ES2644778T3 - Administración dirigida de lípidos-aminoácidos - Google Patents

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ES2644778T3
ES2644778T3 ES13710293.5T ES13710293T ES2644778T3 ES 2644778 T3 ES2644778 T3 ES 2644778T3 ES 13710293 T ES13710293 T ES 13710293T ES 2644778 T3 ES2644778 T3 ES 2644778T3
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Michael Wilhelm PLATSCHER
Raymond BEHRENDT
Viola Groehn
Simone Rachel HOERTNER
Marco Silvio PASSAFARO
Finn BAUER
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eicosenilo, heneicosenilo, docosenilo (erucilo), tricosenilo, tetracosenilo, pentacosenilo y sus isómeros de cadena ramificada, así como alquenilos poliinsaturados como octadecs-9,12-dienilo (linoleilo, elaidolinoleilo), octadecs9,12,15-trienilo (linolenilo, elaidolinolenilo, 9(Z),11(E),13(E)-octadecatrienilo (eleostearilo) y eicos-5,8,ll,14-tetraenilo.
Entre los ejemplos de grupos alquinilo se incluyen, pero sin limitaciones, hexadeca-7-inilo y octadeca-9-inilo.
El término «ramificado» en combinación con hidrocarburo se refiere a una cadena de hidrocarburo con una serie lineal de átomos de carbono como cadena principal con al menos un sustituyente de uno o más átomos de carbono como cadena subordinada (o grupos ramificados). Entre los ejemplos de cadenas subordinadas se incluyen uno o más grupos alquilo(C1-6), como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, grupo sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo y similares, uno o más grupos alquenilo(C1-6), como vinilo, alilo, propenilo, isopropenilo, 2-butenilo y similares, o uno o más grupos alquinilo(C1-6) como etinilo, propinilo, butinilo y similares. Las cadenas subordinadas preferidas son grupos alquilo(C1-6), los más preferidos son metilo y etilo.
Los compuestos de la invención comprenden preferiblemente al menos dos cadenas de hidrocarburo, preferiblemente 2, 3, 4, 5 o 6 cadenas de hidocarburo, más preferiblemente 2 o 3 cadenas de hidrocarburo, donde la cadena principal de las cadenas de hidrocarburo es la misma o diferente, preferiblemente la misma, y se selecciona a partir de una cadena alquilo, una cadena alquenilo y una cadena alquinilo, preferiblemente una cadena alquilo y alquenilo. En una realización preferida, los compuestos de la invención llevan dos cadenas alquilo, que pueden ser la mismo o diferente, preferiblemente la misma.
En una realización específica de un compuesto de la invención las cadenas de hidrocarburo Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re se seleccionan preferiblemente a partir de miristilo, palmitoilo, estearilo, oleilo, linoleilo y fitanoilo.
Los términos «alquilo», «alcoxi», «alquenilo», «alquinilo» según se usa en este documento tienen los siguientes significados:
El término «alquilo» se refiere a una cadena alquilo lineal o ramificada, que contiene de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 8 átomos de carbono. Entre los ejemplos de grupos alquilo se incluyen, pero sin limitaciones, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo y t-butilo. El término «alcoxi» se refiere a un radical O-alquilo. Entre los ejemplos de grupos alcoxi se incluyen, aunque sin limitaciones, metoxi, etoxi y butoxi. El término «alquenilo» se refiere a un grupo alquilo insaturado lineal o ramificado que comprende uno o más enlaces dobles carbonocarbono. Los grupos alquilo, alquenilo y alcoxi anteriores pueden estar opcionalmente sustituidos con grupos adicionales. Entre los ejemplos de sustituyentes se incluyen, pero sin limitaciones, halo, hidroxilo, amino, ciano, nitro, mercapto, alcoxicarbonilo, amido, carboxi, alquilsulfonilo, alquilcarbonilo, carbamido, carbamilo, carboxilo, tioureido, tiocianato, sulfonamido, arilo, heteroarilo, ciclilo y heterociclilo.
El término «arilo» se refiere a un radical carbocíclico aromático que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, preferiblemente de 5 a 7 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes de grupo arilo, que pueden ser el mismo o diferentes, donde el «sustituyente de grupo arilo» incluye alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, carboxi, aroilo, halo, nitro, trihalometilo, ciano, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralcoxicarbonilo, aciloxilo, acilamino, aroilamino, carbamoilo, alquilcarbamoil, dialquilcarbamoil, ariltio, alquiltio, alquileno y -NRR', donde R y R' pueden ser cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, arilo y aralquilo. Entre los ejemplos de grupos arilo se incluyen fenilo, naftilo, pirenilo, antrilo y fenantrilo sustituidos o no sustituidos.
El término «heteroarilo» se refiere a un resto arilo como se define anteriormente que tiene al menos un heteroátomo
(p. ej., N, O o S). Entre los ejemplos de resto heteroarilo se incluyen furilo, furileno, fluorenilo, pirrolilo, tienilo, oxazolilo, imidazolilo, tiazolilo, piridilo, pirimidinilo, quinazolinilo, quinolilo, isoquinolilo e indolilo.
El término «(hetero)ariloxi» se refiere a un grupo (hetero)-O-arilo donde el grupo (hetero)arilo es como se describe previamente. Entre los ejemplos de grupos ariloxi se incluyen fenoxi y naftoxi. El término «(hetero)aralquilo» se refiere a un grupo (hetero)aril-alquilo donde (hetero)arilo y alquilo son como se describe anteriormente. Entre los ejemplos de grupos aralquilo se incluyen bencilo, feniletilo y naftilmetilo. El término «(hetero)aralquiloxi» se refiere a un grupo (hetero)-O-aralquilo donde el grupo (hetero)aralquilo es como se describe anteriormente. Un ejemplo de grupo aralquiloxi es benciloxi.
El término «cicloalquilo» se refiere a un resto de hidrocarburo cíclico, no aromático saturado o insaturado con 6 a 10 átomos de carbono, como ciclohexilo o ciclohexen-3-ilo. El término «heterocicloalquilo» se refiere a un cicloalquilo como se define en este documento que tiene al menos un heteroátomo en el anillo (p. ej., N, O o S) como 4tetrahidropiranilo o 4-piranilo.
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Arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo como se menciona en este documento incluyen restos tanto sustituidos como no sustituidos, siempre que no se especifique otra cosa. Entre los posibles sustituyentes de cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo se incluyen alquilo(C1-C10), alquenilo(C2-C10), alquinilo(C2-C10), cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo(C5-C8), alcoxi(C1-C10), arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, amino, alquilamino(C1-C10), dialquilamino(C1-C20), arilamino, diarilamino, hidroxilo, halógeno, tio, alquiltio(C1-C10), ariltio, alquilsulfonilo(C1-C10), arilsulfonilo, acilamino, aminoacilo, amidino, guanidina, ureido, ciano, nitro, acilo, aciloxi, carboxilo y éster carboxílico. Cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo pueden también estar fusionados entre sí.
El grupo Y es O, N, S o un enlace covalente, preferiblemente O o N, más preferiblemente N. Se entiende que si el grupo Y es un enlace covalente, –S1-X1 está unido directamente al grupo CO.
El término «espaciador» o «grupo espaciador» (o grupos S1, S2, S3) según se usa en este documento se refiere a un grupo químico bivalente ramificado o no ramificado que permite unir un lípido-éter de la invención a uno o más ligandos bioactivos X1, X2, X3 con una distancia suficiente para eliminar cualquier interacción no deseada entre el lípido-éter y el ligando y/o reducir cualquier impedimento estérico (causado por el propio lípido-éter o cualquier otra molécula vecina) que pueda afectar a la actividad biológica del ligando (como unión por afinidad de los ligandos a sus dianas). Dependiendo del uso previsto de un conjugado de lípido-éter y ligando bioactivo, los grupos espaciadores pueden ser de longitudes diferentes, pueden ser estables (hidrolítica, enzimática y químicamente) o pueden incluir un enlace escindible. Los enlaces escindibles de la invención pueden seleccionarse para su escisión a través de cualquier forma de reacción química escindibles; por ejemplo, química, enzimática, hidrolítica y similares. Entre los ejemplos de enlazadores escindibles se incluyen, pero sin limitaciones, enlazadores peptídicos escindibles por proteasas, enlazadores de ácidos nucleicos sensibles a nucleasas, enlazadores lipídicos sensibles a lipasas, enlazadores de hidratos de carbono sensibles a glucosidasas, enlazadores sensibles al pH, enlazadores sensibles a hipoxia, enlazadores fotoescindibles, enlazadores termolábiles, enlazadores escindibles por enzimas, enlazadores sensibles a ultrasonidos, enlazadores escindibles por rayos X, etc.
Se entiende que los espaciadores pueden o no tener un grupo terminal activado que permita el enlace del compuesto modificado por el espaciador de la invención a un resto adicional, como el grupo bioactivo.
En realizaciones específicas, un «grupo espaciador» (o grupos S1, S2, S3) representa un grupo espaciador corto o un grupo espaciador de cadena larga a partir de una cadena alquileno que opcionalmente comprende uno o más de los grupos seleccionados a partir de funciones cetona, éster, éter, amino, amida, amidina, imida, carbamato o tiocarbamato, glicerol, urea, tiourea, dobles enlaces o anillos aromáticos.
Más específicamente, puede elegirse un grupo espaciador corto (o grupos S1, S2, S3) entre alquilo(C1-C12), alquenilo(C2-C12), arilo, aralquilo, heteroarilo.
Puede elegirse un grupo espaciador de cadena larga (o grupos S1, S2, S3) a partir de radicales poliméricos de fórmula -W-(CH2-)k-W′-, donde k es un número entero entre 13 y 3000, y W y W′ son grupos reactivos capaces de reaccionar con amino, carboxilo, hidroxi o tio, y donde uno o más de los grupos CH2 no adyacentes pueden independientemente
estar sustituidos por arilo, heteroarilo, -CH=CH-, -C≡C-o un grupo hidrófilo (o polar) seleccionado a partir de -O-, -CO, -CO-O-, -O-CO-, -NR’-, -NR’-CO-, -CO-NR’-, -NR’-CO-O-, -O-CO-NR’-, -NR’-CO-NR’-y -O-CO-O-, donde R’ representa hidrógeno o alquilo(C1-C12). Se entiende que sustituyendo más de un grupo CH2 no adyacente por el
mismo grupo puede dar lugar a una cadena polimérica con una unidad de repetición específica (p. ej., un poliéster, poliéter, poliimida, etc.).
Los grupos espaciadores preferidos incluyen radicales poliméricos hidrófilos (con un aumento de la afinidad por las soluciones acuosas), es decir, polímeros que contienen unidades estructurales de repetición que comprenden uno o más de los grupos hidrófilos (o polares) anteriores en su esqueleto de alquileno. Entre los ejemplos típicos de radicales poliméricos hidrófilos se incluyen polioxialquilenos(C2-C3) (p. ej., polietilenglicol [PEG] o polipropilenglicol [PPG]), polisacáridos (p. ej., dextrano, pululano, quitosano, ácido hialurónico), poliamidas (p. ej., ácidos poliamino, péptidos semisintéticos y polinucleótidos); ácido polisiálico, poliésteres (p. ej., polilactida [PLA], polilactida-co-glicolida [PLGA]), policarbonatos, polietileniminas (PEI), poliimidas de acetato de polivinilo (PVA).
Un espaciador preferido es «PEG» o «politilenglicol», que abarca cualquier poli(óxido de etileno) hidrosoluble. Típicamente, «PEG» significa un polímero que contiene una mayoría, por ejemplo >50 %, de subunidades que son -CH2CH2O-. Las diferentes formas de PEG pueden diferir en pesos moleculares, estructuras o geometrías (p. ej., PEG ramificados, lineales, en horquilla, multifuncionales y similares). Los PEG de uso en la presente invención pueden comprender preferiblemente una de las dos siguientes estructuras: «-O(CH2CH2O)m-» o «-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-» donde m es de 3 a 3000, y los grupos terminales y la arquitectura del PEG total pueden variar. Como se indicó anteriormente, dependiendo de su uso, PEG puede estar en forma de extremo terminal protegido. Cuando PEG se define como «-O(CH2CH2O)m-» el grupo terminal protector generalmente es un grupo que contiene carbono
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compuesto típicamente de 1 a 20 carbonos y preferiblemente es alquilo (p. ej., metilo, etilo o bencilo) aunque también se consideran formas saturadas e insaturadas del mismo, así como arilo, heteroarilo, ciclilo, heterociclilo y formas sustituidos de cualquiera de las anteriores. Cuando PEG se define como «-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-», el grupo terminal protector generalmente es un grupo que contiene carbono típicamente comprende de 1 a 20 átomos de carbono y un átomo de oxígeno que está unido covalentemente al grupo y está disponible para unirse covalentemente a un extremo terminal del PEG. En este caso, el grupo es típicamente alcoxi (p. ej., metoxi, etoxi o benciloxi) y con respecto al grupo que contiene carbono puede opcionalmente estar saturado e insaturado, así como arilo, heteroarilo, ciclilo, heterociclilo y formas sustituidas de cualquiera de los anteriores. El otro extremo («terminal no protegido») típicamente es un hidroxilo, amina o un grupo activado que puede someterse a una modificación química adicional cuando PEG se define como «-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-». Además, el grupo terminal protector también puede ser un silano.
En la técnica se conoce una revisión de la preparación de diversos PEG con grupo terminal funcionalizado o activado (véase por ejemplo Zalipsky S., Bioconjug. Chem., 6, 150-165 (1995)).
Los métodos para la conjugación de un ligando bioactivo (X1 y/o X2 y/o X3) a un lípido-éter (es decir, compuestos de fórmula I donde X1, X2, X3 son H) incluyen la unión covalente de uno o más ligandos bioactivos X1, X2, X3 a una o más de las posiciones reactivas del grupo de cabeza (es decir, grupos N-y/o Y-) de uno o más lípidos-éter individuales. Por tanto, un ligando bioactivo puede unirse a uno o más sitios de un lípido-éter individual o a más de un sitio de más de un lípido-éter individual. Alternativamente, dos o tres ligandos bioactivos se unen a los sitios de acoplamiento de un lípido-éter individual. El uno o más grupos bioactivos pueden unirse directamente al lípido-éter o hacerlo a través de un grupo espaciador.
Típicamente, los métodos para la unión pueden incluir generalmente los pasos de:
a) proporcionar un compuesto lipídico de fórmula I, donde X1, X2, X3 son H, que lleva uno o más sitios de acoplamiento en uno o más de los grupos S1, S2, S3,
b) proporcionar un ligando antígeno portador de un grupo reactivo adecuado para reaccionar con el uno o más sitios de acoplamiento, y
c) hacer reaccionar el compuesto lipídico con el antígeno para obtener un conjugado lípido-ligando.
El término «sitio de acoplamiento» o «grupo de acoplamiento», según se usa en este documento, se refiere a un reactivo o grupo funcional capaz de reaccionar con un reactivo o grupo funcional (o dos reactivos de acoplamiento) correspondiente en una reacción de acoplamiento para formar un enlace covalente (enlace C-C, C-O, C-N, C-S).
La elección del método de conjugación (o acoplamiento) depende de varios factores como la naturaleza del ligando bioactivo que se va a unir, es decir, características físicas (p. ej., tamaño, carga, etc.), la naturaleza de los grupos reactivos presentes en el ligando bioactivo y similares.
En algunas realizaciones, la conjugación se lleva a cabo en presencia de un agente bifuncional (es decir, agente con dos grupos (terminales) funcionales), preferiblemente un agente heterofuncional (es decir, un agente con dos grupos (terminales) funcionales diferentes). El uso de dicho agente (hetero)bifuncional da lugar a un conjugado lípido-ligando en el que el lípido y el ligando pueden estar unidos directamente entre sí o separados por un espaciador. Entre los grupos funcionales típicos se incluyen, pero sin limitaciones, grupos como ésteres de succinimidilo, maleimidas y piridildisulfuros. En algunas realizaciones, el agente bifuncional se selecciona a partir de, pero sin limitaciones, por ejemplo, carbodiimidas, ácido N-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico (NHS-ASA), dihidrocloruro de dimetil pimelimidato (DMP), dimetilsuberimidato (DMS), 3,3′-ditiobispropionimidato (DTBP), N-succinimidil 3-[2-piridilditio]-propionamido (SPDP), succimidil α-metilbutanoato, ácido biotinamidohexanoil-6-amino-hexanoico, éster de N-hidroxi-succinimida (SMCC), éster de succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaetileneglicol] (NH S-PEO12), N-succinimidil (4yodoacetil) aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA), éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida (MBS) y éster de N--maleimidobutiriloxi-succinimida (GMBS), succinimidil dicarbonil pentano o disuccinimidil suberato. En otras realizaciones, el agente bifuncional es el reactivo de Traut 2-iminotiolano en combinación con SPDP. Aún en una realización adicional el enlazador es. En una realización adicional, el agente bifuncional se selecciona entre los descritos en el catálogo de productos de Pierce (Pierce Chemical Company, EE. UU.) y en la guía de selección de reactivos de entrecruzamiento Double AgentsTM (Pierce Chemical Company).
Entre los métodos de conjugación preferidos se incluyen la formación de amida mediada por carbodiimida y de amina activa mediada por éster de maleimida y acoplamiento de sulfhidrilo y similares.
Por ejemplo, una molécula que contiene tiol puede reaccionar con una molécula que contiene amina usando un reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional, por ejemplo, un reactivo que contiene tanto éster de succinimidilo
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como una maleimida, un piridildisulfuro o una yodoacetamida. Puede usarse entrecruzamiento de ácido aminocarboxílico y ácido tiolcarboxílico, reacciones químicas de acoplamiento con maleimida sulfhidrilo (p. ej., el método del éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida [MBS]), etc.
Los polipéptidos pueden conjugarse convenientemente a un lípido-éter a través de grupos amina o tiol en las cadenas laterales de la lisina o la cisteína, respectivamente, o mediante un grupo amino N-terminal. Del mismo modo, los oligonucleótidos pueden conjugarse convenientemente a un lípido-éter a través de un único grupo reactivo del extremo 3’ o 5’, por ejemplo, un grupo sulfhidrilo, amino, fosfato o similar. Los grupos sulfhidrilo reactivos pueden conjugarse a un lípido de fórmula I que tiene un grupo amino libre (p. ej., grupos N e Y) mediante el uso de reactivos como (i) Nsuccinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y SPDP de cadena larga (SPDP-cl) produciendo un enlace disulfuro escindible entre el lípido y el oligonucleótido o polipéptido, o (ii) succinimidil-yodoacetato para producir enlaces no escindibles entre el lípido y el oligonucleótido o polipéptido. Estas y otras técnicas de conjugación son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 5 512 439; el documento WO 01/22995; Greg Hernanson «Bioconjugate Techniques», Academic Press, 1996; Gordon Bickerstaff «Immnobilization of Enzimes and Cells» Humana Press, 1997).
Un experto en la materia sabrá qué grupo funcional o grupos funcionales (p. e., grupos amina, carbonilo o carboxilo del grupo espaciador S1, S2, S3 del grupo de cabeza de un lípido-éter de fórmula I elegir para permitir la conjugación con un ligando bioactivo según los métodos de conjugación descritos anteriormente.
Puede encontrar información general adicional sobre métodos de conjugación por ejemplo, en «Cross-Linking», Pierce Chemical Technical Library, disponible en la página web de Pierce y publicado originalmente en el Catálogo de Pierce 1994-95 y las referencias citadas en él; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991; y Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, 1996.
Las relaciones molares utilizadas en la conjugación de uno o más ligandos a un compuesto lípido-éter de fórmula I pueden ser optimizadas fácilmente por un experto en la materia. Típicamente, puede estar en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1 de compuesto lipídico con respecto al ligando.
En el método general presentado anteriormente, puede usarse cualquier método adecuado para purificar un compuesto intermedio conjugado, tal como mediante HPLC preparativa en fase inversa (RP-HPLC), mediante filtración a través de membrana, como ultrafiltración o diafiltración. Los reactivos que no hayan reaccionado pueden eliminarse mediante cromatografía de exclusión molecular como filtración en gel, o mediante diálisis de equilibrio. El conjugado final también puede purificarse utilizando cualquier medio adecuado, incluidos por ejemplo filtración en gel, filtración en membrana, como ultrafiltración o cromatografía de intercambio iónico, o una combinación de las mismas.
Los conjugados lípido-ligando de la invención son especialmente adecuados para su uso en la preparación de sistemas transportadores lipídicos o nanoparticulados, como liposomas, micelas y nanopartículas.
B. Sistemas transportadores lipídicos
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un sistema transportador lipídico que comprende uno o más conjugados lípido-ligando de la invención opcionalmente en combinación con otros colípidos.
Entre los ejemplos de sistemas transportadores lipídicos preferiblemente se incluyen vesículas de lípidos (lipídica). El término «vesícula de lípidos (lipídica)» (o presentes vesículas o vesículas de la invención) se utilizan indistintamente con la expresión de sistemas transportadores lipídicos y se refiere a una entidad esférica que se caracteriza por la presencia de un espacio interno. Típicamente, las vesículas de la invención se forman a partir de uno o más conjugados lípido-ligando opcionalmente, en combinación con otros lípidos sintéticos o naturales (colípidos). En cualquier vehículo dado de la invención, los lípidos pueden estar en forma de monocapa o bicapa. En el caso de más de una mono o bicapa, las mono o bicapas son generalmente concéntricas. Las presentes vesículas incluyen dichas entidades normalmente denominadas liposomas (es decir, vesícula que incluye una o más bicapas lipídicas ordenas con un espacio interno), micelas (es decir, vesícula que incluye una única monocapa lipídica con un espacio interno) y similares. Por tanto, los lípidos pueden utilizarse para formar una vesícula unilamelar (compuesta por una monocapa
o una bicapa), una vesícula oligolamelar (compuesta por aproximadamente dos o aproximadamentes tres monocapas
o bicapas) o una vesícula multilamelar (compuesta por más de aproximadamente tres monocapas o bicapas).
El espacio interno de las vesículas generalmente está relleno de un líquido incluidos, por ejemplo, un líquido gaseoso, un gas, un precursor gaseoso y/o un material sólido, incluido, por ejemplo, uno o más agentes bioactivos, véase también más adelante.
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dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxiletil amonio (DMRIE), bromuro de 1,2-dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DPRIE), bromuro de 1,2-diesteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DSRIE); ésteres catiónicos de acilcarnitinas (como se recoge en la patente de EE. UU. N.º 5 498 633 de Santaniello y col.); triésteres catiónicos de fosfatidilcolina; es decir, 1,2-diacil-sn-glicerol-3-etilfosfocolinas, donde las cadenas de hidrocarburos pueden estar saturadas o insaturadas y ramificada o no ramificadas con una longitud de cadenas de C12 a C24, no siendo las dos cadenas acilo necesariamente idénticas. Los lípidos neutros o aniónicos tienen carga neta neutra o aniónica, respectivamente. Estos pueden seleccionarse a partir de esteroles o lípidos como colesterol, fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos, esfingolípidos y lípidos pegilados con carga neta neutra o negativa. Los lípidos neutros y aniónicos útiles incluyen por tanto: fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol (sin limitarse a un azúcar específico), ácidos grasos, esteroles, que contienen un grupo ácido carboxílico, por ejemplo, colesterol, sulfato de colesterol y hemisuccinato de colesterol, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina incluyendo, pero sin limitaciones, DOPE, 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas y esfingomielina. Los ácidos grasos unidos al esqueleto de glicerol no se limitan a una longitud o número de enlaces dobles específico. Los fosfolípidos también pueden tener dos ácidos grasos diferentes.
Un experto en la materia entenderá que la proporción entre los conjugados lípido-ligando y los colípidos depende de la naturaleza del ligando bioactivo, la naturaleza del agente bioactivo opcional incluido, embebido, adsorbido o unido a las vesículas lipídicas, el uso previsto (tratamiento de la enfermedad, prueba diagnóstica, etc.), la formulación como composición farmacéutica y la vía de administración.
En una realización, una vesícula lipídica de la invención puede comprender conjugados lípido-ligando de la invención y otros lípidos formadores de vesículas (colípidos) preferiblemente en una proporción entre 1:1000 y 1:1, preferiblemente entre 1:500 y 1:50.
En realizaciones adicionales de la invención, las vesículas lipídicas pueden comprender uno o más conjugados lípidoligando donde el lípido-éter del conjugado comprende cadenas de hidrocarburo insaturadas, que pueden estar entrecruzadas o polimerizadas para formar vesículas lipídicas polimerizadas.
Según se usa en este documento, el término «vesículas lipídicas polimerizadas» y (en particular un liposoma polimerizado) significa una vesícula lipídica en la que los lípidos constituyentes están unidos covalentemente entre sí mediante interacciones intermoleculares. Los lípidos pueden unirse entre sí dentro de una única capa de la bicapa lipídica (las caras) y/o unirse entre sí entre las dos capas de la bicapa. La polimerización de la estructura de la capa lipídica hace el conjunto drásticamente más resistente a la degradación enzimática mediante ácidos, sales biliares o enzimas presentes in vivo. Además, el control del grado de polimerización y la velocidad de degradación (eligiendo proporciones específicas de conjugados lípido-ligando que tienen cadenas de hidrocarburos escindibles o polimerizables), la estabilidad, así como las «filtraciones» (mediante la generación de poros de tamaño deseado) puede reajustarse según la velocidad de escape deseada de un agente bioactivo opcionalmente incluido. Por tanto, el diseño de una vesícula lipídica permite modular la velocidad de escape óptima de, por ejemplo, un agente antigénico encapsulado en sitios de captación inmunitaria específicos, o cualquier fármaco encapsulado a sitios tisulares o celulares específicos, etc.
Como reconocerán los expertos en la materia, los sistemas transportadores lipídicos en forma de vesículas como liposomas, micelas u otras vesículas, pueden prepararse fácilmente a partir de los conjugados lípido-ligando de la invención usando condiciones convencionales conocidas en la técnica.
Dependiendo de las propiedades físicas deseadas, las vesículas lipídicas pueden prepararse a partir de conjugados lípido-ligando opcionalmente en combinación con uno o más colípidos que incluyen lípidos estabilizantes. Los compuestos estabilizantes en particular que finalmente se combinan con los presentes conjugados lípido-ligando pueden seleccionarse si se desea para optimizar las propiedades de las vesículas lipídicas resultantes (y son fácilmente identificables por un experto en la materia sin necesidad de experimentación).
Las composiciones micelares según la invención pueden prepararse usando una cualquiera de los diversos métodos de preparación micelar convencionales que serán aparentes para los expertos en la materia. Estos métodos típicamente implican la suspensión de un conjugado lípido-ligando en un solvente orgánico, la evaporación del solvente, la resuspensión en un medio acuoso, la sonicación y la centrifugación. Los métodos mencionados anteriormente, además de otros, se discuten, por ejemplo, en Canfield y col., Methods in Enzymology, Vol. 189, pág. 418-422 (1990); El-Gorab y col, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 306, pág. 58-66 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, y col, Academic Press, N.Y. (1963) (especialmente "The Formation of Micelles", Shinoda, capítulo 1, pág. 1-88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler and Fendler, Academic Press, N.Y. (1975).
Los materiales estabilizantes opcionales que se combinan con los conjugados lípido-ligando para estabilizar las composiciones micelares producidas de los mismos incluyen bromuro de lauriltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, cloruro de alquil(C12-C16)dimetilbencilamonio, bromuro y cloruro de cetilpiridinio, laurilsulfato y similares. Otros materiales para estabilizar las composiciones micelares, además de los
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ejemplos anteriores, podrían ser fácilmente aparentes para un experto en la materia en función de la presente descripción.
Las composiciones liposomales de la invención son especialmente preferidas ya que son especialmente eficaces como vehículos para la administración de agentes bioactivos a tejidos y células y como vehículos presentadores de antígeno.
Las composiciones de liposomas pueden comprender uno o más conjugados lípido-ligando opcionalmente en combinación con uno o más colípidos adicionales y/o uno o más compuestos estabilizantes. Los conjugados lípidoligando (y co-lípidos) puede estar en forma de una monocapa o bicapa, y los lípidos de la mono o bicapa puede usarse para formar una o más mono o bicapas. En el caso de más de una mono o bicapa, las mono o bicapas son generalmente concéntricas. Por tanto, los conjugados lípido-ligando (y colípidos) pueden utilizarse para formar un liposoma unilamelar (compuesta por una monocapa o una bicapa), un liposoma oligolamelar (compuesto por dos o tres monocapas o bicapas) o un liposoma multilamelar (compuesto por más de tres monocapas o bicapas).
La selección de colipidos y compuestos estabilizantes adecuados en la preparación de composiciones de lípidos liposomales de la invención será aparente para un experto en la materia y pueden conseguirse sin necesidad de experimentación, en función de la presente memoria descriptiva.
Otros materiales para su uso en la preparación de composiciones de lípidos liposomales de la invención, además de los ejemplos anteriores, podrían ser fácilmente aparentes para un experto en la materia en función de la presente memoria descriptiva.
La cantidad de material estabilizante, como por ejemplo, un compuesto anfipático adicional, que se combina con los conjugados lípido-ligando presente puede variar dependiendo de diversos factores, incluidos los conjugados lípidoligando específicos de la invención seleccionados, los materiales estabilizantes específicos seleccionados, el uso particular para el cual se está empleando, el modo de administración y similares. La cantidad de material estabilizante que se combina con los presentes conjugados lípido-ligando y la proporción de material estabilizante con respecto a los conjugados lípido-ligando variarán y es fácilmente determinable por un experto en la materia en función de la presente memoria descriptiva. Típicamente, se prefieren las relaciones mayores de aproximadamente 4:1, 3:1 o 2:1 de conjugado lípido-ligando con respecto al lípido estabilizante.
Hay disponible una amplia variedad de métodos en conexión con la preparación de composiciones de liposomas de la invención. Por consiguiente, los liposomas pueden prepararse usando una cualquiera de las diversas técnicas de preparación de liposomas convencionales que serán aparentes para los expertos en la materia. Estas técnicas incluyen inyección de etanol, técnica de película fina, homogeneización, diálisis en solvente, hidratación forzada, evaporación en fase inversa, microemulsificación y congelación-descongelación simple, usando por ejemplo, un equipo de microemulsificación convencional. Entre los métodos adicionales para la preparación de composiciones liposomales de la invención a partir de los conjugados lípido-ligando de la presente invención se incluyen, por ejemplo, sonicación, diálisis con quelante, homogeneización, infusión de solvente, formación espontánea, evaporación de solvente, diálisis con detergente controlada y otros, implicando cada uno la preparación de liposomas de diversas formas. Típicamente, se prefieren los métodos que implican la inyección de etanol, la técnica de película fina, la homogeneización y la extrusión en conexión con la preparación de composiciones liposomales de la invención a partir de los conjugados lípido-ligando de la presente invención.
El tamaño de los liposomas puede ajustarse, si se desea, mediante diversas técnicas, que incluyen extrusión, filtración, sonicación y homogeneización. Otros métodos para ajustar el tamaño de los liposomas y modular la biodistribución liposomal resultante y el aclaramiento de los liposomas podrían ser aparentes para un experto en la materia en función de la presente invención. Preferiblemente, el tamaño de los liposomas se ajusta mediante extrusión bajo presión a través de poros de un tamaño definido. Las composiciones liposomales de la invención pueden ser de cualquier tamaño, preferiblemente menos de aproximadamente 200 nanometros (nm) de diámetro externo.
Como reconocerán los expertos en la materia, cualquiera de los conjugados lípido-ligando y sistemas transportadores lipídicos que comprenden los conjugados lípido-ligando de la invención puede liofilizarse para su conservación y reconstituirse, por ejemplo, en un medio acuoso (como agua estéril o solución tamponada de fosfato, o solución salina acuosa), preferiblemente bajo agitación vigorosa. Si es necesario, pueden incluirse a aditivos para evitar la aglutinación
o fusión de los lípidos como resultado de la liofilización. Entre los aditivos útiles se incluyen, sin limitaciones, sorbitol, manitol, cloruro sódico, glucosa, trehalosa, polivinilpirrolidona y poli(etilenglicol), por ejemplo, PEG 400.
C.
Sistemas transportadores nanoparticulados
Los sistemas transportadores nanoparticulados pueden existir en cualquier forma y cualquier morfología. Entre los ejemplos de sistemas transportadores nanoparticulados se incluyen, nanopartículas, nanopolvos, nanoagregados, nanocristales, nanoesferas, nanofibras, nanotubos y otras formas geométricas. Las composiciones vesiculares
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nanoparticuladas o nanopartículas típicamente son partículas pequeñas con un diámetro típico de menos de 1 micrómetro, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 25-1000 nm, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 50-300 nm, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 60-200 nm. Una nanoesfera se refiere a un tipo de nanopartícula que tiene una forma aproximadamente esférica con un centro hueco. Típicamente, las nanopartículas tienen una estructura central de matriz que puede formarse usando todos los tipos de materiales y estructuras, incluyendo materiales inorgánicos, como metales, y materiales orgánicos, como polímeros incluyendo polímeros fisiológicamente aceptables. Entre los ejemplos no limitantes de dichos polímeros se incluyen, por ejemplo, poliésteres (como poli(ácido láctico), poli(L-lisina), poli(ácido glicólico) y poli(ácido láctico-co-glicólico), poli(ácido láctico-co-lisina), poli(ácido láctico-injerto de lisina), polanhídridos (como poli(dímero de ácido graso), poli(ácido fumárico), poli(ácido sebácico), poli(carboxifenoxi propano), poli(carboxifenoxi hexano), copolímeros de estos monómeros y simialres), poli(anhídrido-co-imidas), poli(amidas), poli(ortoésteres), poli(iminocarbonatos), poli(uretanos), poli(organofosfacenos), poli(fosfatos), poli(acetato de etilenvinilo) y otros acetatos de celulosa sustituidos con acilo y sus derivados, poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli(aminoácidos), poli(acrilatos), poliacetales, poli(cianoacrilatos), poli(estirenos), poli(vinil cloruro), poli(vinil fluoruro), poli(vinil imidazol), poliolefinas clorosulfonadas, óxido de polietileno, copolímeros, poliestireno y mezclas o copolímeros de los mismos. Las nanopartículas también pueden incluir hidroxipropilcelulosa (HPC), N-isopropilacrilamida (NIPA), polietilénglicol, polivinilalcohol (PVA), polietilenimina, quitosano, quitina, dextransulfato, heparina, condroitina sulfato, gelatina, etc., así como sus derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. En la publicación de EE. UU. 2003/0138490 se describe un método no limitante para la fabricación de nanopartículas. En otra realización el material del núcleo puede seleccionarse a partir de metales, aleaciones, metaloides, compuestos de metal como óxidos metálicos, compuestos inorgánicos y materiales a base de carbono, en especial nanotubos de carbono, nanopartículas de carbono unidimensionales de fulereno C6o, y nanopartículas tridimensionales de fulereno C70. Entre los ejemplos de metales se incluyen, pero sin limitaciones, metales nobles o de platino como Ag, Au, Pd, Pt, Rh, Ir, Ru y Os, metales de transición como Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Ta, W, Re, y metales de grupos principales como Al, Ga, In, Si, Ge, Sn, Sb, Bi, Te. Se apreciará que algunos de los metales de los grupos principales, en especial Si y Ge, también se denominan normalmente metaloides. Entre los ejemplos adecuados de aleaciones se incluyen, aunque sin limitaciones, aleaciones de metales nobles o de platino y metales de transición, en especial aleaciones de plata y metales de transición como Ag/Ni, Ag/Cu, Ag/Co, y platino y metales de transición como Pt/Cu, o aleaciones de metal noble o platino como Ru/Pt. Entre los ejemplos no limitantes de compuestos inorgánicos se incluyen, pero sin limitaciones, SiO2, compuestos metálicos, en especial óxidos metálicos como TiO2 y óxidos de hierro. Las nanopartículas también pueden comprender restos fluorescentes o luminiscentes intrínsecos, restos de plasmón resonante y restos magnéticos, que proporcionan dichas nanopartículas con propiedades eléctricas, magnéticas y/u ópticas detectables.
Un experto en la materia reconocerá que la elección del material puede depender del uso deseado de la nanopartícula.
En una realización, la invención se refiera a una nanopartícula que comprenden uno o más conjugados lípido-ligando. El uno o más conjugados lipídicos pueden ser atrapados, embebidos, incorporados, encapsulados, adsorbidos o unidos a la superficie, o asociados de otro modo con la nanopartícula.
En una realización específica el conjugado lípido-ligando puede asociarse con una nanopartícula en forma de recubrimiento, a través de fuerzas intermoleculares como las fuerzas de Van-der-Waals, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, opcionalmente en combinación con otro colípidos.
Alternativamente, las nanopartículas pueden incluir opcionalmente uno o más grupos funcionales como, por ejemplo, un grupo carboxilo, sulfidrilo, hidroxilo o amino, para unir covalentemente uno o más conjugados lípido-ligando (u otros compuestos, como espaciadores) a la superficie de las nanopartículas, opcionalmente en combinación con otros colípidos.
Las nanopartículas de la invención también pueden agruparse (opcionalmente con un agente de dispersión) para formar un nanoagregado. La formulación independiente de cada tipo de nanopartícula antes de la formación del agregado y una disposición especial de las nanopartículas dentro del agregado puede permitir el control de la retención y la concentración de un conjugado lípido-ligando y, por tanto, del agente bioactivo.
En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden además comprender un agente bioactivo atrapado, embebido o encapsulado dentro del núcleo sólido de matriz de la nanopartícula.
En realizaciones preferidas, las nanopartículas recubiertas de lípido-ligando pueden formarse a partir de partículas de núcleo de escala nanométrica y uno o más conjugados lípido-ligando de la presente invención y, opcionalmente, uno
o más colípidos. En cualquier nanopartícula recubierta de lípido-ligando determinado, los conjugados lípido-ligando pueden estar en forma de una monocapa o una bicapa. En el caso de más de una mono o bicapa, las mono o bicapas son generalmente concéntricas. El recubrimiento de las nanopartículas preferiblemente se lleva a cabo en una solución que comprende los conjugados lípido-ligando de la invención y dejando el tiempo suficiente que permita que los conjugados lípido-ligando recubran las nanopartículas.
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En algunas realizaciones, el uno o más ligandos del uno o más conjugados lípido-ligando son uno o más ligandos antigénicos.
La cantidad de ligando antigénico por nanopartícula (o densidad de superficie del ligando antigénico) para inducir una respuesta inmunitaria depende de muchos factores, como la naturaleza de la respuesta inmunitaria en sí (humoral frente a mediada por células), la inmunogenicidad del ligando antigénico, la constitución inmunogénica del organismo expuesto y la vía de administración y duración de la exposición al antígeno.
Claramente, la inmunización de un sujeto puede potenciarse mediante el uso de múltiples copias de un antígeno como un despliegue multivalente aumentando de este modo la concentración antigénica específica del sitio e induciendo así respuestas inmunitarias de larga duración. Es especialmente deseable en caso de ligandos antigénicos como péptidos
o hidratos de carbono pequeños, que son difíciles de administrar y generalmente no logran inducir una respuesta inmunitaria eficaz debido a los problemas de tamaño relacionados con el hapteno.
Por tanto, en algunas realizaciones, la nanopartícula muestra copias únicas o múltiples de un antígeno o una combinación de diferentes ligandos antigénicos sobre su superficie (en forma de un despliegue multivalente). Según se usa en este documento, el término «multivalente» se refiere al despliegue de más de una copia o tipo de antígeno en un sistema transportador.
Más específicamente, la presente invención se refiere a una nanopartícula que comprende un núcleo sólido que está recubierto por al menos un conjugado lípido-ligando de fórmula I, donde uno o más de X1, X2, X3 son un ligando antigénico y, opcionalmente, otra matriz o colípidos.
La inmunización puede mejorarse adicionalmente incluyendo ligandos diana para dirigir la nanopartícula a la localización o célula inmune adecuada.
Los compuestos que pueden actuar como ligandos diana son compuestos que interfieren con la adherencia de los patógenos a las células huésped y, por tanto, con el éxito de la colonización. Entre los ejemplos de estos compuestos se pueden incluir el toxoide tetánico; P pili de E. coli; pili de tipo IV de Pseudomonas aeruginosa, especies de Neisseria, especies de Moraxella, EPEC o Vibrio cholerae; genes de fimbrias y varias adhesinas de fimbrias, incluidos FHA, pertactina, toxina pertussis y BrkA de Bordetella pertussis; y SipB-D de Salmonella typhimurium; y la adhesión de adenovirus; la proteína sigma-1 de reovirus que se dirije a la célula M.
Por tanto, la invención se refiere a una nanopartícula que comprende un núcleo sólido que está recubierto por al menos un conjugado lípido-ligando de fórmula I, donde uno o más de X1, X2, X3 son un ligando antigénico y/o un ligando diana, y opcionalmente, otra matriz o colípidos.
En otras realizaciones, una nanopartícula recubierta de lípido-ligando además comprende un agente antigénico único
o una combinación de agentes antigénicos (multivalente) incluido o embebido dentro del núcleo sólido de la nanopartícula.
Por tanto, la invención también se refiere a una nanopartícula que comprende un núcleo sólido que está recubierto por al menos un conjugado lípido-ligando de fórmula I, donde uno o más de X1, X2, X3 son un ligando antigénico y/o un ligando diana, y opcionalmente, otra matriz o colípidos, y donde el núcleo sólido opcionalmente comprende uno o más agentes antigénicos adicionales.
Aún en otras realizaciones, la nanopartícula además comprende uno o más adyuvantes incluidos, embebidos o dispersados dentro del núcleo sólido de la nanopartícula.
Según se usa en este documento, el término «adyuvante» se refiere a cualquier materia capaz de potenciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular frente a un antígeno específico. Los adyuvantes adecuados pueden desplegarse en la superficie de una nanopartícula, intercalarse en la pared de la nanopartícula o encapsularse en el interior de la nanopartícula. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden usarse para promover la producción de anticuerpos séricos y/o de la mucosa, así como respuestas inmunitarias mediadas por células frente a los antígenos administrados conjuntamente se incluyen la enterotoxina termolábil de E. coli holotoxina (TL) y la enterotoxina de Vibrio cholerae (CT), así como el adyuvante KPL (derivada de la pared celular de Salmonella minnesota).
Según se usa en este documento, los términos «desplegados» o «expuesto en la superficie» se refiere a cualquier ligando que aparece en la superficie externa de un sistema transportador como una vesícula lipídica o una nanopartícula y, por tanto, es accesible para su reconocimiento.
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composiciones farmacéuticas dirigidas según la invención permite la administración de dosis más bajas para obtener el efecto terapéutico deseado que se quiere conseguir.
A modo de guía general, puede ser adecuado administrar la proporción de conjugado lípido-ligando en el sistema transportador que variará entre 0,05 y 5 moles %, siendo más preferida una proporción de 0,1 a 2 moles %, y entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 10 mg del agente antigénico, terapéutico o diagnóstico en particular por kilogramo de peso corporal del paciente, aunque pueden usarse cantidades más altas y más bajas.
E. Métodos de uso
Como se indicó anteriormente, en una realización específica, los conjugados lípido-ligando dirigidos y, en particular, las vesículas dirigidas (es decir, liposomas y micelas) y las nanopartículas dirigidas que las comprenden, así como las respectivas composiciones farmacéuticas de las mismas, son especialmente adecuadas para su uso como vehículos para una administración dirigida de uno o más agentes bioactivos, preferiblemente agentes terapéuticos, diagnósticos y/o antigénicos.
Por tanto, los conjugados lípido-ligando dirigidos de la presente invención son especialmente aplicables para su uso in vitro y/o in vivo en métodos para el tratamiento de enfermedades, para las que es deseable o se requiere la administración dirigida de uno o más agentes bioactivos específicos, preferiblemente agentes terapéuticos, diagnósticos y/o antigénicos a células o tejidos.
En el caso de nanopartículas dirigidas y sus composiciones farmacéuticas, el uno o más agentes bioactivos están preferiblemente atrapados dentro del núcleo sólido.
En el caso de vesículas lipídicas dirigidas y sus composiciones farmacéuticas, el uno o más agentes bioactivos están preferiblemente incluidos dentro del espacio interno o incorporados en la bicapa lipídica.
En aspectos adicionales, la presente invención también abarca métodos para el transporte de un compuesto diagnóstica o biológicamente activo a través de una membrana, en métodos particulares para la administración intracelular de uno o más agentes bioactivos que comprenden poner en contacto células con una composición farmacéutica de la invención.
En otra realización específica, las vesículas antigénicas (es decir, liposomas y micelas) y las nanopartículas antigénica que las comprenden, así como sus respectivas composiciones farmacéuticas, son especialmente adecuadas para su uso como sistemas de despliegue antigénico. Por tanto, los conjugados lípido-ligando antigénicos de la presente invención son especialmente aplicables, por ejemplo, para su uso en métodos de inmunización y/o para aplicaciones diagnósticas in vitro/in vivo.
Opcionalmente, las vesículas antigénicas (es decir, liposomas y micelas) y las nanopartículas antigénicas pueden comprender además uno o más agentes bioactivos. En el caso de nanopartículas antigénicas, el uno o más agentes bioactivos están atrapados preferiblemente dentro del núcleo sólido. En el caso de vesículas lipídicas dirigidas y sus composiciones farmacéuticas, el uno o más agentes bioactivos están preferiblemente incluidos dentro del espacio interno o incorporados en la bicapa lipídica.
Por tanto, aún en otro aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de despliegue antigénico para vacunas profilácticas y terapéuticas que comprende una vesícula lipídica antigénica o una nanopartícula antigénica que comprende uno o más conjugados lípido-ligando antigénicos opcionalmente en combinación con otros colípidos, donde el opcionalmente comprende uno o más adyuvantes y/o uno o más agentes bioactivos.
Además la presente invención abarca métodos para desencadenar o modular una respuesta inmunitaria frente a un antígeno en un sujeto que comprende el despliegue de antígenos a células presentadoras de antígeno, en especial a células dendríticas, macrófagos, células B y células endoteliales, y administrar posteriormente dichas células presentadoras de antígeno al sujeto.
Otros aspectos de la invención incluyen métodos para el transporte de un compuesto biológicamente activo a través de una membrana y/o métodos de administración de un compuesto biológicamente activo dentro de una célula usando sistemas transportadores de la invención.
Entre las aplicaciones adicionales que se contemplan se incluyen por ejemplo la aplicación in vivo para favorecer el crecimiento y la diferenciación de las células, así como la modificación de los perfiles de expresión y patrones de modificación postraduccionales de productos biológicos fabricados en biorreactores.
F. Kits
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Aún en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un kit que comprende un recipiente que está compartimentalizado para alojar los diversos elementos del kit. Un compartimento puede contener una cantidad predeterminada de conjugado lípido-ligando o un sistema transportador preparado con este. En el caso de sistemas transportadores como los liposomas, estos pueden estar con o sin un tampón de pH para ajustar el pH de la composición a un intervalo fisiológico de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, o bien en forma liofilizada o secada por congelación para su reconstitución en el momento de su uso. El kit también incluye otros reactivos e instrucciones para su uso.
La presente invención se describe además en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Materiales: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) es de Merck & Cia. (Schaffhausen, Suiza). Colesterol, DOPE, DSPC, POPC, MPEG2000-DOPE (880130) y los lípidos fluorescentes NBD-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio)) (810145P) y PhB-DOPE (810150) se adquirieron en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). El derivado del ácido propiónico (AP) funcionalizado con PEG Fmoc-NH-PEG12-PA-COOH (851024) se obtuvo de Novabiochem, Fmoc-NH-PEG8-PA-COOH (PEG1830), Fmoc-NHPEG36-PA-COOH (PEG4400) y MPEG(2kDa)-amina (PEG1152) de IRIS Biotech GmbH. La resina difenildiazometano (D-2230) se obtiene de Bachem AG, la resina H-Thr(tBu)-2-ClTrt (RRA-1251) de CBL Patras, la resina H-Gly-2-ClTrt (856053) y la resina Sieber (855008) de Novabiochem. Todos los demás productos químicos y solventes son de grado analítico o superior.
El péptido aza aceptor de Michael ácido trans-Cbz-D-Ala-D-Ala-2-aza-Asn-acrílico (RR11a-OH) y su éster activado con N-hidroxisuccinimida (RR11a-NHS) se sintetiza en WuXi AppTec Co. Ltd. (Ekici y col., 2004, J. Med. Chem. 47, 1889-1892; Reisfeld y col., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 7, Número 6, 2011, 665-673).
2,3-Bis(tetradeciloxi)propan-1-amina se sintetiza según Kokotos y col. Chemistry-A European Journal, 2000, vol. 6, N.º 22, 4211-4217. De forma análoga, bis(3-((Z)-octadec-9-eniloxi)propil)amina se obtiene a partir de metanosulfonato de oleilo y bis(3-hidroxipropil)amina (véase MaGee y col., J. Journal of Organic Chemistry, 2000, vol. 65, N.º 24, 83678371).
Cultivo celular: las células de melanoma humano M21, obtenidas de la Cell Culture Strain Collection, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, se mantienen a 37 ºC con CO2 al 5 % en DMEM con medio del cultivo con alto contenido en glucosa (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal bovino al 10 %. Se realizaron pases de las células con regularidad y se dispusieron en placas de cultivo de 6 pocillos durante 16 horas antes del experimento a 0,3 x 106 células en 2 ml de medio de cultivo. Las células M21 se incuban con liposomas en medio de cultivo sin suero Opti-MEM durante 1 hora a 37 ºC y, a continuación, se recogieron usando tampón de disociación celular (Life Technologies, Carlsbad, CA) tras un lavado con Opti-MEM. La colocalización de NBD-DOPE se determina mediante Guava easyCyte 8HT (EMD Millipore Corp., Billerica, MA).
Análisis estadístico: los análisis estadísticos se realizan con la prueba de t de Student. Las diferencias entre las medias se consideran estadísticamente significativas a un valor de p < 0,01.
Ejemplo 1: síntesis de α-terc-butilester-γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9il)metoxi)carbonilamino)-glutámico
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Se disuelven 15 g de Fmoc-Glu(OSu)OtBu (éster α-terc-butil-éster γ-N-hidroxisuccinimida del ácido (2S)-N-(9fluorenilmetiloxicarbonil)-glutámico) en diclorometano a temperatura ambiente. Tras la adición de 15,3 g de 2,3bis(tetradeciloxi)propan-1-amina, la mezcla se agita durante 17 horas y se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en una cantidad mínima de diclorometano y se purifica mediante cromatografía en columna usando SiO2 como fase sólida y terc-butiléter de metilo/hexano 7:3 como eluyente. Tras la evaporación del producto se obtienen fracciones 25,5 g de α-terc-butilester-γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9il)metoxi)carbonilamino)-glutámico como un sólido incoloro. RMN 1H en CDCl3 (TMS como patrón interno),
desplazamiento químico en ppm: 7,76 (d, 2H, Fmoc), 7,61 (d, 2H, Fmoc), 7,25-7,43 (m, 4H, Fmoc), 6,13 (sa, NH, 1H), 5,60 (sa, NH, 1H), 4,39, 4,18-4,25 (d y m, 4H), 3,21-3,62 (m, 9H), 1,97-2,23 (m, 4 H), 1,51-1,60 (m, 4H), 1,47 (s, 9 H), 1,25 (m, 44H, CH2), 0,84-0,91 (m, 6H, 2x alquilo-CH3).
Ejemplo 2: síntesis de γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-glutámico
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En un matraz de 100 ml se disuelven 4,6 g (5,1 mmol) de α-terc-butilester-γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-glutámico en 25 ml de diclorometano y se trata con 25 ml de ácido trifluoroacético. Después de 1 h el grupo éster está completamente escindido y la solución se vierte sobre 50 ml de agua fría. La capa orgánica se extrae, se lava a pH neutro y se seca sobre Na2SO4. La capa orgánica recoge por filtración y el solvente se evapora para obtener 4,2 g del producto deseado (5,0 mmol, rendimiento del 98 %, TLC: MtBE/hexano 7:3; Rf = 0,43.
Ejemplo 3: síntesis de γ-(2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amida del ácido (2S)-glutámico
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15 Se añaden 5 g de α-terc-butilester-γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9il)metoxi)carbonilamino)-glutámico a 85 ml de N,N-dimetilformamida. A la mezcla se añaden 2,6 ml de piperidina. La mezcla se agita durante tres horas a temperatura ambiente y, a continuación, se evapora a sequedad al vacío para obtener 5,2 g de γ-(2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amida del ácido (2S)-glutámico como un sólido incoloro, que puede usarse en la preparación de vesículas lipídicas y para la derivatización previa con un agente activo o un grupo
20 espaciador.
Ejemplo 4: síntesis de (R)-2-amino-N1-(2-(4-metoxibenzamido)etil)-N4,N4-bis(3-((Z)-octadec-9-eniloxi)propil)succinamida
(a) Síntesis de N-(2-aminoetil)-4-metoxibenzamida
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25 Se añaden 3,0 g de cloruro de 4-metoxibenzoilo a 30 ml de 1,2-diaminoetano en diclorometano a -78 ºC y posteriormente se deja enfriar a 23 ºC. El tratamiento con una mezcla ácido-base acuosa y la evaporación a sequedad al vacío proporciona 1,65 g de N-(2-aminoetil)-4-metoxibenzamida, un aceite de color amarillo pálido. RMN 1H en
CDCl3 (TMS como patrón interno), desplazamiento químico en ppm: 8,53 (t, 1H, NH), 7,91 (d, 2H, Benz), 6,99 (d, 2H, Benz), 4,75 (sa, 2H, NH2), 3,81 (s, 3H, CH3), 3,39, (dd, 2H, CH2), 2,82 (t, 2H, CH2).
(b) Síntesis de (R)-terc-butil 3-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4-metoxbenzamido)etilamino)-4oxobutanoato
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Se añaden 3,0 g de 2 N-(2-aminoetil)-4-metoxibenzamida (obtenida en la etapa (a)) y 1,70 ml de N-metilmorfolina en DMF (0 ºC) a una solución de 6,35 g de Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 1,70 ml de N-metilmorfolina y 2,00 ml de isobutilcloroformato en acetato de etilo (-12 ºC) y se agita durante 3 h al tiempo que se deja atemperar hasta 23 ºC. La dilución de la suspensión resultante con acetato de etilo, seguido de un tratamiento con una mezcla ácido-base 10 acuosa y evaporación a sequedad al vacío permite obtener 9,55 g de (R)-terc-butil 3-(((9H-fluoren-9il)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4-metoxibenzamido)etilamino)-4-oxobutanoato. Este material sin procesar se resuspende en isopropiléter durante 23 h, a continuación se recoge mediante filtración y se seca para obtener 4,47 g de (R)-terc-butil 3-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4-metoxibenzamido)etilamino)-4-oxobutanoato como cristales de color blanco. RMN 1H en CDCl3 (TMS como patrón interno), desplazamiento químico en ppm: 8,28 (t, 1H,
15 NH), 8,07 (t, 1H, NH), 7,89 (d, 2H, Fmoc), 7,81 (d, 2H, Benz), 7,71-7,60 (m, 2H, Fmoc y 1H, NH), 7,46-7,27 (m, 4H, Fmoc), 6,96 (d, 2H, Benz), 4,35-4,20 (m, 3H, Fmoc, y 1H CH), 3,78 (s, 3H, CH3), 3,40-3,20, (m, 4H, 2xCH2), 2,69 (dd, 1H, CH2), 2,46 (dd, 1H, CH2), 1,37 (s, 9H, 3xCH3).
(c) Síntesis de acetato sódico de (R)-3-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4-metoxibenzamido)etilamino)4-oxobutanoato
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Se añaden 30,0 ml de ácido trifluoroacético a 3,0 g de (R)-terc-butil 3-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4metoxibenzamido)etilamino)-4-oxobutanoato (obtenido en el paso (b)) en diclorometano a 23 ºC. Tras completar la reacción se añade NaHCO3 para obtener un precipitado blanco que se lava con diclorometano y se seca para obtener 2,55 g de acetato sódico de (R)-3-(((9H-fluoren-9-l)metoxi)carbonilamino)-4-(2-(4-metoxibenzamido)etilamino)-4
25 oxobutanoico como un polvo blanco. RMN 1H en SO(CD3)/CD3OD, 1:1, (TMS como patrón interno), desplazamiento químico en ppm: 7,85-7,79 (m, 2H, Fmoc y 2H, Benz), 7,68 (d, 2H, Fmoc), 7,45-7,29 (m, 4H, Fmoc), 6,93 (d, 2H, Benz), 4,51-4,17 (m, 3H, Fmoc y 1H, CH), 3,78 (s, 3H, CH3), 3,47-3,34, (m, 4H, 2xCH2), 2,82 (dd, 1H, CH2), 2,63 (dd, 1H, CH2).
(d) Síntesis de carbamato de (9H-fluoren-9-il)metil (R,Z)-1-(4-metoxifenil)-10-(3-((Z)-octadec-9-eniloxi)propil)-1,6,930 trioxo-14-oxa-2,5,10-triazadotriacont-23-en-7-ilo
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2H, NH2), 1,85-1,67 (m, 4H, 2xCH2), 1,60-1,47 (m, 4H, 2xCH2), 1,28 (sa, 44H, 22xCH2), 0,90 (t, 6H, 2xCH3). EM: 947,9 [M+Na]+.
Ejemplo 5: síntesis de α-terc-butil ester-γ-2,3 bis(tetradeciloxi)propilamida del ácido N2,N,N-dimetilaminometilen-10-formil-fólico
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Se añaden 2,2 g de ácido N2,N,N-dimetilaminometilen-10-formil-pteroico a 46 ml de N,N-dimetilformamida. Tras la adición de 3,2 g de O-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato, la mezcla se agita durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añade gota a gota una mezcla de 5,0 g de γ-(2,3-bis (tetradeciloxi)propil)amida del ácido (2S)-glutámico y 50 ml de N,N-dimetilformamida. Tras agitar a temperatura ambiente durante 17 horas, se elimina el material sólido mediante filtración y el filtrado se evapora a sequedad al vacío a 40 ºC. El residuo se disuelve en 100 ml de diclorometano. La solución de diclorometano se lava con 25 ml de solución acuosa de ácido cítrico, 25 ml de solución acuosa de carbonato hidrogenado de sodio al 5 % y 25 ml de agua. Cada una de las fases acuosas se extrae con diclorometano. Las fases de diclorometano combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se evapora a sequedad para obtener una espuma de color amarillo que se disuelve en una mezcla de diclorometano/metanol 95:5 y se agita durante 15 min a 40 ºC. El material sólido se elimina por filtración y el filtrado se purifica mediante cromatografía en columna usando SiO2 como fase sólida y diclorometano/metanol 95:5 como eluyente. Tras la evaporación de las fracciones del producto se obtienen 2,7 g de una espuma de color amarillo que se purifica de nuevo mediante cromatografía en columna como se describe anteriormente para obtener 2,2 g de αterc-butil-ester-α-(2,3 bis(tetradeciloxi)propil)amida del ácido N2,N,N-dimetilaminometilen-10-formil-fólico como una espuma de color amarillo pálido. RMN 1H en CDCl3 (TMS como patrón interno), desplazamiento químico en ppm: 10,00 (sa, 1H, N3-H), 8,96 (s, 1H, C7-H), 8,76, 8,72 (2s, 2H, CHN, CHO), 7,88 (d, 2H, C2’-H, C6’-H), 7,73 (d, 1H, NH(Glu)), 7,35 (d, 2H, C3’-H, C5’-H), 6,26 (d, 1H, C�-NH), 5,32 (s, 2H, C6-H2), 4,53 (m, 1H, CH-Glu), 3,30-3,56 (m, 9H, m, 4CH2, CH-O-alquilo), 3,22 (s, 3H, N-CH3), 3,15 (s, 3H, N-CH3), 2,03-2,40 (m, 4H, 2 CH2-Glu), 1,54 (m, s, 4H, 2CH2), 1,46 (s, 9H, OC(CH3)3), 1,24 (s, 44H, 22 CH2), 0,87 (m, 6H, 2x alquil-CH3).
Ejemplo 6: Síntesis de γ-(2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amida del ácido fólico
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OH
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Se disolvieron 2,1 g de α-terc-butilester-γ-2,3 bis(tetradeciloxi)propilamida del ácido N2,N,N-dimetilaminometilen-10formil-γ fólico en 105 ml de diclorometano. Tras la adición de 105 ml de ácido trifluoroacético, la mezcla se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y, a continuación se evapora a sequedad a 40 ºC para obtener 3,4 g de una espuma de color amarillo. Esta última se disuelve en 105 ml de tetrahidrofurano y se añaden gota a gota 105 ml de solución acuosa de hidróxido de sodio 1M mientras se mantiene en agitación. La mezcla se calienta a 50 °C durante 2,5 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente se separa la capa orgánica y se evapora a sequedad. Al residuo se añaden 105 ml de diclorometano y 105 ml de ácido clorhídrico acuoso 1 M. La mezcla se agita durante 5 minutos a temperatura ambiente y el producto precipitado se aspira, se lava con 500 ml de agua y, a continuación, se seca a 40 ºC al vacío para obtener 1,76 g γ-(2,3 bis(tetradeciloxi)propil)amida del ácido fólico como un sólido de color amarillo. RMN 1H en DMSO-d6 (TMS como patrón interno), desplazamiento químico en ppm: 11,59 (sa, 1H, N3-H), 8,64 (s, 1H, C7-H), 8,17 (d, 1H, NH), 7,81 (t, 1H, NH), 7,66 (d, 2H, C2’-H, C6’-H), 7,01 (sa, NH, 1H), 6,92 (t, 2H, NH), 6,64 (d, 2H, C3’-H, C5’-H), 4,49 (d, 2H, C6-H2), 4,29 (m, 1H, CH-Glu), 3,26-3,46 (m, 5H, 2CH2, CH-O-alquilo), 3,08 (s, 2H, CH2), 2,17-2,2.5 (m, 2H, CH2), 1,84-2,11 (2m, 2H, CH2), 1,42, 1,23 (m, s, 44H, 22 CH2), 0,85 (m, 6H, 2x alquil-CH3).
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Ejemplo 7: síntesis de ácido (2S,47S)-47-[2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroilamino-2-[3-[[2,3bis(tetradeciloxi)propil]amino]-3-oxopropil]-4,44-dioxo-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43diazaoctatetracontan-1,48-dioico
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Síntesis de la resina Fmoc-Glu(DMA)-difenilmetilo:
En un reactor SPPS de 100 ml se lavan 3,85 g de resina difenildiazometano (3,3 mmol) dos veces con 30 ml d DCM y se trata con una solución de 4,2 g de γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9il)metoxi)carbonilamino)-glutámico (véase el ejemplo 2, 1,5 eq., 5,0 mmol) en 30 ml de DCM durante toda la noche. La solución se filtra y la resina se lava con DCM cuatro veces. Para destruir finalmente el difenildiazometano que no ha reaccionado la resina se trata con 125 µl de ácido acético (0,5 eq.; 2,2 mmol) en 30 ml de DCM durante 15 minutos y se lava a continuación tres veces alternando con 30 ml de dimetilformamida e isopropanol. La resina se lava dos veces con éter diisopropílico y se seca durante toda la noche al vacío. Se obtienen 6,7 g del producto deseado (>100 % del teórico, rendimiento teórico de 6,5 g). La carga de la resina se determina a 0,49 mmol/g mediante medición UV del producto escindido Fmoc a 304 nm (carga máxima teórica: 0,51 mmol/g).
(b)
Síntesis de la resina H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo:
La resina H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo se obtiene mediante síntesis en fase sólida convencional mediante la siguiente secuencia de reacción:
(1)
escisión del grupo Fmoc de la resina de Fmoc-Glu(DMA)-difenilmetilo con piperidina en DMF,
(2)
condensación con Fmoc-NH-PEG12-PA-COOH usando HBTU en DMF y DIPEA,
(3)
escisión del grupo Fmoc de la resina Fmoc-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo con piperidina en DMF,
(4)
condensación con Fmoc-Glu-OtBu usando HBTU en DMF y DIPEA, y finalmente
(5)
escisión del grupo Fmoc de la resina Fmoc-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo con piperidina en DMF.
(c)
Síntesis de la resina [2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroil-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo:
La resina [2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroil-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo se obtiene mediante síntesis en fase sólida convencional haciendo reaccionar la resina H-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)difenilmetilo en DMF con ácido [2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroico, HATU y DIPEA.
(d)
Síntesis de ácido (2S,47S)-47-[2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroilamino-2-[3-[[2,3-bis(tetradeciloxi)propil]amino]-3-oxopropil]-4,44-dioxo-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazaoctatetracontan1,48-dioico:
Se lavan 4,5 g de resina [2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroil-Glu-OtBu-NH-PEG12-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo con 45 ml de diclorometano, se recoge por filtración y se resuspende de nuevo en 45 ml de diclorometano. A continuación se añaden 41,4 ml de ácido trifluoroacético seguido de 2,25 ml de triisopropilsilano. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, se filtra. La resina se lava tres veces con 45 ml de diclorometano cada vez. Los filtrados combinados se evaporan al vacío para obtener 5,75 g de un aceite de color ámbar. HPLC: 90,7 % del área, ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 1718,1, PM [M-H]-= 1718,0.
Ejemplo 8: síntesis del ácido (2S,47S)-47-pteroilamino-2-[3-[[2,3-bis(tetradeciloxi)propil]amino]-3-oxopropil]4,44-dioxo-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazaoctatetracontan-1,48-dioico
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Se agitan 4,6 g de (2S,47S)-47-[2-N-(dimetilamino)metilen]-10-formilpteroilamino-2-[3-[[2,3-bis(tetradeciloxi)propil]amino]-3-oxopropil]-4,44-dioxo-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazaoctatetracontan1,48-dioico con 460 ml de NaOH 1 N a 50 ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se Lleva a pH 12,5 mediante la adición de 59,2 g de NaOH ic 32 %. La solución marrón se trata con 0,46 g de carbono activado durante 15 min a 50 ºC, se filtra en caliente y se lleva a pH 1 mediante la adición de 3,2 g, HCl ic 37 %. El precipitado resultante se recoge mediante filtración, se lava con agua y se seca a temperatura ambiente al vacío para obtener 1,2 g de un sólido de color amarillo verdoso. HPLC: 89,9 % del área, ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 1635,0, PM [M-H] = 1634,1.
Ejemplo 9: síntesis de pentapéptido RGD lipídico ciclo[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-]:
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(a)
Síntesis de Fmoc-hGlu(OBzl)-OH:
El ácido homoglutámico (H-hGlu-OH) disponible en el mercado es una cadena lateral protegida como éster δ-bencílico según un protocolo publicado (Benoitin L., Can. J. Chem., 40, 570 (1962)) (rendimiento: 19,8 g, 26 % del teórico, TLC (CHCl3/MeOH/ácido acético al 32 % 5:3:1) Rf = 0,62). Sin purificación adicional H-hGlu(OBzl)-OH (19,7 g; 77,6 mmol) se disuelve en una mezcla de dioxano/agua (1:2, 300 ml) y se protege con Fmoc mediante la adición de NaHCO3 (12,8 g; 155 mmol) y Fmoc-OSu (26,2 g; 7,76 mmol). Tras su finalización, la mezcla de reacción se extrae tres veces con éter de diisopropilo. La capa acuosa que contiene el producto se ajusta a pH 2 con HCl y le producto se extrae con acetato de etilo tres veces. Las capas orgánicas combinadas se lavan con H2O hasta pH neutro. El acetato de etilo se evapora y se elimina en agua residual como un azeotropo con acetonitrilo. Por tanto, el producto se obtiene como una espuma seca: 34,9 g, 73,7 mmol, 95 % del teórico, ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 473,2; PM [M+H]+= 474,1.
(b)
Síntesis de H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH:
La síntesis del péptidos en fase sólida se realiza siguiendo la estrategia de Fmoc/tBu (Atherton E., y col., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 539 (1978)), se utiliza H-Gly-2-ClTrt (46 g, 34,5 mmol) como la resina base, el acoplamiento se realiza mediante Fmoc-Xaa-OH/DIC/HOBt (2 eq.:4 eq.:3 eq.) durante toda la noche, la eliminación de la protección Fmoc se consigue con piperidina al 20 % en DMF después de 5 y 10 min. Se emplean tres pasos de lavado alternativos con dimetilformamida/isopropanol después de cada paso de acoplamiento y desprotección, respectivamente. Los derivados de aminoácido utilizados en su orden cronológico son Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-homoGlu(OBzl)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH. Fmoc-SPPS produce 73,4 g de resina peptídica lineal (peso ganado por la resina 27,4 g, 87 % del teórico, teórico = 31,5 g).
El pentapéptido lineal de cadena lateral protegida se escinde de la resina (72,0 g) con una mezcla de 1,1,1,3,3,3hexafluoro-2-propanol/diclorometano 1:4 (700 ml) en tres repeticiones. Los solventes de los filtrados combinados se eliminan a presión reducida y el aceite resultante se agita en metil-t-butiléter (1 l) frío para obtener un precipitado blanquecino que se recoge mediante filtración, se lava tres veces con metil-t-butiléter y se seca al vacío: 23,6 g; 23,9 mmol, 70 % del teórico con respecto a la carga de la resina base, >40 % del área en HPLC, tiempo de retención de 14,1 min (condiciones de HPLC: columna = Halo® Peptide ES-C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 µm, gradiente: gradiente lineal de acetonitrilo del 25 % al 90 % de B en 30 min., tampón A = TFA al 0,1 % y acetonitrilo al 2 % en agua, tampón B = TFA al 0,1 % en acetonitrilo, longitud de onda = 210 nm), ESI-EM: monoisotópica PM calc.. = 986,5; PM [M+H]+ = 987,6.
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tampón HEPES, seguido de extrusión a través de una membrana de policarbonato de 200 nm 5 veces y una membrana de policarbonato de 100 nm 21 veces usando un extrusor Lipofast (Avestin, Inc., Ottawa, Canadá). Los liposomas obtenidos se almacenaron a 4 ºC hasta su uso.
Ejemplo 13: captación celular de liposomas recubiertos de RGD
El grado de captación celular de los liposomas recubiertos de RDG (obtenidos en el ejemplo 6) sobre células M21 se evalúa en función de la señal NBD-DOPE detectada mediante un citómetro de flujo Guava easyCyte 8HT y se ilustra en la figura 1 y en la tabla 1.
Tabla 1:
Células positivas para NBD (%)
Media DE
Blanco
0,19 0,36 0,4 0,33 0,29 0,65 0,37 0,15
0 % RGD
1,04 1,75 1,56 1,57 1,37 1,66 1,49 0,25
5 % RGD
29,99 28,41 23,77 24,82 23,68 20,99 25,28 3,33
Se observa un aumento de aproximadamente 16 veces en la captación celular de liposomas dirigidos a RGD (5 % de DMA-RGD) en comparación con los liposomas no dirigidos (0 % de DMA-RGD). El eje x representa la relación molar de DMA-RGD (%) en el liposoma. El eje y representa las células positivas para NBD (%). En la figura 1 se muestra que los restos RGD puede reconocer receptores diana (receptores de integrina αvβ3) expresados en células M21 (*p < 0,01).
Ejemplo 14: síntesis de ácido (5S,8S,45S,E)-11-(2-amino-2-oxoetil)-45-(3-((2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amino)3-oxopropil)-5,8-dimetil-3,6,9,12,15,43-hexaoxo-1-fenil-2,19,22,25,28,31,34,37,40-nonaoxa-4,7,10,11,16,44hexaazahexatetracont-13-en-46-oico
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(a)
Síntesis de la resina Fmoc-Glu(DMA)-difenilmetilo (véase el ejemplo 7; 1,1 eq.; 3,05 mmol).
(b)
Síntesis de resina RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo: la resina RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)difenilmetilo se obtiene mediante síntesis en fase sólida convencional mediante la siguiente secuencia de reacción:
(1)
escisión del grupo Fmoc de la resina de Fmoc-Glu(DMA)-difenilmetilo con piperidina en DMF,
(2)
condensación con Fmoc-NH-PEG8-PA usando PyBOP en DMF y DIPEA,
(3)
escisión del grupo Fmoc de la resina Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo con piperidina en DMF y finalmente
(4)
condensación con RR11a-OH usando PyBOP en DMF y DIPEA.
(c)
Síntesis del ácido (5S,8S,45S,E)-11-(2-amino-2-oxoetil)-45-(3-((2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amino)-3oxopropil)-5,8-dimetil-3,6,9,12,15,43-hexaoxo-1-fenil-2,19,22,25,28,31,34,37,40-nonaoxa-4,7,10,11,16,44hexaazahexatetracont-13-en-46-oico:
Se lavan 7,15 g de resina RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-difenilmetilo con 50 ml de diclorometano cada uno, se recogen por filtración, se resuspenden de nuevo en 50 ml de diclorometano y se secan al vacío. A continuación se añadieron 70 ml de una solución al 5 % de ácido trifluoroacético en diclorometano. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 3,5 horas y, a continuación, se filtra en 100 ml de éter diisopropílico. La resina se lava
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con diclorometano/éter diisopropílico (1/1). Los filtrados combinados se evaporan al vacío y se liofilizan a partir de t-BuOH para obtener 4,15 g (92 %) de un aceite de color ámbar. ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 1481,9; PM [M-H] = 1480,2.
Ejemplo 15: síntesis de ácido (5S,8S,45S,E)-11-(2-amino-2-oxoetil)-45-(3-((2,3-bis(tetradeciloxi)propil)amino)3-oxopropil)-5,8-dimetil-3,6,9,12,15,43-hexaoxo-1-fenil-2,19,22,25,28,31,34,37,40-nonaoxa-4,7,10,11,16,44hexaazahexatetracont-13-en-46-oico
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Se disuelven 7,15 g de RR11a-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-OH (producto del ejemplo 14) y 1,50 ml DIPEA en 70 ml de diclorometano. A continuación se añaden 4,32 g de MeO-PEG-NH2 y 1,67 g de PyBOP y la solución se agita durante toda la noche. La solución marrón se evapora y el residuo se purifica dos veces mediante cromatografía en columna sobre 300 g de gel de sílice (Merck 60; 0,040-0,063 mm) usando una mezcla de acetato de etilo, metanol y trietilamina en una relación 16:3,1 resp. 17:2:1. Las fracciones que contienen el producto se combinan y evaporan, y el residuo viscoso resultante se liofiliza a partir de t-BuOH para obtener 4,5 g (60 %) de un sólido amarillento. MALDI-EM: monoisotópica PM calc. = 3476,2; PM [M+Na]+ = 3500, Pn = 3363,2; PM = 3384,5; PDI = 1,01
Ejemplo 16: síntesis de ((2S,5S,14S,E)-8-(2-amino-2-oxoetil)-14-carbamoil-5-metil-3,6,9,12,17-pentaoxo-20(tetradeciloxi)-22-oxa-4,7,8,13,18-pentaazahexatriacont-10-en-2-il)carbamato de bencilo
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(a)
Síntesis de la resina Fmoc-Glu(DMA)-Sieber:
En un reactor SPPS de 100 ml se lavan 5,0 g de resina Sieber (3,1 mmol) dos vece con 50 ml de DMF, tratada con una solución al 20 % ic de piperidina en DMF durante 15 min y se lava tres veces alternativamente con 50 ml de DMF y con 50 ml de iPrOH. A continuación se añade una solución de 3,2 g de γ-2,3-bis(tetradeciloxi)propil-amida del ácido (2S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-glutámico (véase el ejemplo 2; 1,25 eq.; 3,8 mmol) y 2,48 g de PyBOP (1,5 eq.) en 50 ml de DMF y 1,62 ml de DIPEA (2,5 eq.) durante 2,5 h. La solución se filtra y la resina se lava tres veces alternativamente con 50 ml de DMF y con 50 ml de iPrOH.
(b)
Síntesis de la resina RR11Aa-Glu(DMA)-Sieber:
La resina RR11a-Glu(DMA)-Sieber se obtiene a través de síntesis en fase sólida convencional mediante la siguiente secuencia de reacción:
(1)
escisión del grupo Fmoc de la resina de Fmoc-Glu(DMA)-Sieber con piperidina en DMF (5,6 g de resina tras secado al vacío).
(2)
condensación con RR11a-NHS usando DIPEA en DMF.
(c) Escisión del producto de la resina:
Se tratan 2,6 g de resina RR11a-Glu(DMA)-Sieber con 20 ml de ácido trifluoroacético al 5 % ic en diclorometano durante 2 h. La suspensión se filtra en 100 ml de éter diisopropílico frío. El filtrado se evapora al vacío y se liofiliza a partir de t-BuOH para obtener 660 mg de un sólido amarillento. ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 1056,7; PM [M-H]-= 1056,0.
Ejemplo 17: síntesis de ((2S,5S,42S,E)-8-(2-amino-2-oxoetil)-42-carbamoil-5-metil-3,6,9,12,40,45-hexaoxo-48(tetradeciloxi)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-nonaoxa-4,7,8,13,41,46-hexaazatetrahexacont-10-en-2-il)carbamato de bencilo
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(a)
Síntesis de la resina Fmoc-Glu(DMA)-Sieber: (véase el ejemplo 16).
(b)
Síntesis de la resina NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber:
La resina NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber se obtiene a través de síntesis en fase sólida convencional mediante la siguiente secuencia de reacción:
(1)
escisión del grupo Fmoc de la resina de Fmoc-Glu(DMA)-Sieber con piperidina en DMF,
(2)
condensación con Fmoc-NH-PEG8-PA usando HBTU en DMF y DIPEA y finalmente
(3)
escisión del grupo Fmoc de la resina Fmoc-NH-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber con piperidina en DMF.
(c)
Síntesis de NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-amida:
El producto se escinde de la resina NH2-PEG8-PA-Glu(DMA)-Sieber usando ácido trifluoroacético en diclorometano. ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 1034,8; PM [M-H] = 1035,9.
(d)
Síntesis de ((2S,5S,42S,E)-8-(2-amino-2-oxoetil)-42-carbamoil-5-metil-3,6,9,12,40,45-hexaoxo-48(tetradeciloxi)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-nonaoxa-4,7,8,13,41,46-hexaazatetrahexacont-10-en-2-il)carbamato de bencilo:
Un matraz de 5 ml del fondo redondo equipado con un agitador mecánico se carga con 42 mg de NH2-PEG8PA-Glu(DMA)-amida (40,6 mmol) en 2 ml de diclorometano. A continuación se añaden 0,01 ml de trietilamina (95 mmol). Se forma una solución de color amarillo claro después de 2-3 minutos de agitación y se añaden 23 mg de RR11a-NHS (41 mmol) durante un periodo de 3 minutos. La solución se agita durante 1 hora y se evapora a presión reducida dando lugar a un producto sólido blanquecino. El producto muestra una única mancha en TLC. PM calc. = 1480,0; PM [M+H]+ = 1482 y PM [M+Na]+ = 1504,0.
(a)
Síntesis de la resina Fmoc-Glu(DMA)-Sieber: (véase el ejemplo 16).
(b)
Síntesis de la resina RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber:
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La resina RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber se obtiene mediante síntesis en fase sólida convencional mediante la siguiente secuencia de reacción:
(1)
escisión del grupo Fmoc de la resina de Fmoc-Glu(DMA)-Sieber con piperidina en DMF,
(2)
condensación con Fmoc-NH-PEG36-PA usando PyBOP en DMF y DIPEA,
(3)
escisión del grupo Fmoc de la resina Fmoc-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber con piperidina en DMF y finalmente
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(4) condensación con RR11a-NHS usando DIPEA en DMF.
(c) Síntesis de ((2S,5S,126S,E)-8-(2-amino-2-oxoetil)-126-carbamoil-5-metil-3,6,9,12,124,129-hexaoxo-132(tetradeciloxi)16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115 ,118,121,134-heptatriacontaoxa-4,7,8,13,125,130-hexaazaoctatetracontahect-10-en-2-il)carbamato de bencilo: Se tratan 7,0 g de resina RR11a-NH-PEG36-PA-Glu(DMA)-Sieber con 70 ml de una solución al 2 % ic de ácido trifluoroacético en diclorometano. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 3 horas y, a continuación, se filtra en 70 ml de éter diisopropílico frío. El filtrado se evapora al vacío y se liofiliza a partir de t-BuOH para obtener 1,25 g de un sólido de color blanco. ESI-EM: monoisotópica PM calc. = 2713,7; PM [M+Na+H]2+ = 1380,1.
Ejemplo 19: preparación de liposomas recubiertos de RR11a
Los liposomas recubiertos de RR11a (MS 15-4) y los liposomas control (MS 15-0) están compuestos a partir de las siguientes soluciones lipídicas:
lípido
concentración en cloroformo volumen MS 15-0 MS 15-4
DOPE
33 mM 35 µl 35 µl
DSPC
32 mM 35 µl 35 µl
Colesterol
33 mM 35 µl 35 µl
MPEG2000-DOPE
18 mM 15 µl 15 µl
RhB-DOPE
0,8 mM 3 µl 3 µl
RR-11a-8PEG-PA-Glu(DMA)-amida (véase el ejemplo 17)
17 mM 0 µl 20 µl
Es carga un vial de vidrio con tapón de rosca de 3 ml (tapón recubierto de Teflon) con los lípidos anteriores y se agita en un vórtex brevemente. El cloroformo se evapora con un flujo de argón hasta que se obtiene una película opaca de lípidos. A continuación el vial se coloca en un desecador al vacío durante 10 minutos. A la película seca se le añaden 1000 µl de DPBS 1x y el contenido se agita en un vórtex hasta que se obtiene una suspensión lechosa homogénea (3-4 min). Esto va seguido de sonación en baño en un equipo Branson modelo 1510 durante 5 minutos para obtener una suspensión turbia. A continuación esta suspensión se sonica con una sonda en un equipo Branson modelo 4C15 al 30 % de amplitud completa durante 30 segundos (evitando la formación de espuma) para obtener una suspensión de liposomas prácticamente translúcida. La suspensión se extruye a alta presión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm (Avanti N.º 610005). Finalmente, la suspensión se esteriliza mediante filtración a través de filtros de membrana Millex-GV de 0,22 µm y se almacena en un vial estéril a 4 ºC. El diámetro hidrodinámico promedio Z de MS-15-0 y 15-4 es de 101 y 99 µm (aparato Malvern ZetaSizer), respectivamente.
Ejemplo 20: direccionamiento a legumain de liposomas recubiertos RR11a
Los experimentos de direccionamiento de legumain se realizan según el siguiente protocolo empleando las formulaciones de liposomas del ejemplo 19:
Día 1 sembrar 3,12 x 10e4 de células 4T1/cm2 sobre un portaobjeto sin tratar
Día 2 añadir 100 µM de CoCl2; incubar durante 24 h
Día 3 añadir 100 µl de liposomas (10e12 NP/ml); incubar 2 h:
añadir 5 µg/ml de Hoechst 33342; incubar durante 20 min; montar y analizar con un microscopio de fluorescencia
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Ejemplo 22: preparación de liposomas recubiertos de RR11a sin extrusión
Los liposomas recubiertos de RR11a (MS-32-1 a MS-32-10) se forman a partir de las siguientes soluciones lipídicas:
Se carga un vial de vidrio con tapón de rosca de 3 ml (tapón recubierto de Teflon) con los lípidos anteriores y se agita en un vórtex brevemente. El cloroformo se evapora con un flujo de argón hasta que se obtiene una película 5 opaca de lípidos. A continuación el vial se coloca en un desecador al vacío durante 10 minutos. A la película seca se le añaden 1000 µl de DPBS 1X y el contenido se agita en un vórtex hasta que se obtiene una suspensión lechosa homogénea (10 min). Esto va seguido de sonación en baño en un equipo Branson modelo 1510 durante 5 minutos para obtener una suspensión turbia. A continuación esta suspensión se sonica con una sonda en un equipo Branson modelo 4C15 al 40 % de amplitud completa durante 30 segundos (evitando la formación de
10 espuma) para obtener una suspensión de liposomas prácticamente translúcida. Finalmente la suspensión se esteriliza mediante filtración a través de filtros de membrana Millex-GV de 0,22 µm y se conserva en un vial estéril a 4 ºC. El diámetro hidrodinámico promedio Z y el PDI se determinan usando un aparato Malvern ZetaSizer:
lípido
concentración encloroformo [mM] MS-32-1 MS-32-2 MS-32-3 MS-32-4 formulación MS-32-5MS-32-6 MS-32-7 MS-32-8 MS-32-9 MS-32-10
Volumen [µl]
DOPE
33 35
DSPC
33 35
Colesterol
33 35
RhB-DOPE
0,8 3
MPEG2000-DOPE
18 - - 15 15 - - 15 15 - -
RR-11a-Glu(DMA)amida (véase el ejemplo 16)
24 - - - - 15 - 15 - - -
RR-11a-8PEG-PAGlu(DMA)-amida (véase el ejemplo 17)
17 15 - 15 - - - - - - -
RR-11a-36PEG-PAGlu(DMA)-amida (véase el ejemplo 18)
9 - - - - - 15 - 15 35 70
RR-11a-8PEG-PAGlu(DMA)-NH-MPEG2k (véase el ejemplo 15)
9 - 15 - 15 - - - - - -
Diámetro hidrodinámico prom. Z
204,9 115,1 109,0 98,9 179,8 144,6 227,0 100,6 - -
PDI
0,5 0,2 0,2 0,19 0,25 0,28 0,47 0,18 - -

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