RU2409587C2 - 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид - Google Patents
1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид Download PDFInfo
- Publication number
- RU2409587C2 RU2409587C2 RU2009107569/04A RU2009107569A RU2409587C2 RU 2409587 C2 RU2409587 C2 RU 2409587C2 RU 2009107569/04 A RU2009107569/04 A RU 2009107569/04A RU 2009107569 A RU2009107569 A RU 2009107569A RU 2409587 C2 RU2409587 C2 RU 2409587C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hep
- transfection
- hexadecyl
- ornitile
- Prior art date
Links
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к липодипептиду, представляющему собой 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-N-(L-орнитил)-L-глутамат бисхлорид, который проявляет способность доставлять нуклеиновые кислоты в клетки и содержит в своей структуре стабильную флуоресцентную метку в виде пирена. Полученное соединение по сравнению с «Lipofectamine» проявило меньшую в 10 раз токсичность по отношению к клеткам HeLa и НЕР. Синтезированное соединение проявило более высокую эффективность трансфекции на опухолевых (HeLa, НЕР, COS-7) и неопухолевых линиях клеток (СНО, лейкоциты крысы), чем специально разработанные коммерческие агенты трансфекции для клеток НЕР и СНО. Благодаря наличию устойчивой флуоресцентной метки в структуре синтезированного соединения существенно расширяется область применения таких веществ и становится возможным изучение локализации меченых липосом и времени протекания процесса трансфекции.
Description
Изобретение относится к химии аминокислот и пептидов, принадлежащих классу алифатических диэфиров дипептидов.
Катионные амфифилы являются перспективной основой для разработки систем генного переноса в экспериментах in vitro. Они способны самостоятельно формировать в водной среде бислойные агрегаты, неиммуногенны и биодеградируемы.
Известен медиатор трансфекции - 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), в котором гидрофобные цепи присоединены к полярной компоненте биодеградируемой сложноэфирной связью:
DOTAP широко применяется для доставки в клетки генетического материала, в основном в смеси с нейтральными липидами. Недостатком указанного соединения является его достаточно высокая цитотоксичность и низкая эффективность.
Наиболее близким к заявленному техническим решением является 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропиламоний трифторацетат «Lipofectamine 2000»).
В настоящее время этот коммерческий препарат широко применяется для трансфекции in vitro, проявляет высокую эффективность в отношении линий клеток 293, СНО, COS-7, HeLa, Vero, PC 12 и многих других как в бессывороточной среде, так и в присутствии сыворотки. Разработан универсальный протокол применения «Lipofectamine», который может быть использован для решения различных задач: доставки в клетки олигонуклеотидов, малой интерферирующей РНК, а также плазмидных конструктов, кодирующих биосинтез специальных белков.
Однако «Lipofectamine» обладает заметной токсичностью и малоэффективен для некоторых типов клеток, например лейкоцитов. Кроме того, недостатком препарата является сложность его детектирования в клетке, что является необходимым условием для изучения механизма преодоления плазматических мембран и локализации внутри клетки. Это не позволяет определить, на каком этапе процесса трансфекции происходит снижение эффективности.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание катионного липодипептида, 1-гексадецил-5-(1-пиренбутинил)-N-(L-орнитил)-L-глутамат бисхлорида, содержащего стабильную флуоресцентную метку на основе пирена.
Пирен является одним из наиболее часто используемых в клеточной биологии флуорофоров при изучении транспорта или метаболизма липидов. Его отличительными характеристиками являются длительное время существования в возбужденном состоянии и гидрофобность, благодаря которой он не оказывает заметного влияния на конформацию липидных молекул [Р.Somerharju, Chemistry and Physics of Lipids, 2002, 116, 57-74]. Кроме того, отличительной особенностью медиатора трансфекции на основе дипептида является высокая трансфекционная активность на опухолевых, неопухолевых, а также труднотрансфицируемых линиях клеток, которая сопоставима или превышает эффективность коммерческих агентов, низкая токсичность и высокая аффинность по отношению к нуклеиновым кислотам.
Для достижения указанного технического результата разработана схема получения соединения, состоящая из следующих стадий: получение эфира L-глутаминовой кислоты - гидрофобного блока амфифила, защита и активация L-орнитина - гидрофильного блока, удаление защитных групп и введение флуоресцентной метки.
Реализация данного изобретения подтверждается примером.
К раствору N-оксисукцинимидного эфира Вос2-L-орнитина 0.1 г (0.175 ммоль) в 4 мл THF и при перемешивании порциями добавляли 0.072 г (0.193 ммоль) 1-гексадецил-5-третбутил-L-глутамата (2). Смесь выдерживали при комнатной температуре 5 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной ТСХ в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон 10:6:3. Выход 0.06 г (33.3%). Выход 0.107 г (52%), Rf 0.60 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон 10:6:3), [α]D 20+10° (с 0.1, С2Н5ОН).
Полученный защищенный дипептид 0.1 г (0.23 ммоль) растворяли в 3 мл хлороформа, добавляли 0.3 мл безводной СF3СООН. Раствор перемешивали при комнатной температуре 12 ч. Кислоту отгоняли в вакууме. Продукт выделяли тонкослойной хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-метанол-вода 7:3:1. Выход 0.098 г (99%), Rf 0.1 (Б), [α]D 20+25° (с 0.1, C2H5OH). Масс-спектр [M]+ 486.41.
Введение флуоресцентной метки осуществляли следующим способом.
К 0.055 г (0.092 ммоль) 5-гексадецил-N-(L-орнитил)-L-глутамата добавляли 26 мкл (0.37 ммоль) тионилхлорида и каплю ДМФА. Нагревали в течение 2 ч при 50°С, после чего отгоняли тионилхлорид и ДМФА в вакууме. Полученное аморфное вещество растворяли в 3 мл хлороформа, добавляли раствор 0.025 г (0.092 ммоль) 1-пиренбутанола в хлороформе, реакционную массу перемешивали в течение суток при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-метанол 9:1. Выход 0.03 г (38%), Rf 0.3 (хлороформ-метанол, 9:1).
1Н-ЯМР-спектр (СDСl3, δ, м. д.): 0.8 (3 Н, т, СН3), 1.22 (24 Н, с, 12 CH2), 1.6 (4 Н, м, 2βСН2), 1.75 (2 Н, м, CH2), 2.14 (2 Н, м, СH2), 2.6 (2 Н, м, CH2CH2), 2.7 (2 Н, т, CH2СОО), 3.9 (2 Н, м, αСН2), 4.2-4.5 (2 Н, м, 2СН), 7.6 (5Н, м, СН=), 8.7 (4 Н, с, NH3 +).
Масс-спектр [М]+ 742.81.
УФ (хлороформ, макс., нм): 270,280.8, 338, 353.
Спектр флуоресценции (λехс=355, макс., нм): 381, 399.
Полученный нами флуоресцентный липодипептид не уступает по своим биологическим параметрам коммерческому агенту «Lipofectamine». При этом эффективность изобретения может быть охарактеризована приведенными ниже данными.
В результате исследования тропности липосом к клеткам линии COS-7 с помощью флуоресцентной микроскопии было показано, что через 35 минут после инкубации наблюдается флуоресценция клеток по периметру, что свидетельствует о связывании липосом с клетками, а через 60-80 мин происходит накопление флуоресцентной метки в цитоплазме в виде дискретных образований и по периметру ядра.
На опухолевых клетках (НЕР) синтезированное соединение проявило эффективность трансфекции 83%, специальный реагент для данного типа клеток (HEP-G2 transfection reagent) в тех же условиях проявил меньшую активность (77%). В экспериментах с неопухолевыми клетками (СНО) эффективность трансфекции была сопоставима с контрольным образцом (69% и 71% соответственно). Полученный медиатор трансфекции проявил достаточно высокий уровень активности (49%) по отношению к лейкоцитам крысы - клеткам, которые относятся к плохо трансфицируемым линиям клеток и эффективность для них на большинстве коммерческих препаратов не превышает 35%. Синтезированное соединение проявило токсичность по отношению к клеткам HeLa и НЕР в 10 раз меньшую, по сравнению с аналогом «Lipofectamine».
Продемонстрированная высокая эффективность трансфекции для 1-гексадецил-5-(1-пиренбутинил)-N-(L-орнитил)-L-глутамат бисхлорида позволит использовать его в биохимических исследованиях, направленных на получение специальных белков для целей молекулярной биологии, цитологии и медицины. Благодаря наличию устойчивой флуоресцентной метки в структуре синтезированного соединения становится возможным изучение локализации меченых липосом и времени протекания процесса трансфекции.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009107569/04A RU2409587C2 (ru) | 2009-03-04 | 2009-03-04 | 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009107569/04A RU2409587C2 (ru) | 2009-03-04 | 2009-03-04 | 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009107569A RU2009107569A (ru) | 2010-09-10 |
RU2409587C2 true RU2409587C2 (ru) | 2011-01-20 |
Family
ID=42800108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009107569/04A RU2409587C2 (ru) | 2009-03-04 | 2009-03-04 | 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2409587C2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2533554C1 (ru) * | 2013-04-12 | 2014-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова" (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) | Липотетрапептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения |
RU2654210C2 (ru) * | 2012-03-16 | 2018-05-17 | Мерк Патент Гмбх | Нацеливающие аминокислотные липиды |
-
2009
- 2009-03-04 RU RU2009107569/04A patent/RU2409587C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Себякин Ю.Л. и др. рН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПОПЕПТИДЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ. БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2006, Т.32, №5, С.453-458. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2654210C2 (ru) * | 2012-03-16 | 2018-05-17 | Мерк Патент Гмбх | Нацеливающие аминокислотные липиды |
RU2533554C1 (ru) * | 2013-04-12 | 2014-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова" (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) | Липотетрапептиды на основе диэфиров l-глутаминовой кислоты и способ их получения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2009107569A (ru) | 2010-09-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111902397B (zh) | 改进了细胞内动力学的阳离子脂质 | |
US9090648B2 (en) | Cationic oligonucleotides, automated methods for preparing same and their uses | |
Kumar et al. | Single histidine residue in head-group region is sufficient to impart remarkable gene transfection properties to cationic lipids: evidence for histidine-mediated membrane fusion at acidic pH | |
Banerjee et al. | Novel series of non-glycerol-based cationic transfection lipids for use in liposomal gene delivery | |
KR102029654B1 (ko) | 표적 약물 전달체 및 siRNA 활성을 증가시키는 화합물 | |
JP5796113B2 (ja) | トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質および脂質集合体 | |
US20090221684A1 (en) | Molecules for Gene Delivery and Gene Therapy, and Methods of Use Thereof | |
FR2759382A1 (fr) | Nouveaux composes et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique | |
EP0736002B1 (en) | Compound capable of introducing at least one molecule into a cell | |
US10279050B2 (en) | Sucrose ester based cationic gene vector and preparation method thereof | |
US8338643B2 (en) | Reagent for introduction of protein or gene | |
US20050100527A1 (en) | Compounds for delivering substances into cells | |
RU2409587C2 (ru) | 1-гексадецил-5-(1-пиренбутил)-n-(l-орнитил)-l-глутамат бисхлорид | |
CN103204999A (zh) | 水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用 | |
US10092655B2 (en) | Cationic lipid for nucleic acid delivery | |
AU704189B2 (en) | Cationic transport reagents | |
Ghonaim et al. | N 1, N 12-Diacyl spermines: SAR studies on non-viral lipopolyamine vectors for plasmid DNA and siRNA formulation | |
EP2802556A1 (en) | Lipopolyamines of spermine type for construction of liposomal transfection systems | |
Kim et al. | Transfection property of a new cholesterol-based cationic lipid containing tri-2-hydroxyethylamine as gene delivery vehicle | |
US20230127080A1 (en) | Novel cationic lipid having cystine skeleton | |
Jain et al. | An Amphipathic trans‐Acting Phosphorothioate DNA Element Delivers Uncharged PNA and PMO Nucleic Acid Sequences in Mammalian Cells | |
KR100909786B1 (ko) | 올리고 펩티드를 수식한 신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 전달체 | |
US10087465B2 (en) | Trans-acting elements for intracellular delivery of nucleic acid sequences | |
US20030109699A1 (en) | Amphiphilic quinolylpolyamines as transfer agents for biologically active macromolecules | |
RU2394834C1 (ru) | Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150305 |