ES2445328T3 - Sistema de suministro para ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Liposoma que selecciona como diana el receptor de la integrina αv β3, que comprende: un anfifílico catiónico; un lípido neutro; un lípido seleccionador de diana que tiene un antagonista no peptídico de la integrina αvβ3 y un dominiohidrofóbico unido al antagonista, y un ácido nucleico que forma complejo con el anfifílico catiónico; estando el anfifílico catiónico presente en una cantidad en el intervalo comprendido entre 1 y 50% en moles,estando dicho lípido seleccionador de diana presente en una cantidad en el intervalo comprendido entre 1 y 20%en moles, estando los valores porcentuales de los moles basados en los moles totales de los lípidos en elliposoma, estando el antagonista no peptídico de la integrina αvβ3 representado por la fórmula **Fórmula**

Description

Sistema de suministro para ácidos nucleicos.

Derechos gubernamentales

La presente invención se llevó a cabo con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos, Instituto Nacional de la Salud, Subvenciones 1 R37 CA50286 y 1 R01 CA86312; el Gobierno de los Estados Unidos posee ciertos derechos sobre la invención.

Campo de la Invención

La presente invención se refiere al suministro de genes y ácidos nucleicos generales similares a sitios seleccionadores de diana in vivo. Más particularmente, la presente invención se refiere al suministro génico mediado por liposomas a los vasos sanguíneos angiogénicos.

Antecedentes de la invención

Las integrinas constituyen un tipo de receptores celulares conocidos por unirse a proteínas matriciales extracelulares, y por tanto, median interacciones célula-célula y células-matriz extracelular, a las que se hace referencia como eventos de adhesión celular. Aunque muchas integrinas y los ligandos que se unen a ellas se describen en la literatura, la función biológica de muchas de ellas permanece esquiva. Los receptores de las integrinas constituyen una familia de proteínas con características estructurales compartidas de complejos glicoproteicos heterodiméricos no covalentes formados por subunidades a y �, Cheresh & Mecham, eds. Integrins: Molecular and Biological Responses to the Extracellular Matrix, Academic Press, Inc., San Diego, CA 92101 (1994), Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). Las funciones de adhesión celular específica que estas integrinas juegan en las abundantes interacciones celulares tisulares, se encuentran todavía bajo investigación.

Las interacciones matriz-endotelio juegan un papel durante la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos. Un receptor de adhesión celular conocido como av�3 integrina se encuentra en la superficie de las células endoteliales activadas que participan en la angiogénesis.

Es bien conocido que la angiogénesis constituye también un requerimiento para el crecimiento maligno tumoral y las metástasis. En la ausencia de angiogénesis, la expansión tumoral se suprime. Asimismo, la expresión de un marcador específico de la angiogénesis, la integrina av�3 se sabe que se correlaciona con el grado tumoral.

Se ha encontrado ahora que los liposomas catiónicos que transportan un antagonista no peptídico de la integrina como un agente seleccionador de diana, pueden proporcionar ácidos nucleicos tales como genes, a los vasos sanguíneos angiogénicos. Ácidos nucleicos apropiadamente seleccionados pueden suprimir o aumentar el crecimiento de los vasos sanguíneos tales como se desea, y así, proporcionan un procedimiento para el tratamiento de las enfermedades dependientes de la angiogénesis.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un liposoma que selecciona como diana un receptor de la integrina av�3, que comprende un anfifílico catiónico, un lípido neutro, un lípido que selecciona como diana un antagonista no peptídico de la integrina av�3 y un dominio hidrofóbico unido al antagonista; y un ácido nucleico que forma complejo con el anfifílico catiónico, encontrándose éste en una cuantía del orden de 1% al 50% en moles aproximadamente, y encontrándose presente dicho lípido seleccionador de diana en una cantidad del orden de entre 1% a 20% en moles aproximadamente, basándose los valores porcentuales molares en los moles totales de lípidos en el liposoma, donde el antagonista no peptídico de la integrina av�3, está representado por la fórmula

En una forma de realización, el grupo amino libre del antagonista se une covalentemente directamente o mediante un grupo de engarce superficial al dominio hidrofóbico.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el liposoma del primer aspecto para utilizarlo en un procedimiento para introducir un ácido nucleico en una célula que presente una integrina av�3 que comprende la puesta en contacto de dicha célula con el liposoma.

En un tercer aspecto,, la presente invención proporciona la utilización de un liposoma que selecciona como diana un receptor de la integrina av 3 del primer aspecto, capaz de expresar una proteína o péptido que inhibe la angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica con objeto de inhibir ésta.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un liposoma que selecciona como diana un receptor de la integrina av 3 del primer aspecto, que puede expresar una proteína o péptido que inhibe la angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica que inhiba el crecimiento tumoral.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el liposoma del primer aspecto para utilizarlo en un procedimiento que induzca la apoptosis en las células endoteliales vasculares, que comprende la puesta en contacto de las células vasculares endoteliales con una cantidad efectiva del liposoma que pueda expresar una proteína o péptido que induzca la apóptosis.

Los liposomas seleccionadores de diana proporcionados por la presente invención, son útiles para el suministro selectivo de ácidos nucleicos, tales como genes, secuencias oligonucleótidas anticodificantes, ADN o ARN, a un sitio diana predeterminado, por ejemplo, un vaso sanguíneo angiogénico in vivo, cuando se introduce sistémica o localmente. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden suministrarse a los vasos sanguíneos angiogénicos, de esta forma, para mediar la absorción de los ácidos nucleicos por las células endoteliales vasculares para la expresión o para el suministro anticodificante. Puede alcanzarse la interrupción del crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos. Asimismo, mediante selección apropiada del ácido nucleico que vaya a ser proporcionado, puede inducirse un nuevo crecimiento de vasos sanguíneos, si se desea.

Más particularmente, un liposoma que selecciona como diana el receptor de la integrina av 3, puede ser una monopartícula que posee un tamaño no superior a 100 nanómetros aproximadamente, y es una vesícula unilamelar

o multilamelar que comprende un anfifílico catiónico tal como un lípido catiónico, un lípido neutral, un lípido seleccionador de diana que posee un dominio seleccionador de diana de la integrina av 3, [es decir, el antagonista no peptídico, de la integrina av 3] y un dominio hidrofóbico, y un ácido nucleico tal como un gen, una secuencia oligonucleótida antisentido, una secuencia de ADN, o una secuencia de ARN. En el lípido seleccionador de diana, el dominio para ésta puede unirse directamente al dominio hidrofóbico. Alternativamente, el dominio seleccionador de diana puede unirse covalentemente a un dominio de engarce hidrofílico, (engarce superficial), que, a su vez, se une covalentemente al dominio hidrofóbico. El ácido nucleico forma complejo con el anfifílico catiónico que se encuentra en el liposoma.

En el liposoma que va a impactar en la diana, el anfifílico catiónico, tal como un lípido catiónico, se encuentra en una cuantía de alrededor del orden de entre 1 a 50 moles por ciento y el dominio seleccionador de diana del lípido seleccionador de diana se encuentra en una cantidad del orden de entre 1 a 20 moles por ciento, basándose en los moles totales del lípido en el liposoma. Los lípidos que constituyen el liposoma seleccionador de diana pueden tener grupos funcionales oligomerizables y/o polimerizables en sus respectivas porciones hidrofóbicas, y, por lo menos, una parte de cada lípido que se encuentre en el liposoma, puede entrecruzarse con otro a través de dichos grupos. El lípido catiónico puede también tener grupos capaces de entrecruzarse, si se desea. Alternativamente, el lípido catiónico puede estar libre de grupos capaces de entrecruzamiento.

Los presentes liposomas que actúan sobre las dianas, pueden utilizarse para el suministro de ácidos nucleicos para tratar el cáncer, enfermedades inflamatorias, y oculares. Dichos liposomas seleccionadores de diana pueden utilizarse también para suministrar genes con objeto de identificar dianas terapéuticas en los vasos sanguíneos.

Dichos liposomas de la presente invención que actúan sobre las dianas, constituyen monopartículas de uniones múltiples, preferentemente no más grandes que alrededor de 250 nanómetros, más preferentemente de alrededor de 40 a 100 nanómetros, que incluyen un lípido catiónico o citofoctina, junto con un ácido nucleico que forma complejo con él. Un lípido preferido que actúa sobre las dianas puede representarse como L-X-K, donde L es el dominio seleccionador de diana, [es decir, el antagonista no peptídico de la integrina av 3], X es un dominio hidrofílico que sirve como un engarce superficial a un domino K hidrofóbico. Alternativamente, el lípido que actúa sobre las dianas puede representarse por L-K, donde el dominio L diana se une directamente al domino K hidrofóbico.

El antagonista no peptídico del receptor de la integrina av 3 se representa por la fórmula donde el grupo amino libre (NH2) está disponible para unir covalentemente el antagonista al domino hidrofóbico del liposoma, bien directamente, o a través de un grupo ligante superficial.

La combinación del antagonista L no peptídico del receptor de la av 3 integrina y del engarce X superficial opcional

5 constituye una molécula que actúa sobre la diana del receptor av 3 o grupo apropiado para la conjugación a un transportador ácido nucleico, tal como un liposoma catiónico. El liposoma resultante susceptible de actuar sobre la diana, se asocia entonces con un ácido nucleico predeterminado, por ejemplo, un gen, acomplejándose con él.

Breve descripción de las figuras

10 En las figuras.

La figura 1 ilustra esquemáticamente un liposoma seleccionador de diana de la presente invención;

15 La figura 2 es una ilustración de un liposoma seleccionador de diana unido entrecruzadamente de la presente invención;

La figura 3 es una ilustración de otro liposoma seleccionador de diana unido entrecruzadamente de la presente invención; 20 La figura 4 ilustra esquemáticamente los liposomas seleccionadores de diana que circulan sistemáticamente ;

La figura 5 ilustra esquemáticamente la recolección de liposomas seleccionadores de diana en los sitios angiogénicos; 25 Las figuras 6 y 7 ilustran esquemáticamente el suministro de ADN, tal como un gen, a las células diana;

La figura 8 ilustra esquemáticamente un ensayo de adhesión apropiado para el ensayo de antagonistas av 3;

30 La figura 9 es una presentación gráfica de los datos obtenidos utilizando los ensayos de adhesión que se muestran en la figura 8 y mostrando que un liposoma seleccionador de diana de la presente invención se une a un receptor av 3;

La figura 10 es una presentación gráfica de los datos que muestran el suministro efectivo del gen de la proteína

35 fluorescente verde llevado a cabo a las células que expresan av3 in vivo, utilizando un liposoma seleccionador de diana de la invención; los liposomas seleccionadores de diana que transportan el gen muestran la transfección de células de una forma dependiente de av 3; las células utilizadas fueron células M21 y M21L de melanoma humano; las células M21 expresan integrinas av 3, mientras que las células M21L expresan la integrina av 3 (a-nulo);

40 La figura 11 es una presentación gráfica de datos que demuestran la diana selectiva in vivo del gen de la luciferasa de luciérnaga para las células de los vasos tumorales que expresan av 3, utilizando un liposoma seleccionador de diana de la invención; se muestra que los transportadores del gen diana transfectan las células tumorales de forma dependiente de av 3; las células que se utilizaron fueron células M21 y M21L de melanoma

45 humano, que se implantaron en los ratones; las células M21 expresan la integrina av 3, mientras que las células M21L no expresan la integrina av 3;

La figura 12 es una presentación gráfica de datos que demuestran la inhibición in vivo y la regresión del crecimiento tumoral en tumores establecidos, debido a la administración de un liposoma seleccionador de diana 50 unido a un gen que expresa una proteína Raf mutante que inhibe la angiogénesis;

La figura 13 es una presentación gráfica de datos que demuestran la inhibición in vivo y la regresión tumoral en tumores establecidos, debido a la administración de un liposoma seleccionador de diana unido a un gen que expresa una proteína Raf mutante que inhibe la angiogénesis;

55 La figura 14 muestra fotomicrográficas que demuestran in vivo el suministro de un gen que codifica GFP para los vasos sanguíneos en una CAM de polluelos que utiliza un liposoma seleccionador de diana de la invención;

La figura 15 muestra fotomicrografías que demuestran el suministro in vivo a vasos sanguíneos en un ojo de 60 ratón, de un gen que codifica GFP mediante la inyección intravítrea de un liposoma seleccionador de diana de la invención que se une al gen;

La figura 16 muestra fotomicrografías que demuestran la apóptosis neovascular in vivo mediante el suministro mediado por un liposoma seleccionador diana de un gen que codifica la Raf mutante para los vasos sanguíneos 65 angiogénicos en retinas de ratón;

La figura 17 muestra el esquema 1 sintético de liposomas seleccionadores de diana, que detalla la síntesis del conjugado 12 antagonista lípido-integrina y

La figura 18 muestra el esquema 2 sintético del liposoma seleccionador diana, que esboza la formación de liposomas nanoparticulados diana (NPs) mediante acto-ensamblamiento y polimerización de los lípidos apropiados a partir del conjugado 12 de lípidos trivalentes-antagonista de la integrina.

Descripción de las formas de realización preferidas

Los liposomas seleccionadores de diana de la presente invención se muestran en las figura 1-3 y 18.

El lípido seleccionador de diana posee un dominio seleccionador de diana (es decir, el antagonista no peptídico del receptor de la integrina) unido covalentemente de modo preferido a un dominio hidrofóbico. El dominio seleccionador de diana puede unirse directamente al dominio hidrofóbico, o puede unirse a un dominio hidrofílico tal como un grupo de engarce (engarce superficial), el cual, a su vez, está unido a un dominio hidrofóbico.

El término “arilo”, tal como se utiliza en la presente Memoria y en las reivindicaciones que se adjuntan, significa un radical hidrocarbonado que contiene por lo menos un anillo aromático de 6 carbonos, y que puede contener además sustituyentes lineales, ramificados o cíclicos hidrocarbonados. El término “heteroalilo” significa un radical que comprende por lo menos un anillo de 6 carbonos, y que pueden contener además sustituyentes lineales, ramificados

o hidrocarbonados cíclicos, donde el heteroátomo puede ser cualquier elemento seleccionado a partir del grupo designado por la IUPAC como 15 (grupo del nitrógeno) y 16 (grupo del oxígeno) de la tabla periódica, que incluye radicales heterocíclicos aromáticos de dichos compuestos tal como se dan a conocer en L.A. Paquette, Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1968). Cuando se hace referencia a ellos, en la presente Memoria, los grupos arilo y heteroarilo pueden estar sustituidos o no.

El término heterocíclico, tal como se utiliza en la presente Memoria, y en las reivindicaciones que se adjuntan, significa un radical que comprende, por lo menos, un anillo no aromático que contiene un heteroátomo de carbono, y que puede contener además sustituyentes cíclicos hidrocarbonados, lineales o ramificados, en los que el heteroátomo puede ser cualquier elemento seleccionado a partir de los grupos denominados por el IUPAC como 15 (grupo del nitrógeno) y 16 (grupo del oxígeno)m de la tabla periódica, incluyendo radicales heterocíclicos no aromáticos de dichos compuestos, tal como se dan a conocer en Paquette, supra. Los grupos heterocíclicos pueden ser sustituidos o no con grupos alquilos o con grupos funcionales reactivos tales como halógenos, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílicos y grupos de ácido sulfónico.

El término “alquilo”, tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones que se adjuntan, se refiere a una mitad hidrocarbonada, que puede ser lineal, ramificada, o puede contener una estructura carbocíclica de anillo.

El término “alquenilo”, tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones que se añaden, se refiere a un grupo alquilo que, por lo menos, tiene un enlace doble carbono-carbono.

El término “alquinilo”, tal como se utiliza aquí y en las reivindicaciones que se adjuntan, se refiere a un grupo alquilo que tiene por lo menos, un enlace triple carbono-carbono.

El término “sustituido”, tal como se utiliza aquí y en las reivindicaciones que se adjuntan, significa el reemplazamiento de uno o más átomos de hidrógeno de uno de los radicales anteriores con un grupo alquilo, un grupo fenilo, o un grupo funcional tal como hidróxido, alcoxilo, amino, nitroso, nitro, azo, azido, amido, carboxilo, oxo, tiol, sulfoxilo, sulfonilo, fosfinilo, fosfonilo, fluoro, cloro, bromo, yodo y grupos parecidos, tal como se describen en R. Panico et al. Ed. A. Guide To IUPAC Nomenclature of Organic Compounds, Blackwell Science Ltd. (1993).

El término “liposoma”, tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones que se adjuntan, se refiere a un glóbulo cuyas paredes son moléculas lipídicas que pueden o no estar copolimerizadas entre ellas.

El término “lípido”, tal como se utiliza en la presente patente y en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a cualquier elemento de los grupos de aceites, grasas, y sustancias tipo grasa que son solubles característicamente en disolventes relativamente no polares, pero que son solo escasamente solubles en disolventes acuosos. Los lípidos constituyen uno de los cuatro tipos más importantes de compuestos que se encuentran en los tejidos vivos e incluyen ácidos grasos, grasas neutras tales como triacilgliceroles, ésteres de ácidos grasos y jabones, alcoholes y ceras (grasos) de cadena larga, esfingoides y otras bases de cadena larga, glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, carotenos, poliprenoles, esteroles, así como terpenos e isoprenoides.

El término “citofectina” tal como se utiliza en esta invención y en las reivindicaciones adjuntas, designa un lípido catiónico para la y expresión génica, constituido por un grupo catiónico principal unido por un engarce a un dominio

o mitad hidrofóbicos.

El término “neutral” tal como se utiliza en esta patente y en las reivindicaciones adjuntas, con referencia a los lípidos, incluye lípidos no cargados, por ejemplo, colesterol, así como lípidos zwiteriónicos, por ejemplo, dioleoilfosfatidil etanolamina y dioleoilfosfatidil colina.

El término “colesterilo”, tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a mitades hidrocarbonadas esteroidales derivadas de, o estructuralmente similares al colesterol.

El compuesto no peptídico antagonista de la integrina av 3 se representa por la fórmula

en la que el grupo amino (NH2) libre está disponible para unir covalentemente el antagonista a un dominio hidrofóbico del liposoma mediante un grupo ligante superficial tal como un grupo carboxílico y u otro activo apropiado.

El antagonista no peptídico del receptor de la integrina se une preferentemente de forma covalente al engarce superficial hidrofílico o directamente al dominio hidrofóbico utilizando técnicas químicas convencionales que proporcionan una unión covalente del antagonista al engarce superficial o el dominio hidrofóbico. La química reaccional que da lugar a dichas uniones es bien conocida en la técnica, e implica la utilización de grupos funcionales complementarios en el engarce superficial o en el dominio hidrofóbico, y el ligando antagonista de la integrina. Preferentemente, los grupos funcionales complementarios en el engarce superficial o el dominio hidrofóbico son seleccionados con respecto a los grupos funcionales disponibles para unión en el ligando, o que puedan introducirse en el ligando para la unión. Otra vez, dichos grupos funcionales complementarios se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la reacción entre un ácido carboxílico y una amina primaria o secundarias en presencia de agentes activantes bien conocidos apropiados, da lugar a la formación de un enlace amida que puede unir covalentemente el ligando al engarce superficial o al dominio hidrofóbico; la reacción entre un grupo amino y un grupo haluro sulfonilo da lugar a la formación de un enlace sulfonamida que puede unir covalentemente el ligando al engarce superficial o al dominio hidrofóbico; y la reacción entre un grupo alcohol o fenol y un haluro arilo o alquilo da lugar a la formación de otro enlace que puede unir covalentemente al ligando antagonista de la integrina al engarce superficial o al dominio hidrofóbico.

Alternativamente, el antagonista del receptor de la integrina, puede incluir un dominio hidrofóbico tal como un grupo C18-C30 alquilo, un grupo C18-C30 alquenilo, un grupo alquinilo C18-C30, un grupo colesterilo.

El dominio hidrofóbico, con o sin un engarce superficial interviniente, se une al antagonista del receptor de la integrina en una posición que conserva la interacción del sitio de unión del receptor y que permite específicamente que el antagonista se oriente él mismo a unirse al sitio de unión del receptor de la integrina. Dichas posiciones y protocolos de síntesis para la unión, son bien conocidos en la técnica.

El antagonista del receptor de la integrina av 3, cuando se une covalentemente a, o incluye un dominio hidrofóbico, en combinación con un lípido catiónico, proporciona un liposoma catiónico que es biocompatible y sustancialmente no inmunogénico. La actividad biológica del liposoma seleccionador de diana puede ser sensible a la valencia, glometría, composición, tamaño, flexibilidad o rigidez, etc. del engarce de la superficie hidrofílica, si está presente, y, a su vez, de la configuración en conjunto del liposoma seleccionador de diana, así como de la hidrofilicidad relativa del engarce superficial.

De acuerdo con esto, el engarce superficial hidrofílico, cuando está presente, se elige preferentemente para maximizar la actividad biológica del liposoma seleccionador de diana. El engarce superficial puede escogerse para potenciar la actividad biológica de la molécula seleccionadora de diana. En general, el engarce superficial puede elegirse a partir de cualquier constructo molecular orgánico que oriente el antagonista al sitio de unión. A este respecto, el enlace superficial puede considerarse como un entramado en el cual uno o más antagonistas de la integrina están dispuestos para dar lugar el resultado de orientación deseado. La orientación puede incluir, por ejemplo, la presentación del antagonista a una distancia apropiada de la superficie del liposoma, para permitir la interacción efectiva de los antagonistas con el sitio activo del receptor de la integrina.

Por ejemplo, orientaciones distintas del original puede alcanzarse, incluyendo en el entramado grupos que incluyen los mono o policíclicos, incluyendo grupos aril y/o heteroarilos, o estructuras que incorporan uno o más enlaces múltiples (grupos alquenilos, alquenileno, alquinilos o alquinilenos). Otros grupos pueden incluir también oligómeros y polímeros que constituyen especies de cadena recta o ramificada. En formas de realización preferidas, la rigidez es producida por la presencia de grupos cíclicos (por ejemplo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocíclico, etc.). En

otra forma de realización preferida, el anillo contiene seis o diez elementos. En otras formas de realización preferidas, el anillo es un anillo aromático, tal como, por ejemplo, fenilo o naftilo.

La estructura de cristal de la parte extracelular de la integrina av 3, cuando está asociada con un antagonista de la integrina, se describe en Xiong et al., Science 296: 151-155 (2002). El antagonista del receptor de la integrina av3 utilizado para poner en práctica la presente invención tiene una estructura que interactúa con el receptor de la integrina av 3 de una manera similar a la interacción descrita por Xiong et al.

Diferentes características hidrofílicas del ligante superficial, así como la presencia o ausencia de fracciones cargadas en el liposoma, pueden ser fácilmente controladas por el experto en la materia. Por ejemplo, la naturaleza hidrofóbica de un ligante superficial derivado de la diamina hexametileno (H2N(CH2)6NH2) o poliaminas relacionadas pueden modificarse para ser sustancialmente más hidrofílicas al sustituir el grupo alquileno por un grupo polioxialquileno, tal como polietilenglicol o polipropilenglicol.

Las propiedades del ligante superficial pueden modificarse mediante la adición o inserción de grupos auxiliares en o sobre el ligante superficial, por ejemplo, para cambiar la solubilidad de los liposomas (en agua, grasas, lípidos, fluidos biológicos, etc.), la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la flexibilidad del ligante superficial, y la antigenicidad, la estabilidad. Por ejemplo, la introducción de uno o más grupos polietilenglicol (PEG) en o dentro del ligante superficial aumenta la hidrofilicidad y la solubilidad en agua del liposoma nanoparticulado, mejora tanto el peso molecular como el tamaño molecular y, en función de la naturaleza del ligante superficial, puede aumentar también el tiempo de retención in vivo. Además, el PEG puede disminuir la antigenicidad y mejora potencialmente la rigidez total del ligante superficial.

Los grupos auxiliares que pueden mejorar la solubilidad en agua/hidrofilicidad del liposoma son útiles para poner en práctica esta invención. Por lo tanto, el alcance de la presente invención incluye el uso de grupos auxiliares, tales como, por ejemplo, pequeñas unidades de repetición de etilenglicoles propilenglicoles, alcoholes, polioles (ejemplo, por glicerina, propoxilato de glicerol, sacáridos, que incluyen mono-, oligosacáridos, etc.) carboxilatos (por ejemplo, pequeñas unidades de repetición de ácido glutámico, ácido acrílico, etc.) y aminas (por ejemplo, tetraetilenpentamina), para potenciar la solubilidad en agua y/o la hidrofilicidad del liposoma de la presente invención. En formas de realización preferida, el grupo auxiliar utilizado para mejorar la solubilidad acuosa hidrofilicidad es un poliéster. El grupo auxiliar puede unirse a un engarce superficial sobre el lípido seleccionador de diana, o puede unirse a otros lípidos en el liposoma, tal como el lípido catiónico o un lípido neutro relevante por ejemplo.

La incorporación de grupos lipofílicos auxiliares en el interior de la estructura del engarce superficial, para potenciar la lipofilicidad y/o la hidrofobicidad de los liposomas que se describen en esta Memoria, pertenece también al alcance de la invención, grupos lipofílicos útiles con los engarces superficiales de esta invención incluyen sólo como ejemplo, grupos arilo o heteroarilo sustituidos o no, pero sustituidos, por lo menos, con un grupo que permite su unión covalente al engarce superficial. Otros grupos lipofílicos que son útiles con los engarces superficiales que se describen en la presente Memoria, incluyen derivados de ácidos grasos que no forman bicapas en medio acuoso hasta que son alcanzadas concentraciones relativamente más altas.

La flexibilidad del engarce superficial puede manipularse mediante la inclusión de grupos auxiliares que son rígidos y/o abultados. La presencia de grupos rígidos o abultados puede dificultar la rotación libre con respecto a los enlaces en el engarce superficial, enlaces entre el engarce superficial y el grupo (o grupos) auxiliares, o enlaces entre el engarce superficial y los grupos funcionales. Los grupos rígidos pueden incluir, por ejemplo, aquellos cuya labilidad conformacional está “restringida” por la presencia de anillos y/o enlaces múltiples dentro del grupo, por ejemplo, grupos arilo, heretoarilo, cicloalquilo, ciclialquenilo, y grupos heterocíclicos. Otros grupos que pueden dar lugar a rigidez incluyen grupos polipeptídicos, tales como cadenas oligo o poliprolina.

La rigidez puede producirse electrostáticamente. De este modo, si los grupos auxiliares están cargados positiva o negativamente, los grupos auxiliares cargados de modo similar, se verán obligados a moderar el engarce superficial en una configuración que permita la distancia máxima entre cada una de las cargas similares. El coste energético de atraer a los grupos cargados de forma similar más cercano uno de otro, tenderá a sostener al engarce superficial en una configuración que mantenga la separación entre los grupos auxiliares cargados de forma similar. Además, los grupos auxiliares que portan cargas opuestas tenderán a ser atraídos a sus opuestos cargados de forma contraria pudiendo penetrar potencialmente en enlaces iónicos tanto intra como inter moleculares. Este mecanismo no covalente tenderá a mantener el engarce superficial en una conformación que permita el enlace entre los grupos cargados de forma opuesta. La adicción de grupos auxiliares que están cargados o alternativamente, portan una carga latente cuando están desprotegidos, después de añadirlos al engarce superficial, incluyen la desprotección de un grupo carboxilo, hidroxilo, tiol o amino mediante un cambio en el pH, oxidación, reducción u otro mecanismo conocidos por los expertos en la técnica, que da lugar a la remoción del grupo protector, pertenece al alcance de la presente invención.

La rigidez puede también ser proporcionada por la unión interna del hidrógeno o por colapso hidrofóbico.

Los grupos voluminosos pueden incluir, por ejemplo átomos grandes, iones, (por ejemplo, yodo, sulfuro, iones metálicos, etc.), o grupos que contienen átomos grandes, grupos policíclicos, incluyendo grupos aromáticos, grupos no aromáticos y estructuras que incorporan uno o más enlaces múltiples carbono-carbono (es decir, alquenos y alquinos). Los grupos voluminosos pueden incluir también oligómeros y polímeros que constituyen especies de cadena recta o ramificada. Se espera que las especies que son ramificadas proporcionen una rigidez mayor a la estructura que las especies de cadena recta de peso molecular similar.

En algunas formas de realización, la rigidez es producida por la presencia de grupos cíclicos (por ejemplo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocíclico, etc.). En otras formas de realización, el engarce superficial comprende uno o más anillos de seis elementos. En otras formas de realización, todavía, el anillo es un grupo arilo como, por ejemplo, fenilo o naftilo.

La selección apropiada de un grupo de engarces superficiales que proporcionen orientación apropiada, rotación limitada/no limitada, el grado deseado de hidrofolicidad/hidrofilicidad, etc., es buena en cuanto a capacidad de la técnica. La eliminación o reducción de la antigenicidad de las nanopartículas que se describen en la presente Memoria pertenece también a la capacidad de la técnica. En ciertos casos, la antigenicidad de una nanopartícula puede eliminarse o reducirse utilizando grupos tales como, por ejemplo, grupos polietilenglicol.

El transportador ácido nucleico es un anfifílico catiónico tal como un lípido catiónico, un liposoma catiónico, o una micela que posea grupos catiónicos, que es capaz de unirse a un ácido nucleico mediante une interacción, habitualmente, con secuencias ácido nucleicas cargadas negativamente, para formar complejos que puedan penetrar en la célula. Los liposomas seleccionadores de diana se ilustran en las figuras 1, 2, 3, 17 y 18.

Los lípidos catiónicos apropiados a estos propósitos (citofectinas) se ilustran mediante el cloruro de 1,2-dioleoiloxy3-(N,N,N-trimetilamonio)propano (DOTAP)bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), cloruro de dioleoildimetilamonio, dioleoil-L-a-fosfatidiletanolamina (DOPE), y ‘N-colecteriloxicarbonil-3,7,12-triazapenta-decano1,15-diamina (CTAP). Un lípido catiónico preferido es DOTAP. Otros lípidos catiónicos se describen en Miller, Angew, Chem. Int.Ed. 37:1768-1785 (1998), al que se alude en lo sucesivo como “Miller”, y Cooper et al., Chem. Eur. J. 4(1):137-151 (1998).

El liposoma seleccionador de diana de la presente invención puede entrecruzarse, entrecruzarse parcialmente, o no entrecruzarse. Los liposomas entrecruzados pueden incluir tanto componentes entrecruzados como no entrecruzados.

Un liposoma seleccionador de diana no entrecruzado, ejemplo de la presente invención, es una mezcla lipídica que incluye DOTAP (lípido catiónico), colesterol (lípido neutro), polietilenglicol (un componente hidrofílico auxiliar) tal como PEG-350 (un polioxietileno que posee 350 unidades oxietilénicas de repetición) y el antagonista no peptídico av 3 del receptor de la integrina unido covalentemente a, o incluyendo un lípido). Preferentemente, la relación de DOTAP al colesterol al polietilenglicol es alrededor de 1:1:0,12 respectivamente, y el lípido que contiene el antagonista del receptor no peptídico de la integrina av 3 (lípido seleccionador de diana de la integrina) está incluido en una cantidad suficiente para proporcionar una avidez relativamente grande para la integrina av 3. El liposoma seleccionador de diana incluye el lípido seleccionador de diana de la integrina en una cantidad del orden de un porcentaje alrededor de 1 a 20 moles %, basados en moles totales de los componentes lipídicos en el liposoma, más preferentemente de entre 8 a 12 moles por ciento.

Un liposoma entrecruzado seleccionador de diana de la presente invención, incluye un lípido neutro o zwiteriónico polimerizable, un lípido seleccionador de diana polimerizable de la integrina y un lípido catiónico polimerizable apropiado para unir un ácido nucleico.

En otra forma de realización preferida, el liposoma seleccionador de diana entrecruzado incluye un lípido neutro o zwiteriónico polimerizable, un lípido seleccionador de diana polimerizable de la integrina, y un lípido catiónico nopolimerizable.

El liposoma que contiene lípidos polimerizables puede entrecruzarse, por ejemplo añadiendo un iniciador de polimerización apropiado sin radicales mediante irradiación con una apropiada longitud de onda de luz ultravioleta, o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica de polimerización.

Liposomas catiónicos apropiados o citofectinas están disponibles comercialmente y pueden también prepararse tal como se describe en Sipkins et al., Nature Medicine, 1998, 4(5):(1998), 623-626, o como se describe en Miller, supra.

Los liposomas catiónicos pueden formarse, bien a partir de un anfifílico catiónico único, o bien a partir de una combinación de un anfifílico catiónico y un lípido neutro, por ejemplo, a partir de 3,3-[N,(N’,N’dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol y dioleil-L-a-fosfatidil-etanolamina.

Las características hidrofílicos derivan de la presencia de un fosfato, un fosfonato, un carboxilato, un sulfato, un

sulfonato, un sulfidrilo, un amino, un nitro, un hidroxilo, u otros grupos similares, que se conocen bien en la técnica. La hidrofobicidad puede conferirse mediante le inclusión de grupos que poseen, pero no se limitan a grupos hidrocarbonados alifáticos saturados e insaturados de cadena larga de hasta 20 átomos de carbono, estando sustituidos dichos grupos por uno o más grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo, y/o heterocíclicos. Los lípidos preferidos son fosfoglicéridos y esfingolípidos. Ejemplos representativos de fosfoblicéridos incluyen fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidil-etanolamina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dioleoil-fosfatidilcolina, distearoilfosfatidil colina, y dilinoleoilfosfatidil colina. Compuestos a los que faltan grupos que contengan fósforo, tales como las familias de esfingolípidos y glicoesfingolípidos, se encuentran también en el grupo que se denomina lípidos. Además, los lípidos anfipáticos que se han descrito anteriormente pueden mezclarse con otros lípidos que incluyen triglicéridos y esteroles, tales como colesterol y colesteroles modificados.

El antagonista del receptor de la integrina puede incluir un dominio hidrofóbico o unirse al engarce superficial o, directamente a un dominio hidrofóbico en cualquier posición apropiada, por ejemplo, en el final de una cadena lineal

o en cualquier posición intermedia suya, siempre que la unión no interfiere con la unión del antagonista al receptor de la integrina. El antagonista del receptor de la integrina puede incluir también, o proveerse con un grupo puente divalente opcional para facilitar la unión al engarce superficial, si se desea.

La figura 1 ilustra esquemáticamente un liposoma seleccionador de diana como una partícula de forma esférica que posee sitios de unión ácido nucleicos y sitios seleccionadores de diana de la integrina en la superficie de la partícula.

La figura 2 ilustra un liposoma seleccionador de diana entrecruzado de la presente invención. La figura 3 ilustra otro liposoma seleccionador de diana entrecruzado, en el que el lípido catiónico se encuentra en el liposoma. Pero no entrecruzado. La preparación de la forma de realización de este liposoma seleccionador de diana, se describe detalladamente en la sección de “Materiales y Métodos” que se menciona a continuación en la presente Memoria. Dicho liposoma entrecruzado presenta, en su superficie externa, grupos catiónicos derivados de las mitades de colina, que pueden unir ácidos nucleicos, y sitios de unión del receptor de la integrina derivados de grupos antagonistas de la integrina unidos a un engarce superficial hidrofílico.

Los ácidos nucleicos pueden unirse a la nanopartícula del liposoma entrecruzado poniendo en contacto un ácido nucleico cargado negativamente con el grupo catiónico presente en el liposoma, tal como mezclando el ácido nucleico y el liposoma seleccionador de diana en un medio acuoso farmacéuticamente aceptable, a un pH fisiológico. Los liposomas seleccionadores de diana formando complejo de esta forma, con el ácido nucleico, son tomados prontamente por las células presentadoras de la integrina que contactan con los liposomas seleccionadores de diana tanto in vitro como in vivo.

La proporción de las cargas positivas del liposoma seleccionador de diana a las negativas ácido nucleicos, es superior, preferentemente a 1, más preferentemente, por lo menos, a alrededor de 1,2.

Para la diana selectiva o el antagonismo de las integrinas, tal como las integrinas av 3, los compuestos y composiciones de la presente invención pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva, de forma parenteral, oral, mediante inhalación, o tópicamente, en formas unitarias de dosificación, junto con transportadores farmacéuticamente aceptables, vehículos y adyuvantes. El término “parenteral” tal como se utiliza en la presente Memoria , incluye la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraesternal, intraocular (por ejemplo intravítrea) y la administración intraperitoneal, así como también la administración mediante técnicas de infusión.

Cualquier vía apropiada de administración puede utilizarse. La composición farmacéutica que incluye un ácido nucleico unido a nanopartículas de la presente invención, se administra en una dosis efectiva para el tratamiento que se presente. Las cantidades terapéuticamente efectivas que son necesarias para tratar una situación médica particular, o inhiben su progreso, son determinadas prontamente por los expertos en la técnica utilizando estudios preclínicos y clínicos que se comen en las técnicas médicas.

El término “cantidad terapéuticamente efectiva”, tal como se utiliza en la presente Memoria, se refiere a aquella cantidad del principio activo que provoca la respuesta médica o biológica de un tejido, sistema, animal o humano, que se busca por un clínico o un investigador.

El término “inhibe”, tal como se utiliza en la presente Memoria, se refiere a un enlentecimiento, interrupción o detención de una situación médica, pero no indica necesariamente una eliminación total de la situación. Una supervivencia prolongada de un paciente por sí mismo, indica que la situación médica se controla beneficiosamente.

Los regímenes de dosificación para estos ácidos nucleicos unidos a los liposomas seleccionadores de diana o de las composiciones que los contienen, se basan en varios factores como edad, peso, sexo y tipo de situación médica del paciente, la gravedad de ésta, la vía de administración, y la actividad antagonista de la particular molécula seleccionadora de diana o ligando que se utilice. El régimen de dosificación puede variar dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Los niveles de dosificación del orden de alrededor de 0,01 miligramos a 1.000 miligramos aproximadamente por kilo de peso corporal son útiles para tratar las situaciones médicas anteriormente

mencionadas. Los niveles de dosificación preferidos son del orden de alrededor de entre 0,01 miligramos a 100 miligramos aproximadamente , por kilo de peso corporal.

Para la administración mediante inyección, una composición que contiene el liposoma seleccionador de diana que abarca esta invención, se formula con un transportador farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina,

o una solución acuosa de dextrosa. Para la inyección una dosis típica diaria es de entre 0,01 miligramos aproximadamente y 100 miligramos por kilo de peso corporal, inyectados diariamente como una dosis única o como dosis múltiples, dependiendo de los factores anteriormente mencionados.

Para inhibir la angiogénesis, por ejemplo, a un paciente que necesite la inhibición de la angiogénesis, se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un liposoma seleccionador de diana que abarca esta invención y transportando un ácido nucleico tal como un ácido (ARN) o uno desoxiribonucleico (ADN) que pueden expresar una proteína o péptido que inhiban la angiogénesis. El ácido nucleico administrado penetra entonces en el núcleo celular y expresa una proteína diana en las células endoteliales vasculares.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar más los aspectos diversos de la invención.

Materiales y métodos

Preparación de las nanopartículas

La construcción de los liposomas multivalentes seleccionadores de diana que se unen a las integrinas, empieza con el diseño y síntesis de la molécula 12 seleccionadora de diana de la integrina lipídica polimerizable (figura 17, esquema 1). El grupo amino de la taurina 1 se protegió como su derivado benciloxicarbonilo (CBZ), para proveer 2, seguido por la formación del cloruro de sulfonilo 3 y la unión con el éster metilo del ácido tert-butoxicarbonil diamino propiónico 4, para dar lugar al compuesto 5. La saponificación del 5 proporcionó el compuesto 6 y la eliminación del grupo tert-butoxi carbonilo (BOC) abastecido por el compuesto clave intermediario 7. El acoplamiento del compuesto 7 al derivado 8 del ácido benzoico, dio lugar al compuesto 9, que se hidrógeno para desproteger la amina y reducir simultáneamente el anillo pirimidínico para proveer el conjugado 10 engarce-antagonista del receptor de la integrina. La síntesis del compuesto 8 se ha descrito previamente por Duggan et al. J. Me. Chem., 2000, 43, 3736-3745. El acoplamiento de tres equivalentes de 10 al lípido quelante del ácido tricarboxílico 11, utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino) fosfonio (BOP), proporcionó el lípido 12 trivalente clave del antagonista de la integrina. La preparación de compuesto 11 se ha descrito previamente por Storrs et al. J. Magn. Reson. Imaging, 1995, 5, 719-724. El tratamiento de 11 con metóxido de sodio en metanol proveyó el compuesto 15 (es decir, la sal trisódica de 11). El complejo lipídico europio-quelante 14 se sintetizó calentando el 15 con una solución de tricloruro de europio, tal como se describe por Storrs, et al., supra.

El esquema 2, en la figura 18, esboza la formación de liposomas seleccionadores de diana entrecruzados (NPs) mediante auto-ensamblaje y polimerización de los lípidos apropiados tal como se ha descrito previamente por Storrs, et al., supra. Liposomas seleccionadores de diana entrecruzados de forma ejemplar se sintetizan combinando el antagonista 12 integrina-lípido trivalente, con el fosfolípido zwitteriónico diacetileno 13, y el complejo lipídico europioquelante 14 en una solución clorofórmica. Se añadió el compuesto 14 al 1% en peso a todas las formulaciones, para visualizar las partículas, utilizando la espectroscopia de fluorescencia. A esta solución clorofórmica de lípidos se añadió, bien el lípido quelante aniónico 15, o el lípido catiónico 16 (DOTAP), con objeto de variar la carga superficial. La densidad superficial del antagonista de la integrina en NPs, se controló variando la cantidad del compuesto 12 en el liposoma.

Para formar vesículas, las soluciones lipídicas combinadas se evaporaron a sequedad, secándose al alto vacío para eliminar cualquier disolvente residual, para formar una película seca. La película lipídica seca se hidrató hasta una densidad lipídica conocida (30 mM), utilizando agua desionizada. La suspensión resultante se sometió entonces a ultrasonidos, a temperaturas superiores a las de la transición en la fase de cristal gel-líquida, (Tm ‘64°), siguiendo el procedimiento de Leaver et al. Biochim. Biophys. Acta, 1983, 732, 210-218, utilizando un generador de ultrasonidos con un extremo sonda, mientras se mantenía el pH entre 7,0 y 7,5. Después aproximadamente de 1 hora de aplicar los ultrasonidos, la solución adquirió transparencia. Las vesículas se polimerizaron entonces enfriando la solución a 0°C sobre un techo de hielo húmedo, e irradiando la solución a 254 nm aproximadamente con una lámpara manual de UV durante 2 horas. Los liposomas resultantes (NP1 a NP6) eran de color amarillo-naranja y tenían dos bandas visibles de absorción entradas a 490 nm y 535 nm, y que provenían del polímero conjugado de diacetileno ene-yne. Los diámetros medios de los NPs estaban entre 40 y 50 nm, tal como se determinó mediante dispersión dinámica de luz (DLS). El potencial zeta estaba entre –42 y –53 mV para NP1 a NP4 (es decir, NP1-NP4 estaban cargados negativamente) y de +35 y +43 mV para NP5 y NP6 (es decir, NP5 y NP6 estaban positivamente cargados) respectivamente (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY). Los liposomas fueron estables durante meses sin cambios significativos en las propiedades físicas y biológicas, cuando se formularon para aplicaciones in vivo que utilizaban cloruro sódico 150 mM, histidina 50 mM, y soluciones de dextrosa al 5%.

Las composiciones de liposomas NP1 mediante NP6 se proporcionan en la tabla 1 a continuación, expresadas como porcentaje molar de los componentes 12 (lípido seleccionador de diana), 13 (lípido zwitteriónico), 15 (lípido aniónico

quelante) y 16 (lípido catiónico; DOTAP). Tabla 1. Composiciones liposómicas NP1-NP6

Liposoma

Lípido seleccionador de diana (porcentaje molar) Lípido zwitteriónico (% molar) Lípido aniónico (% molar) Lípido catiónico (% molar)

NP1

10 80 10 0

NP2

1 89 10 0

NP3

0,1 90 10 0

NP4

0 90 10 0

NP5

10 80 0 10

NP6

0 90 0 10

Los liposomas se construyeron mediante vehículos de polimerización, utilizando un porcentaje de 0,1, 1 y 10 moles del complejo lipídico antagonista de la integrina 12 y del compuesto 13, tal como se esboza en la figura 18, con materiales adicionales 14, 15 y 16, que se incorporan al liposoma antes de la polimerización para variar la densidad de la carga superficial y permitir que los liposomas sean visualizados mediante fluorescencia. Por simplicidad, el compuesto 13, que es opcional y que incluye sólo un porcentaje de 1 mol del liposoma no se muestra en la figura 18. Los materiales que contenían un porcentaje de 10 moles del compuesto 12 (NP1 y NP5) mostraron la afinidad más alta para el sitio de unión de la integrina av 3. En un ensayo competitivo de unión de la integrina, utilizando la espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo, fueron necesarias 100 veces del ligando 10 libre (65 !M) para reducir la unión de NP1s y la integrina av 3 en el 50%, a pesar del hecho de que NP1 posee sólo el equivalente de 0,5 !M del antagonista 10 de la integrina en su superficie. En un ensayo in vitro para la inhibición de la adhesión celular utilizando la unión de las células de Melanoma M21 positivas para av 3 a placas revestidas con vitronectina, IC50 para el ligando libre 10, fue de 64 !M. En un apreciable contraste. IC50 para la partícula aniónica NP1 fue de 0,27 !M equivalentes del compuesto 10 en la superficie. Esto representa una avidez aproximadamente de 200 veces superior para la superficie celular cuando 10 se encuentra sobre NPs, comparado con el ligando libre. Para la partícula catiónica NP5, IC50 fue de 0,35 !M equivalentes del compuesto 10, que posee aproximadamente una avidez de 180 veces superior, cuando se compara con el ligando libre, tal como se muestra en la Tabla 2 a continuación. Así, sin considerar la carga superficial, los NPs tenían aproximadamente una avidez aumentada de 180-200 veces para las integrinas, cuando se comparó con el ligando monomérico. Este resultado demuestra que tiene lugar una interacción importante entre a superficie de NP y la superficie celular. Esta interacción es independiente de la carga superficial sobre los NPs y está relacionada directamente a una interacción específica del ligando receptor. Se puede alcanzar un aumento de dos órdenes de magnitud de la avidez, mediante la presentación multivalente de un antagonista de la integrina sobre la superficie de los NPs, comparado con el ligando libre. Cuando la cantidad del compuesto 12 en las formulaciones de NP, disminuyó 10 y 100 veces a porcentajes de 1 mol y 0,1 moles como en NP2 y NP3 respectivamente, la capacidad para bloquear la adhesión celular disminuyó aproximadamente uno o dos órdenes de magnitud, mostrándose respectivamente en la Tabla 2 a continuación.

Material

Tamaño (mm) Potencial zeta (mV) Ensayo de inhibición competitive (μM of 10) Ensayo IC50 adhesión celular (μM de 10 sobre NPs) Efecto de la IC50 de Multivalencia (libre [10]/[10] sobre NPs)

NP1

45,1 ± 0,6 -42 65 0.27 237

NP2

42,8 ± 1,5 -49 24 7 9

NP3

44,4 ± 0,8 -53 1 30.5 2

NP4

46,4 ± 0,7 -49 NA No Inhibición NA

NP5

41,7 ± 2,2 35 60 0.35 183

NP6

36,8 ± 0,9 43 NA No Inhibición NA

El liposoma NP5 representa un liposoma seleccionador de diana entrecruzado de forma ejemplar de la presente invención.

Procedimientos sintéticos generales

Todos los disolventes y reactivos que se utilizaron fueron de calidad reactiva. Las evaporaciones del disolvente se llevaron a cabo bajo presión reducida, proporcionada a partir de una bomba de vacío casera o de una bomba de vacío Welch de manejo directo a :40oC. Los espectros 1H y 13C-NMR se gravaron en un JEOL FX90Q con 90 MHz para el espectro protónico y a alrededor de 23 MHa para el espectro del carbono en CDCl3, CD3OD, D2O o sus mezclas, tal como se describe para cada caso (Nota: aunque soluble en CDCl3, la adición de CD3OD a los lípidos, inhibe la formación de micelas invertidas y, de este modo, se proporcionan espectros, más afilados. Los espectros se referenciaron a CHCl3 (7,25 ppm) residuales para experimentos H1 y a la línea central de CDCl3 (77,00 ppm) para experimentos C13. La espectrometría de masas MALDI-TOF se llevó a cabo en PerSeptive DE instrument (Mass Spectrometry, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA). TLC se realizó en vidrio marcado Merck 60 F254 (0,2 mm; EM Separations, Wakefield RI) y las placas que se revelaron se rociaron de forma rutinaria con sulfato cérico (1%) y molibdato amónico (2,5%) en ácido sulfúrico acuoso al 10%, calentándose hasta alrededor de 150oC. Otros

reveladores incluyen yodo (utilización general), ninhidrina al 0,5% e acetona (para aminas), y luz ultravioleta (para los cromóforos UV).

Sal sódica de la N-benziloxicarbonil-taurina (2). La taurina, 1 (alrededor de 40 g, 320 mmoles), se disolvió en una solución de hidróxido sódico 4N (80 ml) y agua (alrededor de 200 ml). A esta solución se añadió cloruro de benciloxi carbonilo (alrededor de 48 ml, 330 mmoles) gota a gota, agitando vigorosamente durante alrededor de 4 horas. El pH de la solución se mantuvo alcalino añadiendo una solución de bicarbonato sódico al 10%, (alrededor de 300 ml), y una solución de hidróxido sódico 4N (alrededor de 45 ml). La mezcla reactiva obtenida se lavó entonces con éter dietílico (alrededor de 1.000 ml) y la capa acuosa se evaporó rotativamente hasta sequedad, secándose posteriormente bajo condiciones de alto vacío sobre pentóxido fosfórico por la noche para producir alrededor de 12,7 g (14%) de 2. 1H-NMR (D2O):0 7,50 (5H, s, Ar-H), 5,21 (2H, s, Ar-CH2), 3,62 (2H, t, CH2), 3,14 (2H, t, CH2).

Cloruro de 2-benciloxicarbonilamidoetanosulfonilo (3). La sal sódica 2 de N-CBZ-taurina (alrededor de 12,7 g, 32 mmoles), se suspendió en éter dietilo seco (alrededor de 30 ml), bajo una presión positiva de argón, tratándose con pentacloruro de fósforo (alrededor de 7g, 33,6 mmoles), en 5 partes durante alrededor de 15 minutos. La reacción se agitó durante alrededor de 4 horas, a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria. Se añadió agua helada (alrededor de 10 ml), y el residuo obtenido se trituro después de enfriar el matraz y el contenido en un baño de hielo. Se añadió más agua helada (alrededor de 50 ml), solidificándose el producto. Los sólidos se recuperaron mediante filtración, se lavaron con agua helada (alrededor de 20 ml), y se secaron sobre pentóxido de fósforo durante la noche, para producir alrededor de 6,95 g (78%) de 3. 1H-NMR (CDCl3): 0 7,35 (5H, s, Ar-H), 5,12 (2H, s, Ar-CH2), 3,89 (2H, t, CH2) solapándose con 3,85 (2H, t, CH2).

Metil 3-butiloxicarbonilamido-2-(s)-benciloxicarbonil-amidoetilsulfanomido propionato (5). En un baño de hielo se enfrió una mezcla del 3 de cloruro de sulfonilo (alrededor de 21,6 g, 78 mmoles) y metil-3-N-butoxicarbonilamido-2aminopropionato (4, alrededor de 9,96 g, 39,2 mmoles), en tetrahidrofurano anhidro (THF, 150 ml), bajo una presión positiva de argón. A esta solución se añadió N-metil morfolina (alrededor de 16 ml, 145 mmoles), en THF (alrededor de 275 ml) gota a gota durante alrededor de30 minutos, utilizando un embudo de goteo que se había secado previamente, y bajo una presión positiva de argón. Después de 1 hora aproximadamente de agitación en el baño de hielo, se observó, mediante TLC, que, sustancialmente, todo el cloruro de sulfonilo (Rf = 0,65), se había consumido (eluyente: acetato de etilo/hexano 1:1). Sin embargo, todavía se encontraba presente ácido diaminopropiónico (Rf = 0,1, rociado de ninhidrina) que no había reaccionado. Durante un tiempo de alrededor de 3 horas, se añadió cloruro de sulfonilo (alrededor de 5,0 g, 18 mmoles). El producto de reacción obtenido se filtró entonces y se evaporo rotacionalmente para eliminar el disolvente, y se disolvió en acetato de etilo (alrededor de 100 ml), lavándose con ácido clorhídrico diluido enfriado (alrededor de 20 ml), con solución saturada de bicarbonato sódico (alrededor de 20 ml), y entonces con solución saturada de cloruro sódico (alrededor de 20 ml), secándose entonces sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria, y el residuo producido se secó, durante la noche, al vacío. El residuo seco se recristalizó, en primer lugar, disolviendo en acetato de etilo, y entonces, añadiendo un volumen idéntico de hexano, para obtener el éster metílico 5 como un sólido decolorado, de alrededor de 13,4 g (alrededor del 74%). 1H-NMR (CDCl3): 0 7,36 (5H, s, Ar-H), 5,83 (1H, d, NH), 5,55 (1H, t, NH), 5,12 (2H, s, Ar-CH2), 5,06 (1H, t, NH), 4,26 (2H, m, CH), 3,79 (3H, s, CH3), 3,70 (2H, dd, CH2), 3,26 (2H, dd, CH2), 1,43 (9H, s, (CH3)3).

Ácido 3-butiloxicarbonilamido-2-(S)-benciloxicarbonil-amido-etilsulfonamidopropiónico (6). Una solución del éster metílico 5 (alrededor de 13,3 g, 28,9 mmoles) en tetrahidrofurano (alrededor de 160 ml), se enfrió en un baño de hielo. A esta solución se añadió una solución de hidróxido de litio (alrededor de 5,42 g, 128 mmoles), en agua helada (160 ml). La mezcla reactiva producida se calentó lentamente a temperatura ambiente, eliminando el baño de hielo, agitándose entonces la mezcla a temperatura ambiente durante alrededor de 1 hora. El disolvente orgánico se eliminó entonces mediante disolvente orgánico se eliminó entonces mediante evaporación rotatoria. La porción acuosa residual se lavó con éter dietílico (alrededor de 20 ml), acidificándose entonces hasta alrededor de un pH 4, utilizando ácido clorhídrico diluido. Esta solución se enfrió en un baño de hielo, y se mezcló entonces con acetato de etilo (alrededor de 100 ml), acidificándose entonces ulteriormente hasta un pH 1 aproximadamente, utilizando ácido clorhídrico diluido enfriado en hielo y que se extrajo inmediatamente con acetato de etilo (alrededor de 2 x 200 ml). La capa de acetato de etilo se lavó con salmuera (alrededor de 50 ml) y se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se eliminó entonces mediante evaporación rotatoria, y el residuo obtenido se secó bajo alto vacío durante la noche para obtener alrededor de 13,3 g de un sólido espumoso, que se recristalizó a partir de acetato de etilo/hexano (1:1), para obtener alrededor de 11,6 g (89,7) del compuesto 6. 1H-NMR (CDCl3): 0 7,33 (5H, s, Ar-H), 6,12 (1H, d, NH), 5,68 (1H, t, NH), 5,26 (1H, t, NH), 5,1 (2H, s, Ar-CH2), 4,24 (2H, m, CH2), 3,67 (2H, t, CH2), 3,27 (2H, t, CH2), 1,45 (9H, s, C(CH3)3).

Ácido 3-amino-2-(S)-benciloxicarbonilamido-etilsulfo-namido-propiónico (7). El compuesto 6 N-BOC--aminoácido (alrededor de 11,5 g, 25,8 mmoles), se trató con ácido trifluoroacético (alrededor de 68 ml) en cloruro de metileno (alrededor de 350 ml) durante 1,5 h. aproximadamente, evaporándose entonces rotatoriamente hasta sequedad. El residuo obtenido se disolvió en agua (alrededor de 200 ml), y se liofilizó para obtener alrededor de 10,9 g (98,8%) del compuesto 7 como un sólido. 1H-NMR (CDCl3): 0 7,30 (5H, s, Ar-H), 6,07 (1H, d, NH), 5,61 (1H, t, NH), 5,20 (1H, t, NH), 5,17 (2H, s, Ar-CH2), 4,11 (2H, m, CH2), 3,53 (2H, t, CH2), 3,32 (2H, t, CH2), DCI-MS para C13H19N3O6S: m/z (ion) 346 (M+H) (calculado para C13H19N3O6S + H, m/z 346).

4-[2-(pirimidina-2-ilamino)etiloxi]benzoil-2-(S)-benciloxicarbonilamidoetiloxisulfonamido-B-alanina (9). El derivado 8 del ácido benzoico (alrededor de 6,4 g, 24,7 mmoles) y la N-hidroxisuccinimida (alrededor de 3,6 g, 31 mmoles), se disolvieron en dimetilsulfóxido anhidro (alrededor de 110 ml), bajo una presión positiva de argón, y se enfrió en un baño de hielo. A esta solución se añadió cloruro de 1-(3-dimetilamino)propil)-3-etilcarbodiimida (alrededor de 4,9 g, 25,6 mmoles). La solución se agitó a baja temperatura durante 1 hora y se dejó entonces que se calentara a la ambiental. Se continuó la agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente otras 24 horas. A la mezcla producida se añadió una solución del compuesto 7 -aminoácido (alrededor de 12,2 g, 25,8 mmoles), seguido por Nmetilmorfolina. La mezcla reactiva producida se agitó bajo argón durante 3 días aproximadamente. La mezcla resultante se vertió entonces en agua (alrededor de 1 l), se acidificó con ácido clorhídrico diluido hasta pH 1,5 aproximadamente, y se extrajo con acetato de etilo (alrededor de 5 x 500 ml). La fase orgánica combinada se lavó con una solución saturada de cloruro sódico (alrededor de 50 ml), y se secó entonces sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria. El residuo obtenido se trituró en acetato de etilo, se filtró y se secó entonces bajo alto vacío, para obtener alrededor de 10,5 g (72,5%) del compuesto 9. 1H-NMR (DMSO-d6): 0 8,30 (2H, d, Ar-H), 7,99 (2H, d, Ar-H), 7,34 (5H, s, Ar-H), 7,00 (2H, d, Ar-H), 6,60 (1H, dd, Ar-H), 5,01 (2H, s, CH2), 4,15 (1H, t, CH), 3,67 (2H, t, CH2), 3,56 (2H, t, CH2), 3,17 (2H, t, CH2).

4-[2-(3,4,5,6-tetrahidropirimidin-2-ilamino)etiloxi] benzoil-2-(S)-aminoetilsulfonamido--alanina (10). Una solución del compuesto 9 derivado de la pirimidina (alrededor de 3,7 g, 6,4 mmoles) se disolvió en ácido acético (alrededor de 190 ml) y ácido clorhídrico concentrado (alrededor de 17 ml). La solución obtenida se mezcló con paladio al 10% sobre carbono (alrededor de 1,62 g) y se hidrógeno con 45 psi aproximadamente de gas hidrógeno durante 5 h aproximadamente. La mezcla obtenida se filtró entonces mediante celita y se lavó con agua. El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria, y el residuo obtenido se secó bajo alto vacío. El residuo seco se disolvió en agua (alrededor de 100 ml), se ajustó el pH a 7 aproximadamente con una solución 1N de hidróxido sódico, evaporándose entonces de forma rotatoria hasta sequedad. El residuo obtenido se disolvió en metanol (alrededor de 20 ml) y se filtró. El filtrado se evaporó de forma rotatoria, se disolvió en agua (alrededor de 275 ml), y se liofilizó. El producto liofilizado obtenido se volvió a cristalizar a partir del agua, para obtener alrededor de 2,96 g (alrededor del 78,9%) del producto 10. 1H-NMR (D2O): 0 7,80 (2H, d, Ar-H), 7,14 (2H, d, Ar-H), 4,49 (1H, s, CHaCHb), 4,28 (2H, t, CH2), 3,94 (1H, dd, CHaCHb), 3,61 (6H, m, CH2), 3,32 (4H, t, CH2), 1,90 (2H, t, CH2). ES-MS para C18H28N6O6S: m/z (ion) 457 (M+H) (calculado para C18H28N6O6S + H, m/z 457).

[(PDA-PEG3)2-DTPA-(CONHPM)3](12) (PDA-PEG)2DTPA-COOH)3 (alrededor de 11,69 mg, 50 !moles), se disolvió en CH3CN anhidro (alrededor de 5 ml), y CH2Cl2 anhidro (alrededor de 2 ml) y Et3N (alrededor de 1 ml) en un matraz RB de 3 cuellos, previamente secado a la llama (flameado) y llevado con argón. A la solución resultante se añadió el reactivo BOP (alrededor de 134 mg, 150 !mol), y la mezcla producida se agitó bien durante 5 minutos para obtener una solución lipídica. Una solución del elemento 10 (alrededor de 69 mg, 50 !moles), se preparó en un vial seco relleno con argón, en una mezcla de CH3CN anhidro (alrededor de 5 ml) y dimetilformamida anhidra (DMF) (alrededor de 2 ml). La solución de 10 se añadió a la solución lipídica utilizando una jeringuilla seca, agitando continuamente. La mezcla reactiva así producida se agitó durante 10 horas en la oscuridad. TLC (disolvente: CHCl3, CH3OH, H2O y CH3COOH), mostró una desaparición completa del material inicial (Rf = 0,53). Hubo un producto principal (Rf = 0,2) y 5 productos menores (Rf = <0,18). El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria, y el residuo obtenido se secó bajo alto vacío durante 24 horas aproximadamente para obtener un producto en bruto. Éste se purificó mediante HPLC de fase normal utilizando una columna semi preparativa de sílice, una velocidad del flujo de 5 ml/min aproximadamente (sistema de gradiente empezando con CHCl3 al 100% durante alrededor de 5 minutos, entonces 75% CHCl3/25% CH3OH durante 10 minutos, entonces 50% CHCl3/50% CH3OH durante 10 minutos entonces 25% (CHCl3/75% CH3OH durante alrededor de 10 minutos, y, finalmente, durante 20 minutos aproximadamente con 100% CH3OH. Las fracciones (tiempo de retención = 35 a 37 minutos) que contenían el producto más importante se combinaron y se evaporaron rotatoriamente para eliminar el disolvente, secándose el residuo obtenido bajo alto vacío durante 24 horas, para obtener alrededor de 35,5 mg (26,5%) del producto deseado. Alta resolución MALDI-FTMS: m/z 2681.4711 (calculado para C130H209N25O29S3 + H, m/z 2681.4882).

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensayo de adhesión celular

El estudio de la inhibición de la adhesión celular se llevó a cabo sobre placas revestidas con vitronectina, utilizando la progenie celular M21 del melanoma humano. Los liposomas multivalentes NP1-NP6, así como el ligando monomérico 10, se incubaron separadamente con células M21 y se aplicaron sobre las placas de 48 pocillos revestidos con vitronectina. Después de, aproximadamente, 1 hora de incubación, los pocillos se lavaron, y las células que se habían adherido se tiñeron con una solución de cristal violeta, midiéndose la densidad óptica (OD) a alrededor de 590 nm. La OD medida era proporcional al número de células unidas a la placa de vitronectina y se graficó con respecto a la concentración del componente 10 sobre la superficie de os NPs en distintas formulaciones, para calcular el IC50.

La figura 8 muestra esquemáticamente el ensayo de la adhesión celular en el que las células M21 del melanoma humano, que expresan av 3, se mezclaron con liposomas conjugados covalentemente a un antagonista (ligando) de

la integrina, o al ligando sólo. Las células se dispusieron entonces sobre placas de vitronectina, se lavaron y se tiñeron. El número de células unidas se contó entonces utilizando un contador de placas.

La figura 9 es una presentación gráfica de los datos obtenidos utilizando el ensayo de adhesión que se muestra en la figura 8 y que muestra que los liposomas unidos al antagonista de la integrina, inhiben intensamente la adhesión celular (IC50 = 1 !M), mientras que el antagonista solo (ligando) fue mucho menos efectivo en la inhibición de la adhesión celular (IC50 = 0,5 mM).

Ejemplo 2: Ensayo de transfección in vitro

Alrededor de treinta nanomoles de liposomas catiónicos NP5 y NP6, con o sin el ligando seleccionador de diana-av3 covalentemente unido, respectivamente, se acomplejaron con alrededor de 2 !g de ADN plasmídico que codificaba la proteína verde fluorescente (GFP) en dextrosa al 5%, y se expusieron in vitro entonces a las células de melanoma durante alrededor de 1 hora. La eficiencia de la transfección se ensayó contando el número de células fluorescentes comparado con el número de células totales después de 24 horas. Las células que se utilizaron fueron células M21 y M21L de melanoma humano. Las células M21 expresan la integrina av 3, mientras que las células M21L no expresan la integrina av 3 (av-nula).

Tal como se muestra en la figura 10, las células que expresan av (M21) que se trataron con el liposoma seleccionador de diana (NP5) formando complejo con el gen GFP, mostraron un grado de transfección 5 veces o más superior (>150.000 células/millón) que las células que expresaban av que se trataron con liposomas no diana (NP6) (no antagonistas, alrededor de 25.000 células/millón) o ADN solo (sin liposoma, alrededor de 12células/millón). Contrariamente a esto, las células av-nulas (M21L) no mostraron una incorporación preferente del gen GFP, previendo niveles relativamente bajos de transfección (25.000 células(millón, o menos), sin considerar el tratamiento recibido. De este modo, los transportadores génicos diana muestran transfectar las células de una forma dependiente de av 3.

Ejemplo 3: El suministro génico mediado por liposomas seleccionadores de diana se aplica al tumor in vivo

Alrededor de 450 nanomoles cada uno, de NP5 y NP6, formaron complejo electrostáticamente con 30 !gs aproximadamente cada uno, de ADN plasmídico que codifica la luciferasa de luciérnaga en alrededor, cada uno, de 200 !ls de dextrosa al 5%, inyectándose por vía intravenosa entonces en los animales cada solución de ADN acomplejada con los liposomas en animales que portaban alrededor de 150 mm3 de melanomas subcutáneos los que faltaba la expresión de av 3 (M21L). Después de 24 horas aproximadamente, los animales se sacrificaron, los órganos que se describen y los tumores se extrajeron y se ensayaron en cuanto a la actividad luciferásica. Ésta se ensayó utilizando el equipo de ensayo de luciferasa Bright-Glo (Promega Corp., Madison, WI), según las instrucciones del fabricante, con la excepción de que los órganos completos se sembraron utilizando un triturador tisular en una cantidad de reactivo lítico Bright-Glo normalizado para el peso del órgano.

Tal como se muestra en la figura 11, el liposoma seleccionador de diana (NP5), formando complejo con el gen de la luciferasa, mostró una expresión altamente selectiva en el tejido tumoral respecto a los tejidos pulmonares, hepáticos y cardiacos, con un nivel de expresión de alrededor de 4 picogramos de tejido luciferásico/mg, comparado con los niveles tisulares de sub-picogramos/mg en los otros tejidos evaluados. Los liposomas no dirigidos (NP6), formando complejo con la luciferasa, no fueron efectivos en la transfección de ninguno de los tejidos. La adición de aproximadamente, un exceso de 20 veces el ligando soluble del antagonista de la integrina, inhibió de modo efectivo la transfección de las células por el ligando seleccionador de diana.

Ejemplo 4: Suministro mediado por liposomas seleccionadores de diana de genes mutantes Raf a la vasculatura tumoral disminuye los melanomas establecidos.

Los melanomas a los que les faltaba la expresión de av 3 (M21L) se inyectaron subcutáneamente en el flanco, y se les dejó crecer hasta alrededor de 70 mm3, en cuyo momento a los ratones se les inyectó por vía intravenosa con, bien 200 !L de dextrosa al 5%, (control), el liposoma NP5 seleccionador de diana, formando complejos con alrededor de 30 !g del ADN plasmídico que codificaba una forma mutante negativa dominante de la Raf quinasa (Raf-ATP!) en 200 !ls de dextrosa al 5% o (formando complejos) con un vector lanzadera que no codificaba ningún ADN, en 200 !l de dextrosa al 5%. Alrededor de quince días después, los tumores se inyectaron otra vez con los mismos tratamientos. Se midió el tamaño tumoral en los tiempos que se indican en la figura 12, utilizando la fórmula: volumen tumoral = (diámetro mínimo)2 * diámetro máximo/2.

Tal como se muestra en la figura 12, el tratamiento de los ratones que portan tumotes de melanoma de un volumen inicial aproximado de 70 mm3 con el liposoma seleccionador de diana NP5 formando complejo con la forma mutante negativa dominante de la quinasa Raf (Raf-ATP!), condujo a un aumento inicial en el volumen del tumor hasta 550 mm3 aproximadamente, seguido por una regresión tumoral después de los 30 días, que llevó a un “platean” estabilizado de alrededor de un volumen de 200 mm3 por día 35 (marcado “partícula/Raf(-)” en la Fig. 12). Este tamaño tumoral estacionario se conservó durante otros 30 días, en cuyo momento el experimento se acabó. En los ratones tratados con el liposoma seleccionador de diana NP5 solo (sin gen) (marcado “Partícula/lanzadera”), o el

gen mutante Raf solo (sin liposoma), los tumores continuaron creciendo por encima del período de tiempo completo de 35 días, sin indicación de ninguna regresión. En la medida en que a los tumores les faltaba la expresión av 3, pero las células endoteliales neovasculares expresaban av 3, la reducción en el crecimiento tumoral se debió muy probablemente a la inhibición de la angiogénesis en la vasculatura tumoral.

Ejemplo 5: Suministro mediado por liposomas seleccionadores de diana de genes mutantes Raf a la vasculatura tumoral, hace involucionara los melanomas establecidos

Los tumores se trataron como en el Ejemplo 4, excepto porque a los tumores se les dejó desarrollarse hasta alrededor de 300 mm3 antes del tratamiento inicial, en cuyo momento se inyectaron con, bien (a) alrededor de 450 nanomoles del liposoma NP5 seleccionador de diana, acomplejado electrostáticamente con hasta alrededor de 30 !g de ADN plasmídico que codificaba Raf-ATP! en alrededor de 200 !l de dextrosa al 5%, (b) alrededor de 450 nanomoles del liposoma no diana NP6, acomplejado electrostáticamente a alrededor de 30 !gs del ADN plasmídico que codificaba Raf-ATP! en 200 !l de dextrosa al 5%, o (c) alrededor de 450 nanomoles del liposoma seleccionador de diana NP acomplejado electrostáticamente a alrededor de 30 !g del ADN plasmídico que codifica Raf-ATP! mezclado con un exceso de alrededor de 20 moles de un ligando competitivo para la integrina av 3, en alrededor de 200 !l de dextrosa al 5%. Las mediciones tumorales se tomaron en los tiempos indicados en la figura 13, donde (a) está marcado “Raf(-)”, (b) está marcado “no diana”, (c) está marcado “exceso”. También se incluyó un control sin tratamiento.

Tal como se muestra en la figura 13, el tratamiento de ratones, que portan tumores melanoma con un volumen inicial de 300 mm3, con el liposoma NP5 seleccionador de diana acomplejado con la forma mutante negativa dominante de la Raf quinasa (Raf-ATP!), después de un período inicial de crecimiento, condujo también a una regresión del volumen tumoral, comparado con grupos de control sin tratamiento.

Ejemplo 6: Suministro mediado por liposomas seleccionadores de diana es selectivo para los vasos angiogénicos

Alrededor de 300 nanomoles de NP5 se acomplejaron con alrededor de 20 !g de ADN plasmídico que codificaba la proteína verde fluorescente (GFP) en alrededor de 50 !l de dextrosa al 5%, inyectándose entonces por vía intravenosa en embriones de pollo, cuya membrana corioalantoidea (CAM) se había expuesto previamente a un disco de filtro saturado con 1 mg/ml de bFGF durante alrededor de 24 horas, para estimular la angiogénesis. Un día después de la inyección del complejo, se recuperó el tejido CAM, se lavó con PBS, se fijó en paraformaldehído al 4% y que examinó para detectar fluorescencia. Los resultados se presentan en la figura 14.

GFP se localizó fuertemente en la vasculatura de los CAMs, como puede apreciarse a partir de las fotomicrografías en la figura 14.

Ejemplo 7: Suministro mediado por liposomas seleccionadores de diana de genes Raf mutantes a la vasculatura tumoral, induce la apoptosis de ésta y la muerte subsiguiente de las células tumorales.

Los melanomas a los que les faltaba la expresión de av 3, se inyectaron subcutáneamente en los flancos de los ratones. A los tumores resultantes se les dejó crecer hasta alrededor de 200 mm3, en cuyo momento se inyectaron a los animales, por vía intravenosa, con alrededor de 450 nanomoles de NP5, que se acomplejó con, bien alrededor de 30 !g del ADN plasmídico que codificaba Raf-ATP!, o con un vector lanzadera, en alrededor de 200 !l de dextrosa al 5%. Los tumores se extirparon después de 72 horas aproximadamente, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se cortaron y se tiñeron para detectar el factor de Willebrand (un marcador de vasos) y para detectar la apoptosis, utilizan do el procedimiento TUNEL para detectar el ADN fragmentado (Intergen Corp, Purchase, NY).

Las fotomicrografías que se muestran en la figura 15 indican que los tumores expuestos a la nanopartícula/vector lanzadera (control), mostraban una densidad relativamente alta de vasos con pocas células que experimentaban la apoptosis. Contrariamente a esto, la mayoría de vasos en los tumores expuestos a NP5/Raf-ATP! experimentaban apoptosis, y extensas regiones tumorales morían a distancias fijas de los vasos apoptósicos, debido presumiblemente a una perfusión insuficiente.

Ejemplo 8: Suministro mediado por liposomas seleccionadores de diana es selectivo para los vasos angiogénicos

En los ratones, ramas colaterales nacen de los capilares retinianos del plexo superficial, penetrando en la retina y formando un profundo plexo vascular, entre los días 8 (P8) y 10 (P10) después del nacimiento. En este estudio, a los ratones se les inyectó en P10, intravitrealmente, con liposomas NP5 seleccionadores de diana formando complejos, con alrededor de 0,15 !g de ADN plasmídico, que codificaba proteína verde fluorescente en alrededor de 1 !l de dextrosa al 5%. Después aproximadamente de 24 horas después de la inyección de NP5 acomplejado con el gen GFP, se sacrificaron los animales y las retinas se inmunotiñeron con anticuerpos anti-colágeno IV unidos a la rodamina (un marcador vascular), y se evaluó la microscopia 2-fotónica de escaneo láser para detectar el nivel relativo de GFP en los vasos sanguíneos retinales.

Las fotomicrografías en la figura 16, muestran que GFP estaba intensamente localizado en la vasculatura retinaria.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES

   1. Liposoma que selecciona como diana el receptor de la integrina av 3, que comprende: un anfifílico catiónico; un lípido neutro; un lípido seleccionador de diana que tiene un antagonista no peptídico de la integrina av 3 y un dominio

   hidrofóbico unido al antagonista, y un ácido nucleico que forma complejo con el anfifílico catiónico; estando el anfifílico catiónico presente en una cantidad en el intervalo comprendido entre 1 y 50% en moles,

   estando dicho lípido seleccionador de diana presente en una cantidad en el intervalo comprendido entre 1 y 20% en moles, estando los valores porcentuales de los moles basados en los moles totales de los lípidos en el liposoma, estando el antagonista no peptídico de la integrina av 3 representado por la fórmula

2. 2.

   Liposoma según la reivindicación 1, en el que el grupo amino libre del antagonista está unido covalentemente de forma directa o mediante un grupo ligante superficial al dominio hidrofóbico.

3. 3.

   Liposoma según la reivindicación 1 o 2, en el que el anfifílico catiónico es un lípido catiónico.

4. 4.

   Liposoma según la reivindicación 3, en el que por lo menos una parte de los lípidos presentes en el liposoma tiene grupos funcionales que están entrecruzados entre sí.

5. 5.

   Liposoma según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ADN.

6. 6.

   Liposoma según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es un gen.

7. 7.

   Liposoma según la reivindicación 1 en el que el ácido nucleico es una secuencia oligonucleótida antisentido.

8. 8.

   Liposoma según la reivindicación 1, en el que el ácido núcleo es ARN.

9. 9.

   Liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma tiene un tamaño de partícula de no más de aproximadamente 250 nanómetros.

10. 10.

    Liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo comprendido entre aproximadamente 40 nanómetros y aproximadamente 100 nanómetros.

11. 11.

    Liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo comprendido entre aproximadamente 75 y aproximadamente 100 nanómetros.

12. 12.

    Liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo comprendido entre aproximadamente 40 nanómetros y aproximadamente 65 nanómetros.

13. 13.

    Liposoma según la reivindicación 3, libre de lípidos entrecruzados, y que tiene un tamaño de partícula en el intervalo comprendido entre aproximadamente 75 y aproximadamente 100 nanómetros.

14. 14.

    Liposoma según la reivindicación 3, en el que el liposoma incluye unos lípidos entrecruzados y tiene un tamaño de partícula en el intervalo comprendido entre aproximadamente 40 y aproximadamente 65 nanómetros.

15. 15.

    Liposoma según la reivindicación 1 o 2, en el que el lípido seleccionador de diana y el lípido neutro están por lo menos parcialmente entrecruzados entre sí, y el anfifílico catiónico está sustancialmente libre de entrecruzamiento.

16. 16.

    Liposoma según la reivindicación 3, en el que el anfifílico catiónico es el cloruro de 1,2-dioleoiloxi-3-(N,N,Ntrimetilamonio)propano.

17. 17.

    Liposoma según la reivindicación 16, que comprende además un polietilenglicol que presenta entre aproximadamente 250 y aproximadamente 500 unidades de repetición de oxietileno.

18. 18. Liposoma según la reivindicación 17, en el que el polietilenglicol comprende 350 unidades de repetición de 5 oxietileno.
19. 19. Liposoma según la reivindicación 3, que comprende cloruro de 1,2-dioleoiloxi-3-(N,N,N-trimetilamonio)propano, colesterol y polietilenglicol, en una proporción de aproximadamente 1:1:0,12, respectivamente.

    10 20. Liposoma según la reivindicación 3, en el que el ácido nucleico puede expresar una proteína o péptido en una célula, en la que el liposoma ha sido introducido.
20. 21. Liposoma según la reivindicación 20, en el que el ácido nucleico puede expresar una proteína o péptido que

    inhibe la angiogénesis. 15

21. 22.

    Liposoma según la reivindicación 21, en el que la proteína que inhibe la angiogénesis es una proteína Raf.

22. 23.

    Liposoma según la reivindicación 1 o 2 para su utilización en un procedimiento destinado a introducir un ácido

    nucleico en una célula presentadora de la integrina av 3, que comprende poner en contacto dicha célula con el 20 liposoma.
23. 24. Utilización de un liposoma que selecciona como diana el receptor de la integrina av 3 según la reivindicación 1 o 2, que puede expresar una proteína o péptido que inhibe la angiogénesis para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la angiogénesis.
24. 25. Utilización según la reivindicación 24, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración del liposoma por vía intraocular para el tratamiento de una patología ocular angiogénica.
25. 26. Utilización según la reivindicación 24, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración 30 intravenosa del liposoma.
26. 27. Utilización según la reivindicación 24, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración del liposoma por inyección en un tumor.

    35 28. Utilización de un liposoma que selecciona como diana el receptor de la integrina av 3 según la reivindicación 1 o 2, que puede expresar una proteína o péptido que inhibe la angiogénesis para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir el crecimiento tumoral.
27. 29. Utilización según la reivindicación 28, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración 40 del liposoma por vía intravenosa.
28. 30. Utilización según la reivindicación 28, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración del liposoma por inyección en un tumor.

    45 31. Liposoma según la reivindicación 1 o 2, para su utilización en un procedimiento destinado a inducir la apoptosis en las células endoteliales vasculares, que comprende poner en contacto las células vasculares endoteliales del liposoma que induzca la apoptosis, que puede expresar una proteína o péptido que induzca la apoptosis.
29. 32. Liposoma según la reivindicación 31, en el que la proteína inductora de la apoptosis, es una proteína Raf. 50