 나노입자에 대한 이중 가닥 RNA의 오리엔테이션의 일 측면을 결정한다.
센스 가닥이 나노입자에 부착되어 있고 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥에 혼성화되어 있지만 나노입자에 부착되어 있지 않은, RNA 듀플렉스가, 안티센스 가닥이 나노입자에 부착되어 있고 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 혼성화되어 있지만 나노입자에 부착되어 있지 않은, RNA 듀플렉스에 비해, 더 높은 활성을 가지는 것으로 확인되었다(실시예 5 참조). 이론으로 결부시키지 않으며, 나노입자에 대한 RNA 듀플렉스의 부착 오리엔테이션은 (예컨대, 비제한적으로, RNA 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 나노입자에 부착되었는지는), 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에 대한 기질 제시에 중요한 것으로 생각된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 Dicer이다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 Argonaute이다.
폴리펩타이드 상호작용 부위의 위치
일부 구현예에서, 본 발명은, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오티드가 RNA인 것을 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA의 서열에 위치한 단백질 상호작용 부위가 나노입자에 대해 근위 또는 원위로 위치되도록 나노입자에 부착된다. 이러한 측면에서, "근위" 및 "원위"는 폴리뉴클레오티드의 중심점을 기준으로 한다. 예컨대, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오티드가 20개의 염기 길이이라면, 중심점은 나노입자로부터 10개의 염기 간격으로 떨어져 있는 위치이며, 단백질 상호작용은 10번째 염기에 대해 근위이거나 원위일 수 있다.
본원에 기술된 방법을 이용하여 나노입자 상에 RNA 폴리뉴클레오티드를 고정함으로써, 이러한 듀플렉스에 대한 본원의 폴리펩타이드의 접근성을 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 다양한 길이의 스페이서 서열을 이용하여 나노입자 상에 있는 RNA 폴리뉴클레오티드의 수와 간격을 변형시킴으로써, 타겟 폴리뉴클레오티드의 분해율을 조절한다. 이론으로 결부시키지 않으며, 단백질 상호작용 부위가 전술한 바와 같이 근위 위치에 있도록 RNA 폴리뉴클레오티드를 나노입자 상에 고정시킴으로써, 타겟 폴리뉴클레오티드의 분해율을 조절할 수 있다. 이러한 측면을, 후술되는 바와 같이 표면 밀도와 조합함으로써, 본원의 폴리펩타이드가 단백질 상호작용 부위로 접근하게 하거나 또는 접근하지 못하게 할 수 있다.
스페이서는 하기에서 더욱 상세하게 설명된다.
스페이서
특정 측면에서, 관능화된 나노입자는, 스페이서를 통한 올리고뉴클레오티드의 나노입자로의 부착을 포함한다. 본원에서 "스페이서"는 그 자체로는 유전자의 발현 조절에 참여하지 않지만, 나노입자와 관능기 올리고뉴클레오티드 사이의 거리를 넓히거나 또는 나노입자에 복수의 카피 수로 부착되었을 경우 각각의 올리고뉴클레오티드 간의 간격을 넓히기 위해 제공되는 모이어티를 의미한다. 따라서, 스페이서는, 올리고뉴클레오티드들이 동일한 서열이거나 또는 다른 서열을 가지던 간에, 각각의 올리고뉴클레오티드에 직렬식으로 위치되는 것으로 본다. 일 측면에서, 존재하는 경우 스페이서는 유기 모이어티이다. 다른 측면에서, 스페이서는 폴리머이며, 예컨대 수용성 폴리머, 핵산, 폴리펩타이드, 올리고사카라이드, 탄수화물, 지질, 에틸글리콜 또는 이의 조합을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 측면에서, 스페이서는 나노입자에 결합할 수 있는 공유 결합된 폴리뉴클레오티드를 가진다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 나노입자에 스페이서가 결합됨으로써, 폴리뉴클레오티드는 나노입자의 표면과 떨어져 배치되어, 이에 대한 표적과의 혼성화 접근성이 더 좋아진다. 스페이서가 폴리뉴클레오티드인 경우, 다양한 구현예에서, 스페이서의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 10-30개의 뉴클레오티드, 또는 심지어 30개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 스페이서는 나노입자 또는 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합되게 되는 폴리뉴클레오티드의 결합력을 간섭하지 않는, 임의의 서열을 가질 수 있다. 스페이서는 서로 또는 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 가지지 않아야 하지만, 타겟 폴리뉴클레오티드에 일부분이 또는 전체가 상보적일 수도 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 스페이서의 염기는 모두 아데닌, 모두 티민, 모두 시티딘, 모두 구아닌, 모두 우라실이거나 또는 모두 일부 다른 변형된 염기이다.
표면 밀도
본원에서 제시되는 나노입자는, 다양한 측면에서, 나노입자들 간의 협력적 행태와 하나의 나노입자에서 폴리뉴클레오티드 가닥들 간의 협력적 행태를 이루는데 충분한 충진 밀도(packing density)로 폴리뉴클레오티드를 나노입자 표면 상에 포함한다. 다른 측면에서, 나노입자들 간의 협력적 행태는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레이즈 분해 내성을 증가시킨다. 또다른 측면에서, 세포에 의한 나노입자의 흡수는 나노입자에 조합된 폴리뉴클레오티드의 밀도에 의해 영향을 받는다. PCT/US2008/65366에 기술된 바와 같이, 나노입자 상에 고밀도의 폴리뉴클레오티드는 세포의 나노입자 흡수 증가와 연관된다.
나노입자 및 폴리뉴클레오티드의 바람직한 조합을 위해, 나노입자를 안정시키는데 적합한 표면 밀도와 이를 달성하기 위한 필수 조건은 실험을 통해 정할 수 있다. 일반적으로, 안정적인 나노입자-올리고뉴클레오티드 구조체를 제공하는데에는 표면 밀도 2 pmoles/cm2 이상이 적합할 것이다. 일부 측면에서, 상기 표면 밀도는 적어도 15 pmoles/cm2이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 나노입자에 표면 밀도 적어도 2 pmol/cm2, 적어도 3 pmol/cm2, 적어도 4 pmol/cm2, 적어도 5 pmol/cm2, 적어도 6 pmol/cm2, 적어도 7 pmol/cm2, 적어도 8 pmol/cm2, 적어도 9 pmol/cm2, 적어도 10 pmol/cm2, 적어도 약 15 pmol/cm2, 적어도 약 20 pmol/cm2, 적어도 약 25 pmol/cm2, 적어도 약 30 pmol/cm2, 적어도 약 35 pmol/cm2, 적어도 약 40 pmol/cm2, 적어도 약 45 pmol/cm2, 적어도 약 50 pmol/cm2, 적어도 약 55 pmol/cm2, 적어도 약 60 pmol/cm2, 적어도 약 65 pmol/cm2, 적어도 약 70 pmol/cm2, 적어도 약 75 pmol/cm2, 적어도 약 80 pmol/cm2, 적어도 약 85 pmol/cm2, 적어도 약 90 pmol/cm2, 적어도 약 95 pmol/cm2, 적어도 약 100 pmol/cm2, 적어도 약 125 pmol/cm2, 적어도 약 150 pmol/cm2, 적어도 약 175 pmol/cm2, 적어도 약 200 pmol/cm2, 적어도 약 250 pmol/cm2, 적어도 약 300 pmol/cm2, 적어도 약 350 pmol/cm2, 적어도 약 400 pmol/cm2, 적어도 약 450 pmol/cm2, 적어도 약 500 pmol/cm2, 적어도 약 550 pmol/cm2, 적어도 약 600 pmol/cm2, 적어도 약 650 pmol/cm2, 적어도 약 700 pmol/cm2, 적어도 약 750 pmol/cm2, 적어도 약 800 pmol/cm2, 적어도 약 850 pmol/cm2, 적어도 약 900 pmol/cm2, 적어도 약 950 pmol/cm2, 적어도 약 1000 pmol/cm2 또는 그 이상으로 결합시키는 방법을 제공한다.
나노입자에서 폴리뉴클레오티드의 표면 밀도는, 특이적인 폴리펩타이드와 표면 상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 나노입자 자체와의 상호작용을 조절하는 것으로 확인되고 있다. 여러가지 조건에서, 일부 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오티드의 밀도에 의해 생기는 입체 장애로 인해 나노입자에 조합된 폴리뉴클레오티드와의 상호작용이 저지될 수 있다. 입체 장애에 의해 가로막힌 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 것이 바람직한 경우, 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오티드와 상호작용 할 수 있도록, 나노입자의 폴리뉴클레오티드 표면 밀도를 낮춘다.
또한, 폴리뉴클레오티드의 표면 밀도가 나노입자에 조합된 폴리뉴클레오티드의 안정성을 조절하는 것으로 확인되었다. 일 구현예에서, 나노입자에 조합된 RNA 폴리뉴클레오티드는, RNA 폴리뉴클레오티드가 나노입자에 조합되어 있지 않은 동일한 RNA 폴리뉴클레오티드의 반감기와 거의 실질적으로 동일한 반감기를 가진다. 다른 측면에서, 나노입자에 조합된 RNA 폴리뉴클레오티드는, 나노입자에 조합되어 있지 않은 동일한 RNA 폴리뉴클레오티드의 반감기 보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배 이상, 약 200배 이상, 약 300배 이상, 약 400배 이상, 약 500배 이상, 약 600배 이상, 약 700배 이상, 약 800배 이상, 약 900배 이상, 약 1000배 이상, 약 5000배 이상, 약 10,000배 이상, 약 50,000배 이상, 약 100,000배 이상, 약 200,000배 이상, 약 300,000배 이상, 약 400,000배 이상, 약 500,000배 이상, 약 600,000배 이상, 약 700,000배 이상, 약 800,000배 이상, 약 900,000배 이상, 약 1,000,000배 이상 긴, 반감기를 가진다.
폴리뉴클레오티드의 부착 방법
방법에 이용되는 것으로 고려되는 폴리뉴클레오티드는 임의의 수단을 통해 나노입자에 결합되는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 나노입자에 부착하는 방식과 상관없이, 다양한 측면에서, 5' 연결, 3' 연결, 일부 내부 연결(internal linkage) 또는 이들의 임의 조합을 통해 부착이 이루어진다.
일 측면에서, 나노입자, 폴리뉴클레오티드 또는 이 둘다는, 나노입자에 폴리뉴클레오티드의 부착을 위해 관능화된다. 나노입자와 폴리뉴클레오티드를 관능화하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 3'-말단 또는 5'-말단에 알칸티올로 관능화된 폴리뉴클레오티드가 금 나노입자에 쉽게 부착된다. Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121 (1995)을 참조한다. 또한, Mucic et al. [Chem. Commun. 555-557 (1996)]에는 평평한 금 표면에 3' 티올 DNA를 부착하는 방법이 기술되어 있는데, 이를 참조한다. 또한, 알칸티올 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 다른 금속, 반도체 및 자기 콜로이드 및 다른 타입의 본원의 나노입자에 부착할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 고상 표면에 부착하기 위한 다른 관능기로는, 포스포로티오에이트기(예, 미국 특허 5,472,881의 금 표면에 올리고뉴클레오티드-포스포로티오에이트 결합을 참조함), 치환된 알킬실록산[(예, Burwell, Chemical Technology, 4, 370-377 (1974) 및 Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981)의 실리카 및 유리 표면에 올리고뉴클레오티드의 결합과, Grabar et al., [Anal. Chem., 67, 735-743]의 아미노알킬실록산의 결합 및 머캅토알킬실록산에 대한 유사 결합을 참조함]이 있다. 5' 티오뉴클레오시드 또는 3' 티오뉴클레오시드를 가진 폴리뉴클레오티드 역시 고상 표면에 올리고뉴클레오티드를 부착하는데 사용할 수 있다. 하기 참조문헌들은 나노입자에 올리고뉴클레오티드 부착에 적용할 수 있는 그외 방법들을 기술한다: Nuzzo et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 2358 (1987) (금 상에 다이설파이드); Allara and Nuzzo, Langmuir, 1, 45 (1985) (알루미늄 상에 카르복시산); Allara and Tompkins, J. Colloid Interface Sci., 49, 410-421 (1974) (구리 상의 카르복시산); Iler, The Chemistry Of Silica, Chapter 6, (Wiley 1979) (실리카 상의 카르복시산); Timmons and Zisman, J. Phys. Chem., 69, 984-990 (1965) (플라티늄 상의 카르복시산); Soriaga and Hubbard, J. Am. Chem. Soc., 104, 3937 (1982) (플라티늄 상의 방향족 고리 화합물); Hubbard, Acc. Chem. Res., 13, 177 (1980) (플라티늄 상의 설폴란, 설폭사이드 및 그외 관능화된 용매); Hickman et al., J. Am. Chem. Soc., 111, 7271 (1989) (플라티늄 상의 이소니트릴); Maoz and Sagiv, Langmuir, 3, 1045 (1987) (실리카 상의 실란); Maoz and Sagiv, Langmuir, 3, 1034 (1987) (실리카 상의 실란); Wasserman et al., Langmuir, 5, 1074 (1989) (실리카 상의 실란); Eltekova and Eltekov, Langmuir, 3, 951 (1987) (티타늄 다이옥사이드 및 실리카 상의 방향족 카르복시산, 알데하이드, 알코올 및 메톡시기); Lec et al., J. Phys. Chem., 92, 2597 (1988) (금속 상의 단단한 포스페이트).
미국 출원번호 09/760,500 및 09/820,279와, 국제 출원번호 PCT/US01/01190 및 PCT/US01/10071에는, 사이클릭 다이설파이드로 관능화된 올리고뉴클레오티드가 기술되어 있다. 특정 측면에서, 사이클릭 다이설파이드는 2개의 황 원자를 포함하여, 고리에 5 또는 6개의 원자를 가지고 있다. 적합한 사이클릭 다이설파이드는 상업적으로 구입가능하거나 또는 공지된 방법으로 합성한다. 또한 사이클릭 다이설파이드의 환원된 형태를 이용한 관능화도 생각할 수 있다. 3환 사이클릭 다이설파이드에 고정되어 있는 기를 이용한 관능화는 PCT/US2008/63441에 기술되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
사이클릭 다이설파이드 관능화를 이용하는 특정 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 링커를 통해 나노입자에 부착된다. 일 구현예에서, 상기 링커는 사이클릭 다이설파이드에 부착된 탄화수소 모이어티를 포함한다. 적합한 탄화수소는 상업적으로 구입가능하며, 사이클릭 다이설파이드에 부착된다. 탄화수소 모이어티는, 일 측면에서, 스테로이드 잔기이다. 사이클릭 다이설파이드에 부착된 스테로이드 잔기를 포함하는 링커를 이용하여 제조된 올리고뉴클레오티드-나노입자 구조체가, 링커로서 알칸티올이나 어사이클릭 다이설파이드으로 이용하여 제조된 구조체 보다 더 안정적이며, 특정 경우에, 올리고뉴클레오티드-나노입자 구조체는 300배 이상 더 안정적인 것으로 확인되었다. 특정 구현예에서, 사이클릭 다이설파이드에서 2개의 황 원자는 황 원자 2개가 모두 나노입자에 동시에 부착될 만큼 충분히 근접해 있다. 다른 측면에서, 2개의 황 원자는 서로 인접하여 있다. 이러한 경우, 탄화수소 모이어티는 나노입자의 표면을 덮는 소수성 표면을 제공할 만큼 크다.
다른 측면에서, 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 부착하는 방법은, 1999년 6월 25일자 미국 출원번호 09/344,667; 2000년 6월 26일자 미국 출원번호 09/603,830; 2001년 1월 12일자 미국 출원번호 09/760,500; 2001년 3월 28일자 미국 출원번호 09/820,279; 2001년 8월 10일자 미국 출원번호 09/927,777; 1997년 7월 21일자 국제 출원번호 PCT/US97/12783; 2000년 6월 26일자 PCT/US00/17507; 2001년 1월 12일자 PCT/US01/01190; 2001년 3월 28일자 PCT/US01/10071에 기술되어 있는 에이징 프로세스를 토대로 하며, 이들 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 에이징 프로세스는 안정성 및 선택성이 강화된 나노입자-올리고뉴클레오티드 구조체를 제공한다. 이러한 프로세스는, 일 측면에서, 나노입자에 결합할 수 있는 관능기를 포함하는, 모이어티가 공유결합으로 결합되어 있는, 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함한다. 모이어티와 관능기는 올리고뉴클레오티드를 나노입자에 (화학흡착 또는 공유 결합에 의해) 결합시킨다. 예컨대, 5' 또는 3' 말단에 공유 결합으로 알칸티올, 알칸다이설파이드 또는 사이클릭 다이설파이드가 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 올리고뉴클레오티드를 금 나노입자 등의 다양한 나노입자에 결합시킬 수 있다.
"에이징" 단계로 만들어지는 구조체는, "에이징" 단계 없이 제조된 산물에 비해 꽤 안정적인 것으로 확인되었다. 나노입자의 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 밀도 증가는 "에이징" 단계에 의해 달성된다. "에이징" 단계에 의해 달성되는 표면 밀도는, 나노입자의 크기와 타입, 그리고 올리고뉴클레오티드의 길이, 서열 및 농도에 따라 결정될 것이다. 바람직한 나노입자 및 올리고뉴클레오티드의 조합을 위해, 이를 수득하는데 필수적인 조건과 안정적인 나노입자를 제조하는데 적합한 표면 밀도는, 경험으로 결정할 수 있다. 일반적으로, 표면 밀도 2 picomoles/cm2 이상이, 안정적인 나노입자-올리고뉴클레오티드 구조체를 제공하는데 적합할 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 다양한 밀도들도 본원에 포함된다.
"에이징" 단계는 나노입자에 올리고뉴클레오티드를 처음 결합시켜 관능화된 나노입자를 제조하는데 사용된다. 간략하게는, 올리고뉴클레오티드를 나노입자와 수중에서 적어도 일부의 올리고뉴클레오티드가 나노입자에 관능기에 의해 결합되기에 충분한 시간 동안 접촉시킨다. 이러한 시간은 경험을 통해 결정할 수 있다. 일 측면에서, 약 12-24시간이다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 결합에 적합한 다른 조건들 역시 경험으로 정할 수 있다. 예컨대, 나노입자 농도 약 10-20 nM, 실온에서의 인큐베이션을 포함한다.
다음으로, 1종 이상의 염을 물에 첨가하여 염 용액을 만든다. 염은 임의의 적합한 수용성 염일 수 있으며, 예로, 소듐 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 암모늄 클로라이드, 소듐 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 이들 염 2종 이상의 조합, 또는 인산염 완충액 중의 이들 염 용액일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 염은 농축 용액으로서 첨가되거나 또는 다른 예로 고형으로도 첨가될 수 있다. 다양한 구현예에서, 염은 물에 한꺼번에 첨가하거나, 또는 시간 경과에 따라 서서히 첨가할 수 있다. "시간 경과에 따라 서서히"는 염을 일정 시간 간격으로 2회 이상으로 나누어 첨가하는 것을 의미한다. 적절한 시간 간격은 경험을 통해 결정할 수 있다.
염 용액의 이온 세기는 올리고뉴클레오티드 서로 간의 정전기적 반발과, 양으로 하전된 나노입자의 경우 이에 대한 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드의 정전기적 인력을, 또는 음으로 하전된 나노입자의 경우 이에 대한 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드의 정전기적 반발을 일정 부분 이상으로 해결하기에 충분하여야 한다. 염을 시간 경과에 따라 서서히 첨가함으로써 정전기적 인력과 반발을 서서히 감소시키면, 나노입자 상에 올리고뉴클레오티드가 최고 표면 밀도로 구비된다. 적절한 이온 세기는 각 염 또는 염의 조합에 대해 경험을 통해 결정할 수 있다. 일 측면에서, 인산 완충액 중에서 소듐 클로라이드는 최종 농도 약 0.01 M 내지 약 1.0 M로 사용되며, 시간 경과에 따라 소듐 클로라이드의 농도를 높인다. 다른 측면에서, 소듐 클로라이드는 최종 농도 약 0.01 M - 약 0.5 M, 또는 약 0.1 M - 약 0.3 M로 사용되며, 시간 경과에 따라 소듐 클로라이드의 농도를 높인다.
염을 첨가한 후, 올리고뉴클레오티드와 나노입자를, 추가적인 올리고뉴클레오티드가 나노입자에 결합하기에 충분한 시간 동안 염 용액 중에서 인큐베이션하여, 안정적인 나노입자-올리고뉴클레오티드 구조체를 제조한다. 본원에 기술된 바와 같이, 나노입자 상의 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도 증가는 구조체를 안정시킨다. 이의 인큐베이션 시간은 경험으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 총 배양 시간 약 24-48 시간 동안 염 농도를 전체 시간 동안 서서히 증가시키는 방법이 고려된다. 염 용액내에서의 이러한 2차 인큐베이션 기간은 본원에서 "에이징" 단계로 언급된다. 또한, 이러한 "에이징" 단계에 적합한 그외 조건들 역시 경험으로 결정할 수 있다. 예로, 에이징 단계는 실온 및 pH 7.0에서의 인큐베이션으로 수행한다.
"에이징" 단계로 만들어지는 구조체는, "에이징" 단계 없이 제조한 산물에 비해 꽤 안정적이다. 전술한 바와 같이, 이러한 안정성 증가는 "에이징" 단계에 의해 달성된 나노입자 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 밀도 증가로 인한 것이다. "에이징" 단계에 의해 달성되는 표면 밀도는, 나노입자의 크기와 타입, 그리고 올리고뉴클레오티드의 길이, 서열 및 농도에 따라 결정될 것이다.
본원에서, "안정적인"은 구조체 제조 후 적어도 6달의 기간 동안 대부분의 올리고뉴클레오티드가 나노입자에 부착된 상태로 남아있으며, 핵산 검출 방법 및 나노제조 방법에서 직면하는 표준 조건하에서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 및 올리고뉴클레오티드 타겟과 혼성화할 수 있는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드
본원에서 용어 "뉴클레오티드" 또는 이의 복수형은 본원에서 논의되거나 당해 기술 분야에 공지된 변형된 형태와 상호 호환된다. 특정 예로, 당해 기술 분야에서는, 천연 뉴클레오티드와 중합될 수 있는 뉴클레오티드의 변형을 포괄하는 "뉴클레오베이스"가 사용된다. 즉, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스는 천연 아데노신(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)과, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N',N'-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신(mC), 5-(C3-C6)-알키닐-사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner et al ., 미국 특허. 5,432,272와 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443에 기재된 "비천연" 뉴클레베이스 등의 비천연 뉴클레오베이스를 의미한다. 용어 "뉴클레오베이스"는 또한 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 뿐만 아니라 이의 헤테로사이클릭 유사체와 호변이성체를 포함한다. 나아가, 천연 및 비천연 뉴클레오베이스로는, 미국 특허 3,687,808 (Merigan, et al .), Chapter 15 by Sanghvi, in Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al ., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722(특히 페이지 622 및 623 참조, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, 상기 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 언급된 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는, 가장 고전적인 의미로는 뉴클레오시딕 염기(nucleosidic)는 아니지만 뉴클레오시딕 염기로서 제공되는 특정 "보편적인 염기(universal bases)"를 비롯하여, 유사 뉴클레오베이스를 제공할 수 있는 헤테로사이클릭 화합물과 같은 화합물을 포함하는, "뉴클레오시딕 염기" 또는 "염기 유닛(base unit)" 하나 이상을 포함한다. 보편적인 염기로, 3-니트로피롤, 선택적으로 치환된 인돌(예, 5-니트로인돌) 및 선택적으로 치환된 하이폭산틴이 언급된다. 그외 바람직한 보편적인 염기로는, 당업계에 공지된 보편적인 염기를 비롯하여, 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체가 있다.
폴리뉴클레오티드는 또한 변형된 뉴클레오베이스를 포함할 수 있다. "변형된 염기"는 천연 염기(예, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 우라실, 및/또는 티민)와 쌍을 이룰 수 있거나 및/또는 비천연 염기와 쌍을 이룰 수 있는 것으로 당해 기술 분야에서는 이해된다. 변형된 염기의 예는 EP 1 072 679 및 WO 97/12896에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 변형된 염기로는, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 그외 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 그외 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 그외 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 그외 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 그외 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 변형된 염기로는, 3환식 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), 치환된 페녹사진 시티딘(예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온)과 같은 G-clamp, 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는, 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예컨대 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 염기를 포함할 수 있다. 추가적인 뉴클레오베이스로는 미국 특허 3,687,808에 언급된 염기, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 언급된 것, Englisch et al ., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613에 언급된 것, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 언급된 것을 포함한다. 이들 염기 중 일부는 결합 친화력을 증가시키는데 유용하며, 그 예로는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신이 있다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스의 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 입증되어 있으며, 특정 측면에서, 이는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된다. 미국 특허 3,687,808, 미국 특허 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 및 5,681,941을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
미리 정해진 서열의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 잘 공지되어 있다. 예로, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)을 참조한다. 폴리리보뉴클레오티드와 폴리데옥시리보뉴클레오티드 둘다 고상 합성 방법이 바람직하다(잘 알려져 있는 DNA 합성 방법들은 RNA 합성에서 사용가능함). 또한, 폴리리보뉴클레오티드는 효소반응에 의해 제조할 수 있다. 비천연 뉴클레오베이스를 폴리뉴클레오티드로 병합할 수 있다. 예로, 미국 특허 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al ., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al ., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al ., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); 및 Zimmermann, et al ., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002)을 참조한다.
폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태로 관능화된 나노입자는, 일반적으로, 약 5 - 약 100개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 구체적으로, 나노입자는, 약 5 - 약 90개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 80개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 60개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 50개의 뉴클레오티드 길이 약 5 - 약 45개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 35개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 15개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 10개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드가 바람직한 결과를 달성할 수 있는 범위로 특정하게 언급된 크기의 길이의 모든 폴리뉴클레오티드 중간체로 관능화된다. 즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 보다 많은 수의 뉴클레오티드 길이로 구성된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
나노입자로의 부착이 고려되는 폴리뉴클레오티드는, 타겟 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 유전자 산물의 발현을 조절하는 것을 포함한다. 즉, 타겟 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 RNase 활성(예, RNase H)을 개시하는 RNA 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 혼성하여 전사를 저해하는, 3중 나선을 형성하는 폴리뉴클레오티드, 및 타겟 폴리뉴클레오티드에 혼성하여 번역을 저해하는 리보자임이 고려된다.
다양한 측면에서, 특이적인 mRNA를 타겟으로 한다면, 나노입자-결합성 물질의 단일 구조체는 동일한 전사체의 복수 카피에 대해 결합력을 가진다. 일 측면에서, 나노입자는 동일한 폴리뉴클레오티드, 즉 각각의 폴리뉴클레오티드가 동일한 길이와 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 관능화된다. 다른 측면에서, 나노입자는 동일하지 않은, 즉 부착한 하나의 폴리뉴클레오티드가 부착된 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오티드와 길이 및/또는 서열 차이로 인해 동일하지 않은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드로 관능화된다. 상이한 폴리뉴클레오티드가 나노입자에 부착된 경우, 이들 여러가지 폴리뉴클레오티드는 위치나 기질 부위는 다르지만 동일한 단일 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 또는 상이한 유전자 산물을 코딩하는 상이한 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합한다. 즉, 다양한 측면에서, 나노입자-결합성 물질의 단일 구조체는 1개 보다 많은 수의 유전자 산물을 타겟으로 한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는, 타겟 폴리뉴클레오티드내 한 곳 이상의 특이적인 부위를 통해 또는 필요에 따라 타겟 폴리뉴클레오티드의 전체 길이를 통해 유전자의 발현에 대해 바람직한 저해 수준을 달성할 수 있든지 간에, 타겟-특이적인 폴리뉴클레오티드이다.
폴리뉴클레오티드 특징
본 발명은, 다양한 구현예에서, 유전자 조절에 유용한 다가 RNA-나노입자 구조체를 제공한다. 작은 간섭 RNA는 타겟 RNA(일반적으로 메신저 RNA(mRNA))의 일부분에 대해 상보성을 가지고 있는(즉, 혼성화 가능한) 이중 가닥 RNA 물질이다. 일반적으로, 이러한 상보성은 100%이지만, 필요에 따라, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 낮을 수도 있다. 예컨대, 염기 21개 중 19개가 염기쌍을 이룰 수 있다. 즉, 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성화가능한 바람직한 타겟 핵산에 100% 상보적일 필요는 없는 것으로 이해될 것이다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 세그먼트들이 서로 혼성화되고, 개재(intervening) 또는 인접 세그먼트들은 혼성화 현상에 참여하지 않을 수 있다(예, 루프 구조 또는 헤어핀 구조). 임의의 주어진 올리고뉴클레오티드 간의 상보성%는 당해 기술 분야에 공지된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tools) 프로그램 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 통례적으로 확인할 수 있다(Altschul et al ., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410; Zhang and Madden, 1997, Genome Res., 7: 649-656).
일부 측면에서, 다양한 대립유전자 변형체들에서 선택하는 것이 바람직한 경우, 다른 대립유전자 서열로부터 타겟 유전자를 효과적으로 인지하기 위해서는, 타겟 유전자에 대한 100% 상보성이 필요하다. 대립유전자 타겟들에서 선택하는 경우, 길이는 상보성%와 상이한 대립유전자의 분별력과 관련있는 또다른 인자이기 때문에, 중요한 인자이다.
"혼성화"는 왓슨-크릭 DNA 상보성, 호그스타인(Hoogstein) 결합 또는 그외 당업계에 공지된 서열-특이적인 결합 규칙에 따른, 수소 결합에 의한 핵산 2 또는 3 가닥 간의 상호작용을 의미한다. 혼성화는 당업계에 공지된 여러 엄격한 조건 하에서 수행할 수 있다.
용어 "RNA"는 2개의 별개의 가닥들로 구성된 듀플렉스 뿐만 아니라, 단일 가닥, 삼중 가닥 또는 4중 가닥 구조를 포함한다. 단일 가닥 RNA의 예는 헤어핀 루프 RNA이다. RNA 서열은 상보적인 염기 쌍 상호작용을 통해 소형 간섭 RNA와 타겟 RNA를 규합하는데 충분한 길이이어야 한다. 본원에 기술된 방법에 사용가능한 RNA는 다양한 길이일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, RNA는, 적절한 조건 하에서, 듀플렉스의 단일 가닥이 타겟 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있도록 타겟 폴리뉴클레오티드의 서열과 충분히 상보적인 도메인을 상기 듀플렉스의 단일 가닥내에 포함하며, 상기 듀플렉스의 상기 도메인이 타겟 폴리뉴클레오티드내 서열과 혼성화되면 폴리펩타이드에 의해 인지되는 기질 부위가 형성된다. 상기 도메인의 길이는, 일반적으로, 뉴클레오티드 10개 이상이며, 타겟 RNA와 혼성화하는데 충분한 길이이며, 특히 10-100개 뉴클레오티드 길이이며, 보다 구체적으로는, 10 - 80개 범위의 임의 갯수의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100개의 뉴클레오티드 길이이다. "충분한 길이"는 예상되는 조건 하에서 의도한 기능을 제공하는데 충분히 긴 길이인 뉴클레오티드 10개 이상으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
RNA는 시험관내에서 중합하거나, 재조합 RNA일 수 있으며, 키메라 서열 또는 이들 그룹의 유도체를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, RNA는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 또는 타겟 유전자의 발현을 저해하는, 임의의 적합한 조합을 포함한다.
전달되는 RNA는 세포질이나 핵내에 머무를 수 있다. RNA는 세포에 전달되어, 내인성 또는 외인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 저해할 수 있으며, 또는 세포와 천연적으로 조합되어 있지 않은 특별한 생리 특징을 부여할 수 있다.
RNA를, 치료학적 변화인 세포 변화를 형성하기 위해 세포에 전달할 수 있다. 치료 목적(질병의 치료 또는 예방을 비롯하여, 동물에서 건강을 증진시키는 기술 분야)을 위한 RNA 또는 그외 다른 유전 물질의 전달을 유전자 치료라고 한다. RNA는 유기체에 인 시츄(in situ)로 직접 또는 유기체에 이식되는 세포를 생체외 전달함으로써 간접적으로 전달할 수 있다. 단백질의 생산을 차단시키거나 또는 RNA의 양을 감소시키기 위해, RNA의 세포내 도입이 필요하다. 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오티드 서열은 하기에서 더욱 설명된다.
폴리뉴클레오티드 서열 및 혼성화
일부 측면에서, 본 발명은 특정 핵산을 타겟팅하는 방법을 제공한다. 모든 타입의 핵산을 타겟팅할 수 있으며, 예컨대 유전자 발현을 치료적으로 조절하기 위해 상기 방법을 사용할 수 있다(예, PCT/US2006/022325를 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 본 발명의 방법에서 타겟이 될 수 있는 핵산의 예로는, 유전자(예, 특정 질환과 관련있는 유전자), 바이러스 RNA, 또는 mRNA, RNA, 단일 가닥 핵산이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
타겟 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 세포, 조직 샘플 또는 생물 유체내일 수 있다. 예로 Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and B. D. Hames and S. J. Higgins, Eds., Gene Probes 1 (IRL Press, New York, 1995)을 참조한다.
용어 "개시 코돈부" 및 "번역 개시 코돈부"는 번역 개시 코돈으로부터 양쪽 방향(즉 5' 또는 3') 중 어느 한 방향으로 접해있는 뉴클레오티드를 포함하는, mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "정지 코돈부" 및 "번역 종결 코돈부"는 번역 종결 코돈으로부터 양 방향 중 어느 한 방향(즉, 5' 또는 3')으로 접해있는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 따라서, "개시 코돈부"(또는 "번역 개시 코돈부") 및 "정지 코돈부"(또는 "번역 종결 코돈부")는 모두 관능화된 나노입자 상의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 효과적으로 타겟팅할 수 있는 영역들이다.
그외 타겟 영역으로는, 2' 비번역부(2' UTR), 5' 캡 부위와 mRNA의 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드(또는 유전자 상에 대응되는 뉴클레오티드)를 포함하는, 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향의 mRNA 영역, 및 번역 종결 코돈과 mRNA의 3' 말단 사이의 뉴클레오티드(또는 유전자에서 대응되는 뉴클레오티드)를 포함하는, 번역 종결 코돈에서 3' 방향에 있는 mRNA 영역인 3' 비번역부(3' UTR)가 있다. mRNA의 5' cap 부위는 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA의 5'-최말단 잔기에 연결되어 있는 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' cap 영역은 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 상기 캡 부위에 인접되어 있는 처음 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다.
원핵 타겟 핵산의 경우, 다양한 측면에서, 핵산은 게놈 DNA로부터 전사되는 RNA이다. 진핵 타겟 핵산의 경우, 핵산은 동물 핵산, 식물 핵산, 효모 핵산을 비롯한 진균 핵산이다. 상기와 같이, 타겟 핵산은 게놈 DNA 서열로부터 전사되는 RNA이다. 특정 측면에서, 타겟 핵산은 미토콘드리아 핵산이다. 바이러스 타겟 핵산의 경우, 핵산은 바이러스 게놈 RNA 또는 바이러스 게놈 DNA로부터 전사되는 RNA이다.
제공되는 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법은, 타겟 유전자 산물의 발현을, 올리고뉴클레오티드-관능화된 나노입자가 없는 조건에서의 유전자 산물 발현과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 까지 저해한다. 즉, 제공되는 방법은 타겟 유전자 산물의 발현을 기본적으로 임의의 수준으로 저해하는 방법을 포함한다.
저해 정도는 체액 시료나 바이옵시 시료로부터 생체내에서 결정하거나, 또는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 영상화 기법에 의해 정할 수 있다. 다른 예로, 저해 수준은 특정 타입의 나노입자 및 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하였을 때 생체내에서 예상할 수 있는 저해 정도의 예측 척도로서 일반적으로 세포 배양 분석으로 정한다.
변형된 폴리뉴클레오티드
나노입자의 관능화에 있어서, 폴리뉴클레오티드에서, 하나 이상의 당 및/또는 뉴클레오티드 유닛들의 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합 둘다가 "비천연" 기로 치환된, 변형된 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 일 측면에서, 이러한 구현예는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다. PNA 화합물에서, 폴리뉴클레오티드의 당-벡본은 아미드를 포함하는 벡본으로 치환된다. 예로, 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262와, Nielsen et al ., Science, 1991, 254, 1497-1500을 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원의 폴리뉴클레오티드에서 고려되는, 뉴클레오티드와 비천연 뉴클레오티드 사이의 다른 연결로는, 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920; 미국 출원 공개번호 20040219565; 국제 출원 공개 번호 98/39352 및 WO 99/14226; Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology 5:343-355 (1995) 및 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997)에 언급된 것을 포함하며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
폴리뉴클레오티드에 대한 구체적인 예는 변형된 벡본 또는 뉴클레오시드간 비천연 연결을 포함하고 있는 것을 포함한다. 변형된 벡본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드로는, 벡본에 인 원자를 가지고 있는 폴리뉴클레오티드와 벡본에 인 원자를 가지고 있지 않은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오시드간 벡본에 인 원자가 없는 변형된 폴리뉴클레오티드도 "폴리뉴클레오티드" 의미에 포함되는 것으로 간주된다.
인 원자를 함유하고 있는 변형된 폴리뉴클레오티드 벡본으로는, 예컨대 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 그외 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 정상적인 3'-5' 연결을 가진 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 이의 2'-5' 연결된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 간 연결이 3' -> 3', 5' -> 5' 또는 2' -> 2' 연결인, 역위된 극성(inverted polarity)의 물질을 포함한다. 또한, 3'-최말단 뉴클레오티드간 연결에서 하나의 3' -> 3' 연결, 즉 어베이직(abasic)일 수 있는 하나의 역위된 뉴클레오시드 잔기(뉴클레오티드가 생략되거나 또는 그 위치에 하이드록시기를 가짐)를 포함하는 역위된 극성의 올리고뉴클레오티드도 고려된다. 또한, 염, 혼성 염 및 유리 산 형태도 고려된다.
상기 인-함유성 연결의 제조 방법을 기술한 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050이 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
벡본에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 벡본은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼성된 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자의 뉴클레오시드 연결 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 벡본을 가진다. 이들은, 모르폴리노 연결을 가진 벡본; 실록산 벡본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 벡본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 리보아세틸 벡본; 알켄 함유성 벡본; 설파메이트 벡본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 벡본; 설포네이트 및 설폰아미드 벡본; 아미드 벡본; 및 그외 혼성된 N, O, S 및 CH2 구성 파트를 가진 벡본을 포함한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 벡본이 구비되며, 올리고뉴클레오티드는 헤테로원자 벡본이 구비되며, 예로 미국 특허 5,489,677 및 5,602,240에 언급되어 있는 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-,, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-이 구비된다. 예로, 미국 특허 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439를 참조하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다양한 형태로, 올리고에서 2개의 연속적인 단량체 사이의 연결은 -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3) -, -P(O,S) -, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3) -, 및 -PO(NHRH)-로부터 선택되는 2-4개, 바람직하게는 3개의 기/원자로 구성되며, 상기에서 RH는 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택되고, R"은 C1-6-알킬 및 페닐 중에서 선택된다. 이러한 연결에 대한 예시적인 예는, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH=(다음 차례 단량체에 연결로서 사용되는 경우에, R5를 포함함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2 -, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N=(다음 차례 단량체에 연결로서 사용되는 경우에, R5를 포함함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH- CH2-, - CH2-NRH-O-, - CH2-NRH-CO-, -O-NRH- CH2-, -O-NRH, -O- CH2-S-, -S- CH2-O-, - CH2- CH2-S-, -O- CH2- CH2-S-, -S- CH2-CH=(다음 차례 단량체에 연결로서 사용되는 경우에, R5를 포함함), -S- CH2- CH2-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2- CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2- CH2-; -O-S(O)2- CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(O CH2CH3)-O-, -O-PO(O CH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH H-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, - CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2- CH2-, 및 -O-Si(R")2-O-가 있으며; 특히, RH가 수소 및 C1-4-알킬에서 선택되고, R"이 C1-6-알킬 및 페닐 중에서 선택되는, -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-O-P(-O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O- 및 -O-PO(NHRN)-O-가 고려된다. 추가적인 예시적인 예는 Mesmaeker et. al., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 및 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol 25: pp 4429-4443이 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드의 또다른 변형된 형태들은 미국 출원번호 20040219565에 상세하게 기술되어 있으며, 이 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
또한, 변형된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(여기에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 - C10 알킬 또는 C2 - C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 다른 구현예로, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2가 있으며, 이때 n과 m은 약 1 - 약 10이다. 그외 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 들 중 하나를 포함한다: C1 - C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단성 그룹, 리포터 그룹, 인터칼레이터, 폴리뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키는 그룹, 또는 폴리뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키는 그룹, 및 비슷한 특성을 지닌 그외 치환기. 일 측면에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3, 또한, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라 함)(Martin et al ., 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486-504) 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 그외 변형으로, 2'-디메틸아미녹시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한, 당해 기술 분야에서는 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE라 함), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2이 있다.
또다른 변형은, 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴(2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴(2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 상기 2'-변형은 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치에 있을 수 있다. 일 측면에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 또한, 폴리뉴클레오티드 상의 다른 위치, 예컨대 3'말단 뉴클레오티드나 2'-5' 연결된 폴리뉴클레오티드에서 당의 3'번 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5'번 위치에서, 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당 대신 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 예로, 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920을 참조하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 원용에 의해 포함된다.
일 측면에 있어서, 당의 변형은 2'-하이드록시기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어, 이환식 당 모이어티를 형성하는, LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다. 특정 측면에서, 연결은 메틸렌(-CH2-)n 기가 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 연결이며, 여기에서 n은 1 또는 2이다. LNA 및 이의 제조 방법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기술되어 있으며, 이의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
키메라
주어진 화합물내 모든 위치가 반드시 일률적으로 변형되어야 하는 것은 아니며, 사실상 전술한 변형이 1회 보다 높은 빈도로 단일 화합물에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 이러한 "키메라" 안티센스 화합물은 전형적으로 본원에 기술된 변형을 포함하는 적어도 한 영역을 포함하고 있으며, 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분은 "비변형"된 상태이다.
특정 측면에서, 변형은 뉴클레이즈 분해에 대한 내성 증가, 세포 흡수 증가, 안정성 증가 및/또는 타겟 핵산에 대한 결합 친화성 증가를 부여한다. 다른 측면에서, 변형은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 제공된다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 자르는 세포 엔도뉴클레이즈이다. 따라서, RNase H가 활성화되면 RNA 타겟을 절단하게 되고, 그로 인해 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드-매개 저해 효율이 크게 증강된다. 비슷한 양상으로 RNA:RNA 하이브리드의 절단은 세포 RNA와 바이러스 RNA 둘다를 절단하는 RNAseL과 같은 엔도리보뉴클레이즈의 작용을 통해 달성될 수 있다. 타겟 RNA의 절단은 일반적으로 겔 전기영동에 의해, 필요에 따라서는 당해 기술 분야에 공지된 핵산 혼성화 기법과 조합하여 검출할 수 있다.
키메라 화합물은 전술한 바와 같이, 2 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 컴포지트 구조체로서 형성될 수 있다. 이러한 화합물들은 또한 당해 기술 분야에서는 하이브리드 또는 갭머라고 지칭된다. 예로, 미국 특허 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922를 참고하며, 이 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1
RNase -미함유 나노입자의 제조
사이트레이트-안정화된 골드 나노입자(13 nm)를 공개된 제조 공정을 이용하여 제조하였다 [Frens, Nature Physical Science 241: 20-22 (1973)]. 합성한 후, 입자를 0.1% 디에틸피로카보네이트(DEPC)로 12시간 교반하면서 처리한 다음, 121℃에서 60분간 자동 멸균하였다. 중요하고도 매우 놀랍게도, 나노입자의 광학 및 물리적 특성은 UV 분광측정과 투과 전자 형미경 TEM 분석으로 측정시, 이러한 비교적 과격한 처리에도 영향을 받지 않았다(도 1). 또한, 이후의 리간드 관능화에도 이러한 처리에 영향을 받지 않았다. RNaseAlert 키트 (Ambion)를 이용한 이들 용액 중에서의 RNase 활성 검사에서, 대조군 또는 무처리 입자와 비교하여, 검출가능한 RNA 활성은 없었다(도 2).
실시예 2
RNase -미함유 나노입자의 제조
제조되는 RNase-미함유 나노입자는 공개된 공정을 이용하여 티올화된 올리고뉴클레오티드로 추가적으로 변형가능하다 [Demers et al., Anal. Chem. 72: 5535 (2000)]. 전처리하지 않고는, RNA를 이용한 이후의 관능화를 수행할 수 없었는데, 이는 아마도 RNA-베이스의 표면 캡핑 리간드가 분해되었기 때문인 것으로 추측되었다. 27-베이스의 RNA 가닥과 25-베이스의 상보체로 구성되어 있으며, 말단에 에틸렌 글리콜 스페이서와 알킬티올이 있는, 듀플렉스를 혼성화시키고, RNase 미함유성 Au NP에 첨가하여, 티올-금 결합을 통해 화학흡착시켰다. 이러한 작업에서, 서열은 개똥벌레 루시퍼레이즈 유전자를 타겟팅하도록 설계하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 TOM-RNA 시약 (Glen Research) 및 MerMade 6 (Bioautomation)을 이용하여 합성하거나, 상업적으로 제작하였다(Integrated DNA Technologies). 비-상업적인 소스에서 합성한 올리고뉴클레오티드를 TOP-RNA 카트리지(Varian)를 이용하여 정제하였다. 이러한 실험에 이용한 서열은 다음과 같다: 루시퍼레이즈 센스, 5' - 포스페이트 rCrGrA rCrUrU rCrGrU rGrCrC rArGrA rGrUrC rUrUrU rCrGAC Spacer 18 Spacer 18-티올 - 3' (서열번호 1), 루시퍼레이즈 안티센스, 5'- rGrUrC rGrArA rArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArA rGrUrC rGrUrA -3' (서열번호 2), Cy3 루시퍼레이즈, 5'-Cy3 rGrUrC rGrArA rArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArA rGrUrC rGrUrA -3' (서열번호 3), Cy5 루시퍼레이즈, 5'-Cy5 rGrUrC rGrArA rArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArA rGrUrC rGrUrA -3' (서열번호 4), 루시퍼레이즈 답실(luciferase dabcyl), 5'-rCrGrA rCrUrU rCrGrU rGrCrC rArGrA rGrUrC rUrUrU rCrGA C-dabcyl -3' (서열번호 5), 레닐라(Renilla) 루시퍼레이즈 센스, 5'-Phosphate rGrGrA rGrGrA rCrGrC rUrCrC rArGrAr UrGrA rArArU rGrGGT Spacer 18 Spacer 18-티올-3' (서열번호 6), 레닐라 루시퍼레이즈 안티센스, 5' rArCrC rCrArU rUrUrC rArUrC rUrGrG rArGrC rGrUrC rCrUrG-3' (서열번호 7).
사전 제작한 티올화된 RNA 듀플렉스(100 nM)를 0.1 M NaCl로 조절된 Au NP의 RNase-미함유 용액(10 nM)과 인큐베이션하였다. 혼합물을 염 용액을 증가시키면서(0.1 -> 0.3 M NaCl) 용액에서 에이징하고, 표면 상의 올리고리보뉴클레오티드의 커버리지를 높이기 위해 초음파 처리하였다. 올리고에틸렌 글리콜 (OEG)을 듀플렉스 첨가 후 24시간 후 첨가(최종 농도 30 μmol/mL)하여, 세포 배양시 입자 침강을 방지하였다(도 3). 이 농도로 첨가시 듀플렉스 로딩(loading)을 바꾸지 않았다. 관능화한 후, 입자를 4℃에서 원심분리(13,000 rpm, 20 분)하여 정제하고, 무균 포스페이트 완충화된 염수(PBS: 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 재현탁하였다. 이 과정을 3번 반복하였다. 원심분리 과정에서 발생되는 가열로 인한 듀플렉스 탈혼성화를 방지하기 위해서는 냉장 온도에서의 원심분리가 필요하였다. dsRNA 로딩을 측정하기 위해, 안티센스 가닥에 시아닌 3(Cys) 형광 다이를 로딩하였다. 형광은 Jobin Yvon Fluorolog FL3-22를 이용하여 550 nm에서 여기와 560 - 620 nm에서 1 nm 단위로 방출을 측정하고, 표준 곡선과 비교하였다. 입자 당 듀플렉스의 수는, 25 μM 포타슘 시아나이드를 이용하여 금을 산화시키고, 형광 안티센스 가닥의 수를 측정(형성된 듀플렉스를 나타냄)한 다음 이를 나노입자의 농도로 나누어, 계산하였다. 각각의 RNA-금 나노입자 구조체에는 13 nm Au NP 당 33 ± 4 RNA 듀플렉스가 포함되어 있었다.
RNA 듀플렉스의 탈혼성화를 방지하기 위해, Au NP 용액의 염 농도를 듀플렉스 첨가하기 전에 NaCl로 0.1 M로 조정하였다. 그런 후, 염 농도를 12시간 동안에 걸쳐 0.1 M 에서 0.3 M NaCl로 높이고, 나노입자 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 커버리지를 높이기 위해 각각의 첨가 후 간단히 초음파 처리하였다 [Hurst et al., Anal Chem 78: 8313 (2006)]. 보다 안정적인 구조체를 수득하기 위해, RNA-관능화된 입자에 추가적인 표면 부동태화 리간드로서 올리고에틸렌 글리콜-티올(OEG-티올) 30 μmol/mL를 처리하였다(반응식 1). OEG-티올의 부동태화로 인해 장기간 세포 배양 조건에서 이들 나노물질이 안정화된다는 것을 확인하였다.
Figure 112011047470626-pct00001
반응식 1. 다가 RNA 금 나노입자 구조체의 제조. RNA 듀플렉스(이중 가닥 RNA 서열, 에틸렌 글리콜 스페이서 및 알킬티올 기 함유)를 혼성화한 다음 RNase 미함유 나노입자와 인큐베이션하여 제조한다. 올리고에틸렌 글리콜-티올(OEG-티올)을 이용한 추가적인 부동태화는 세포 배양에서 추가적인 안정성을 부여한다.
실시예 3
RNA -나노입자 구조체의 세포 흡수
구조체의 세포 도입력을 상기에서 제조한 형광(시아닌 5, Cys) 구조체를 이용하여 공초점 현미경으로 평가하였다. RNA-Au NP를 HeLa 세포 배양물에 첨가하였다. 세포를 유리 커버슬립 위에서 키우고, 플루오로포어-표지된 RNA 듀플렉스로 관능화된 나노입자를 처리하였다. 6시간 처리한 후, 커버슬립을 제거하고, PBS로 헹군 다음 유리 슬라이드 상에 둔 PBS가 충진된 챔버에 고정시켰다. 모든 이미지는 63x 배율에서 공초점 현미경(Zeiss 510 LSM) 및 633 nm HeNe 레이저 여기 소스로 스캐닝하여 수득하였다. 이미지 연구에서 6시간 후 HeLa 세포의 세포질 전체에서 형광이 나타났다(도 4a). DNA Au-NP에서와 같이, RNA Au-NP는 세포 도입에 전이제가 필요하지 않다는 점이 흥미로웠다 [Giljohann et al., Nano Lett. 7: 3818 (2007)]. 실제, 분석용 유세포 측정에서 RNA-Au NP 흡수율은 세포 전체 집단에서 >99%인 것으로 확인되었다(도 4b). 유세포 측정 실험을 위해, 세포에 형광-표지된(Cy5) RNA-나노입자 구조체를 처리하였다. 형질전이 후 6시간 후에, 세포에 트립신을 처리하여 세포 배양웰에서 이를 제거하였다. 유세포 측정을 DakoCytomation CyAn을 이용하여 여기 635 nm에서 수행하였다.
실시예 4
RNA -나노입자 구조체의 활성
RNA-Au NP가 세포에 내재되어 있는 것으로 확인되어, RNA-금 나노입자 구조체의 세포내 활성을 다음과 같이 조사하였다. 이 모델 시스템에 대한 타겟으로서 형질전환된 루시퍼레이즈 플라스미드를 이용하여, 단백질 넉다운 실험을 HeLa 세포에서 수행하였다. HeLa 세포(ATCC)는 10% 열에 의해 불활성화된 소태아 혈청(FBS)이 첨가된 Eagle의 최소 필수 배지(EMEM)에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 세포를 96웰 플레이트에 파종하고, 개똥벌레 루시퍼레이즈 및 레닐라 유전자 둘다를 포함하고 있는 플라스미드(psiCHECK 2, Promega)를 형질전환 전 하루 동안 배양하였다. 플라스미드 (0.2 ㎍/웰)를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 첨가하였다. 플라스미드를 도입한 후(24 시간), 배지를, 개똥벌레 루시퍼레이즈에 대한, 관능화된 RNA-Au NP(3 nM 나노입자 농도, ~100 nM RNA 듀플렉스 농도)가 포함된 혈청 저감 배지로 교체하였다. 처리 1일 째에, 세포는 약 70% 컨플루언트가 되었다. 실험 종료에서, 처리된 세포의 리플레케이트 웰 수를 계수하고, Guava EasyCyte Mini (Guava Technologies)를 이용하여 생존성을 측정하였다. RNA Au NP로 처리된 세포의 경우, 인큐베이션 후 생존율은 > 98%이었다.
비교를 위해, 루시퍼레이즈 RNA 듀플렉스 동일 수(100 nM)를 상업적인 물질인 리포펙타민 2000을 이용하여 제조사의 추천 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 처리 24시간 후, 배지를 신선한 EMEM으로 교체하였다. 지정된 날에, 제조사의 프로토콜에 따라 Dual-Glo (Promega) 분석으로 루시퍼레이즈 발현에 대해 세포를 분석하였다.
루시퍼레이즈 발현의 정량치를 형질전환되지 않은 대조군으로 정규화하였고, 나노입자 물질이 용량 및 시간 의존적인 방식으로 개똥벌레 루시퍼레이즈를 하향-조절하는 것으로 확인되었다. 대조군(레닐라)의 발현은 개똥벌레 루시퍼레이즈에 대해 고안된 RNA-Au NP에 의한 영향은 받지 않았으며, 이는 넉다운 역시 서열 특이적임을 시사한다. 흥미롭게도, RNA-Au NP를 이용한 3번의 독립적인 실험의 결과들은, 처리 후 4일간 유리 RNA를 능가하는 넉다운이 나타났다(73 ± 7% RNA-Au NP 대 33 ± 2% 유리형, 도 5a).
루시퍼레이즈의 지속적인 넉다운은 나노입자 상의 RNA가 안정화된 결과이다. 이를 확인하기 위해, Cy3 표지된 RNA 입자를 96웰 플레이트에서 PBS 90 ㎕에 5 nM 농도로 희석하였다. 답실-표시된 분자 RNA의 경우, 농도는 150 nM이었다. 마이크로플레이트를 37℃로 유지되는 Photon Technology International FluoDia T70 형광 플레이트 리더에 장착하였다. 시료를 평형화한 후(10분), 10 ㎕ 소태아 혈청(FBS, Gemini Bioproducts)을 첨가하여, 시료를 10% 혈청 농도로 만들었다. 증발을 방지하기 위해, 반응물을 미네랄 오일 40 ㎕로 덮었다. 시료의 형광(여기 = 530 nm, 방사 = 570 nm)을 48시간 동안 5분마다 측정하였다. FBS 대신 PBS 10 ㎕를 처리한 시료로부터 베이스라인 형광을 구하였다. 시간 함수로서 추가적인 형광 증가가 관찰되는 반응물의 엔드포인트를 구하였다. 모든 시료는 3번 측정하였다.
이러한 안정성 실험에서, 혈청에서 인큐베이션한 구조체는 이의 분자 RNA 카운터파트에 비해 매우 증가된 안정성을 보였다. 예컨대, 10% 혈청 존재 하에, RNA-Au NP 구조체 RNA 듀플렉스에 비해 반감기가 6배 길었다(816 ± 59분 대 133 ± 30 분, 도 5b). 이러한 데이타는, 나노입자 접합체가 세포외 환경에서의 분해에 대한 현저한 보호를 제공함을 의미한다. RNA의 세포외 수명은 이의 보관, 취급 및 잠재적인 치료적 적용에 매우 중요하기 때문에, 나노입자 접합체는 기능적 RNA 리간드의 보호와 전달에 상당한 이점을 제공할 수 있다. 중요한 점은, 이러한 강화된 안정성은 RNA의 완전성을 보호하는데 화학적 변형이 필요하지 않다는 점이다.
실시예 5
나노입자 표면 상의 폴리뉴클레오티드의 오리엔테이션
나노입자에 고정된 RNA의 오리엔테이션을 조절할 수 있다. RNA 기질을 고정하는 전략으로 Dicer 효소에 대한 듀플렉스 접근을 조절할 수 있다. 여러가지 고정 화학물, 모노티올 또는 디티올 및 여러가지 길이의 스페이서 서열을 이용하여, RNA 듀플렉스 간의 간격과 수를 다르게 함으로써, RNA 분해율을 조절할 수 있다.
본 시스템에서 RNAi 개시를 담당하는 RNase인 Dicer가 이들 듀플렉스를 인지하여 절단할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 전형적인 효소 카이네틱 실험으로, RNA-Au NP (약 5nM)를 Dicer (최종 0.1 U/mL)와 반응 완충액에서 37℃에서 혼합하였다. RNA 듀플렉스의 분해율을 적어도 12시간 동안 72초 마다 형광 증가를 모니터링함으로써 측정하였다. 최소 및 최대 형광을 정하기 위해, 효소 미함유(최소) 또는 금을 용해시키기 위한 3 mM 포타슘 시아나이드(CN) 함유(최고) 시료를 사용하였다. KCN은 금 나노입자를 산화시켜, 플루오로포어-표지된 가닥의 퀀칭을 소거한다.
한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥을 형광 표지하고, RNA-관능화된 나노입자의 해당 농도에 대한 형광을 동일한 가닥을 이용하여 구한 표준과 비교함으로써, 나노입자 당 듀플렉스의 수를 구하였다. 대표적인 로딩 실험의 결과는 표 1에 나타낸다.
2종의 상이한 RNA 로딩 전략을 이용한 RNA 듀플렉스 로딩 결정. 접합체는 안티센스 가닥(나노입자에 공유 결합된 센스 가닥에 혼성화됨)에 플루오레세인을 포함하거나, 또는 헤어핀 시스템의 경우에는, 5' 말단에 플루오레세인으로 RNA가 표지된다.
나노입자 구조체의 타입 플루오로포어의 위치 듀플렉스의 수
양 가닥 혼성화된 가닥의 5' 말단 91
단일 가닥의 RNA 헤어핀 헤어핀의 5' 말단 34
dsRNA를 분해하는 것으로 공지된 리보뉴클레이즈인 RNase III를 Dicer의 활성과 비교하였다. RNase III와 Dicer는 시간에 따른 백그라운드(효소가 첨가되지 않은 반응) 대비 형광 증가로 측정된 바와 같이, 2가지 시스템에서 활성이다. 도 6은 RNase III의 존재시에 활성을 나타냄을 보여준다.
각 시스템에 RNase III와 비슷한 방식으로 Dicer를 처리하였을 때, 시간에 따라 비례적인 형광 증가가 관찰되었다(도 7). 또한, 백그라운대 대비 형광의 절대 차이는 RNase III와 비교하여 Dicer에서 더 높았다. 이러한 결과들은, 나노입자 표면에 높은 밀도로 고정되었을 때, RNA가 RNase III와 같은 비특이적인 효소 보다는 Dicer에 의해 보다 특이적으로 인지됨을 시사한다. 나아가, 오리엔테이션 선호성을 센스 대비 안티센스 가닥의 고정에 따라 관찰할 수 있다 (도 8). 센스 가닥이 입자에 화학 고정된 경우, 더 높은 활성이 관찰되었다. 이론으로 결부되지 않으며, 이러한 결과는 RNAi 기구에 가이드 가닥으로서 작용하는 안티센스 가닥의 능력을 반영한 것일 수 있다. 이러한 차이는 세포에서 RNAi 반응을 조절하고 조율하는데 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mirkin, et al. <120> POLYVALENT RNA-NANOPARTICLE COMPOSITIONS <130> 30938/28168 <150> US-61/117,449 <151> 2008-11-24 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Phosphate <220> <221> misc_structure <222> (25)..(25) <223> 36 Carbon spacer bound to thiol group <400> 1 cgacuucgug ccagagucuu ucgac 25 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 gucgaaagac ucuggcacga agucgua 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cy3 <400> 3 gucgaaagac ucuggcacga agucgua 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cy5 <400> 4 gucgaaagac ucuggcacga agucgua 27 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> dabcyl <400> 5 cgacuucgug ccagagucuu ucgac 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Phosphate <220> <221> misc_structure <222> (25)..(25) <223> 36 Carbon spacer bound to thiol group <400> 6 ggaggacgcu ccagaugaaa ugggt 25 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 acccauuuca ucuggagcgu ccug 24

Claims (38)

  1. 나노입자에 조합된 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 구조체로서,
    상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 나노입자에 관능화되고 타겟 폴리뉴클레오티드와 동일한 서열을 포함하며;
    상기 RNA 폴리뉴클레오티드는 추가적인 폴리뉴클레오티드와 듀플렉스(duplex)를 형성하는 서열을 포함하며, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는, RNA 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 허용할 만큼 RNA 폴리뉴클레오티드 내 서열과 충분히 상보적인 서열을 포함하고, 상기 듀플렉스는 폴리펩타이드 상호작용 부위를 제공하며;
    상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는, 타겟 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 허용할 만큼 타겟 폴리뉴클레오티드 내 서열과 충분히 상보적인 도메인을 포함하며, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드의 도메인과 상기 타겟 폴리뉴클레오티드의 서열이 혼성화되면 폴리펩타이드에 의해 인지되는 기질 부위가 형성되며; 및
    상기 폴리펩타이드 상호작용 부위가 상기 RNA 폴리뉴클레오티드의 중심점을 기준으로 상기 나노입자에 대해 근위 또는 원위에 위치하는 것인, 나노입자 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드가 상기 나노입자에 공유 결합으로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드가 상기 나노입자에 공유 결합으로 조합되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노입자에 관능화된 RNA 폴리뉴클레오티드는 각각 동일한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA)인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드가 상기 나노입자에 공유 결합으로 조합되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위가 상기 RNA 폴리뉴클레오티드의 중심점을 기준으로 상기 나노입자에 대해 원위에 위치하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 RNA의 표면 밀도는 적어도 2 pmol/cm2 - 1000 pmol/cm2인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 상호작용 부위에는 RNase H, RNase D, RNase L, RNase III, Dicer, Argonaute, Argonaute2, 및 인간 면역결핍 바이러스 전사활성 반응(transactivating response) RNA-결합 단백질(TRBP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질이 조합되는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 듀플렉스의 도메인이 뉴클레오티드 10개 길이인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 듀플렉스가 상기 타겟 폴리뉴클레오티드내 제2 서열과 상보적인 제2 도메인을 더 포함하며,
    상기 듀플렉스의 제2 도메인에 상기 타겟 폴리뉴클레오티드의 상기 제2 서열이 혼성화되면 제2 폴리펩타이드에 의해 인지되는 추가적인 기질 부위가 형성되는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 도메인이 뉴클레오티드 10개 길이인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 기질 부위와 상기 추가적인 기질 부위가 동일한 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드가 5 내지 100개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 추가적인 폴리뉴클레오티드가 5 내지 100개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  17. 제1항에 있어서, 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  18. 제1항에 있어서, 은 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  19. 타겟 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 방법으로서,
    상기 타겟 폴리뉴클레오티드를 제1항의 나노입자 구조체의 도메인과 혼성화하여, 폴리펩타이드에 대한 기질 부위를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 혼성화로 상기 타겟 폴리뉴클레오티드가 분해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 RNase H, RNase D, RNase L, RNase III, Dicer, Argonaute, Argonaute2 및 TRBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 듀플렉스와 나노입자 간의 거리는 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이에 해당하는 것인, 나노입자 구조체.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
KR1020117014393A 2008-11-24 2009-11-24 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체 KR101692880B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11744908P 2008-11-24 2008-11-24
US61/117,449 2008-11-24
PCT/US2009/065822 WO2010060110A1 (en) 2008-11-24 2009-11-24 Polyvalent rna-nanoparticle compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110089433A KR20110089433A (ko) 2011-08-08
KR101692880B1 true KR101692880B1 (ko) 2017-01-04

Family

ID=41698439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117014393A KR101692880B1 (ko) 2008-11-24 2009-11-24 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체

Country Status (10)

Country Link
US (3) US9139827B2 (ko)
EP (2) EP3335705A1 (ko)
JP (3) JP5749172B2 (ko)
KR (1) KR101692880B1 (ko)
CN (2) CN102281872A (ko)
AU (2) AU2009316286B2 (ko)
CA (1) CA2744207C (ko)
DK (1) DK2365803T3 (ko)
MX (1) MX2011005429A (ko)
WO (1) WO2010060110A1 (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252756B2 (en) 2005-06-14 2012-08-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
CN103966345A (zh) 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒
CA2689923A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
CA3013503A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Northwestern University Nanostructures suitable for sequestering cholesterol and other molecules
KR101692880B1 (ko) 2008-11-24 2017-01-04 노오쓰웨스턴 유니버시티 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
US20100184844A1 (en) * 2009-01-08 2010-07-22 Northwestern University Inhibition of Bacterial Protein Production by Polyvalent Oligonucleotide Modified Nanoparticle Conjugates
KR20120136345A (ko) 2009-10-30 2012-12-18 노오쓰웨스턴 유니버시티 주형화된 나노컨쥬게이트
WO2011091065A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Northwestern University Synthetic nanostructures including nucleic acids and/or other entities
CN104024854A (zh) 2011-09-11 2014-09-03 奥拉森斯有限责任公司 细胞摄取对照系统
AU2012308302A1 (en) 2011-09-14 2014-03-20 Northwestern University Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
AU2014292926B2 (en) 2013-07-25 2020-03-05 Exicure Operating Company Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
AU2014292928A1 (en) 2013-07-25 2016-03-03 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunoregulatory agents
GB201313897D0 (en) 2013-08-02 2013-09-18 Maersk Olie & Gas Conformance control in enhanced oil recovery
US10568898B2 (en) 2013-08-13 2020-02-25 Northwestern University Lipophilic nanoparticles for drug delivery
CN106535876B (zh) 2014-06-04 2020-09-11 埃克西奎雷股份有限公司 免疫调节剂通过脂质体球形核酸的多价递送以用于预防或治疗应用
US9910035B1 (en) 2014-07-16 2018-03-06 Verily Life Sciences Llc Polyvalent functionalized nanoparticle-based in vivo diagnostic system
CR20170181A (es) 2014-10-06 2017-05-31 Exicure Inc Compuestos anti-tnf
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
US10517924B2 (en) 2014-11-24 2019-12-31 Northwestern University High density lipoprotein nanoparticles for inflammation
US10078092B2 (en) 2015-03-18 2018-09-18 Northwestern University Assays for measuring binding kinetics and binding capacity of acceptors for lipophilic or amphiphilic molecules
WO2017015444A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Dnp123 Company Programmable, self-assembling patched nanoparticles, and associated devices, systems and methods
US10967072B2 (en) 2016-04-27 2021-04-06 Northwestern University Short interfering RNA templated lipoprotein particles (siRNA-TLP)
EP3452598A4 (en) 2016-05-06 2020-04-29 Exicure, Inc. LIPOSOMAL SPHERIC NUCLEIC ACID (SNA) CONSTRUCTS WITH ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASO) FOR THE SPECIFIC KNOCKDOWN OF INTERLEUKIN-17 RECEPTOR MRNA
CN107435063B (zh) * 2016-05-27 2020-12-22 首都师范大学 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA-AuNP)的方法
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
US10973927B2 (en) 2017-08-28 2021-04-13 The Chinese University Of Hong Kong Materials and methods for effective in vivo delivery of DNA nanostructures to atherosclerotic plaques
CN107881176A (zh) * 2017-11-16 2018-04-06 苏州纳葛诺斯生物科技有限公司 标记外泌体的试剂及其制备方法和使用方法
CN109777794A (zh) * 2019-01-04 2019-05-21 三峡大学 一种核糖核酸酶及其抑制剂筛选的发光体系，制备方法及其应用
US20220175956A1 (en) * 2019-03-06 2022-06-09 Northwestern University Hairpin-like oligonucleotide-conjugated spherical nucleic acid
WO2021177996A1 (en) * 2020-03-02 2021-09-10 Northwestern University Fit-flares for detection of intracellular analytes in live cells
WO2022098768A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 The General Hospital Corporation Therapeutic, radiolabeled nanoparticles and methods of use thereof
CN114272391B (zh) * 2021-12-28 2023-05-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法
WO2024069235A2 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions containing oligonucleotides with theranostic applications

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147966A1 (en) 2001-07-10 2003-08-07 Stefan Franzen Nanoparticle delivery vehicle
WO2008141289A1 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Northwestern University Silver nanoparticle binding agent conjugates based on moieties with triple cyclic disulfide anchoring groups

Family Cites Families (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) * 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) * 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) * 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) * 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5317098A (en) * 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
AU630076B2 (en) 1987-09-21 1992-10-22 Gen-Probe Incorporated Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) * 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) * 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
EP0348458B1 (en) * 1987-11-30 1997-04-09 University Of Iowa Research Foundation Dna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5082830A (en) * 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) * 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5512439A (en) * 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) * 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5721218A (en) * 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
WO1991006556A1 (en) 1989-10-24 1991-05-16 Gilead Sciences, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) * 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) * 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623065A (en) * 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) * 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) * 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
WO1992002258A1 (en) * 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) * 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
EP0541722B1 (en) 1990-08-03 1995-12-20 Sterling Winthrop Inc. Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) * 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) * 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) * 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
ATE198598T1 (de) * 1990-11-08 2001-01-15 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7223833B1 (en) * 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
AU2916292A (en) 1991-10-24 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5594121A (en) * 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
WO1993010820A1 (en) 1991-11-26 1993-06-10 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) * 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
DE69312700T2 (de) 1992-04-14 1998-02-19 Cornell Res Foundation Inc Makromoleküle auf basis von dendritischen polymeren und verfahren zur herstellung
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
EP0691968B1 (en) 1993-03-30 1997-07-16 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
ATE160572T1 (de) 1993-03-31 1997-12-15 Sanofi Sa Oligonucleotide mit amidverkettungen die phosphoesterverkettungen einsetzen
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
NL9301919A (nl) 1993-05-27 1994-12-16 Pelt & Hooykaas Werkwijze voor het afvangen van milieuschadelijke stoffen uit met dergelijke stoffen verontreinigd materiaal.
WO1995006731A2 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JPH09504297A (ja) 1993-10-27 1997-04-28 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ２′−アミドおよび２′−ペプチド修飾オリゴヌクレオチド
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) * 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) * 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) * 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) * 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050059016A1 (en) * 2002-11-05 2005-03-17 Ecker David J. Structural motifs and oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US6767702B2 (en) 1996-07-29 2004-07-27 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
EP1818417B1 (en) 1996-07-29 2014-02-12 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20060002949A1 (en) * 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
AU750244B2 (en) 1997-09-04 2002-07-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
US6827979B2 (en) 1999-01-07 2004-12-07 Northwestern University Methods utilizing scanning probe microscope tips and products therefor or produced thereby
AR022404A1 (es) 1999-01-25 2002-09-04 Photogen Inc Metodo y agentes para la terapia de radiacion mejorada
WO2000066605A2 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Cyclops Genome Sciences Limited Polynucleotides
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
JP2003503699A (ja) 1999-06-25 2003-01-28 ナノスフェアー インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子およびその利用法
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
EP1238071B1 (en) * 1999-11-29 2008-04-23 Avi Biopharma, Inc. Uncharged antisense oligonucleotides targeted to bacterial 16s and 23s rrnas and their uses
US20030181412A1 (en) 1999-12-21 2003-09-25 Ingeneus Corporation Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses
AU2860401A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Aventis Pharma S.A. Compositions comprising nucleic acids incorporated in bilaminar mineral particles
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
ATE487136T1 (de) 2000-03-28 2010-11-15 Nanosphere Inc Nanopartikel mit gebundenen oligonukleotiden und verwendungen derselben
WO2002000916A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 California Institute Of Technology Methods for identifying an essential gene in a prokaryotic microorganism
EP1360318B1 (en) 2000-07-11 2006-04-26 Northwestern University Method of detection by enhancement of silver staining
US6806289B1 (en) 2000-07-14 2004-10-19 Stephen J. Lippard Coordination complexes, and methods for preparing by combinatorial methods, assaying and using the same
US6678548B1 (en) * 2000-10-20 2004-01-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Unified probabilistic framework for predicting and detecting seizure onsets in the brain and multitherapeutic device
DK2813582T3 (en) 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
DE10065475A1 (de) 2000-12-28 2002-07-18 Switch Biotech Ag Verwendung von "intermediate-conductance" Kaliumkanälen und Modulatoren zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten mit gestörter Keratinozytenfunktion
US7667004B2 (en) * 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
IL142875A (en) 2001-04-30 2009-08-03 Avigdor Shafferman PEG-linked cholinesterases for the detoxification of circulating organophosphorus
US20060019917A1 (en) * 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2002096262A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Northwestern University Non-alloying core shell nanoparticles
RU2294192C2 (ru) 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот
AU2002343792A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND PROCESS FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE-KNOCKDOWN CELLS AND THE LIKE USING THE SAME
WO2003052099A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Tao Chen Methods of parallel gene cloning and analysis
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
CA2488048A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Kinase suppressor of ras inactivation for therapy of ras mediated tumorigenesis
DE10238298A1 (de) * 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
AU2003284323A1 (en) * 2002-10-18 2004-05-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
US20060105343A1 (en) 2003-01-09 2006-05-18 Children's Medical Center Corporation Methods for diagnosis and prognosis of cancer
US7138520B2 (en) 2003-01-13 2006-11-21 Massachusetts Institute Of Technology Coordination complexes having tethered therapeutic agents and/or targeting moieties, and methods of making and using the same
US7727969B2 (en) 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
US20050096263A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-05 Keay Susan K. Novel antiproliferative factor and methods of use
US20080057128A1 (en) * 2003-07-18 2008-03-06 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefore, and hydrogels and biomaterials made there from
US7611728B2 (en) 2003-09-05 2009-11-03 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Osmotic delivery of therapeutic compounds by solubility enhancement
DK3342425T3 (da) 2003-09-09 2020-03-16 Geron Corp Modificerede oligonukleotider til inhibering af telomerase
JP5243789B2 (ja) * 2004-03-15 2013-07-24 シティ・オブ・ホープ 二本鎖ｒｎａによる遺伝子発現の特異的阻害のための方法及び組成物
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
BRPI0510206A (pt) 2004-05-12 2007-10-16 Genentech Inc método de identificação de fenótipo, célula isolada, métodos de identificação de agentes, agentes, agentes terapêuticos, método de avaliação de agente terapêutico, composição farmacêutica, métodos de tratamento, prevenção ou melhoria de disfunções e métodos de modulação
GB0411537D0 (en) * 2004-05-24 2004-06-23 Midatech Ltd Nanoparticles comprising rna ligands
US20080213177A1 (en) 2004-05-24 2008-09-04 Thomas William Rademacher Nanoparticles Comprising Rna Ligands
US20060008907A1 (en) * 2004-06-09 2006-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Control of gene expression via light activated RNA interference
WO2006012695A1 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Panvax Limited An immunogenic composition
US20060105342A1 (en) * 2004-08-31 2006-05-18 Mario Villena Computerized systems for formation and update of databases
TW200616606A (en) 2004-10-19 2006-06-01 Schering Ag Treatment and prevention of multi-drug resistance
CN101080241A (zh) 2004-12-17 2007-11-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于分子成像的靶向剂
US20090238767A1 (en) 2004-12-17 2009-09-24 Koninklijke Philips Electronics, N.V. Targeting contrast agents or targeting therapeutic agents for molecular imaging and therapy
EP1674128A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 Steinbeis-Transferzentrum für Herz-Kreislaufforschung Magnetic pole matrices useful for tissue engineering and treatment of disease
US8007829B2 (en) 2005-01-19 2011-08-30 William Marsh Rice University Method to fabricate inhomogeneous particles
KR100704011B1 (ko) 2005-02-16 2007-04-04 한국과학기술원 금속나노입자와 양자점의 ｆｒｅｔ에 의한 생체분자특이결합 검출 방법
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
US8252756B2 (en) 2005-06-14 2012-08-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
JP2007101498A (ja) * 2005-10-07 2007-04-19 Fujifilm Corp 蛍光プローブ及び蛍光検出方法
WO2007047455A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Northwestern University Colorimetric screening of dna binding/intercalating agents with gold nanoparticle probes
FR2892819B1 (fr) 2005-10-28 2008-02-01 Centre Nat Rech Scient Nanoparticules a luminescence persistance pour leur utilisation en tant qu'agent de diagnostic destine a l'imagerie optique in vivo
US20100167051A1 (en) 2006-03-31 2010-07-01 Goia Dan V Process for Manufacture of Silver-Based Particles and Electrical Contact Materials
US20090035576A1 (en) * 2006-09-08 2009-02-05 Prasad Paras N Nanoparticles for two-photon activated photodynamic therapy and imaging
CN103966345A (zh) 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒
CA2680600A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Antigen Express, Inc. Li-rnai involved li suppression in cancer immunotherapy
US8323694B2 (en) 2007-05-09 2012-12-04 Nanoprobes, Inc. Gold nanoparticles for selective IR heating
CA2689923A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US20100183504A1 (en) 2007-06-14 2010-07-22 Fanqing Frank Chen Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
US20080317768A1 (en) 2007-06-21 2008-12-25 Boeing Company Bioconjugated nanoparticles
BRPI0818732A2 (pt) 2007-10-31 2014-10-07 Pamela Lipkin Composições de análogo de prostaglandina e métodos para tratar condições relacionadas epiteliais.
US20090148384A1 (en) 2007-12-10 2009-06-11 Fischer Katrin Functionalized, solid polymer nanoparticles comprising epothilones
US20110262976A1 (en) 2008-01-17 2011-10-27 Indigene Pharmaceuticals, Inc. PRODUCTION OF R-a-LIPOIC ACID BY FERMENTATION USING GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS
WO2009143157A2 (en) 2008-05-19 2009-11-26 Cornell University Self-assembly of nanoparticles through nucleic acid engineering
KR101692880B1 (ko) * 2008-11-24 2017-01-04 노오쓰웨스턴 유니버시티 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체
US8298765B2 (en) 2009-01-01 2012-10-30 Cornell University Multifunctional nucleic acid nano-structures
US20100184844A1 (en) 2009-01-08 2010-07-22 Northwestern University Inhibition of Bacterial Protein Production by Polyvalent Oligonucleotide Modified Nanoparticle Conjugates
AU2010237001B2 (en) 2009-04-15 2016-07-07 Northwestern University Delivery of oligonucleotide-functionalized nanoparticles
WO2011017690A2 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Northwestern University Intracellular delivery of contrast agents with functionalized nanoparticles
US9307200B2 (en) 2014-04-10 2016-04-05 Cisco Technology, Inc. Use of face and motion detection for best view framing in video conference endpoint

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147966A1 (en) 2001-07-10 2003-08-07 Stefan Franzen Nanoparticle delivery vehicle
WO2008141289A1 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Northwestern University Silver nanoparticle binding agent conjugates based on moieties with triple cyclic disulfide anchoring groups

Also Published As

Publication number Publication date
CA2744207A1 (en) 2010-05-27
CN106955360A (zh) 2017-07-18
JP6466500B2 (ja) 2019-02-06
US20180085390A1 (en) 2018-03-29
AU2016219644B2 (en) 2018-04-05
CN102281872A (zh) 2011-12-14
MX2011005429A (es) 2011-06-21
AU2016219644A1 (en) 2016-09-15
US10391116B2 (en) 2019-08-27
KR20110089433A (ko) 2011-08-08
CA2744207C (en) 2019-05-28
US9139827B2 (en) 2015-09-22
JP5749172B2 (ja) 2015-07-15
US20150352138A1 (en) 2015-12-10
JP2015126751A (ja) 2015-07-09
JP2017127327A (ja) 2017-07-27
AU2009316286B2 (en) 2016-05-26
US20100136682A1 (en) 2010-06-03
EP2365803A1 (en) 2011-09-21
EP3335705A1 (en) 2018-06-20
US9844562B2 (en) 2017-12-19
EP2365803B1 (en) 2017-11-01
JP2012509674A (ja) 2012-04-26
WO2010060110A1 (en) 2010-05-27
AU2009316286A1 (en) 2010-05-27
DK2365803T3 (en) 2018-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101692880B1 (ko) 다가 ｒｎａ-나노입자 구조체
US10370661B2 (en) Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US10370656B2 (en) Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
AU2014262264B2 (en) Nucleic Acid Functionalized Nanoparticles For Therapeutic Applications
AU2018279030A1 (en) Nucleic Acid Functionalized Nanoparticles For Therapeutic Applications

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant