ES2210761T3 - Composicion y procedimiento para mejorar el transporte a traves de las membranas biologicas. - Google Patents
Composicion y procedimiento para mejorar el transporte a traves de las membranas biologicas.Info
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Abstract
La invención se refiere a procedimientos y composiciones para transportar fármacos y macromoléculas a través de membranas biológicas. En una realización, la invención incluye un procedimiento para mejorar el transporte de compuestos seleccionados a través de membranas biológicas, cuya membrana biológica está en contacto con un conjugado que contiene un agente biológicamente activo y que se une al polímero de transporte de forma covalente. En una realización el polímero consta de entre 6 a 25 subunidades, con al memos el 50% de las cuales contienen una mitad cadena lateral de guanidino o amidino. El polímero es eficaz para impartir al agente unido una velocidad de transporte a través de la transmembrana biológica que es mayor que la velocidad de transporte a través de la membrana del agente en forma no conjugada.
Description
Composición y procedimiento para mejorar el
transporte a través de las membranas biológicas.
La presente invención se refiere a procedimientos
y a composiciones que son efectivas para mejorar el transporte de
agentes biológicamente activos, tales como compuestos orgánicos,
polipéptidos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, e iones metálicos,
a través de membranas biológicas.
Barsoum et al., Pub. PCT nº WO
94/04686 (1994).
Bonifaci, N., et al., Aids
9:995-1000.
Brugidou, J., et al. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 214(2):685-93
(1995).
Derossi, D., et al., J. Biol.
Chem. 269:10444-50 (1996).
Egholm, M.O., et al., Nature
365:566-568 (1993).
Eberle and Nuninger, J. Org.
Chem. 57:2689 (1992).
Fawell, S., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91:664-668 (1994).
Fletcher, M.D., et al., Chem.
Rev. 98:763 (1998).
Frankel et al., Pub. PCT nº WO
91/09958 (1991).
Gennaro, A.R., Ed., REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA (1990).
Giannis, A., et al., Advances
Drug Res. 29:1 (1997).
Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 32:543 (1993).
Lam, K.S., et al., Chem.
Rev. 97:411 (1997).
Langston, S., DDT 2:255
(1997).
Rivas, A., et al., J.
Immunol. 154:4423-33 (1995).
Ruegg, C., et al., J.
Immunol, 154:4434-43 (1995).
Ryser, H.J.P., Pub. PCT nº WO 79/00515
(1979).
Simon et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 89:9367 (1992).
Suffness, M., Ed., Taxol: Science and
Applications, CRC Press, New York, NY, pp.
237-239 (1995).
Shaheen et al., J. Virology
70:3392 (1996).
Tavladoraki et al., Nature
366:469 (1993).
Thompson, L.A., y Ellman, J.A., Chem.
Rev. 96:555 (1996).
Wong, S.S., Ed., Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc.
Boca Raton, FL (1991).
Zuckermann, R.N.,
Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80
(1993).
Las membranas plasmáticas de las células
presentan una barrera al paso de muchos agentes terapéuticos
útiles. En general, un fármaco debe ser totalmente soluble tanto en
los compartimientos acuosos del cuerpo como en las capas de lípidos
a través de las cuales debe pasar, a fin de penetrar las sellas. Las
moléculas altamente cargadas experimentan en particular dificultad
para pasar a través de las membranas. Muchas macromoléculas
terapéuticas, tales como péptidos y oligonucleótidos, también son
particularmente intratables para el transporte membránico. De este
modo, mientras que la biotecnología ha hecho posible un gran número
de productos terapéuticos potencialmente valiosos, las
consideraciones sobre la biodisponibilidad a menudo impiden su
utilidad médica. Por lo tanto, existe una necesidad de medios
fiables para transportar fármacos, y particularmente
macromoléculas, en las células.
Hasta ahora, se ha propuesto un gran número de
moléculas transportadoras para acompañar a moléculas a través de
las membranas biológicas. Ryser y col. (1979) enseña el uso de
polímeros de lisina de alto peso molecular para aumentar el
transporte de diversas moléculas a través de membranas celulares,
siendo precedidos los pesos moleculares muy altos. Aunque los
autores consideran a los polímeros de otros restos cargados
positivamente, tales como ornitina y arginina, no se ha mostrado la
operatividad de tales polímeros.
Frankel y col. (1991) da a conocer que la
conjugación de moléculas seleccionadas a la proteína tat de VIH
puede aumentar la captación celular de esas moléculas. Sin embargo,
el uso de la proteína tat tiene ciertas desventajas, incluyendo
propiedades desfavorables de agregación e insolubilidad.
Barsoum y col. (1994) y Fawell y col. (1994)
proponen el uso de fragmentos más cortos de la proteína tat que
contiene la región básica tat (restos 49-57 que
tienen la secuencia RKKRRQRRR). Barsoum y col. señalaron que los
polímeros de poliarginina moderadamente largos (Pm
5000-15000 daltons) no permitieron el transporte de
\beta-galactosidasa a través de las membranas
celulares (por ejemplo, Barsoum en la página 3), contrariamente a
la sugerencia de Ryser y col. (más arriba).
Otros estudios han demostrado que un conjugado de
colesterol con un péptido de 16 aminoácidos derivado del
homeodominio de Antennapedia es internado rápidamente por
neuronas cultivadas (Brugidou y col., 1995). Sin embargo, versiones
ligeramente más cortas de este péptido (15 residuos) no son
recogidas efectivamente por las células (Derossi y col., 1996).
La solicitud de patente canadiense nº 2094658
describe péptidos portadores que tienen
D-aminoácidos positivamente cargados, por ejemplo
péptidos portadores que constan de 8 ó 9 residuos de
D-arginina, para el suministro intracelular de
agentes bioquímicos.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de que la conjugación de ciertos polímeros
compuestos de subunidades contiguas, altamente básicas,
particularmente subunidades que contienen restos guadinilo o
amidinilo, a pequeñas moléculas o macromoléculas es efectiva para
mejorar significativamente el transporte de la molécula aneja a
través de las membranas biológicas. Además, el transporte
transcurre a una velocidad significativamente mayor que la
velocidad de transporte proporcionada por un péptido tat de VIH
básico que consta de los residuos 49-57.
La presente invención incluye, en un aspecto, un
procedimiento para mejorar el transporte de un agente
biológicamente activo a través de una membrana biológica. En el
procedimiento, se pone en contacto in vitro una membrana
biológica con un conjugado que contiene un agente biológicamente
activo que está unido covalentemente a un portador polímero de la
invención. La puesta en contacto des efectiva para aumentar el
suministro del conjugado a través de la membrana biológica, en
comparación con el suministro del agente biológicamente activo en
forma no conjugada.
En un aspecto, la invención proporciona un
conjugado que comprende un agente biológicamente activo unido
covalentemente a un portador polimérico que tiene una cadena
principal no peptídica, en el que el portador polimérico (a) consta
de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están
sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo
guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de tales
restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es efectivo
para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es
transportada a través de una membrana biológica con relación a la
cantidad del agente que se puede transportar a través de la
membrana biológica en forma no conjugada.
En una realización, el polímero consta de 6 a 25
subunidades, al menos el 50% de las cuales contiene un resto de
cadena lateral de guanidino o amidino, en el que el polímero consta
de al menos 6, y más preferiblemente al menos 7, restos de cadena
lateral de guanidino o amidino. En otra realización, el polímero
consta de 6 a 20, 7 a 20, o 7 a 15 subunidades. Más preferiblemente,
al menos el 70% de las subunidades en el polímero contiene restos
de cadena lateral de guanidino o amidino, y más preferiblemente aún
90%. Preferiblemente, ningún resto de cadena lateral de guanidino o
amidino está separado de ningún otro resto por más de una subunidad
no guadinídica o no amidínica. En una realización más específica,
el polímero contiene al menos 6 subunidades contiguas conteniendo
cada una un grupo guanidino o amidino, y preferiblemente al menos 6
ó 7 restos de cadena lateral de guanidino contiguos.
En otra realización, el polímero de transporte
contiene de 6 a 25 subunidades contiguas, de 7 a 25, de 6 a 20, o
preferiblemente de 7 a 20 subunidades contiguas, cada una de las
cuales contiene un resto de cadena lateral de guanidino o amidino,
y con la condición opcional de que una de las subunidades contiguas
puede contener un resto no arginínico al que está unido el agente.
En una realización, cada unidad contigua contiene un resto
guanidino, según se ejemplifica por un polímero que contiene al
menos seis restos de arginina contiguos.
Preferiblemente, cada polímero transportador es
lineal. En una realización preferida, el agente se une a un extremo
terminal del polímero transportador.
En otra realización específica, el conjugado
contiene un único polímero transportador.
El procedimiento se puede usar para mejorar el
transporte de agentes terapéuticos seleccionados a través de
cualquiera de un número de membranas biológicas, incluyendo, pero
sin limitarse a, membranas de células eucariotas, membranas de
células procariotas, y paredes células. Las membranas ejemplares de
células procariotas incluyen membranas bacterianas. Las membranas
ejemplares de células eucariotas de interés incluyen, pero no se
limitan a, membranas de célula dendríticas, células epiteliales,
células endoteliales, queratinocitos, células de los músculos,
células fúngicas, células bacterianas, células de plantas, y
similares.
Según una realización preferida de la invención,
el polímero transportador de la invención tiene una afinidad
aparente (Km) que es al menos 10 veces mayor, y preferiblemente al
menos 100 veces mayor, que la afinidad medida para el péptido tat
(49-57) mediante el procedimiento del ejemplo 6
cuando se mide a temperatura ambiente (23ºC) o 37ºC.
Los agentes biológicamente activos (que engloban
a agentes terapéuticos) incluyen, pero no se limitan a, iones
metálicos, que se suministran típicamente como quelatos metálicos;
pequeñas moléculas orgánicas tales como moléculas contra el cáncer
(por ejemplo taxano) y moléculas antimicrobianas (por ejemplo,
frente a bacterias u hongos tales como levadura); y macromoléculas
tales como ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y análogos de los
mismos. En una realización preferida, el agente es un ácido
nucleico o análogo de ácido nucleico, tal como una ribozima que
contiene opcionalmente una o más unidades
2-desoxinucleotídicas para una mayor estabilidad.
Como alternativa, el agente es un ácido nucleico peptídico (PNA).
En otra realización preferida, el agente es un polipéptido, tal
como un antígeno proteínico, y la membrana biológica es una
membrana celular de una célula que presenta el antígeno (APC). En
otra realización, el agente se selecciona para promover o producir
una respuesta inmune frente a un antígeno tumoral seleccionado. En
otra realización preferida, el agente es un taxano o un compuesto
anticancerígeno taxoide. en otra realización, el agente es un
agente no polipeptídico, preferiblemente un agente terapéutico no
polipeptídico. En una realización más general, el agente tiene
preferiblemente un peso molecular menor que 10 kDa.
El agente puede estar enlazado al polímero
mediante un resto enlace, que puede dar flexibilidad conformacional
dentro del conjugado y puede facilitar las interacciones entre el
agente y su objetivo biológico. En una realización, el resto enlace
es un enlace rompible, por ejemplo, que contiene un grupo enlace
que se puede romper mediante una enzima o mediante una ruptura a
través de disolventes, tal como un grupo éster, amida, o disulfuro.
En otra realización, el grupo enlace rompible contiene un grupo
fotorrompible.
En una realización más específica, el grupo
enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante
del agente biológicamente activo, y un segundo grupo rompible que
está próximo al agente biológicamente activo, de forma que la
ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de grupo
enlace/agente que contiene un resto nucleófilo capaz de reaccionar
intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando
de ese modo el agente del grupo enlace y del polímero.
En otra realización, la invención se puede usar
para detectar sistemáticamente una pluralidad de conjugados en
busca de una actividad biológica seleccionada, en el que los
conjugado están formados de una pluralidad de agentes candidatos.
Los conjugado se ponen en contacto con una célula que muestra una
señal detectable con la captación del conjugado en la célula, de
forma que la magnitud de la señal indica la eficacia del conjugado
con respecto a la actividad biológica seleccionadas. Este
procedimiento es particularmente útil para ensayar las actividades
de los agente que por sí mismos son incapaces o muy poco capaces de
penetrar en las células para manifestar actividad biológica. En una
realización, los agentes cantidades se seleccionan de una
biblioteca combinatoria.
La invención también incluye una biblioteca de
conjugados que es útil para la detección sistemática en el
procedimiento anterior.
En otro aspecto, la invención incluye una
composición farmacéutica para suministrar un agente biológicamente
activo a través de una membrana biológica. La composición comprende
un conjugado que contiene un agente biológicamente activo enlazado
covalentemente a al menos un polímero de transporte como se
describe anteriormente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
El polímero es efectivo para impartir al agente una velocidad de
transporte transmembránico que es mayor que la velocidad de
transporte transmembránico del agente en forma no conjugada. La
composición se puede envasar adicionalmente con instrucciones para
su uso.
En otro aspecto, la invención incluye un uso como
se define en la reivindicación 30.
Estos y otros objetos y características de la
invención serán manifiestos de forma más completa cuando se lea la
siguiente descripción detallada de la invención conjuntamente con
los dibujos que se acompañan.
Las figs. 1A y 1B son representaciones gráficas
de la captación celular de ciertos conjugados de polipéptido con
fluoresceína que contienen el péptido básico tat
(49-57, SEQ ID NO:1), poli-Lys (K9,
SEQ ID NO:2), y poli-Arg (R4-R9 y
r4-r9, SEQ ID NO:3-9 y
12-17, respectivamente), como una función de la
concentración del péptido; la fig. 1C es un histograma de los
niveles de captación de los conjugados medidos para conjugados a
una concentración de 12,5 \muM (Ejemplos
2-3);
las figs. 2A-2F muestran imágenes
generadas por ordenador de microfotografías confocales (Ejemplo 4)
que muestran la fluorescencia emitida (2A-2C) y la
luz transmitida (2D-2F) procedente de células Jurkat
tras la incubación a 37ºC durante 10 minutos con 6,25 \muM de tat
(49-57) conjugada con fluoresceína (paneles A y D),
un 7-mer de
poli-L-arginina (R7) marcada
isotópicamente con fluoresceína (paneles B y E), o un
7-mer de
poli-D-arginina (r7) marcada
isotópicamente con fluoresceína (paneles C y F);
la fig. 3 muestra la captación celular de ciertos
conjugados de poli-Arg con fluoresceína (r9, R9,
R15, R20 y R25, SEQ ID NO: 17 y 8-11,
respectivamente) como una función de la concentración del conjugado
(Ejemplo 5);
la fig. 4 muestra un histograma de la captación
celular de tat (49-57) conjugada con fluoresceína,
y conjugados de poli-Arg con fluoresceína (R9, R8 y
R7, respectivamente) en ausencia (las cuatro barras a la izquierda)
y en presencia (cuatro barras a la derecha) de azida sódica al 0,5%
(Ejemplo 7);
las figs. 5A-5C muestran
representaciones gráficas de los niveles de captación de los
conjugados poliméricos seleccionados (K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8, y
r9) por células bacterianas como una función de la concentración del
conjugado; la fig. 5A compara los niveles de captación observados
para los conjugados R9 y r9 como una función de la concentración
del conjugado cuando se incuba con células HB 101 de E.
coli; la fig. 5B muestra los niveles de captación observados
para los conjugados K9 y r4 a r9 cuando se incuba células HB 101 de
E. coli; la fig. 5C compara los niveles de captación de los
conjugados de r9 y K9 cuando se incuba con células de Strep.
bovis;
las figs. 6A-6E muestran
conjugados ejemplares de la invención que contienen restos enlaces
rompibles; las figs. 6F y 6G muestran estructuras químicas y la
numeración convencional de los átomos constituyentes de la cadena
principal para paclitaxel y "TAXOTERE"; la fig. 6H muestra una
estructura química general y la numeración de los átomos del anillo
para compuestos taxoides; y
la fig. 7 muestra la inhibición de la secreción
de gamma-interferón (\gamma-IFN)
por células T de múridos como una función de la concentración de un
conjugado de r7 con PNA sentido (SEQ ID NO:18), conjugado de r7 con
PNA antisentido (SEQ ID NO:19), y PNA antisentido no conjugado (SEQ
ID NO:20), en los que las secuencias de PNA se basan en una
secuencia procedente del gen para
gamma-interferón.
La expresión "membrana biológica", como se
usa aquí en este documento, se refiere a una barrera que contiene
lípidos, que separa a las células o grupos de células del espacio
extracelular. Las membranas biológicas incluyen, pero no se limitan
a, membranas plasmáticas, paredes celulares, membranas de orgánulos
intracelulares, tales como la membrana mitocondrial, membranas
nucleares, y similares.
La expresión "concentración transmembránica"
se refiere a la concentración de un compuesto presente en el lado
de una membrana que es opuesto o "trans" al lado de la
membrana al que se ha añadido una composición particular. Por
ejemplo, cuando se añade un compuesto al fluido extracelular de una
célula, la cantidad del compuesto medida subsiguientemente en el
interior de la célula es la concentración transmembránica del
compuesto.
"Agente biológicamente activo" o
"sustancia biológicamente activa" se refiere a una sustancia
química, tal como una pequeña molécula, macromolécula, o ión
metálico, que provoca un cambio observable en la estructura, función
o composición de la célula con la captación por la célula. Los
cambios observables incluyen el aumento o disminución de la
expresión de uno o más ARNm, el aumento o disminución de la
expresión de una o más proteínas, la fosforilación de una proteína
o de otro componente celular, la inhibición o activación de una
enzima, la inhibición o activación de la unión entre miembros de un
par de unión, un aumento o disminución de la velocidad de síntesis
de un metabolito, un aumento o disminución de la proliferación
celular, y similar.
El término "macromolécula", como se usa en
este documento, se refiere a moléculas grandes (peso molecular
mayor que 1000 daltons), ejemplificadas pero no limitadas a
péptidos, proteínas, oligonucleótidos y polinucleótidos de origen
biológico o sintético.
"Pequeña molécula orgánica" se refiere a un
agente que contiene carbono y que tiene un peso molecular (Pm)
menor o igual a 1000 daltons.
Las expresiones "agente terapéutico" ,
"composición terapéutica", y "sustancia terapéutica", se
refieren, sin limitación, a cualquier composición que se puede usar
para el beneficio de una especie mamífera. Tales agentes pueden
tener la forma de iones, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos,
proteínas o polipéptidos, oligonucleótidos y oligosacáridos, por
ejemplo.
Las expresiones "agente no polipeptídico" y
"agente terapéutico no polipeptídico" se refieren a la porción
de un conjugado polimérico transportador que no incluye el polímero
potenciador del transporte, y que es un agente biológicamente
activo distinto de un polipéptido. Un ejemplo de un agente no
polipeptídico es un oligonucleótido antisentido, que se puede
conjugar con un péptido de poli-arginina para
formar un conjugado para el suministro mejorado a través de las
membranas biológicas.
El término "polímero" se refiere a una
cadena lineal de dos o más subunidades idénticas o no unidas por
enlaces covalentes. Un péptido es un ejemplo de un polímero que
puede estar compuesto de subunidades de aminoácidos idénticas o no
que están unidas por enlaces peptídicos.
El término "péptido", como se usa en este
documento, se refiere a un compuesto formado por una única cadena
de D-o L-aminoácidos, o una mezcla
de D- y L-aminoácidos, unidos por enlaces
peptídicos. Generalmente, los péptidos contienen al menos dos
restos aminoácidos, y tienen una longitud menor que alrededor de 50
aminoácidos.
El término "proteína", como se usa aquí, se
refiere a un compuesto que está compuesto de aminoácidos dispuestos
linealmente unidos por enlaces peptídicos pero que, contrariamente
a los péptidos, tienen una conformación bien definida. Las
proteínas, en oposición a los péptidos, constan generalmente de
cadenas de 50 ó más aminoácidos.
"Polipéptido", como se usa en este
documento, se refiere a un polímero de al menos dos restos
aminoácidos, y que contiene uno o más enlaces peptídicos.
"Polipéptido" engloba a péptidos y a proteínas,
independientemente de si el polipéptido tiene una conformación bien
definida.
Los términos "guanidilo",
"guanidinilo", y "guanidino", se usan de forma
intercambiable para referirse a un resto que tiene la fórmula
-HN=C(NH_{2})NH (fórmula no protonada). Como
ejemplo, la arginina contiene un resto guanidilo (guanidino), y
también se denomina como ácido
2-amino-5-guanidinovalérico
o ácido
\alpha-amino-\delta-guanidinovalérico.
"Guanidinio" se refiere a la forma ácida conjugada
positivamente cargada.
"Amidinilo" o "amidino" se refiere a un
resto que tiene la fórmula -C(=NH)(NH_{2}). "Amidinio" se
refiere a la forma ácida conjugada positivamente cargada.
El término "poli-arginina" o
"poli-Arg" se refiere a una secuencia
polimérica compuesta de residuos contiguos de arginina:
poli-L-arginina se refiere a todas
las L-argininas:
poli-D-arginina se refiere a todas
las D-argininas. La
poli-L-arginina también se abrevia
mediante una letra mayúscula "R" seguido del número de
L-argininas en el péptido (por ejemplo, R8
representa un 8-mer de residuos contiguos de
L-arginina); la
poli-D-arginina se abrevia mediante
una letra en minúsculas "r" seguido del número de
D-argininas en el péptido (r8 representa un
8-mer de residuos contiguos de
D-arginina).
Los restos de aminoácidos se nombran aquí por sus
nombres completos o mediante abreviaturas estándares de una sola
letra o de tres letras: A, Ala, alanina; C, Cys, cisteína; D, Asp,
ácido aspártico; E, Glu, ácido glutámico; F, Phe, fenilalanina; G,
Gly, glicina; H, His, histidina; I, Ile, isoleucina; K, Lys,
lisina; L, Leu, leucina; M, Met, metionina; N, Asn, asparagina; P,
Pro, prolina; Q, Gln, glutamina; R, Arg, arginina; S, Ser, serina;
T, Thr, treonina; V, Val, valina; W, Trp, triptófano; X, Hyp,
hidroxiprolina; Y, Tyr, tirosina.
En una realización, los polímeros transportadores
según la presente invención contienen polímeros de cadena corta, de
6 hasta 25 subunidades, según se describe anteriormente. El
conjugado es efectivo para mejorar la velocidad de transporte del
conjugado a través de la membrana biológica con relación a la
velocidad de transporte del agente biológico no conjugado solo.
Aunque las composiciones poliméricas ejemplificadas con péptidos,
los polímeros de la invención contienen cadenas principales no
peptídicas, como se plantea posteriormente más abajo.
En un aspecto importante de la invención, los
conjugados de la invención son particularmente útiles para
transportar agentes biológicamente activos a través de las
membranas celulares o de los orgánulos, cuando los agentes son del
tipo que requieren el transporte transmembránico para mostrar sus
efectos biológicos, y que no muestran sus efectos biológicos
principalmente uniéndose a un receptor de la superficie, es decir
de forma que no ocurre la entrada del agente. Además, los
conjugados son particularmente útiles para transportar agentes
biológicamente activos del tipo que requiere el transporte
transmembránico para mostrar sus efectos biológicos, y que por sí
mismos (sin conjugación a un polímero transportador o alguna otra
modificación) son incapaces o sólo son muy poco capaces de penetrar
en las células para manifestar actividad biológica.
Como un asunto general, el polímero transportador
usado en el conjugado incluye preferiblemente una cadena principal
lineal de subunidades. La cadena principal comprenderá
habitualmente heteroátomos seleccionados de carbono, nitrógeno,
oxígeno, azufre, y fósforo, constando habitualmente la mayoría de
los átomos de la cadena principal de carbonos. Cada subunidad
contiene un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino
o amidino terminal.
Aunque el espaciamiento entre los restos de
cadena lateral adyacentes será consistente habitualmente de una
subunidad a otra, los polímeros usados en la invención también
pueden incluir un espaciamiento variable entre restos de cadena
lateral a lo largo de la cadena principal.
Los restos de cadena lateral se extienden
alejándose de la cadena principal de forma que el átomo de carbono
de guanidino o amidino central (al que están unidos los grupos
NH_{2}) está enlazado a la cadena principal mediante un grupo
enlace de cadena lateral que contiene preferiblemente al menos dos
átomos de carbono en la cadena enlace, más preferiblemente de 2 a 5
átomos en la cadena, de forma que el átomo de carbono central es el
tercer a sexto átomo de la cadena alejado de la cadena principal.
Los átomos de la cadena se proporcionan preferiblemente como átomos
de carbono metilénicos, aunque también pueden estar presentes uno o
más átomos distintos tales como oxígeno, azufre o nitrógeno.
Preferiblemente, el grupo enlace de la cadena lateral entre la
cadena principal y el átomo de carbono central del grupo guanidino
o amidino tiene una longitud de 4 átomos en la cadena, según se
ejemplifica mediante una cadena lateral de arginina.
La secuencia del polímero transportador de la
invención puede estar planteada por una o más subunidades no
guanidínicas/no amidínicas, o un grupo enlace tal como un grupo
ácido aminocaproico, que no acepta significativamente a la
velocidad de transporte membránico del conjugado correspondiente que
contiene el polímero, tal como, por ejemplo, glicina, alanina, y
cisteína. También se puede tapar con un grupo bloqueante, tal como
con un grupo acetilo o bencilo, cualquier grupo amino terminal
libre, para evitar la omnipresencia in vivo.
El agente a transportar se puede enlazar al
polímero transportador según un número de realizaciones. En una
realización preferida, el agente se enlaza a un único polímero
transportador, bien mediante un enlace a un extremo terminal del
polímero transportador o bien a una subunidad interna dentro del
polímero vía un grupo enlace adecuado.
En una segunda realización, el agente se une a
más de un polímero, de la misma manera que antes. Esta realización
es en cierto modo menos preferida, puesto que puede conducir a la
reticulación de células adyacentes.
En una tercera realización, el conjugado contiene
dos restos del agente unidos a cada extremo terminal del polímero.
Para esta realización, se prefiere que el agente tenga un pero
molecular menor que 10 kDa.
Con respecto a las realizaciones primera y
tercera recientemente mencionadas, el agente generalmente no se une
a ninguna de las cadenas laterales guanidínicas o amidínicas de
forma que están libres para interaccionar con la membrana
objetivo.
Los conjugados de la invención se pueden preparar
mediante esquemas sintéticos directos. Además, los productos
conjugados son habitualmente homogéneos de forma sustancial en
longitud y composición, de modo que proporcionan una consistencia y
reproducibilidad en sus efectos mayor que las mezclas
heterogéneas.
Según un aspecto importante de la presente
invención, se ha encontrado que la unión de un único polímero
transportador a cualquiera de una variedad de tipos de agentes
biológicamente activos es suficiente para mejorar sustancialmente
la velocidad de captación de un agente a través de membranas
biológicas, incluso sin que se requiera la presencia de un gran
resto hidrófobo en el conjugado. De hecho, la unión de un resto
hidrófobo grande puede impedir o prevenir significativamente el
transporte a través de la membrana debido a la adhesión del resto
hidrófobo a la bicapa lipídica. En consecuencia, la presente
invención incluye conjugados que no contienen grandes restos
hidrófobos, tales como moléculas de lípidos y de ácidos grasos. En
otra realización, el procedimiento se usa para tratar un estado del
sistema nervioso no central (SN no Central) en un individuo que no
requiere el suministro a través de la membrana
hematoencefálica.
En una realización, el polímero transportador
está compuesto de restos de D o L aminoácidos. El uso de restos de
L-aminoácidos de origen natural en los polímeros
transportadores tiene la ventaja de que los productos de la
descomposición deben ser relativamente no tóxicos para la célula o
para el organismo.
Más generalmente, se prefiere que cada subunidad
del polímero contenga un resto de cadena lateral fuertemente básico
que (i) tenga un pKa mayor que 11, más preferiblemente 12,5 o
superior, y (ii) contenga, en estado protonado, al menos dos grupos
amino (NH_{2}) geminales que compartan una carga positiva
estabilizada por resonancia, lo que da al resto un carácter
bidentado.
También se pueden usar
D-aminoácidos en los polímeros transportadores. Las
composiciones que contienen exclusivamente
D-aminoácidos tienen la ventaja de una reducción de
la degradación enzimática. Sin embargo, pueden también permanecer
largamente intactas dentro de la célula objetivo. Tal estabilidad
generalmente no es problemática si el agente es biológicamente
activo cuando el polímero está aún unido. Para agentes que son
inactivos en forma conjugada, se debe incluir en el conjugado un
grupo enlace que sea rompible en el sitio de acción (por ejemplo,
mediante ruptura enzimática o por disolventes dentro de la célula),
para promover la liberación del agente en las células o
orgánulos.
\newpage
También se pueden seleccionar subunidades
distintas de aminoácidos para uso en la formación de los polímeros
transportadores. Tales subunidades pueden incluir, pero no se
limitan a, hidroxi-aminoácidos,
N-metil-aminoácidos,
aminoaldehídos, y similares, que dan como resultado polímeros con
menor número de enlaces peptídicos. Se pueden usar otros tipos de
subunidades, dependiendo de la naturaleza de la cadena principal
seleccionada, según se plantea en la siguiente sección.
Se puede usar una gran variedad de tipos de
cadena principal para ordenar y colocar los restos guanidínicos y/o
amidínicos de cadena lateral, tales como restos de cadena principal
alquílica unidos por grupos tioéteres o sulfonilos, ésteres de
hidroxiácidos (equivalentes a sustituir enlaces de amidas por
enlaces de éster), sustituyendo el carbono de la posición alfa por
nitrógeno para formar un análogo aza, restos de cadena principal
alquílica unidos por grupos carbamato, polietileniminas (PEI), y
aminoaldehídos, lo que da como resultado polímeros compuestos de
amidas secundarias.
Una lista más detallada de cadenas principales
incluye amida N-sustituida (CONR sustituye a los
enlaces CONH), ésteres (CO_{2}), cetometileno (COCH_{2})
reducido o metilenamino (CH_{2}NH), tioamida (SCN), fosfinato
(PO_{2}RCH_{2}), fosfonamidato y éster de fosfonamidado
(PO_{2}RNH), retropéptido (NCO), trans-alqueno
(CR=CH), fluoroalqueno (CF=CH), dimetileno (CH_{2},CH_{2}),
tioéter (CH_{2}S), hidroxietileno (CH(OH)CH_{2}),
metilenoxi (CH_{2}O), tetrazol (CN_{4}), retrotioamida (NHCS),
retrorreducido (NHCH_{2}), sulfonamido (SO_{2}NH),
metilensulfonamido (CHRSO_{2}NH), retrosulfonamida (NHSO_{2}),
y peptoides (glicinas N-sustituidas), y cadenas
principales con subunidades de malonato y/o diaminoalquílicas
geminales, por ejemplo, según lo estudiado por Fletcher y col.
(1998), y detallados mediante las referencias citadas allí. También
se pueden usar cadenas principales de peptoides (glicinas
N-sustituidas) (por ejemplo, Kessler, 1993;
Zuckermann y col., 1992; y Simon y col., 1992). Muchas de las
sustituciones anteriores dan como resultado cadenas principales de
polímeros aproximadamente isostéricos con relación a cadenas
principales formadas a partir de
\alpha-aminoácidos.
Los estudios llevados a cabo para apoyar la
presente invención han utilizado polipéptidos (por ejemplo, cadenas
principales peptídicas). Sin embargo, las cadenas principales no
peptídicas de la invención, tales como las descritas anteriormente,
pueden proporcionar una mejor estabilidad biológica (por ejemplo,
resistencia a la degradación enzimática in vivo).
Los polímeros se construyen mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica.
Los polímeros transportadores de la invención se
pueden unir covalentemente a los agentes biológicamente activos
mediante procedimientos químicos.
Los agentes biológicamente activos, tales como
pequeñas moléculas orgánicas y macromoléculas, se pueden enlazar a
los polímeros transportadores de la invención vía un número de
procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Wong,
1991), bien directamente (por ejemplo, con una carbodiimida) o bien
mediante un resto enlace. En particular, los enlaces de carbamato,
éster, tioéter, disulfuro e hidrazona generalmente son fáciles de
formar y adecuados para la mayoría de las aplicaciones. Se
prefieren los enlaces de tipo éster y disulfuro si el enlace se va
a degradar fácilmente en el citosol, después del transporte de la
sustancia a través de la membrana celular.
Se pueden usar diversos grupos funcionales
(hidroxilo, amino, halógeno, etc.) para unir el agente
biológicamente activo al polímero transportador. Se prefieren los
grupos que se sabe que no son parte de un sitio activo del agente
biológicamente activo, particularmente si el polipéptido o cualquier
porción del mismo va a permanecer unido a la sustancia después del
suministro.
Los polímeros, tales como los péptidos producidos
según el Ejemplo 1, generalmente se producen con un grupo protector
amino terminal, tal como FMOC. Para agentes biológicamente activos
que pueden sobrevivir a las condiciones usadas para romper el
polipéptido de la síntesis de la resina y desproteger las cadenas
laterales, el FMOC se puede romper a partir del
N-término del polipéptido completo unido a la
resina de forma que el agente se pueda enlazar a la amina
N-terminal libre. En tales casos, el agente a unir
se activa típicamente por procedimientos bien conocidos en la
técnica, para producir un resto de éster activo o de carbonato
activo efectivo para formar un enlace de tipo amida o carbamato,
respectivamente, con el grupo amino del polímero. Por supuesto,
también se pueden usar otras químicas de enlace.
Para ayudar a minimizar las reacciones laterales,
los restos guanidínicos y amidínicos se pueden bloquear usando
grupos protectores convencionales, tales como grupos carbobenciloxi
(CBz), di-t-BOC, PMC, Pbf,
N-NO_{2}, y similares.
Las reacciones de acoplamiento se realizan
mediante procedimientos de acoplamiento conocidos en cualquiera de
un conjunto de disolventes, tales como
N,N-dimetilformamida (DMF),
N-metilpirrolidinona, diclorometano, agua, y
similares. Los reactivos de acoplamiento ejemplares incluyen
hexafluorofosfato de
O-benzotriazoliloxi-tetrametiluronio
(HATU), diciclohexilcarbodiimida, bromuro de
bromo-tris(pirrolidino)fosfonio
(PyBroP), etc. Se pueden incluir otros reactivos, tales como
N,N-dimetilaminopiridina (DMAP),
4-pirrolidinopiridina,
N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxibenzotriazol, y similares.
Para agentes biológicamente activos que son
inactivos hasta que se libera el polímero transportador unido, el
grupo enlace es preferiblemente un grupo enlace fácilmente
rompible, queriendo decir que es susceptible a la ruptura
enzimática o mediante disolventes in vivo. Para este fin, se
prefieren los grupos enlaces que contienen enlaces de tipo ésteres
de ácidos carboxílicos y enlaces de tipo disulfuro, en los que los
primeros grupos se hidrolizan enzimática o químicamente, y los
últimos se rompen mediante intercambio de disulfuro, por ejemplo,
en presencia de glutationa.
En una realización preferida, el grupo enlace
rompible contiene un primer grupo rompible que está distante del
agente, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente, de
forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un
conjuntado de grupo enlace/agente que contiene un resto nucleófilo
capaz de reaccionar intramolecularmente para romper el segundo grupo
rompible, liberando de ese modo el agente del grupo enlace y del
polímero. Esta realización se ilustra adicionalmente por los
diversos conjugados de pequeñas moléculas planteados más abajo.
Los sistemas de modelos para determinar la
capacidad de los polímeros de la invención para transportar
biomoléculas y otras sustancias terapéuticas a través de membranas
biológicas incluyen sistemas que miden la capacidad del polímero
para transportar una molécula fluorescente, unida covalentemente, a
través de la membrana. Por ejemplo, la fluoresceína (Pm de
\approx376) puede servir como un modelo para el transporte de
pequeñas moléculas orgánicas (Ejemplo 2). Para el transporte de
macromoléculas, se puede unir un polímero transportador a un gran
polipéptido, tal como ovoalbúmina (peso molecular 45 kDa; por
ejemplo, Ejemplo 14). La detección de la captación de macromoléculas
se puede facilitar uniendo un marcador fluorescente. La captación
celular también se puede analizar mediante microscopia confocal
(Ejemplo 4).
En experimentos llevados a cabo para apoyar la
presente invención, se analizó el transporte transmembránico y la
captación celular concomitante mediante la captación de un péptido
transportador enlazado a fluoresceína, según los procedimientos
descritos en los Ejemplos 2 y 3. Brevemente, se incubaron
suspensiones de células con conjugados fluorescentes suspendidos en
tampón durante tiempos variables a 37ºC, 33ºC, o 3ºC. Tras la
incubación, la reacción se detuvo y las células se recogieron
mediante centrifugación y se analizaron para determinar la
fluorescencia usando separación de células activadas por
fluorescencia (FACS).
En las condiciones usadas, la captación celular
de los conjugados no fue saturable. En consecuencia, no se pudieron
calcular los valores de ED_{50} para los péptidos. En su lugar,
los datos se presentan como histogramas para permitir comparaciones
directas de la captación celular a concentraciones individuales de
los conjugados.
Las figs. 1A-1C muestran los
resultados procedentes de un estudio en el que se analizaron
polímeros de L-arginina (R; fig. 1A) o
D-arginina (r; fig. 1B), de una longitud que oscila
de 4 a 9 subunidades de arginina, para determinar la capacidad para
transportar fluoresceína en células Jurkat. Para comparación,
también se analizaron los niveles de transporte para restos de HN
tat 49-57 ("49-57") y un
nonámero de L-lisina (K9). La fig. 1C muestra un
histograma de los niveles de captación para los conjugados a una
concentración de 12,5 \muM.
Como se muestra en las figuras, los polímeros
peptídicos fluorescentemente marcados, compuestos de 6 o más restos
de arginina, entraron a las células de forma más eficiente que la
secuencia 49-57 de tat. en particular, la captación
mejoró hasta al menos alrededor de dos veces el nivel de captación
de tat 49-57, y tanto como alrededor de
6-7 veces el nivel de captación de tat
49-57. La captación de fluoresceína sola fue
insignificante. También, el nonámero de lisina (K9) mostró muy poca
captación, indicando que los polímeros cortos de lisina son
ineficaces como transportes transmembránicos, en contraste con los
polímeros de longitud comparables que contienen guanidino.
Con referencia a la fig. 1B, los homopolímeros de
D-arginina mostraron un actividad transportadora
incluso mayor que sus contrapartes L. Sin embargo, el orden de
magnitud de los niveles de captación fue aproximadamente el mismo.
Para los D-homopolímeros, los péptidos con 7 a 9
argininas mostraron actividad casi igual. El hexámero (R6 o r6) fue
en cierto modo menos efectivo, pero aún mostró una actividad
transportadora al menos alrededor de 2 a 3 veces mayor que tat
(49-57).
La capacidad de los polímeros de D- y L- arginina
para mejorar el transporte transmembránico se confirmó mediante
microscopia confocal (figs. 2A-2F, y Ejemplo 4).
Consistente con los datos de FAC descritos anteriormente, el
citosol de las células incubadas con R9 (figs. 2B y 2E) o r9 (figs.
2C y 2F) fue brillantemente fluorescente, indicando niveles
elevados de transporte de conjugado al interior de las células. Por
el contrario, tat(49-57) a la misma
concentración mostró sólo una débil tinción (figs. 2A y 2D). Las
microfotografías confocales también enfatizan el punto en el que el
polímero de D-arginina (fig. 2C) fue más eficaz
entrando en la célula que el polímero compuesto de
L-arginina (fig. 2F).
A partir de lo anterior, es manifiesto que los
polímeros transportadores de la invención son significativamente
más efectivos que el péptido tat 49-57 de VIH
transportando fármacos a través de las membranas plasmáticas de las
células. Además, el nonámero de poli-Lys fue
ineficaz como transportador.
Para determinar si había una longitud óptima para
homopolímeros contiguos que contienen guanidinio, se examinó un
conjunto de conjugados de homopolímeros más largos de arginina
(R15, R20, R25, y R30). Para examinar el efecto de polímeros
sustancialmente más largos, también se ensayó (Ejemplo 5) una mezcla
de polímeros de L-arginina con un peso molecular
medio de \approx 12.000 daltons (\approx 100 aminoácidos). Sin
embargo, para evitar problemas de precipitación, se hubo de reducir
el nivel de suero en el ensayo para ensayar conjugados con el
material polimérico de peso molecular = 12.000. La captación por
las células fue analizada mediante FACS como antes, y se midió la
fluorescencia media de las células vivas. También se midió la
citotoxicidad de cada conjugado.
Con referencia a la fig. 3, la captación de los
conjugados de homopolímeros de L-arginina, con 15 o
más argininas, mostró patrones de captación celular claramente
diferentes de los polímeros que contienen nueve argininas o menos.
Las curvas de los conjugados más largos fue más plana, atravesando
a las de los conjugados de R9 y r9. A mayores concentraciones (>
3 \muM), la captación de R9 y r9 fue significativamente mejor
para los polímeros más largos. Sin embargo, a menores
concentraciones, las células incubadas con los péptidos más largos
mostraron una mayor fluorescencia.
Basándose en estos datos, parece que r9 y R9
entran a las células a velocidades mayores que los polímeros que
contienen 15 o más argininas contiguas. Sin embargo, la semivida
biológica de R9 (péptido L) fue más corta para los conjugados más
largos, presumiblemente debido a que la proteolisis de los péptidos
más largos (debida a las enzimas del suero) produce fragmentos que
retienen actividad transportadora. Por el contrario, el isómero D
(r9) no mostró signos de degradación proteolítica, consistente con
la mayor especificidad de las proteasas del suero por los
L-polipéptidos.
De este modo, parece la eficacia global
transportadora de un polímero transportador depende de una
combinación de (i) la relación de captación transmembránica (los
polímeros con menos de aproximadamente 15 argininas contiguas son
mejores) frente a la susceptibilidad a la inactivación proteolítica
(los polímeros más largos son los mejores). en consecuencia, se
prefieren polímeros que contienen 7 a 20 restos contiguos de
guanidinio, y preferiblemente 7 a 15.
Principalmente, el conjugado de poliarginina de
peso molecular elevado (Pm 12.000) no mostró captación detectable.
Este resultado es consistente con las observaciones de Barsoum y
col. (1994), y sugiere que los polímeros de arginina tienen
propiedades transportadoras que son significativamente diferentes de
aquellas que pueden ser mostradas por los polímeros de lisina.
Además, se encontró que el conjugado de poliarginina de 12.000 fue
muy tóxico (Ejemplo 5). En general, la toxicidad de los polímeros
aumentó con la longitud, aunque sólo el conjugado de peso molecular
12.000 mostró una elevada toxicidad a todas las concentraciones
ensayadas.
Cuando se analizó la captación celular de los
polímeros de D- y L-arginina mediante la cinética
de Michaelis-Menten (Ejemplo 6), la velocidad de
captación por las células Jurkat fue tan eficaz que sólo se
pudieron obtener valores precisos de K_{m} cuando los ensayos se
llevaron a cabo a 3ºC (sobre hielo). Tanto la velocidad máxima de
transporte (V_{max}) como la afinidad aparente de los péptidos
por el receptor putativo de la constante de Michaelis (K_{m}) se
derivaron de las gráficas de Lineweaver-Burk de la
fluorescencia observada de células Jurkat tras la incubación con
concentraciones variables de nonámeros de D- y L- arginina durante
30, 60, 120, y 240 segundos.
El análisis de la cinética también revela que los
polímeros ricos en arginina muestran una capacidad para unirse al
sitio de transporte celular putativo, y para atravesarlo, mejor
que, por ejemplo, el péptido tat(49-57),
puesto que K_{m} para el transporte de la
poli-L-arginina nonámera (44 \muM)
fue sustancialmente menor que K_{m} del péptido tat (722 \muM).
Además, el nonámero de D-arginina mostró el valor
más bajo de K_{m} (7 \muM) de los polímeros analizados en este
ensayo (Tabla 1), es decir, una afinidad aparente de
aproximadamente 100 veces mayor. Según una realización preferida de
la invención, el polímero transportador de la invención tiene una
afinidad aparente (K_{m}) que es al menos 10 veces, y
preferiblemente al menos 100 veces, mayor que la afinidad medida
para tat mediante el procedimiento del Ejemplo 6 cuando se mide a
temperatura ambiente (23ºC) o 37ºC.
K_{m} (\muM) | V_{max} (\muM/s) | |
H_{3}N-RRRRRRRRR-COO- | 44,43 | 0,35 |
H_{3}N-rrrrrrrrr-COO- | 7,21 | 0,39 |
tat 49-57 | 722 | 0,38 |
Los experimentos llevados a cabo en apoyo de la
presente invención indican que el transporte facilitado por los
polímeros depende de la integridad metabólica de las células. La
adición de una cantidad tóxica de azida de sodio (0,5% p/v) a las
células dio como resultado la inhibición de la captación de
conjugados en alrededor de 90% (Ejemplo 7). Los resultados mostrados
en la fig. 4 demuestran (i) sensibilidad a la azida de sodio del
transporte transmembránico, sugiriendo dependencia de la energía
(captación celular), y (ii) la superioridad de los polímeros de
poli-guanidinio de la invención (R9, R8, y R7) con
relación a tat(49-57) de VIH.
Sin adscribirse a ninguna teoría particular, los
datos sugieren que el proceso de transporte es un proceso
dependiente de la energía mediado por el reconocimiento específico
de polímeros que contienen guanidinio o amidinio mediante un
transportador molecular presente en las membranas plasmáticas
celulares.
Otros experimentos en apoyo de la invención han
demostrado que los conjugados de la invención son eficaces para
transportar agentes biológicamente activos a través de membranas de
una variedad de tipos celulares, incluyendo células T de seres
humanos (Jurkat), células B (CH27 de múridos), células T de
linfomas (EL-4 de múridos), células de mastocitomas
(P388 de múridos), varios hibridomas de células T de múridos,
células neuronales (PC-12), fibroblastos (RT de
múridos), células del riñón (HELM de múridos), mieloblastoma (K562
de múridos); y células de tejidos primarios, incluyendo todas las
células de la sangre humana (excepto los glóbulos rojos), tales
como linfocitos T y B, macrófagos, células dendríticas, y
eosinófilos, basófilos, mastocitos, células endoteliales, células
del tejido cardíaco, células del hígado, células del bazo, células
de los nódulos linfáticos y queratinocitos.
Los conjugados también son eficaces para
atravesar tanto las células bacterianas
gram-negativas como gram-positivas,
según se describe en el Ejemplo 8 y en las figs.
5A-5C. En general, se encontró que los polímeros de
las subunidades de D-arginina entran a las
bacterias tanto gram-positivas como
gram-negativas a velocidades significativamente más
rápidas que las velocidades de transporte observadas para polímeros
de L-arginina. Esto se ilustra mediante la fig. 5A,
que muestra niveles de captación para el conjugado r9
(D-argininas) mucho mayores que para el conjugado
R9 (L-argininas), cuando se incuba con células HB
101 (procariotas) de E. coli. Esta observación se puede
atribuir a la degradación proteolítica de los polímeros L por las
enzimas bacterianas.
La fig. 5B muestra niveles de captación para
conjugados de D-arginina como una función de la
longitud (r4 a r9) en comparación con un conjugado de
poli-L-lisina (K9), cuando se incuba
con células HB 101 de E. coli. Como se puede observar, los
conjugados de poliarginina mostraron una tendencia similar a la de
la fig. 2B observada con células eucariotas, de forma que los
polímeros más cortos de r6 mostraron niveles bajos de captación,
aumentando los niveles de captación como una función de la
longitud.
Las bacterias gram-positivas,
ejemplificadas por Strep. bovis, también se tiñeron
eficazmente con polímeros de arginina, pero no de lisina, según se
muestra en la fig. 5C.
Más generalmente, se observaron niveles máximos
de captación por las bacterias a 37ºC. Sin embargo, se observó una
tinción significativa cuando la incubación se realizó a temperatura
ambiente o a 3ºC. La microscopia confocal reveló que el
pretratamiento de las bacterias con azida de sodio al 0,5% inhibió
el transporte a través de las membranas plasmáticas internas de
bacterias tanto gram-positivas como
gram-negativas, pero no el transporte a través de la
pared celular (bacterias gram-positivas) en el
espacio periplásmico.
De este modo, la invención incluye conjugados que
contienen agentes antimicrobianos, tales como compuestos
antibacterianos y antifúngicos, para uso en la prevención o
inhibición de la proliferación o infección microbiana, y para
desinfectar superficies para mejorar la seguridad médica. Además, la
invención se puede usar para el transporte en células de plantas,
particularmente en plantas de hojas verdes.
Estudios adicionales en apoyo de la invención han
demostrado que la translocación a través de las membranas
bacterianas depende tanto de la energía como de la temperatura,
consistente con las observaciones señaladas al principio para otros
tipos de células.
Los agentes terapéuticos de pequeñas moléculas
orgánicas se pueden unir ventajosamente a composiciones poliméricas
lineales como se describe en este documento para facilitar o
mejorar el transporte a través de membranas biológicas. Por
ejemplo, el suministro de agentes altamente cargados, tales como
levodopa
(L-3,4-dihidroxi-fenilalanina;
L-DOPA, se puede ver beneficiado por el enlace a
moléculas transportadoras poliméricas como se describe aquí. También
se contemplan agentes peptoides y peptidomiméticos (por ejemplo,
Langston, 1997; Giannis y col., 1997). También, la invención es
ventajosa para suministrar pequeñas moléculas orgánicas que tienen
malas solubilidades en líquidos acuosos, tales como el suero y
disolución salina acuosa. De este modo, se pueden administrar
compuestos, cuyas eficacias terapéuticas están limitadas por sus
bajas solubilidades, a mayores dosis según la presente invención, y
pueden ser más eficaces en una base molar en forma conjugada, con
relación a la forma no conjugada, debido a mayores niveles de
captación por las células.
Puesto que una parte significativa de la
superficie topológica de una pequeña molécula está implicada a
menudo, y por lo tanto se requiere, para la actividad biológica, en
casos particulares puede ser necesario cortar la parte de la
pequeña molécula del conjugado del polímero transportador unido y
del resto enlace (si lo hay) para que el agente de pequeña molécula
ejerza actividad biológica después de atravesar la membrana
biológica objetivo. Para tales situaciones, el conjugado incluye
preferiblemente un grupo enlace rompible para liberar al fármaco
después de pasar a través de una membrana biológica.
En un enfoque, el conjugado puede incluir un
enlace de tipo disulfuro, como se ilustra en la fig. 6A que muestra
un conjugado (1) que contiene un polímero transportador T que está
enlazado a un agente citotóxico, 6-mercaptopurina,
mediante un grupo de cisteína N-acetil protegido que
sirve como grupo enlace. De este modo, el agente citotóxico está
unido mediante un enlace disulfuro al grupo
6-mercapto, y el polímero transportador está unido
al resto carbonílico de la cisteína mediante un enlace de tipo
amida. La ruptura del enlace disulfuro por reducción o intercambio
de disulfuro da como resultado la liberación del agente citotóxico
libre.
En el Ejemplo 9A se proporciona un procedimiento
para sintetizar un conjugado que contiene disulfuro. El producto
contiene un heptámero de restos de Arg que está enlazado a
6-mercaptopurina mediante un grupo enlace
N-acetil-Cys-Ala-Ala,
en el que los restos Ala se incluyen como un espaciador adicional
para hacer al disulfuro más accesible a tioles y a agentes
reductores para la rotura dentro de una célula. El grupo enlace en
este ejemplo también ilustra el uso de enlaces amida, que se pueden
romper enzimáticamente dentro de una célula.
En otro enfoque, el conjugado incluye un grupo
enlace fotorrompible que se rompe con la exposición a radiación
electromagnética. En la fig. 6B se ilustra un enlace ejemplar, que
muestra un conjugado (II) que contiene un polímero T transportador
que está enlazado a 6-mercaptopurina mediante un
resto enlace meta-nitrobenzoato. El polímero T está
enlazado al resto nitrobenzoato mediante un enlace amida al grupo
carbonílico del benzoato, y el agente citotóxico está unido
mediante su grupo 6-mercapto al grupo
p-metileno. El compuesto se puede formar haciendo
reaccionar 6-mercaptopurina con ácido
p-bromometil-m-nitrobenzoico
en presencia de NaOCH_{3}/metanol con calentamiento, seguido del
acoplamiento del benzoato del ácido carboxílico a un polímero
transportador, tal como el grupo amino de un enlace de ácido
\gamma-aminobutírico unido al polímero (Ejemplo
9B). La fotoiluminación del conjugado provoca la liberación de la
6-mercaptopurina en virtud del grupo nitro que está
en posición orto con respecto al resto mercaptometílico. Este
enfoque encuentra utilidad en procedimientos de fototerapia como
son conocidos en la técnica, particularmente para localizar la
activación de fármacos a un área seleccionada del cuerpo.
Preferiblemente, el enlace rompible contiene un
primer y segundo grupos rompibles que pueden cooperar para romper
el polímero del agente biológicamente activo, según se ilustra
mediante los siguientes enfoques. Esto es, el enlace rompible
contiene un primer grupo rompible que está distante al agente, y un
segundo grupo rompible que está próximo al agente, de forma que la
ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de
enlace/agente que contiene un resto nucleófilo capaz de reaccionar
intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible,
liberando de ese modo el agente del grupo enlace y del polímero.
La fig. 6C muestra un conjugado (III) que
contiene un polímero transportador T enlazado a un agente contra el
cáncer, 5-fluorouracilo (5FU). Aquí, el enlace se
proporciona mediante un resto lisilo modificado. El polímero
transportador se enlaza al grupo \alpha-amino, y
el 5-fluorouracilo está enlazado mediante el
\alpha-carbonilo. El grupo
\varepsilon-amino de lisilo ha sido modificado a
un éster de carbamato de
o-hidroximetil-nitrobenceno, que
comprende un primer grupo rompible fotolábil en el conjugado. La
fotoiluminación rompe al resto nitrobenceno del conjugado, dejando
un carbamato que también se descompone rápidamente para dar el
grupo \varepsilon-amino libre, un nucleófilo
eficaz. La reacción intramolecular del grupo
\varepsilon-amino con el enlace de amida al grupo
5-fluorouracilo conduce a la ciclación con
liberación del grupo 5-fluorouracilo.
La fig. 6D ilustra un conjugado (IV) que contiene
un polímero transportador T enlazado a 2'-oxígeno
del agente contra el cáncer paclitaxel. El enlace se proporciona
mediante un resto enlace que incluye (i) un átomo de nitrógeno
unido al polímero transportador, (ii) un monoéster de fosfato
localizado en para con respecto al átomo de nitrógeno, y (iii) un
grupo carboximetílico en meta con respecto al átomo de nitrógeno,
que está unido al 2'-oxígeno de paclitaxel mediante
un enlace de éster de carboxilato. La ruptura enzimática del grupo
fosfato a partir del conjugado a un grupo hidroxilo de fenol libre.
Este grupo nucleófilo reacciona entonces intramolecularmente con el
éster de carboxilato para liberar paclitaxel para la unión a su
diana biológica. El Ejemplo 9C describe un protocolo sintético para
preparar este tipo de conjugado.
La fig. 6E ilustra aún otro enfoque en el que se
enlaza un polímero transportador a un agente biológicamente, por
ejemplo, paclitaxel, mediante un ácido aminoalquilcarboxílico.
Preferiblemente el grupo amino del enlace está enlazado al carbono
carboxílico del enlace mediante 3 a 5 átomos de cadena (n = 3 a 5),
preferiblemente 3 ó 4 átomos de cadena, que se proporcionan
preferiblemente como carbonos metilénicos. Como se observa en la
fig. 6E, el grupo amino del enlace está unido al polímero
transportador mediante un enlace amida, y está unido al resto de
paclitaxel mediante un enlace éster. La ruptura enzimática del
enlace amida libera el polímero y produce un grupo amino nucléofilo
libre. El grupo amino libre puede reaccionar entonces
intramolecularmente con el grupo éster para liberar el enlace del
paclitaxel.
Las figs. 6D y 6E son ilustrativas de otro
aspecto de la invención, que comprenden conjugados taxánicos y
taxoides contra el cáncer que tienen mayores velocidades de
transporte transmembránico con relación a las formas no conjugadas
correspondientes. Los conjugados son particularmente útiles para
inhibir el crecimiento de células cancerígenas. Se cree que los
taxanos y taxoides manifiestan sus efectos contra el cáncer
promoviendo la polimerización de microtúbulos (e inhibiendo la
despolimerización) hasta un grado que es perjudicial para el
funcionamiento celular, inhibiendo la replicación celular, y
finalmente conduciendo a la muerte de la célula.
El término "taxano" se refiere a paclitaxel
(fig. 6F, R' = acetilo, R'' = bencilo), también conocido con el
nombre "TAXOL", y a análogos de origen natural, sintéticos, u
obtenidos por bioingeniería, que tienen un núcleo de cadena
principal que contiene los anillos A, B, C y D de paclitaxel, según
se ilustra en la fig. 6G. La fig. 6F también indica la estructura
de "TAXOTERE®" (R' = H, R'' = BOC), que es un análogo
sintético en cierto modo más soluble del paclitaxel, medido por
Rhone-Poulenc. "Taxoide" se refiere a análogos
de origen natural, sintéticos, u obtenidos por bioingeniería, de
paclitaxel, que contienen los anillos básicos A, B y C de
paclitaxel, según se muestra en la fig. 6H. La información
sintética y biológica substancial está disponible en las síntesis y
actividades de una variedad de compuestos taxánicos y taxoides, como
se explica en Suffness (1995), particularmente en los capítulos 12
a 14, así como en la bibliografía subsiguiente del paclitaxel.
Además, hay disponible un hospedante de estirpes celulares para
predecir las actividades contra el cáncer de estos compuestos
frente a ciertos tipos de cáncer, como se describen, por ejemplo en
Suffness, en los capítulos 8 y 13.
El polímero transportador se conjuga al resto
taxánico o taxoide mediante cualquier sitio de unión adecuado en el
taxano o taxoide. Convenientemente, el polímero transportador se
enlaza vía un átomo de oxígeno C2', un átomo de oxígeno C7, usando
estrategias de enlace como antes. La conjugación de un polímero
transportador mediante un oxígeno C7 conduce a conjugados de taxano
que tienen actividad contra el cáncer y antitumoral a pesar de la
conjugación en esa posición. En consecuencia, el enlace se puede
romper o no. La conjugación mediante el oxígeno C2' reduce
significativamente la actividad contra el cáncer, de forma que se
prefiere un enlace rompible para la conjugación para este sitio.
También se pueden usar otros sitios de unión, tal como C10.
Se apreciará que los conjugados de taxano y
taxoide de la invención tienen una solubilidad mejorada en agua con
relación a Taxol (\approx0,25 \mug/ml) y Taxotere
(6-7 \mug/ml). Por lo tanto, no se requieren
grandes cantidades de agentes solubilizantes, tales como
"CREMOPHOR EL" (aceite de ricino polietoxilado), polisorbato
80 (monooleato de sorbitán polietoxilado, también conocido como
"TWEEN 80"), ni de etanol, de forma que se pueden reducir los
efectos secundarios asociados típicamente con estos agente
solubilizantes, tales como anafilaxis, disnea, hipotensión y
sonrojamiento.
Los metales se pueden transportar en células
eucariotas y procariotas usando agentes quelantes, tales como
texafirina o ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), conjugados
a una membrana transportadora de la invención, según se ilustra
mediante el Ejemplo 10. Estos conjugados son útiles para
suministrar iones metálicos para la formación de imágenes o para
terapia. Los iones metálicos ejemplares incluyen Eu, Lu, Pr, Gd,
Tc99m, Ga67, In111, Y90, Cu67, y Co57. Los estudios preliminares de
transporte membránico con candidatos conjugados se pueden realizar
usando ensayos a base de células, tales como se describen en la
sección de Ejemplos a continuación. Por ejemplo, usando iones de
europio, se puede monitorizar la captación celular mediante medidas
de fluorescencia a tiempos determinados. Para iones metálicos que
son citotóxicos, la captación se puede monitorizar mediante la
citotoxicidad.
El procedimiento de transporte mejorado de la
invención es particularmente adecuado para mejorar el transporte a
través de membranas biológicas para un gran número de
macromoléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas, ácidos
nucleicos, polisacáridos, y análogos de los mismos. Los ácidos
nucleicos ejemplares incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos
formados de ADN y ARN, y sus análogos, que tienen secuencias
seleccionadas diseñadas para la hibridación a dianas
complementarias (por ejemplo, secuencias antisentido para dianas de
una sola hebra o de doble hebra), o para expresar transcriptos de
ácidos nucleicos o proteínas codificados por las secuencias. Los
análogos incluyen análogos de cadena principal cargados y
preferiblemente no cargados, tales como fosfonatos (preferiblemente
metilfosfonatos), fosforamidatos (N3' o N5'), tiofosfonatos,
polímeros a base de morfolino no cargados, y ácido nucleicos de
proteínas (PNA). Tales moléculas se pueden usar en una variedad de
regímenes terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, terapia de
sustitución de enzimas, terapia génica, y terapia antisentido.
A título de ejemplo, los ácidos nucleicos de
proteínas (PNA) son análogos de ADN en los que la cadena principal
es estructuralmente homomorfa con una cadena principal de
desoxirribosa. Consta de unidades de
N-(2-aminoetil)glicina a las que se unen
nucleobases. Los PNA que contienen las cuatro nucleobases naturales
se hibridan a oligonucleótidos complementarios obedeciendo a las
reglas de apareamiento de Watson-Crick, y son
imitaciones verdaderas de ADN en términos de reconocimiento de
pares de bases (Egholm y col. 1993). La cadena principal de un PNA
está formada por enlaces peptídicos más que ésteres de fosfato,
haciéndola muy adecuada para aplicaciones antisentido. Puesto que la
cadena principal no está cargada, los dúplex PNA/ADN o PNA/ARN que
se forman muestran una estabilidad térmica mayor de lo normal. Los
PNA tienen la ventaja adicional de que no son reconocidos por
nucleasas o proteasas. Además, los PNA se pueden sintetizar en un
sintetizador automatizado de péptidos usando la química estándar de
t-Boc. El PNA se enlaza entonces fácilmente a un
polímero transportador de la invención.
En la patente U.S. 5.594.122, por ejemplo, se
describen ejemplos de oligonucleótidos antisentido cuyo transporte
al interior de las células se puede mejorar usando los
procedimientos de la invención. Tales oligonucleótidos están
dirigidos a tratar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La
conjugación de un polímero transportador a un oligonucleótido
antisentido se puede efectuar, por ejemplo, formando un enlace
amida entre el péptido y el término 5' del oligonucleótido a través
de un enlace de tipo succinato, según procedimientos bien
establecidos. El uso de conjugados de PNA se ilustra adicionalmente
en el Ejemplo 11.
La fig. 7 muestra los resultados obtenidos con un
conjugado de la invención que contiene una secuencia de PNA para
inhibir la secreción de gamma-interferón
(\gamma-IFN) mediante células T, según se detalla
en el Ejemplo 11. Como se puede observar, el conjugado de PNA
antisentido fue eficaz bloqueando la secreción de
\gamma-IFN cuando el conjugado estaba presente en
cantidades por encima de alrededor de 10 \muM. Por el contrario,
no se observó inhibición con el conjugado de PNA sentido o con el
PNA antisentido solo no conjugado.
Otra clase macromoléculas que se pueden
transportar a través de membranas biológicas se ejemplifican
mediante proteínas, y en particular enzimas. Las proteínas
terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de
sustitución. Las enzimas terapéuticas incluyen, pero no se limitan
a, alglucerasa para uso en el tratamiento de la deficiencia de
glucocerebrosidasa lisosómica (enfermedad de Gaucher),
alfa-L-iduronidasa, para uso en el
tratamiento de mucopolisacaridosis 1,
alfa-N-acetilglucosamidasa, para uso
en el tratamiento del síndrome de San Filippo B, lipasa, para uso
en el tratamiento de insuficiencia pancreática, adenosina
desaminasa, para uso en el tratamiento de síndrome de
inmunodeficiencia combinado grave, y triosa fosfato isomerasa para
uso en el tratamiento de la disfunción neuromuscular asociada con
deficiencia de triosa fosfato isomerasa.
Además, y según un aspecto importante de la
invención, se pueden suministrar antígenos proteínicos al
compartimiento citosólico de células que presentan antígenos (APC),
en el que son degradados en péptidos. Los péptidos se transportan
entonces al retículo endoplásmico, en el que se asocian con
moléculas nacientes de HLA de clase I y se despliegan por toda la
superficie celular. Tales APC "activadas" pueden servir como
inductores de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de
antígenos restringidos de clase I, que entonces proceden a
reconocer y destruir células que presentan el antígeno particular.
Las APC que son capaces de llevar a cabo este proceso incluyen, pero
no se limitan a, ciertos macrófagos, células B y células
dendríticas. En una realización, el antígeno proteínico es un
antígeno tumoral para provocar o promover una respuesta inmune
frente a células tumorales.
El transporte de proteínas aisladas o solubles en
el citosol de APC con la activación subsiguiente de CTL es
excepcional puesto que, con pocas excepciones, la inyección de
proteínas aisladas o solubles no da como resultado la activación de
APC o la inducción de CTL. De este modo, los antígenos que están
conjugados a las composiciones potenciadoras del transporte de la
presente invención pueden servir para estimular una respuesta
celular inmune in vitro o in vivo.
El ejemplo 14 proporciona detalles de
experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención en
los que se suministra un antígeno proteínico ejemplar, ovoalbúmina,
a APC tras la conjugación a un polímero R7. La adición subsiguiente
de las APC a linfocitos T citotóxicos (CTL) dio como resultado
células T citotóxicas específicas de albúmina CD8+ (CTL
estimulados). Por el contrario, las APC que se habían expuesto a
ovoalbúmina sin modificar fracasaron estimulando los CTL.
En experimentos paralelos, se expusieron células
dendríticas histocompatibles (un tipo específico de APC) a
conjugados de ovoalbúmina con R7, y después se inyectaron en
ratones. El análisis subsiguiente de la sangre procedente de estos
ratones reveló la presencia de CTL específicos para albúmina. A los
ratones del control se les proporcionó células dendríticas que se
habían expuesto a albúmina no modificada. Los ratones del control no
mostraron la respuesta de CTL específicos para albúmina. Estos
experimentos ejemplifican una de las utilidades específicas
asociadas con el suministro de macromoléculas en general, y
proteínas en particular, a las células.
En otra realización, la invención es útil para
suministrar anticuerpos inmunoespecíficos o fragmentos de
anticuerpos al citosol para interferir con procesos biológicos
perjudiciales tales como la infección microbiana. Experimentos
recientes han demostrado que los anticuerpos intracelulares pueden
ser agentes antivíricos efectivos en células de plantas y de
mamíferos (por ejemplo, Tavladoraki y col., 1993 y Shaheen y col.,
1996). Estos procedimientos han usado típicamente fragmentos de
región variable de cadena única (scFv), en los que las cadenas
pesadas y ligeras de los anticuerpos se sintetizan como un único
polipéptido. Las cadenas pesadas y ligeras variables están separadas
habitualmente mediante un péptido enlace flexible (por ejemplo, de
15 aminoácidos) para producir una molécula de 28 kDa que retiene el
sitio de unión a ligando de alta afinidad. El principal obstáculo
para la aplicación amplia de esta tecnología ha sido la eficacia de
la captación en células infectadas. Pero uniendo polímeros
transportadores a los fragmentos scFv, se puede mejorar el grado de
captación celular, permitiendo que los fragmentos inmunoespecíficos
se unan e incapaciten a importantes componentes microbianos tales
como Rev de VIH, transcriptasa inversa de VIH, y proteínas
integrasas.
Los péptidos a suministrar mediante los
procedimientos mejorados de transporte descritos aquí incluyen,
pero no se deben limitar a, polipéptidos efectores, fragmentos
receptores, y similares. Los ejemplos incluyen péptidos que tienen
sitios de fosforilación usados por proteínas que median señales
intracelulares. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se
limitan a proteína quinasa C, RAF-1, p21 Ras,
NF-_{K}B, C-JUN, y colas
citoplásmicas de receptores de membrana tales como receptor
IL-4, CD28, CTLA-4, V7, y antígenos
de la clase I y clase II de MHC.
En experimentos llevados a cabo en apoyo de la
presente invención (Ejemplo 15) se sintetizó un segmento de 10
aminoácidos de la región de cola citoplásmica de la proteína
transmembránica V7 (también conocida como CD101), con una secuencia
de polímero R7 en su término C. Se sabe que esta región de cola se
asocia físicamente con, y media, la inactivación de
RAF-1 quinasa, una enzima crítica en la ruta de MAP
quinasas de la activación celular. Se añadió el conjugado V7/R7 a
células T, que se lisaron subsiguientemente con detergentes. La
fracción soluble se ensayó para determinar la inmunoprecipitación
mediante anticuerpo anti-V7 de múrido en
combinación con IgG antiratón de cabra.
En ausencia del tratamiento peptídico, la
RAF-1, una quinasa que se sabe que se asocia y se
inactiva por asociación con V7, coprecipitó con V7. en células
tratadas con el péptido, se eliminó la proteína
RAF-1 del inmunocomplejo V7. El mismo tratamiento
peptídico no destruyó un complejo que consta de
RAF-1 y p21 Ras, descartando cualquier modificación
no específica de RAF-1 mediante los péptidos V7.
Estos resultados mostraron que un péptido V7 de la región de cola
citoplásmica, cuando se conjuga a un péptido que mejora el
transporte membránico de la presente invención, entra a una célula
diana y se asocia específicamente con una molécula efectora
fisiológica, RAF-1. Tal asociación se puede usar
para interrumpir procesos intracelulares.
En un segundo conjunto de estudios, se fosforiló
in vitro la porción V7 del conjugado usando proteína quinasa
C. Precipitados anti-RAF-1 de
células T que se habían expuesto a los péptidos de cola V7
fosforilados, pero no al péptido de cola V7 sin fosforilar,
demostraron una potente inhibición de actividad de
RAF-quinasa. Estos estudios demuestran dos
principios. En primer lugar, los polímeros transportadores de la
invención pueden efectuar el transporte de una molécula muy cargada
(fosforilada) a través de la membrana celular. En segundo lugar,
aunque tanto los péptidos de cola V7 fosforilados como no
fosforilados se pueden unir a RAF-1, sólo el péptido
fosforilado modificó la actividad de RAF-1
quinasa.
En otra realización, la invención se puede usar
para detectar sistemáticamente uno o más conjugados en busca de una
actividad biológica seleccionada, en la que el conjugado o
conjugados se forman a partir de uno o más agentes candidatos. El
conjugado o conjugados se ponen en contacto con una célula que
muestra una señal detectable con la captación del conjugado en la
célula, de forma que la magnitud de la señal es indicadora de la
eficacia del conjugado con respecto a la actividad biológica
seleccionada.
Una ventaja de esta realización es que es
particularmente útil para ensayar las actividades de agentes que
por sí mismos son incapaces o muy poco capaces de penetrar en las
células para manifestar actividad biológica. De este modo, la
invención proporciona una forma particularmente eficaz de
identificar agentes activos que de otro modo pueden no ser
accesibles a través de programas de detección sistemática a gran
escala, debido a la falta de una vía eficaz y conveniente para
transportar los agentes al interior de la célula o de los
orgánulos.
Preferiblemente, el agente o más de un agente
candidato se proporcionan como una librería combinatoria de
conjugados que se preparan usando cualquiera de un gran número de
procedimientos sintéticos combinatorios conocidos en la técnica.
Por ejemplo, Thompson y Ellman (1986) reconocieron al menos cinco
enfoques generales diferentes para preparar librerías conminatorias
sobre soportes sólidos, a saber, (1) la síntesis de compuestos
discretos, (2) la síntesis de desdoblamiento (desdoblamiento y
reagrupamiento), (3) desconjunción de librerías solubles, (4)
determinación estructural mediante procedimientos analíticos, y (5)
estrategias de codificación en las que las composiciones químicas
de los candidatos activos se determinan mediante marcadores únicos,
tras un ensayo positivo en busca de la actividad biológica en el
ensayo. La síntesis de librerías en disolución incluye al menos (1)
las síntesis espacialmente separadas y (2) las síntesis de
conjuntos (Thompson, más arriba). En Lam y col (1997) se puede
encontrar una descripción adicional de los procedimientos
sintéticos conminatorios, referencia a la cual describe
particularmente el enfoque de una perla un compuesto, para preparar
conjugados según la presente invención.
Estos enfoques se adaptan fácilmente para
preparar conjugados según la presente invención, incluyendo
esquemas de protección adecuados según sea necesario. Por ejemplo,
para una librería que se construye en uno o más soportes sólidos,
se puede unir un resto transportador al soporte o soportes
primeramente, seguido de la construcción o anexión de agentes
candidatos combinatoriamente sobre los polímeros mediante
funcionalidades reactivas adecuadas. En un ejemplo alternativo,
primero se forma una librería combinatoria de agentes sobre uno o
más soportes sólidos, seguido de la anexión a un polímero
transportador para cada agente candidato inmovilizado. Se pueden
usar enfoques similares o diferentes para la síntesis en fase en
disolución. Las librerías formadas sobre un soporte sólido se
rompen preferiblemente del soporte mediante un grupo enlace
rompible por procedimientos conocidos (Thompson y col., y Lam y
col.).
El candidato o más de un candidato conjugado se
puede ensayar con cualquiera de un número de ensayos a base de
células que provocan señales detectables en proporción a la
eficacia del conjugado. De forma conveniente, los candidatos se
incuban con células en placas de múltiples pocillos, y los efectos
biológicos se miden mediante una señal (por ejemplo, fluorescencia,
reflectancia, absorción o quimioluminiscencia) que se puede
cuantificar usando un lector de placas. Como alternativa, se pueden
eliminar las mezclas de incubación de los pocillos para un
procesamiento y/o análisis posterior. Entonces se determinan las
estructuras de los compuestos activos y opcionalmente inactivos, si
no se conocen ya, y esta información se puede usar para identificar
compuestos y para centrar posteriormente la síntesis y los esfuerzos
de la detección sistemática.
Por ejemplo, el ensayo de secreción de
gamma-interferón detallado en el Ejemplo 11 se
adapta fácilmente a un formato de múltiples pocillos, de forma que
se pueden detectar inhibidores activos de la secreción mediante
detección de fluorescencia basada en europio usando un lector de
placas. Los agentes anticancerígenos se pueden detectar
sistemáticamente usando estirpes celulares de cáncer ya conocidas
(por ejemplo, proporcionadas por National Institute of Health (NIH)
y el National Cancer Institute (NCI)). Los efectos citotóxicos de
los agentes contra el cáncer se pueden determinar mediante exclusión
con colorante tripán, por ejemplo.
Otros ejemplos incluyen ensayos dirigidos a
inhibir la señalización celular, tal como la inhibición del
receptor de IL-4; ensayos para bloquear la
proliferación celular; y ensayos para la expresión génica. En un
ensayo típico para la expresión génica, se coloca un gen de interés
bajo el control de un promotor adecuado y es seguido en la
dirección 3' mediante un gen para producir un especie informadora
tal como \beta-galactosidasa o luciferaza de
luciérnaga. Se puede detectar un efecto inhibidor basándose en una
disminución en la señal informadora.
La invención también incluye una librería de
conjugados que es útil para la detección sistemática en el
procedimiento anterior. La librería incluye una pluralidad de
agentes candidatos para una o más actividades biológicas
seleccionadas, cada uno de los cuales está conjugado a al menos un
polímero transportador según la invención. Preferiblemente la
librería de conjugados es una librería combinatoria. En otra
realización, la invención incluye una batería regular de distintos
conjugados de polímero/agente distribuidos en una pluralidad
indexada o indexable de pocillos para muestras, para ensayar e
identificar agentes activos de interés.
Las composiciones y procedimientos de la presente
invención tienen utilidad particular en el área de compuestos
terapéuticos para seres humanos y para veterinaria. Generalmente,
las dosis administradas serán eficaces para suministrar
concentraciones picomolares a micromolares de la composición
terapéutica al sitio efector. Las dosis y concentraciones apropiadas
dependerán de factores tales como la composición terapéutica o el
fármaco, el sitio de administración pretendido, y la ruta de
administración, todos los cuales se pueden derivar empíricamente
según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se pueden
obtener guías adicionales a partir de estudios usando modelos de
animales experimentales para evaluar la dosis, según se conocen en
la técnica.
La administración de los compuestos de la
invención con un excipiente farmacéutico adecuado según sea
necesario se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los modos
de administración aceptados. De este modo, la administración se
puede realizar, por ejemplo, de forma intravenosa, tópica,
subcutánea, transcutánea, intramuscular, oral, intraarticular,
parenteral, peritoneal, intranasal, o mediante inhalación. Las
formulaciones pueden tomar la forma de un polvo sólido, semisólido,
liofilizado, o formas de dosificación líquidas, tales como, por
ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, disoluciones,
suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención,
cremas, ungüentos, lociones, aerosoles o similares, preferiblemente
en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración
simple de dosis precisas.
Las composiciones incluyen típicamente un
vehículo o excipiente farmacéutico convencional, y pueden incluir
adicionalmente otros agentes médicos, vehículos, coadyuvantes, y
similares. Preferiblemente, la composición será alrededor de 5%
hasta 75% en peso de un compuesto o compuestos de la invención,
constando el resto de excipientes farmacéuticos adecuados. Los
excipientes apropiados se pueden ajustar a la medida para la
composición particular y la vía de administración mediante
procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Gennaro,
1990).
Para la administración oral, tales excipientes
incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón,
estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa,
gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. La
composición puede tomar la forma de una disolución, suspensión,
comprimido, pastilla, cápsula, polvo, formulación de liberación
sostenida, y similar.
En algunas realizaciones, las composiciones
farmacéuticas tienen la forma de una pastilla, comprimido o
cápsula, y de este modo la composición puede contener, junto con el
conjugado biológicamente activo, cualquiera de los siguientes: un
diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico, y similar;
un disgregante tal como almidón o derivados del mismo; un lubricante
tal como estearato de magnesio y similar; y un aglutinante tal como
almidón, goma arábiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y
derivados del mismo.
Los compuestos activos de las fórmulas se pueden
formular en un supositorio que comprende, por ejemplo, alrededor de
0,5% hasta alrededor de 50% de un compuesto de la invención,
dispuesto en un vehículo de polietilenglicol (PRG) (por ejemplo,
PEG 1000 [96%] y PEG 4000 [4%]).
Las composiciones líquidas se pueden preparar
disolviendo o dispersando el compuesto (alrededor de 0,5% hasta
alrededor de 20%) y coadyuvantes farmacéuticos opcionales en un
vehículo, tal como, por ejemplo, disolución salina acuosa (por
ejemplo, cloruro de sodio al 0,9% p/v), dextrosa acuosa, glicerol,
etanol, y similares, para formar una disolución o suspensión, por
ejemplo para administración intravenosa. Los compuestos activos
también se pueden formular en un enema de retención.
Si se desea, la composición a administrar también
puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no
tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes
tamponantes del pH, tales como, por ejemplo, acetato de sodio,
monolaurato de sorbitán u oleato de trietanolamina.
Para la administración tópica, la composición se
administra en cualquier formato adecuado, tal como una loción o un
parche transdérmico. Para el suministro mediante inhalación, la
composición se puede suministrar como un polvo seco (por ejemplo,
Inhale Therapeutics) o en forma líquida vía un nebulizador.
Los procedimientos para preparar tales formas de
dosificación son conocidos o serán manifiestos para los expertos en
la técnica; véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences (1980). La composición a administrar contendrá, en
cualquier caso, una cantidad del profármaco y/o del compuesto o
compuestos activos en una cantidad farmacéuticamente efectiva para
aliviar el estado tratado cuando se administra según las enseñanzas
de esta invención.
Generalmente, los compuestos de la invención se
administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, una
dosis suficiente para efectuar el tratamiento, que variará
dependiendo del sujeto y del estado a tratar. Típicamente, una
dosis diaria terapéuticamente efectiva es de 0,1 a 100 mg/kg de
peso corporal por día de fármaco. La mayoría de los estados
responden a la administración de una dosis total de entre alrededor
de 1 y alrededor de 30 mg/kg de peso corporal por día, o entre
alrededor de 70 mg y 2100 mg por día para una persona de 70 kg.
La estabilidad del conjugado se puede controlar
adicionalmente mediante la composición y la estereoquímica de la
cadena principal y cadenas laterales del polímero. Para polímeros
polipeptídicos, los isómeros D son generalmente resistentes a
proteasas endógenas, y por lo tanto tienen semividas más
prolongadas en el suero y en las células. Los polímeros
D-polipeptídicos son por lo tanto apreciados cuando
se desea una duración más prolongada de la acción. Los polímeros
L-polipeptídicos tienen semividas más cortas debido
a su susceptibilidad a proteasas, y por lo tanto se escogen para
dar efectos más cortos de actuación. Esto permite que se prevengan
efecto secundarios más fácilmente retirando la terapia tan pronto
como se observan los efectos secundarios. Los polipéptidos que
comprenden mezclas de restos D y L tienen estabilidades
intermedias. Generalmente se prefieren los
homo-D-polímeros.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero
no limitar la invención.
Los péptidos se sintetizaron usando técnicas de
fase sólida en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems
usando la química FastMOC™ y resinas Wang comercialmente
disponibles y aminoácidos protegidos Fmoc, según procedimientos
bien conocidos en la técnica (Bonifaci). Los péptidos se
purificaron usando columnas de HPLC de fase inversa C4 o C18, y sus
estructuras se confirmaron usando análisis de aminoácidos y
espectrometría de masas.
Se sintetizaron péptidos fluorescentes mediante
modificación del término amino del péptido con ácido aminocaproico
seguido de reacción con isotiocianato de fluoresceína en presencia
de hexafluorofosfato de
(2-1H-benzotiazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio/N-hidroxi-benzotriazol
disuelto en N-metil-pirrolidona.
Los productos se purificaron mediante filtración en gel.
Las suspensiones celulares (10^{6}/ml) se
incubaron durante tiempos variables, a 37ºC, 23ºC, o 4ºC, con un
intervalo de concentraciones de péptidos o conjugados en PBS pH 7,2
que contiene 2% de suero fetal de ternero (PBS/FCS) en placas de 96
pocillos. Tras una incubación de 15 minutos, las células se
peletizaron mediante centrifugación, se lavaron tres veces con
PBS/FCS que contiene 1% de azida de sodio, se incubaron con
tripsina/EDTA (Gibco) a 37ºC durante cinco minutos, después se
lavaron dos veces más con PBS/FCS/NaN. Las células peletizadas se
resuspendieron en PBS que contiene 2% de FCS y 0,1% de yoduro de
propidio, y se analizaron en un FACScan (Becton Dickenson, Mountain
View, CA). Las células positivas para el yoduro de propidio se
excluyeron del análisis. Para el análisis de polímeros de arginina,
se redujo el voltaje del fotomultiplicador en un orden de magnitud
tal para permitir una medida más exacta.
Se midieron los niveles de captación de los
siguientes péptidos mediante el procedimiento en el Ejemplo 2: (1)
un polipéptido que comprende restos tat 49-57 de
VIH
(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
= SEQ ID NO: 1), (2) un nonámero de restos de L-Lys
(K9, SEQ ID NO: 2), y (3) homo-L u homopolipéptidos
que contienen cuatro a nueve restos Arg (SEQ ID NO:
3-8 y 12-17). Los resultados se
muestran en las Figs. 2A-2C.
Se prepararon células incubadas con péptidos de
poliarginina fluorescentes según se describe anteriormente para
ensayos de unión, y se analizaron en la Instalación de Toma de
Imágenes de Ciencias de la Célula (Stanford University, CA), usando
un microscopio confocal de láser de barrido, de un solo haz, con una
longitud de excitación de 488 nm (láser de ion de argón), y una
anchura de banda de emisión de 510-550 usando un
filtro de paso de banda. Los conjugados (6,25 \muM) que contienen
tat(49-57), R7, o r7 acoplados a fluoresceína
se incubaron en células Jurkat a 37ºC durante 10 minutos. Las figs.
2A-2F muestran los resultados para la fluorescencia
emitida (figs. 2A-2C) y la luz transmitida
(2D-2F) para tat(49-57)
(figs. 2A y 2C), R7 (figs. 2B y 2E), y r7 (figs. 2C y 2F).
Los siguientes homopolímeros de poliarginina se
ensayaron mediante el ensayo de fluorescencia en el Ejemplo 2, con
incubación a 37ºC durante 15 minutos antes de peletizar a las
células: r9, R9, R15, R20, R25 y R30. Además, también se ensayó una
mezcla de polímeros de L-arginina que tienen un peso
molecular medio de 12.000 daltons (aproximadamente 100 aminoácidos)
(Sigma Chem. Co.) después de ser marcada con isotiocianato de
fluoresceína y purificada por filtración en gel ("SEPHADEX"
G-25). Las células se analizaron mediante FACS, y
se midió la fluorescencia media de las células vivas. También se
midió la citotoxicidad de cada conjugado calculando el porcentaje
de células que se tiñeron con yoduro de propidio, que es
característico de la muerte celular. Los resultados de la captación
para los conjugados r9, R9, R15, R20 y R25 se muestran en la fig.
3.
La poliarginina comercialmente disponible (peso
molecular = 12.000) precipitó proteínas en el suero, lo más
probable glicoproteína ácida. Por lo tanto, el nivel de suero fetal
de ternero se redujo diez veces en el ensayo para conjugados
preparados a partir de este material.
La composición de poli-Arg de Pm
12.000 fue tóxica a concentraciones de 800 nM hasta 50 \muM, y
está excluida de la fig. 3. Los conjugados de
poli-L-Arg que contienen 20 restos o
más de arginina fueron tóxicos a concentraciones mayores que 12
\muM, de forma que la toxicidad aumenta con la longitud.
Para medir los parámetros Vmax y Km de la
captación celular, se usó el procedimiento de ensayo del ejemplo 2,
con las siguientes modificaciones. Los péptidos se incubaron con
células durante 0,5, 1, 2 y 4 minutos a 4ºC por triplicado, en 50
\mul de PBS/FCS en placas de 96 pocillos. Al final de la
incubación, la reacción se detuvo rápidamente diluyendo las muestras
en 5 ml de PBS/FCS, centrifugando y lavando una vez con PBS/FCS,
tripsina/EDTA, y finalmente de nuevo con PBS/FCS, y recogiendo los
peletes en PBS/FCS que contiene yoduro de propidio para análisis en
un FACScan. Los datos de FACS se ajustaron a la ecuación de
Lineweaver-Burk para la cinética de
Michaelis-Menten. Los datos de la cinética para los
conjugados fluorescentes de tat(49-57), R9, y
r9 se muestran en la Tabla 1 antes.
Se incubaron células en suspensión (10^{6}/ml)
durante 30 minutos con azida de sodio al 0,5% en PBS que contiene
2% de FCS. Al final de la incubación, se añadieron los péptidos
fluorescentes (tat(49-57), R7, R8, o R9) a
una concentración final de 12,5 \muM. Tras la incubación durante
30 minutos, las células se lavaron como en el Ejemplo 2, excepto
que todos los tampones de lavado contenían azida de sodio al 0,1%.
Los resultados se muestran en la fig. 5.
Se hicieron crecer bacterias
gram-negativas (cepa HB101 de E. coli) y
bacterias gram-positivas (Strep. bovis) en
medios apropiados en fase logarítmica. Los cultivos celulares (4 x
10^{8} por ml) se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con
concentraciones variables de conjugados fluorescentes que contienen
polímeros lineales de L-arginina (R4 a R9),
D-arginina (r4 a r9), o L-lisina
(K9), a concentraciones del conjugado de 3 hasta 50 \muM. Las
células se lavaron y se recogieron en yoduro de propidio que
contiene PBS (para distinguir las células muertas), y se analizaron
mediante FACS y microscopia de fluorescencia. Los resultados se
muestran en las figs. 5A-5C, según se explica
antes.
Se disolvió
N-acetil-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO_{2}H
(12,2 mg, 0,0083 mmoles) en 3 ml de AcOH:H_{2}O 3:1, con
agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añadió
ditio-bis(5-nitropiridina)
(DTPN) (12,9 mg, 0,0415 mmoles, 5 equiv.). La disolución se dejó
agitar durante 24 h a temperatura ambiente, tras lo cual la mezcla
tomó un color amarillo brillante. El disolvente se eliminó a vacío,
y el residuo se redisolvió en 5 ml de H_{2}O, y se extrajo 3
veces con acetato de etilo para eliminar el exceso de DTPN. La capa
acuosa se liofilizó, y el producto se usó sin purificación
adicional.
Se disolvió
N-acetil-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO_{2}H
(0,0083 mmoles) en 1 ml de H_{2}O desgasificada (pH = 5) en argón
a temperatura ambiente, con agitación. Se añadió
6-mercaptopurina (1,42 mg, 0,0083 mmoles, 1 eq.) en
0,5 ml de DMF a la mezcla. La reacción se dejó agitar durante 18 h
en atmósfera inerte a temperatura ambiente. Después de 18 h, se
observó un color amarillo, indicando la presencia
de5-nitro-2-tiopiridina
libre. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se
purificó mediante HPLC, proporcionando el producto deseado (I, fig.
6A) con un rendimiento global de 50%.
Se disolvió ácido
3-nitro-4-(bromometil)benzoico
(100 mg, 0,384 mmoles) en metanol anhidro (5 ml) en una atmósfera
de nitrógeno. A esta disolución se añadió metóxido de sodio (88
\mul, 25% (p/p) en metanol, 0,384 mmoles, 1 eq.) seguido de la
adición de 6-mercaptopurina (58,2 mg, 0,384 mmoles,
1 eq.). La mezcla se calentó hasta reflujo, y se dejó agitar
durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió entonces, se filtró, y
se paralizó por acidificación con HCl 6N. El volumen de reacción se
redujo entonces hasta la mitad, en cuyo momento el producto
precipitó y se recogió por filtración. El residuo se redisolvió en
metanol, se filtró (si es necesario), y se concentró a presión
reducida para proporcionar el sulfuro deseado (II, fig. 6B) con un
rendimiento del 50% como un sólido pulverulento amarillo.
C1. A una suspensión de ácido
o-hidroxifenilacético (15,0 g, 0,099 moles) en
H_{2}O (39 ml) a 0ºC se añadió una disolución de ácido nítrico (12
ml de 65% en 8 ml de H_{2}O) lentamente mediante una pipeta. La
disolución se agitó durante 1,5 h adicionales, a 0ºC. La mezcla se
calentó entonces hasta temperatura ambiente, y se dejó agitar
durante 0,5 h adicionales. La disolución heterogénea se vertió
sobre hielo (10 g) y se filtró para eliminar el isómero
orto-nitro insoluble. La disolución rojiza se
concentró a presión reducida, y el residuo espeso se redisolvió en
HCl 6N y se filtró a través de celita. El disolvente se eliminó
nuevamente a presión reducida para proporcionar el ácido
2-hidroxi-4-nitro-fenilacético
deseado como un sólido claro, rojo marrón (rendimiento 40%). El
producto (IV-a) se usó en la siguiente etapa sin
purificación adicional.
C2. Se disolvió el producto IV-a
(765 mg, 3,88 mmoles) en THF recientemente destilado (5 ml) en
atmósfera de argón. La disolución se enfrió hasta 0ºC, y se añadió
gota a gota borano-THF (1,0 M en THF, 9,7 ml, 9,7
mmoles, 2,5 eq.) mediante una jeringuilla, con evolución aparente
de hidrógeno. La reacción se dejó agitar durante 16 h adicionales,
calentando lentamente hasta temperatura ambiente. La reacción se
paralizó mediante adición lenta de HCl 1M (con burbujeo violento),
y 10 ml de acetato de etilo. La capas se separaron, y la capa acuosa
se extrajo cinco veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas
combinadas se lavaron con salmuera, y se secaron sobre sulfato de
magnesio. El disolvente se evaporó a vacío, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna rápida (hexano:acetato
de etilo 1:1) para proporcionar el nitroalcohol deseado
(IV-b) como un sólido amarillo pálido (rendimiento
85%).
C3. Se disolvió el nitroalcohol
(IV-b) (150 mg, 0,819 mmoles) en DMF seca (5 ml)
que contiene dicarbonato de
di-t-butilo (190 mg, 1,05 eq.) y Pd
al 10% sobre C (10 mg). La mezcla se colocó en un aparato Parr, y
se sometió a presión/se purgó cinco veces. La disolución se sometió
a presión entonces hasta 47 psi, y se dejó agitar durante 24 h. La
reacción se paralizó mediante filtración a través de celita, y el
disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó
mediante cromatografía en columna (hexano:acetato de etilo 1:1)
para proporcionar el producto de anilina protegido
(IV-c) como un sólido cristalino con un rendimiento
de 70%.
C4. Se disolvió TBDMS-C1 (48 mg,
0,316 mmoles) en diclorometano recientemente destilado (4 ml) en
una atmósfera de argón. A esta disolución se añadió imidazol (24
mg, 0,347 mmoles, 1,1 eq.) e inmediatamente se formó un precipitado
blanco. La disolución se agitó durante 30 min a temperatura
ambiente, en cuyo momento se añadió rápidamente el producto
IV-c (80 mg, 0,316 mmoles, 1.0 eq) como una
disolución en diclorometano/THF (1,0 ml). La mezcla resultante se
dejó agitar durante 18 h adicionales, a temperatura ambiente. La
reacción se paralizó por adición de cloruro de amonio saturado
acuoso. Las capas se separaron, y la fase acuosa se extrajo 3 veces
con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinadas se lavaron
con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio. La fase orgánica
se concentró para proporcionar el producto de
silil-éter-fenol (IV-d) como un
aceite amarillo pálido (rendimiento de 90%).
C5. Se disolvió el
silil-éter-fenol IV-d (150 mg, 0,408
mmoles) en THF recientemente destilado (7 ml) en argón, y la
disolución se enfrió hasta 0ºC. Entonces se añadió gota a gota
n-BuLi (2,3 M en hexano, 214 ul) mediante una
jeringuilla. Se observó inmediatamente un cambio de color de
amarillo pálido a rojo intenso. Después de 5 minutos, se añadió
rápidamente pirofosfato de tetrabencilo (242 mg, 0,45 mmoles, 1,1
eq) a la disolución en agitación con argón. La disolución se agitó
durante 18 h adicionales en atmósfera inerte, calentando lentamente
hasta temperatura ambiente, durante lo cual se formó un precipitado
blanco. La reacción se paralizó por adición de cloruro de amonio
saturado acuoso, y 10 ml de acetato de etilo. Se separaron las
capas, y la capa acuosa se extrajo cinco veces con acetato de
etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, y se
secaron sobre sulfato de magnesio. El disolvente se eliminó por
evaporación, y el residuo se purificó mediante cromatografía en
columna rápida (hexano:acetato de etilo 1:1) para proporcionar el
éter de silil-fosfato deseado (IV-e)
como un aceite naranja pálido (rendimiento de 90%).
C6. Se disolvió el éter de
silil-fosfato (IV-e) (10 mg, 0,0159
mmoles) en 2 ml de etanol seco a temperatura ambiente. A la
disolución agitada se añadió 20 ul de HCl concentrado (disolución
1% v:v), y la mezcla se dejó agitar hasta que el análisis de TLC
indicó que la reacción estuvo terminada. Se añadió carbonato de
potasio sólido para paralizar la reacción, y la mezcla se filtró
rápidamente a través de gel de sílice, y se concentró para dar el
producto de alcohol/fosfato de dibencilo bruto
(IV-f) como un aceite amarillo pálido (rendimiento
de 100%).
C7. Se disolvió el alcohol IV-f
(78 mg, 0,152 mmoles) en diclorometano recientemente destilado (10
ml) en una atmósfera de argón. A la disolución se añadió
peryodinano de Dess-Martin (90 mg, 0,213 mmoles, 1,4
eq). La disolución se dejó agitar, y el transcurso de la reacción
se monitorizó mediante análisis de TLC. Una vez que la TCL indicó
que se había terminado la reacción, ésta se paralizó mediante
adición de bicarbonato de sodio acuoso saturado:tiosulfito de sodio
acuoso saturado 1:1. La mezcla bifásica se dejó agitar durante 1 h a
temperatura ambiente. Se separaron las capas, y la fase acuosa se
extrajo 3 veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas
combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de
sodio. El disolvente se eliminó a presión reducida para
proporcionar el producto aldehídico (IV-g) como un
aceite bronceado pálido (rendimiento de 100%).
C8. Se disolvió el aldehído IV-g
(78 mg, 0,152 mmoles) en t-butanol/agua (3,5 ml) en
una atmósfera inerte. A la disolución en agitación se añadió
rápidamente
2-metil-2-buteno
(1,0 M en THF, 1,5 ml), fosfato monobásico de sodio (105 mg, 0,76
mmoles, 5 eq) y clorito de sodio (69 mg, 0,76 mmoles, 5 eq). Se
dejó que la disolución se agitara durante 8 horas adicionales a
temperatura ambiente. La disolución se concentró, y el residuo se
acidificó y se extrajo con acetato de etilo 3 veces. Las fases
orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio. La
disolución se concentró nuevamente a presión reducida, y el residuo
se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de
etilo:hexano 2:1) para dar el ácido carboxílico/fosfato de dibencilo
(IV-h) deseado como un aceite amarillo pálido
(rendimiento 65%).
C9. Se disolvió el ácido IV-h
(8,0 mg, 0,0512 mmoles, 1,1 eq) en diclorometano recientemente
destilado (2 ml) en argón a temperatura ambiente. A esta mezcla se
añadió paclitaxel (12 mg, 0,0138 mmoles, 1 eq), seguido de DMAP (2
mg, 0,0138 mmoles, 1 eq) y DCC (3,2 mg, 0,0152 mmoles, 1,1 eq). La
mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 4 h
adicionales, durante las cuales se formó un precipitado pálido. Una
vez que el análisis de TLC indicó que la reacción estaba completa,
se eliminó el disolvente a presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna rápida (hexano:acetato de
etilo 1:1) para proporcionar éster de carboxilato C2' de paclitaxel
(IV-i) como un sólido blanco cristalino
(rendimiento 65%).
C10. El éster IV-i (5,0 mg) se
disolvió en ácido fórmico puro (1,0 ml) en atmósfera de argón, a
temperatura ambiente, y se dejó agitar durante 30 minutos. Una vez
que la TLC indicó que la reacción estaba terminada, la disolución se
concentró a presión reducida, y el residuo se purificó mediante
filtración rápida a través de gel de sílice, para dar el compuesto
de anilina/taxol (IV-j) deseado con un rendimiento
de 50% como un polvo blanco.
C11. A una disolución de
AcHN-RRRRRRR-CO2H protegido con
(poli-di-CBZ) (1,2 eq, 0,1 a 1,0 M)
en DMF seca se añadió hexafluorofosfato de
O-benzotriazoliloxitetrametil-uronio
(HATU, 1,0 eq), y una cantidad catalítica de DMAP (0,2 eq). La
disolución se agitó en atmósfera inerte durante 5 minutos, a
temperatura ambiente. A esta mezcla se añadió entonces el derivado
de Taxol/anilina (IV-j) como una disolución en DMF
seca (volumen mínimo para disolver). La disolución resultante se
agitó durante 5 h adicionales, a temperatura ambiente. La reacción
se terminó concentrando la mezcla de reacción a presión reducida.
La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante HPLC para
proporcionar el material deseado (IV, fig. 6D).
Se disolvieron 3,93 g de DTPA en 100 ml de HEPES,
y se añadieron 1,52 ml de disolución atómica estándar de cloruro de
europio (Aldrich) disuelta en 8 ml de tampón HEPES, y se ajustó
durante 30 minutos a temperatura ambiente. La separación
cromatográfica y la liofilización da un complejo de quelato de
Eu-DTPA. Este complejo se conjuga entonces al
término amino de un polipéptido mediante química de péptidos en
fase sólida. La captación celular del ion europio se puede
monitorizar mediante fluorescencia de tiempo fijado.
Los conjugados de PNA con péptidos se
sintetizaron usando química de fase sólida con reactivos Fmoc
comercialmente disponibles (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA)
en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433A o en un
sistema sintetizador de ácidos nucleicos Millipore Expedite. Los
polímeros de D- o L-arginina se unieron a los
términos amino o carboxilo de los PNA, que son análogos a los
extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos, respectivamente. Los
conjugados también se modificaron para incluir fluoresceína o
biotina, añadiendo un espaciador de ácido aminocaproico al término
amino del conjugado, y después uniendo biotina o fluoresceína. Lo
conjugados de PNA/péptidos se rompieron de la resina en fase sólida
usando TFA al 95%, triisopropilsilano al 2,5%, y fenol acuoso al
2,5%. La resina se eliminó por filtración, y el ácido residual se
eliminó por evaporación. El producto se purificó mediante HPLC
usando una columna de fase inversa C18, y el producto se liofilizó.
Los conjugados deseados de PNA/polímero se identificaron usando
espectrometría de masas por desorción con láser.
1. Conjugados de PNA/péptido. Se
prepararon los siguientes conjugados de PNA sentido y
antisentido/péptidos para inhibir la producción de
gamma-IFN, en los que r = D-arginina
y R = L-arginina:
Sentido:
NH_{2}-rrrrrrr-AACGCTACAC-COOH | (SEQ ID NO:18) |
Antisentido:
NH_{2}-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH | (SEQ ID NO:19) |
Antisentido
fluorescente:
X-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH | (X-SEQ ID NO:19) |
en la que
X=fluoresceína/aminocaproato
Antisentido
biotinilado:
Z-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH | (Z-SEQ ID NO:19) |
en la que
Z=biotina/aminocaproato
2. Captación por células T. Para mostrar
que los conjugados de PNA/poliarginina entran en las células de
forma efectiva, se sintetizó el conjugado antisentido fluorescente
anterior (X-SEQ ID NO:19), conjugando isotiocianato
de fluoresceína al término amino de SEQ ID NO:18, usando un
espaciador de ácido aminocaproico.
La captación celular se determinó incubando la
estirpe de células T humanas Jurkat (5 x 10^{5} células/pocillo)
pretratadas durante 30 minutos con azida de sodio al 0,5% o
disolución salina tamponada con fosfato, con cantidades variables
(100 nM hasta 50 \muM) del conjugado de PNA sentido y antisentido
con r7, marcado con fluoresceína, así como el PNA antisentido solo
(sin el segmento r7). La cantidad de Pna antisentido que entró a
las células se analizó mediante microscopia confocal y FACS. En
ambos casos, las señales fluorescentes estaban presentes sólo en
células no expuestas a azida, y la señal fluorescente dependió de
la dosis del conjugado fluorescente y de la temperatura y duración
de incubación.
3. Ensayo de gamma-IFN. Se
midió la cantidad de gamma-interferón segregada por
la estirpe de célula T de múrido (clon 11,3), incubando 10^{5}
células T con cantidades variables de antígeno (péptido que consta
de restos 110-121 de mioglobina de esperma de
ballena) y células de bazo histocompatibles procedentes de ratones
DBA/2 (H-2d, 5 x 10^{5}), que actúan como células
que presentan antígeno (APC), en placas de 96 pocillos. Después de
la incubación durante 24 horas a 37ºC, se transfirieron 100 \mul
de los sobrenadantes a placas de microtitulación revestidas con
anticuerpos monoclonales
anti-gamma-IFN comercialmente
disponibles (Mab) (Pharmigen, San Diego, CA). Después de la
incubación durante una hora a temperatura ambiente, las placas se
lavaron con PBS que contiene suero fetal de ternero al 1% y Tween
20 al 0,1%, después de lo cual se añadió un segundo Mab
gamma-IFN biotinilado. Después de una segunda hora
de incubación, las placas se lavaron como antes, y se añadió
europio (Eu)-estreptavidina
(Delphia-Pharmacia). Nuevamente, después de una hora
de incubación, se añadió un tampón ácido para liberar el Eu, que se
midió mediante fluorometría de tiempo fijado, en un lector de
placas Delphia. La cantidad de fluorescencia fue proporcional a la
cantidad de gamma-IFN que se había producido, y se
pudo cuantificar de forma precisa usando cantidades conocidas de
gamma-IFN para crear una curva estándar.
4. Inhibición de la producción de
gamma-IFN mediante los conjugados. Se analizó
la capacidad de los conjugados de PNA/poliarginina para inhibir la
secreción de gamma-IFN, añadiendo diversas
concentraciones de los conjugados anteriores de
gamma-IFN con dosis por debajo de las óptimas de
antígeno peptídico (0,5 \muM), a una mezcla de células T de clon
11.3 y células de bazo histocompatibles. También se ensayaron las
secuencias de PNA que carecen de los restos de poliarginina, y el
heptámero de D-arginina no conjugado.
Después de 24 horas, se tomaron alícuotas de los
sobrenadantes cultivados, y se midió la cantidad de
gamma-IFN usando el ensayo de unión al fluorescente
descrito en la sección 3 anterior. El tratamiento de las células con
el conjugado de PNA antisentido/r7 dio como resultado una reducción
de alrededor de 70% en la secreción de IFN, mientras que cantidades
molares equivalentes de PNA sentido/r7, PNA antisentido que carece
de r7, o r7 solo, no mostraron ninguna inhibición (fig. 7).
Se formó un conjugado de ovoalbúmina acoplado a
un heptámero de poli-L-arginina
haciendo reaccionar un polímero polipeptídico que contiene citeína
(Cys-Ala-Ala-Ala-Arg_{7},
SEQ ID NO:21) con ovoalbúmina (45 kDa) en presencia de
sulfo-MBS, un agente reticulante heterobifuncional
(Pierce Chemical Co., Rockford, IL). La relación molar de péptido
conjugado a ovoalbúmina se cuantificó mediante análisis de
aminoácidos. El producto conjugado se denominó
OV-R7. El conjugado se añadió (concentración final
\approx 10 \muM) a las células B, también denominadas como
células que presentan antígenos (APC), que se aislaron según
procedimientos estándar. Las APC se incubaron con
OV-R7, y después se añadieron a una preparación de
linfocitos T citotóxicos aislados mediante procedimientos estándar.
La exposición de los CTL a las APC que se habían incubado con
OV-R7 produjo CTL específicos para albúmina CD8+.
Por el contrario, las APC que se habían expuesto a ovoalbúmina sin
modificar no estimularon los CTL.
En otro experimento, se expusieron células
dendríticas histocompatibles (un tipo específico de APC) a
conjugados de albúmina/R7, y después se inyectaron en ratones. El
análisis subsiguiente de la sangre procedente de estos ratones
reveló la presencia de CTL específicos de albúmina. A los ratones
del control se les dio células dendríticas que se habían expuesto a
albúmina sin modificar. Los ratones del control no mostraron la
respuesta de CTL específica para albúmina.
Se sintetizó un conjugado que consta de una parte
de la región de cola citoplásmica C terminal de V7 (una proteína de
la superficie de leucocitos), que tiene la secuencia KLSTLRSNT (SEQ
ID NO:22; Ruegg y col., 1995), con 7 restos de arginina unidos a su
término C según procedimiento estándar usando un sintetizador de
péptidos (Applied Biosystems modelo 433). El conjugado se añadió
(concentración final \approx 10 \muM) a células T que se habían
aislado mediante procedimientos estándar, y se incubó a 37ºC
durante varias horas toda la noche. Las células se lisaron usando
detergente (Triton X-100 al 1%). Se eliminó el ADN,
y la fracción soluble (que contiene la proteína) se sometió a
inmunoprecipitación con un anticuerpo monoclonal de múrido
anti-V7 en combinación con IgG antirratón de cabra.
La RAF-1 es una quinasa que se asocia con, y se
inactiva por asociación con, V7.
En ausencia de tratamiento peptídico, la proteína
RAF-1 coprecipitó con V7. En células tratadas con
el péptido, la proteína RAF-1 se eliminó del
inmunocomplejo V7. Los mismos péptidos fueron incapaces de
interrumpir el complejo que consta de RAF-1 y p21
Ras, excluyendo la modificación no específica de
RAF-1 por el péptido V7.
En un segundo estudio, la porción del péptido V7
del conjugado de V7/poliarginina se fosforiló in vitro
usando proteína quinasa C. Los precipitados
anti-RAF 1 de células T que habían sido expuestas a
péptidos de cola de V7 fosforilados, pero no al péptido de cola V7
sin fosforilar, demostraron inhibición potente de la actividad de
RAF-quinasa.
Aunque la invención se ha descrito con referencia
a procedimientos y realizaciones específicos, será notorio que se
pueden realizar diversas modificaciones y cambios.
Claims (41)
1. Conjugado compuesto por un agente
biológicamente activo unido covalentemente a un soporte polimérico
que tiene una cadena principal no peptídica, en el que el soporte
polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos
el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye
un grupo guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de
tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es
efectivo para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo
que es transportada a través de una membrana biológica con relación
a la cantidad del agente que se puede transportar a través de la
membrana biológica en forma no conjugada.
2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que
el soporte polimérico es efectivo para aumentar la cantidad del
agente biológicamente activo que es transportado a través de un
membrana biológica en al menos dos veces, opcionalmente en al menos
seis veces, con relación a la cantidad del agente que se puede
transportar a través de la membrana biológica cuando el agente está
conjugado a un péptido tat básico de VIH que consta de restos
49-57.
3. Conjugado según la reivindicación 1, en el que
el soporte polimérico es también efectivo para aumentar la
velocidad a la que el agente biológicamente activo es transportado
a través de una membrana biológica con relación a la velocidad a la
que el agente se puede transportar a través de la membrana
biológica en forma no conjugada.
4. Conjugado según la reivindicación 3, en el que
el soporte polimérico es efectivo para aumentar la velocidad a la
que el agente biológicamente activo es transportado a través de una
membrana biológica en al menos dos veces, opcionalmente en al menos
seis veces, con relación a la velocidad a la que el agente se puede
transportar a través de la membrana biológica cuando el agente está
conjugado a un péptido tat básico de VIH que consta de restos
49-57.
5. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el agente biológicamente
activo está unido covalentemente al soporte mediante un enlace
rompible, y en el que el enlace es rompible in vivo.
6. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el soporte polimérico consta
de 6 a 25 subunidades contiguas, cada una de las cuales contiene un
resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino
terminal.
7. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la cadena principal no
peptídica es una cadena principal de peptoide, y las subunidades
son subunidades de glicina N-sustituidas.
8. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la cadena principal no peptídica
comprende restos alquílicos unidos por enlaces carbamato.
9. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cadena principal no peptídica
se selecciona del grupo que consta de restos alquilénicos unidos
por tioéteres, grupos sulfonilo, grupos carbamato, polietileniminas
o aminoaldehídos, ésteres de hidroxiácidos, y análogos aza en los
que el carbono en alfa se sustituye por nitrógeno, opcionalmente en
el que la cadena principal no peptídica comprende subunidades
peptoides, de malonato y/o
gem-diaminoalquílicas.
10. Conjugado según la reivindicación 1, en el
que la cadena principal no peptídica comprende enlaces
seleccionados del grupo que consta de enlaces de amida
N-sustituida, éster, cetometileno, metilenamino,
tioamida, fosfinato, fosfonamidato, éster de fosfonamidato,
retropéptido, trans-alqueno, fluoroalqueno,
dimetileno, tioéter, hidroxietileno, metilenoxi, tetrazol,
retrotioamida, sulfonamido, metilensulfonamido,
retrosulfonamido.
11. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que cada uno de dicho grupo
guanidino o amidino terminal está unido a la cadena principal
mediante una cadena lateral que comprende al menos alrededor de 2
átomos de cadena, seleccionados del grupo que consta de carbono,
oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno, y sus combinaciones.
12. Conjugado según la reivindicación 11, en el
que el enlace de cadena lateral contiene 2 a 5 átomos de
cadena.
13. Conjugado según la reivindicación 11, en el
que la cadena lateral tiene la estructura -(CH_{2})_{n}-
en la que n es un número entero en el intervalo de 2 a 5,
inclusive.
14. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente biológicamente activo
es una pequeña molécula orgánica.
15. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, que incluye además un soporte polimérico
adicional conjugado covalentemente al agente biológicamente activo,
en el que el soporte polimérico adicional tiene una cadena
principal no peptídica, consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales
al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que
incluye un grupo guanidino o amidino terminal, y contiene al menos
seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino.
\newpage
16. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, que incluye además un agente
biológicamente activo adicional conjugado covalentemente al
soporte.
17. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 16, en el que el enlace rompible es rompible
enzimáticamente, es rompible químicamente, o es fotorrompible.
18. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 17, en el que el enlace rompible comprende un
enlace carbamato, éster, tioéter, disulfuro o hidrazona.
19. Conjugado según la reivindicación 18, en el
que el enlace rompible comprende un enlace éster o un enlace
disulfuro.
20. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 19, en el que el enlace rompible contiene un
primer grupo rompible que está distante del agente biológicamente
activo, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente
biológicamente activo, de forma que la ruptura del primer grupo
rompible produce un conjugado de grupo enlace/agente biológicamente
activo que contiene un resto nucleófilo que reacciona
intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible,
liberando de ese modo el agente biológicamente activo del grupo
enlace y del soporte.
21. Procedimiento para mejorar el transporte de
un agente biológicamente activo a través de una membrana biológica,
comprendiendo el procedimiento:
- poner en contacto, in vitro, la membrana biológica con un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20;
- con lo que dicha puesta en contacto es efectiva para aumentar el suministro del conjugado a través de la membrana biológica, comparada con el suministro del agente biológicamente activo a través de la membrana en forma no conjugada.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que el agente biológicamente activo está unido covalentemente al
soporte mediante un enlace rompible, en el que el enlace es
rompible in vivo.
23. Procedimiento según la reivindicación 21 o
reivindicación 22, en el que la membrana biológica es una membrana
de célula eucariota.
24. Procedimiento según la reivindicación 21 o la
reivindicación 22, en el que la membrana biológica es una membrana
de célula procariota.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en el que el enlace rompible se rompe
para liberar el agente biológicamente activo tras pasar a través de
la membrana biológica.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que el enlace rompible es un enlace enzimáticamente rompible, y
el agente biológicamente activo libre se libera al poner en
contacto el conjugado con una enzima que rompe al enlace.
27. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que el enlace rompible es un enlace fotorrompible, y el agente
biológicamente activo libre se libera al poner en contacto el
conjugado con la luz.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en el que el enlace rompible es un enlace
químicamente rompible.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que el enlace rompible comprende un enlace disulfuro, y la
ruptura del enlace se efectúa por reducción o intercambio de
disulfuro.
30. Uso de un soporte polimérico que tiene una
cadena principal no peptídica, para la preparación de un
medicamento para aumentar la cantidad de agente biológicamente
activo que es transportada a través de una membrana biológica con
relación a la cantidad de agente que se puede transportar a través
de la membrana biológica en forma no conjugada, en el que
- el agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte polimérico, y
- el soporte polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, y (b) contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino.
31. Uso según la reivindicación 30, en el que el
agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte
mediante un enlace rompible, y el enlace es rompible in
vivo.
32. Uso según la reivindicación 30 ó 31, en el
que el soporte polimérico consta de 6 a 25 subunidades contiguas,
cada una de las cuales contiene un resto de cadena lateral que
incluye un grupo guanidino o amidino terminal.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30 a 32, en el que la cadena principal no peptídica es una cadena
principal de peptoide, y las subunidades son subunidades de glicina
N-sustituidas.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30 a 32, en el que la cadena principal no peptídica comprende
restos alquílicos unidos por enlaces carbamato.
35. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30 a 34, en el que cada uno de dicho grupo guanidino o amidino
terminal está unido a la cadena principal mediante una cadena
lateral que comprende al menos alrededor de 2 átomos de cadena,
seleccionados del grupo que consta de carbono, oxígeno, azufre,
fósforo y nitrógeno, o sus combinaciones.
36. Uso según la reivindicación 35, en el que el
enlace de cadena lateral contiene 2 a 5 átomos de cadena.
37. Uso según la reivindicación 35, en el que la
cadena lateral tiene la estructura -(CH_{2})_{n}- en la
que n es un número entero en el intervalo de 2 a 5, inclusive.
38. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30 a 37, en el que el enlace rompible comprende un enlace
carbamato, éster, tioéter, disulfuro o hidrazona.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30 a 37, en el que el enlace rompible contiene un primer grupo
rompible que está distante del agente biológicamente activo, y un
segundo grupo rompible que está próximo al agente biológicamente
activo, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce
un conjugado de grupo enlace/agente biológicamente activo que
contiene un resto nucleófilo que reacciona intramolecularmente para
romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente
biológicamente activo del grupo enlace y del soporte.
40. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que el agente biológicamente activo
es (a) un ácido nucleico; (b) un oligonucleótido; (c) un
polinucleótido; (d) un péptido, por ejemplo, un polipéptido efector
o un fragmento receptor, tal como RAF-1; (e) una
proteína, por ejemplo, una enzima, un antígeno, un anticuerpo, o un
fragmento de anticuerpo; (f) un ácido nucleico de proteína; (g) un
polisacárido; (h) un agente antimicrobiano; o (i) un agente contra
el cáncer.
41. Composición farmacéutica para la
administración de un agente biológicamente activo cuya eficacia en
forma no conjugada está limitada por su solubilidad acuosa, estando
dicha composición compuesta por el agente biológicamente activo y,
unido covalentemente al mismo, un soporte polimérico que tiene una
cadena principal no peptídica, en el que el soporte polimérico (a)
consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están
sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo
guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de tales
restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es efectivo
para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es
transportada a través de una membrana biológica con relación a la
cantidad del agente que se puede transportar a través de la
membrana biológica en forma no conjugada.
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CN1260006A (zh) | 1996-02-26 | 2000-07-12 | 加利福尼亚州技术学院 | 双链dna和杂环低聚物之间复合物的形成 |
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
US20070092563A1 (en) * | 1996-10-01 | 2007-04-26 | Abraxis Bioscience, Inc. | Novel formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof |
JP2002502376A (ja) * | 1997-05-21 | 2002-01-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法 |
US7135191B2 (en) * | 1997-09-04 | 2006-11-14 | Zsolt Istvan Hertelendy | Urogenital or anorectal transmucosal vaccine delivery system |
US6958148B1 (en) * | 1998-01-20 | 2005-10-25 | Pericor Science, Inc. | Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase |
WO1999046283A1 (en) | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
US20040063618A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Muthiah Manoharan | Peptide nucleic acids having improved uptake and tissue distribution |
US8038984B2 (en) | 1998-06-20 | 2011-10-18 | Washington University | Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis |
AU755564B2 (en) | 1998-06-20 | 2002-12-12 | Washington University | Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy |
US6589503B1 (en) | 1998-06-20 | 2003-07-08 | Washington University | Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy |
US7306784B2 (en) | 1998-06-20 | 2007-12-11 | Washington University | Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy |
EP1220902A2 (en) * | 1998-11-11 | 2002-07-10 | Pantheco A/S | Conjugates between a peptide and a nucleic acid analog, such as a pna, lna or a morpholino |
DK173006B1 (da) * | 1998-11-11 | 1999-11-01 | Ke Burgmann As | Fremgangsmåde og anlæg til frembringelse af vægmateriale til brug ved fremstilling af kompensatorer, navnlig til røggaskanaler, samt kompensatormateriale og kompensator frembragt ved fremgangsmåden |
US6548651B1 (en) | 1998-11-11 | 2003-04-15 | Pantheco A/S | Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules |
US7018654B2 (en) * | 1999-03-05 | 2006-03-28 | New River Pharmaceuticals Inc. | Pharmaceutical composition containing an active agent in an amino acid copolymer structure |
US7060708B2 (en) | 1999-03-10 | 2006-06-13 | New River Pharmaceuticals Inc. | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
US6716452B1 (en) * | 2000-08-22 | 2004-04-06 | New River Pharmaceuticals Inc. | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
MXPA01009971A (es) * | 1999-04-05 | 2002-07-30 | Millennium Pharm Inc | Arreglos de formulaciones y sus usos. |
DE60033932T2 (de) * | 1999-06-05 | 2007-12-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford | Methode und zusammensetzung zur inhibierung von kardiovaskulärer zellproliferation |
EP1656945A1 (en) * | 1999-06-05 | 2006-05-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Pharmaceutical composition comprising oligoarginine |
MXPA02000890A (es) * | 1999-07-28 | 2003-10-15 | Transform Pharmaceuticals Inc | Conjuntos de muestras y analisi de alto rendimiento de las mismas para detectar interacciones. |
US20050226890A1 (en) * | 1999-08-12 | 2005-10-13 | Cohen David I | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
KR100345214B1 (ko) * | 1999-08-17 | 2002-07-25 | 이강춘 | 생체적합성 고분자가 수식된 펩타이드의 비점막 전달 |
US6669951B2 (en) * | 1999-08-24 | 2003-12-30 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues |
EP1210121A2 (en) * | 1999-08-24 | 2002-06-05 | Cellgate Inc. | Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties |
US7229961B2 (en) | 1999-08-24 | 2007-06-12 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues |
US6730293B1 (en) | 1999-08-24 | 2004-05-04 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin |
US6864355B1 (en) | 2000-05-02 | 2005-03-08 | Yale University | Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain |
US8183339B1 (en) | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
US20040082509A1 (en) | 1999-10-12 | 2004-04-29 | Christophe Bonny | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
JP2003511068A (ja) * | 1999-10-13 | 2003-03-25 | パンセコ・アクティーゼルスカブ | Pnaを使用した遺伝子選択 |
DE60032633T2 (de) * | 1999-11-24 | 2007-10-04 | Immunogen Inc., Cambridge | Zytotoxische mittel, die taxane enthalten und ihre therapeutische anwendung |
DE60038695T2 (de) * | 1999-11-29 | 2009-05-28 | Avi Biopharma, Inc., Corvallis | Gegen bakterielle 16s und 23s rrnas gerichtete ungeladene antisense oligonukleotide und deren verwendungen |
JP2003518946A (ja) * | 2000-01-04 | 2003-06-17 | エイブイアイ バイオファーマ, インコーポレイテッド | アンチセンス抗細菌性細胞分裂組成物、およびその方法 |
US7108970B2 (en) | 2000-01-07 | 2006-09-19 | Transform Pharmaceuticals, Inc. | Rapid identification of conditions, compounds, or compositions that inhibit, prevent, induce, modify, or reverse transitions of physical state |
US6977723B2 (en) | 2000-01-07 | 2005-12-20 | Transform Pharmaceuticals, Inc. | Apparatus and method for high-throughput preparation and spectroscopic classification and characterization of compositions |
US20020009491A1 (en) * | 2000-02-14 | 2002-01-24 | Rothbard Jonathan B. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues |
US6749865B2 (en) | 2000-02-15 | 2004-06-15 | Genzyme Corporation | Modification of biopolymers for improved drug delivery |
AU2001238346A1 (en) | 2000-02-15 | 2001-08-27 | Genzyme Corporation | Modification of biopolymers for improved drug delivery |
US7078536B2 (en) | 2001-03-14 | 2006-07-18 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Charged compounds comprising a nucleic acid binding moiety and uses therefor |
EP1265921B1 (en) | 2000-03-16 | 2007-05-23 | Genesoft, Inc. | Charged compounds comprising a nucleic acid binding moiety and uses therefor |
WO2001076636A2 (en) * | 2000-04-06 | 2001-10-18 | Pantheco A/S | Pharmaceutical composition of modified pna molecules |
GB0008563D0 (en) | 2000-04-07 | 2000-05-24 | Cambridge Discovery Chemistry | Investigating different physical and/or chemical forms of materials |
US7049395B2 (en) | 2000-05-02 | 2006-05-23 | Yale University | Anti-inflammatory compounds and uses thereof |
US6784291B2 (en) | 2000-05-04 | 2004-08-31 | Avi Biopharma, Inc. | Splice-region antisense composition and method |
IL154044A0 (en) * | 2000-07-21 | 2003-07-31 | Essentia Biosystems Inc | Multi-component pharmaceutical compositions containing a complex of a positively charged backbone and a negatively charged backbone and methods for the preparation thereof |
US20040220100A1 (en) * | 2000-07-21 | 2004-11-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
WO2006033665A1 (en) * | 2004-03-16 | 2006-03-30 | Inist Inc. | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
WO2005090392A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-29 | Inist Inc. | Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same |
US7163918B2 (en) | 2000-08-22 | 2007-01-16 | New River Pharmaceuticals Inc. | Iodothyronine compositions |
US20020099013A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-07-25 | Thomas Piccariello | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
AU2002226876A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-15 | Quantum Dot Corporation | Cells having a spectral signature, and methods of preparation and use thereof |
US20050059031A1 (en) * | 2000-10-06 | 2005-03-17 | Quantum Dot Corporation | Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes |
US7033597B2 (en) * | 2000-10-13 | 2006-04-25 | Université de Lausanne | Intracellular delivery of biological effectors |
GB0026924D0 (en) * | 2000-11-03 | 2000-12-20 | Univ Cambridge Tech | Antibacterial agents |
US8394813B2 (en) | 2000-11-14 | 2013-03-12 | Shire Llc | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
WO2002042316A2 (en) * | 2000-11-24 | 2002-05-30 | Pantheco A/S | Pna analogues |
WO2002053574A2 (en) * | 2001-01-05 | 2002-07-11 | Pantheco A/S | Modified pna molecules |
JP2005508832A (ja) * | 2001-02-16 | 2005-04-07 | セルゲイト, インコーポレイテッド | 間隔を開けてアルギニン部分を含むトランスポーター |
WO2002076448A1 (en) | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Napro Biotherapeutics, Inc. | Molecular conjugates for use in treatment of cancer |
US7122626B2 (en) | 2001-04-26 | 2006-10-17 | Genesoft Pharmceuticals, Inc. | Halogen-substitued thienyl compounds |
US20030236198A1 (en) | 2001-06-13 | 2003-12-25 | Genesoft, Inc. | Antipathogenic benzamide compounds |
US6716866B2 (en) | 2001-06-13 | 2004-04-06 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Aryl-benzimidazole compounds having antiinfective activity |
US6777425B2 (en) | 2001-06-13 | 2004-08-17 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Isoquinoline compounds having antiinfective activity |
EP1470119A4 (en) | 2001-06-13 | 2005-10-19 | Genesoft Pharmaceuticals Inc | BENZOTHIOPHENE COMPOUNDS WITH ANTI-INFECTIOUS ACTIVITY |
US7033991B2 (en) * | 2001-07-16 | 2006-04-25 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agriculture And Mechanical College | Inhibiting furin with polybasic peptides |
US7618937B2 (en) * | 2001-07-20 | 2009-11-17 | Northwestern University | Peptidomimetic polymers for antifouling surfaces |
US7858679B2 (en) * | 2001-07-20 | 2010-12-28 | Northwestern University | Polymeric compositions and related methods of use |
US8815793B2 (en) * | 2001-07-20 | 2014-08-26 | Northwestern University | Polymeric compositions and related methods of use |
US20060264608A1 (en) * | 2001-08-03 | 2006-11-23 | Wender Paul A | Bi-directional synthesis of oligoguanidine transport agents |
MXPA04001142A (es) * | 2001-08-03 | 2004-09-13 | Univ Leland Stanford Junior | Sintesis bidireccional de agentes de transporte de oligoguanidina. |
US20030119060A1 (en) | 2001-08-10 | 2003-06-26 | Desrosiers Peter J. | Apparatuses and methods for creating and testing pre-formulations and systems for same |
US7375083B2 (en) * | 2003-09-30 | 2008-05-20 | Shire Llc | Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse |
US7338939B2 (en) * | 2003-09-30 | 2008-03-04 | New River Pharmaceuticals Inc. | Abuse-resistant hydrocodone compounds |
US7169752B2 (en) * | 2003-09-30 | 2007-01-30 | New River Pharmaceuticals Inc. | Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone |
US20070066537A1 (en) * | 2002-02-22 | 2007-03-22 | New River Pharmaceuticals Inc. | Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone |
US7375082B2 (en) * | 2002-02-22 | 2008-05-20 | Shire Llc | Abuse-resistant hydrocodone compounds |
US20060014697A1 (en) | 2001-08-22 | 2006-01-19 | Travis Mickle | Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse |
EP1446008A4 (en) * | 2001-10-18 | 2006-08-16 | Essentia Biosystems Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR CONTROLLED RELEASE |
JP2005538035A (ja) * | 2001-12-11 | 2005-12-15 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | グアニジニウム輸送試薬および結合体 |
WO2003059192A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | C3 exoenzyme-coated stents and uses thereof for treating and preventing restenosis |
DE10201862A1 (de) * | 2002-01-18 | 2003-08-07 | Deutsches Krebsforsch | Konjugat zur Behandlung prokaryontischer Infektionen |
US7026166B2 (en) | 2002-01-22 | 2006-04-11 | Chiron Corporation | Fluorogenic dyes |
AU2003207744A1 (en) * | 2002-01-30 | 2003-09-02 | Yale University | Transport peptides and uses therefor |
US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
WO2003064625A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Sequitur, Inc. | Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency |
US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
US7700561B2 (en) * | 2002-02-22 | 2010-04-20 | Shire Llc | Abuse-resistant amphetamine prodrugs |
EP1482894A4 (en) * | 2002-02-22 | 2007-08-29 | Essentia Biosystems Inc | COSMETIC FORMULATIONS WITH L-ARGININE OLIGOMERS |
IL163667A0 (en) * | 2002-02-22 | 2005-12-18 | New River Pharmaceuticals Inc | Novel sustained release pharmaceutical compounds to preventabuse of controlled substances |
US7659253B2 (en) * | 2002-02-22 | 2010-02-09 | Shire Llc | Abuse-resistant amphetamine prodrugs |
AU2003217676B2 (en) | 2002-02-22 | 2009-06-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
US7105486B2 (en) * | 2002-02-22 | 2006-09-12 | New River Pharmaceuticals Inc. | Abuse-resistant amphetamine compounds |
WO2003092736A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Pantheco A/S | Peptide nucleic acid conjugates with transporter peptides |
SE0201863D0 (en) * | 2002-06-18 | 2002-06-18 | Cepep Ab | Cell penetrating peptides |
US7056523B1 (en) | 2002-06-21 | 2006-06-06 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Implantable medical devices incorporating chemically conjugated polymers and oligomers of L-arginine |
US7217426B1 (en) | 2002-06-21 | 2007-05-15 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Coatings containing polycationic peptides for cardiovascular therapy |
US7033602B1 (en) | 2002-06-21 | 2006-04-25 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Polycationic peptide coatings and methods of coating implantable medical devices |
US8506617B1 (en) | 2002-06-21 | 2013-08-13 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Micronized peptide coated stent |
US7794743B2 (en) | 2002-06-21 | 2010-09-14 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Polycationic peptide coatings and methods of making the same |
EP1575508A2 (en) * | 2002-07-11 | 2005-09-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compositions and methods for the intracellular delivery of antibodies |
AU2003263793A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-02-09 | Lg Life Sciences | Dendrimers as molecular translocators |
US8911831B2 (en) * | 2002-07-19 | 2014-12-16 | Northwestern University | Surface independent, surface-modifying, multifunctional coatings and applications thereof |
WO2004012736A1 (en) | 2002-08-02 | 2004-02-12 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Biaryl compounds having anti-infective activity |
US7390898B2 (en) | 2002-08-02 | 2008-06-24 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use |
KR20050032110A (ko) | 2002-08-02 | 2005-04-06 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 신규의 효능을 갖는 탁산을 포함하는 세포독성제 및 그치료용도 |
CA2535760A1 (en) * | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Rima L. Mcleod | Apicomplexan pathways, inhibitiors, and drug delivery |
EE200200531A (et) * | 2002-09-17 | 2004-04-15 | O� InBio | Terapeutiliste rakkusisenevate antikehade saamineja kasutamine |
US7265129B2 (en) | 2002-10-25 | 2007-09-04 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Anti-infective biaryl compounds |
WO2004044136A2 (en) | 2002-11-05 | 2004-05-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation |
TR200502189T1 (tr) * | 2002-12-09 | 2007-01-22 | American Bioscience, Inc. | Kompozisyonlar ve farmakolojik etken maddelerin aktarımı için yöntemler. |
WO2004052304A2 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-24 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | Antibacterial compounds having a (pyrrole carboxamide)-(benzamide)-(imidazole carboxamide) motif |
ATE512674T1 (de) * | 2003-01-06 | 2011-07-15 | Angiochem Inc | Angiopep-1, verwandte verbindungen, und deren verwnedungen |
US8133881B2 (en) | 2003-01-13 | 2012-03-13 | Shire Llc | Carbohydrate conjugates to prevent abuse of controlled substances |
US7704756B2 (en) | 2003-01-21 | 2010-04-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Fluorogenic dyes |
US6969514B2 (en) * | 2003-02-05 | 2005-11-29 | Soll David B | Method for treating elevated intraocular pressure, including glaucoma |
US7166692B2 (en) * | 2003-03-04 | 2007-01-23 | Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. | Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids |
AU2004235396B2 (en) | 2003-04-29 | 2010-11-25 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for enhancing transport and antisense efficacy of nucleic acid analog into cells |
KR101159477B1 (ko) * | 2003-05-29 | 2012-07-02 | 샤이어 엘엘씨 | 남용 방지성 암페타민 화합물 |
US8008255B2 (en) * | 2003-05-30 | 2011-08-30 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for enhanced transmucosal delivery of peptides and proteins |
WO2005013905A2 (en) * | 2003-08-07 | 2005-02-17 | Avi Biopharma, Inc. | SENSE ANTIVIRAL COMPOUND AND METHOD FOR TREATING ssRNA VIRAL INFECTION |
US20050222068A1 (en) * | 2003-10-23 | 2005-10-06 | Mourich Dan V | Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells |
US7985401B2 (en) * | 2003-10-31 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of California | Peptides whose uptake by cells is controllable |
US7431915B2 (en) * | 2003-10-31 | 2008-10-07 | The Regents Of The University Of California | Peptides whose uptake by cells is controllable |
US7601511B2 (en) | 2003-11-12 | 2009-10-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Biotin-facilitated transport in gram negative bacteria |
WO2005072527A2 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-11 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression |
CA2557814A1 (en) | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Lumen Therapeutics, Llc | Compositions and methods for treating diseases |
CA3031270A1 (en) | 2004-03-03 | 2005-12-22 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport |
EP1729821B1 (en) | 2004-03-03 | 2013-07-17 | ReVance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins |
US9211248B2 (en) | 2004-03-03 | 2015-12-15 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins |
KR100578732B1 (ko) * | 2004-03-05 | 2006-05-12 | 학교법인 포항공과대학교 | 분자 수송체로서의 이노시톨 유도체 및 이의 제조방법 |
US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
US7402574B2 (en) * | 2004-03-12 | 2008-07-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense composition and method for treating cancer |
US20050288246A1 (en) * | 2004-05-24 | 2005-12-29 | Iversen Patrick L | Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method |
WO2005118884A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | A method for the rapid diagnosis of infectious disease by detection and quantitation of microorganism induced cytokines |
US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
WO2006085973A2 (en) * | 2004-07-02 | 2006-08-17 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
US8129352B2 (en) | 2004-09-16 | 2012-03-06 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection |
US8357664B2 (en) * | 2004-10-26 | 2013-01-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection |
US7524829B2 (en) * | 2004-11-01 | 2009-04-28 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection |
JP4690418B2 (ja) * | 2004-11-10 | 2011-06-01 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 多相ナノ粒子 |
US8241651B2 (en) * | 2004-11-10 | 2012-08-14 | The Regents Of The University Of Michigan | Multiphasic biofunctional nano-components and methods for use thereof |
US7947772B2 (en) * | 2004-11-10 | 2011-05-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Multiphasic nano-components comprising colorants |
US8043480B2 (en) * | 2004-11-10 | 2011-10-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for forming biodegradable nanocomponents with controlled shapes and sizes via electrified jetting |
EP1656951A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-17 | Xigen S.A. | Conjugates with enhanced cell uptake activity |
EP1814976B1 (en) * | 2004-11-16 | 2015-01-07 | Northwestern University | Peptidomimetic polymers for antifouling surfaces |
AU2006213686A1 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Avi Bio Pharma, Inc. | Antisense composition and method for treating muscle atrophy |
DK1988167T3 (da) | 2005-02-17 | 2020-07-13 | Univ Sorbonne | Intracellulære inhiberende peptider |
ES2383901T5 (es) * | 2005-02-18 | 2015-02-25 | Angiochem Inc. | Polipéptidos de aprotinina para transportar un compuesto a través de la barrera sangre-cerebro |
US20090016959A1 (en) * | 2005-02-18 | 2009-01-15 | Richard Beliveau | Delivery of antibodies to the central nervous system |
RU2007136616A (ru) | 2005-03-03 | 2009-04-10 | Риванс Терапьютикс, Инк. (Us) | Композиция и способ для местного применения и чрескожного введения ботулинового токсина |
SG160358A1 (en) * | 2005-03-03 | 2010-04-29 | Revance Therapeutics Inc | Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of an oligopeptide |
WO2006102267A2 (en) * | 2005-03-21 | 2006-09-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | New neuronal pain pathway |
US20060240032A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-26 | Hinrichs David J | Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases |
ES2351942T3 (es) | 2005-04-05 | 2011-02-14 | Allergan Inc | Analisis de la actividad de una toxina clostridial. |
US7973084B2 (en) * | 2005-04-28 | 2011-07-05 | Postech Academy-Industrial Foundation | Molecular transporters based on alditol or inositol and processes for the preparation thereof |
KR100699279B1 (ko) * | 2005-04-28 | 2007-03-23 | 학교법인 포항공과대학교 | 당 또는 당 유사체를 골격으로 하는 분자 수송체 및 그의제조방법 |
US20060293268A1 (en) * | 2005-05-05 | 2006-12-28 | Rieder Aida E | Antisense antiviral compounds and methods for treating foot and mouth disease |
US7790694B2 (en) * | 2005-07-13 | 2010-09-07 | Avi Biopharma Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8067571B2 (en) * | 2005-07-13 | 2011-11-29 | Avi Biopharma, Inc. | Antibacterial antisense oligonucleotide and method |
EP2233156B1 (en) | 2005-07-15 | 2013-05-01 | Angiochem Inc. | Use of aprotinin polypeptides as carriers in pharmaceutical conjugates |
US7538187B2 (en) * | 2005-08-01 | 2009-05-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Coloring compositions with peptide-based dispersants and binders |
US8524676B2 (en) * | 2005-09-08 | 2013-09-03 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds |
EP1937278B1 (en) * | 2005-09-08 | 2012-07-25 | AVI BioPharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection |
WO2007031098A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway |
US8080517B2 (en) | 2005-09-12 | 2011-12-20 | Xigen Sa | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
WO2007038172A2 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-05 | Nitto Denko Corporation | Guanidinium carriers |
WO2007038169A2 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-05 | Nitto Denko Corporation | Multi-valent guanidinium compounds for molecular translocation across cellular membranes and epithelial tissues |
WO2007038171A2 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-05 | Nitto Denko Corporation | Peptide nucleic acid based guanidinium compounds |
CN101330830B (zh) | 2005-10-18 | 2016-01-20 | 国家犹太健康中心 | 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法 |
US8501704B2 (en) | 2005-11-08 | 2013-08-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Immunosuppression compound and treatment method |
US8518414B2 (en) | 2005-11-17 | 2013-08-27 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins |
FI20055653A (fi) * | 2005-12-08 | 2007-06-09 | Wallac Oy | Leimausreagenssi |
FI20065030L (fi) * | 2006-01-17 | 2007-07-18 | Wallac Oy | Neutraaliset leimausreagenssit ja niistä johdetut konjugaatit |
US7732539B2 (en) * | 2006-02-16 | 2010-06-08 | National Science Foundation | Modified acrylic block copolymers for hydrogels and pressure sensitive wet adhesives |
WO2008069824A2 (en) * | 2006-02-27 | 2008-06-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for transport of molecules with enhanced release properties across biological barriers |
US8785407B2 (en) * | 2006-05-10 | 2014-07-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection |
HUE036995T2 (hu) * | 2006-05-10 | 2018-08-28 | Sarepta Therapeutics Inc | Az alegységek között kationos kötéssel rendelkezõ oligonukleotid analógok |
JP5597836B2 (ja) | 2006-08-04 | 2014-10-01 | ケンジー ナッシュ コーポレイション | バイオミメティック化合物およびその合成方法 |
WO2008091386A2 (en) * | 2006-08-04 | 2008-07-31 | Northwestern University | Biomimetic modular adhesive complex: material, methods and applications therefore |
EP2068936B1 (en) | 2006-09-27 | 2016-06-22 | Paolo Botti | Means and methods of enhancing delivery to biological systems |
AU2007340162B2 (en) * | 2006-12-29 | 2013-08-01 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins stabilized with polypeptide fragments derived from HIV-TAT |
CN101583274A (zh) * | 2006-12-29 | 2009-11-18 | 雷文斯治疗公司 | 使用反向序列hiv-tat多肽的运输分子 |
WO2008089032A1 (en) * | 2007-01-11 | 2008-07-24 | Northwestern University | Fouling resistant coatings and methods of making same |
KR102274003B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2021-07-08 | 카이 파마슈티컬즈 | 안정성 및 전달 효율을 증가시키기 위한 펩타이드 조성물의 변형 |
GB0702020D0 (en) * | 2007-02-02 | 2007-03-14 | Novabiotics Ltd | Peptides and their use |
US8383092B2 (en) * | 2007-02-16 | 2013-02-26 | Knc Ner Acquisition Sub, Inc. | Bioadhesive constructs |
US8673286B2 (en) | 2007-04-09 | 2014-03-18 | Northwestern University | DOPA-functionalized, branched, poly(aklylene oxide) adhesives |
US9365634B2 (en) * | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
US8664359B2 (en) * | 2007-06-03 | 2014-03-04 | Oncotx, Inc. | Cancer related isoforms of components of transcription factor complexes as biomarkers and drug targets |
AU2008271050B2 (en) * | 2007-06-29 | 2014-11-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
US20100016215A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-01-21 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
DE102007041655A1 (de) | 2007-09-03 | 2009-03-05 | Medicyte Gmbh | Vermehrung von primären Zellen und deren Verwendung |
ES2313848B1 (es) * | 2007-10-24 | 2010-03-22 | Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. |
WO2009099636A1 (en) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conjugation of small molecules to octaarginine transporters for overcoming multi-drug resistance |
ES2524312T3 (es) | 2008-03-14 | 2014-12-05 | Allergan, Inc. | Ensayos de actividad de serotipo A de toxina botulínica de base inmunológica |
ES2721148T3 (es) * | 2008-04-18 | 2019-07-29 | Angiochem Inc | Composiciones farmacéuticas de paclitaxel, análogos de paclitaxel o conjugados de paclitaxel y métodos relacionados de preparación y uso |
US8986702B2 (en) * | 2008-05-16 | 2015-03-24 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Antibodies and processes for preparing the same |
WO2009143865A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
WO2009143864A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases |
WO2010011641A2 (en) * | 2008-07-21 | 2010-01-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Microphasic micro-components and methods for controlling morphology via electrified jetting |
EP2318435B1 (en) | 2008-08-28 | 2015-12-23 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Modulators of myc, methods of using the same, and methods of identifying agents that modulate myc |
CN102245636A (zh) | 2008-10-15 | 2011-11-16 | 安吉奥开米公司 | 用于药物递送的依托泊苷和多柔比星结合物 |
BRPI0920209A2 (pt) | 2008-10-15 | 2015-12-22 | Angiochem Inc | conjugados de agonistas de glp-1 e usos dos mesmos |
AU2009322043A1 (en) | 2008-12-05 | 2011-07-07 | Angiochem Inc. | Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof |
US8592386B2 (en) * | 2008-12-17 | 2013-11-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis |
WO2010072228A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Xigen S.A. | Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules |
WO2012018486A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Rapid delivery and/or receiving of fluids |
CN102405015B (zh) | 2009-03-02 | 2017-01-18 | 第七感生物系统有限公司 | 用于分析可提取介质的装置和方法 |
KR102017327B1 (ko) | 2009-03-13 | 2019-09-03 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역 기반 보툴리눔 독소 혈청형 a 활성 검정에 유용한 세포 |
SG174353A1 (en) | 2009-03-13 | 2011-11-28 | Allergan Inc | Immuno-based retargeted endopeptidase activity assays |
CA2755897C (en) | 2009-03-23 | 2020-01-28 | Nanirx, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides |
WO2010108285A1 (en) | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Asteia Technology Inc. | Non-braided reinforced hollow fibre membrane |
EP2421562B1 (en) | 2009-04-20 | 2019-03-13 | Angiochem Inc. | Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog |
EP2437772B1 (en) | 2009-06-05 | 2017-12-06 | 13Therapeutics, Inc. | Immunoregulatory peptides and methods of use |
CN104607053B (zh) | 2009-06-26 | 2017-04-12 | Bl 科技公司 | 非编织、织物增强的中空纤维膜 |
US20110269665A1 (en) | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
CN102596993A (zh) | 2009-07-02 | 2012-07-18 | 安吉奥开米公司 | 多聚体肽结合物以及其应用 |
EP2454271A4 (en) | 2009-07-15 | 2015-08-12 | Univ California | PEPTIDES WITH CONTROLLABLE CELLULAR RECORDING |
CN102711789B (zh) * | 2009-07-29 | 2018-06-08 | 凯伊药品公司 | 用于降低甲状旁腺激素水平的治疗剂 |
KR101944119B1 (ko) * | 2009-11-13 | 2019-01-30 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 안티센스 항바이러스 화합물 및 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법 |
US20110130465A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-06-02 | Nerites Corporation | Coatings for prevention of biofilms |
JP5457813B2 (ja) * | 2009-12-16 | 2014-04-02 | ルネサスエレクトロニクス株式会社 | Adpll回路、半導体装置及び携帯情報機器 |
WO2011094573A1 (en) | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Monitoring or feedback systems and methods |
US20140199239A1 (en) * | 2010-05-17 | 2014-07-17 | The Regents Of The University Of California | Compositions and Methods for in Vivo Imaging |
WO2011150408A2 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Avi Biopharma, Inc. | Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups |
WO2011160653A1 (en) | 2010-06-21 | 2011-12-29 | Xigen S.A. | Novel jnk inhibitor molecules |
WO2011163347A2 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Sampling devices and methods involving relatively little pain |
US20120016308A1 (en) | 2010-07-16 | 2012-01-19 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Low-pressure packaging for fluid devices |
US8198429B2 (en) | 2010-08-09 | 2012-06-12 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection |
WO2012021801A2 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Systems and techniques for monitoring subjects |
WO2012031243A2 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Avi Biopharma, Inc. | dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS |
US9221020B2 (en) | 2010-09-15 | 2015-12-29 | Bl Technologies, Inc. | Method to make yarn-reinforced hollow fiber membranes around a soluble core |
DE102010041958A1 (de) | 2010-10-04 | 2012-04-05 | Medicyte Gmbh | Geeignete Hepatozyten für in-vitro Genotoxitätstests |
WO2012048721A1 (en) | 2010-10-14 | 2012-04-19 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases |
WO2012050673A1 (en) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for the treatment of x-linked hypophosphatemia and related disorders |
WO2012054841A2 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Optical devices with switchable particles |
EP2992827B1 (en) | 2010-11-09 | 2017-04-19 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Systems and interfaces for blood sampling |
CA2817215C (en) | 2010-11-09 | 2017-05-09 | Knc Ner Acquisition Sub, Inc. | Adhesive compounds for use in hernia repair |
US8529814B2 (en) | 2010-12-15 | 2013-09-10 | General Electric Company | Supported hollow fiber membrane |
JP2012131743A (ja) * | 2010-12-22 | 2012-07-12 | Kyoto Univ | 腫瘍集積型抗癌剤 |
WO2012138879A2 (en) | 2011-04-06 | 2012-10-11 | 13Therapeutics, Inc. | Peptides for the treatment of hearing |
WO2012149126A1 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Plasma or serum production and removal of fluids under reduced pressure |
ES2597081T3 (es) | 2011-04-29 | 2017-01-13 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Entrega y/o recepción de fluidos |
US20130158468A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-20 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Delivering and/or receiving material with respect to a subject surface |
EP3106092A3 (en) | 2011-04-29 | 2017-03-08 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Systems and methods for collecting fluid from a subject |
US9161948B2 (en) | 2011-05-05 | 2015-10-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
EP2704749A1 (en) | 2011-05-05 | 2014-03-12 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
WO2012177433A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Evologie Llc | Topical compositions for the treatment of dermatological disorders |
WO2013031833A1 (ja) * | 2011-08-31 | 2013-03-07 | 国立大学法人岡山大学 | 細胞導入ペプチドと皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入システムおよび美白剤 |
US20130085139A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-04-04 | Royal Holloway And Bedford New College | Oligomers |
TWI429747B (zh) * | 2011-11-02 | 2014-03-11 | Univ Nat Taiwan | 具修飾側鏈之rna病毒衍生胜肽及其用途 |
US9278987B2 (en) | 2011-11-18 | 2016-03-08 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof |
CN110251682B (zh) | 2011-11-24 | 2022-12-06 | 苏州宝时得电动工具有限公司 | 多肽序列设计及其在多肽介导的siRNA传递中的应用 |
US9321014B2 (en) | 2011-12-16 | 2016-04-26 | Bl Technologies, Inc. | Hollow fiber membrane with compatible reinforcements |
WO2013091670A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Xigen S.A. | Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases |
US9643129B2 (en) | 2011-12-22 | 2017-05-09 | Bl Technologies, Inc. | Non-braided, textile-reinforced hollow fiber membrane |
US9022229B2 (en) | 2012-03-09 | 2015-05-05 | General Electric Company | Composite membrane with compatible support filaments |
NZ631034A (en) | 2012-03-16 | 2016-06-24 | Merck Patent Gmbh | Targeting aminoacid lipids |
ES2700742T3 (es) | 2012-03-16 | 2019-02-19 | Merck Patent Gmbh | Lípidos aminoácidos |
US8999454B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-04-07 | General Electric Company | Device and process for producing a reinforced hollow fibre membrane |
US20150126457A1 (en) * | 2012-04-17 | 2015-05-07 | Brown University | Neuroprotective composition and method of use |
US9816066B2 (en) | 2012-04-24 | 2017-11-14 | The Regents Of The University Of California | Method for delivery of small molecules and proteins across the cell wall of algae using molecular transporters |
EP2877189B1 (en) | 2012-07-20 | 2021-01-06 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
CA2881602A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-02-20 | Angiochem Inc. | Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof |
US9227362B2 (en) | 2012-08-23 | 2016-01-05 | General Electric Company | Braid welding |
JP2016503300A (ja) | 2012-11-15 | 2016-02-04 | ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブRoche Innovation Center Copenhagen A/S | 抗ApoBアンチセンス複合体化合物 |
WO2014120837A2 (en) | 2013-01-29 | 2014-08-07 | The Regents Of The University Of California | Pretargeted activatable cell penetrating peptide with intracellulary releaseable prodrug |
WO2014118272A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates |
EA031930B1 (ru) | 2013-01-30 | 2019-03-29 | Авелас Байосайенсиз, Инк. | Молекула селективной доставки для визуализации злокачественной ткани |
CN104955952A (zh) | 2013-01-30 | 2015-09-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | Lna寡核苷酸碳水化合物缀合物 |
US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
CN103739674A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-04-23 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 系列低分子鱼精蛋白模拟肽及其应用 |
US10221216B2 (en) | 2013-04-11 | 2019-03-05 | Carnegie Mellon University | Template-directed γPNA synthesis process and γPNA targeting compounds |
WO2014169206A2 (en) | 2013-04-11 | 2014-10-16 | Carnegie Mellon University | Divalent nucleobase compounds and uses therefor |
KR101447901B1 (ko) | 2013-04-16 | 2014-10-16 | 한양대학교 산학협력단 | 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체 |
WO2015197097A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Xigen Inflammation Ltd. | New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases |
CA2903275A1 (en) | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Xigen Inflammation Ltd. | New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
WO2014206427A1 (en) | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Xigen Inflammation Ltd. | New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
DK3013959T3 (da) | 2013-06-27 | 2020-02-17 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | Antisense-oligomerer og konjugater målrettet pcsk9 |
AU2014329393B2 (en) | 2013-10-04 | 2020-04-30 | Pin Pharma, Inc. | Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment |
GB201401453D0 (en) * | 2014-01-28 | 2014-03-12 | Univ Birmingham | Transmucosal and transepithelial drug delivery system |
GB201401877D0 (en) * | 2014-02-04 | 2014-03-19 | Univ Tromsoe | Peptides |
EP2927685A1 (en) | 2014-04-02 | 2015-10-07 | Medicyte GmbH | Suitable hepatocytes for in-vitro hepatitis tests |
GB201408623D0 (en) | 2014-05-15 | 2014-07-02 | Santaris Pharma As | Oligomers and oligomer conjugates |
KR20160001419A (ko) * | 2014-06-27 | 2016-01-06 | 포항공과대학교 산학협력단 | 양이온성 분자 수송체 및 음이온성 생리활성 물질을 포함하는 피부 투과용 조성물 |
WO2016018917A2 (en) | 2014-07-28 | 2016-02-04 | The Regents Of The University Of Califoria | Compositions and methods of making polymerized nucleic acids |
WO2016023036A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | The Regents Of The University Of California | High density peptide polymers |
US10385380B2 (en) | 2014-10-02 | 2019-08-20 | The Regents Of The University Of California | Personalized protease assay to measure protease activity in neoplasms |
MA41795A (fr) | 2015-03-18 | 2018-01-23 | Sarepta Therapeutics Inc | Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine |
US10596259B2 (en) | 2015-05-20 | 2020-03-24 | The Regents Of The University Of California | Tumor radiosensitization with monomethyl auristatin E (MMAE) and derivatives thereof |
US11020417B2 (en) | 2015-06-04 | 2021-06-01 | Sarepta Therapeutics, Inc | Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions |
CA2989400A1 (en) | 2015-06-15 | 2016-12-22 | Angiochem Inc. | Ang1005 for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis |
JP7011830B2 (ja) | 2015-10-14 | 2022-01-27 | エックス-サーマ インコーポレイテッド | 氷晶形成を低減するための組成物および方法 |
AU2017235278C1 (en) | 2016-03-14 | 2022-03-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotides for reduction of PD-L1 expression |
CN114907272A (zh) | 2016-09-26 | 2022-08-16 | 卡耐基梅隆大学 | 二价核碱基化合物及其用途 |
CA3045017A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Nanoparticle formulations |
MX2019006882A (es) | 2016-12-19 | 2019-08-16 | Sarepta Therapeutics Inc | Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular. |
FR3064364A1 (fr) * | 2017-03-27 | 2018-09-28 | S.P.C.M. Sa | Methode de dosage de polymeres cationiques |
EP3654941A1 (en) | 2017-07-17 | 2020-05-27 | Keith Roizman | Topical delivery of therapeutic agents comprising cell-penetrating peptides for use for the treatment of age-related macular degeneration and other eye diseases |
US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
CN108822052A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-11-16 | 中国科学技术大学 | 非肽类多胍小分子和基于非肽类多胍小分子-蛋白质偶联体的蛋白质运输技术 |
WO2019245353A1 (ko) * | 2018-06-22 | 2019-12-26 | 재단법인 대구경북과학기술원 | 사이토카인 융합 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 사이토카인 라이브러리 |
GB201900728D0 (en) * | 2019-01-18 | 2019-03-06 | Univ Birmingham | Drug delivery system |
KR20200110576A (ko) * | 2019-03-15 | 2020-09-24 | 재단법인대구경북과학기술원 | 사이토카인 기반 면역세포 및 그의 면역 치료 용도 |
CN114096554A (zh) | 2019-07-02 | 2022-02-25 | Agc株式会社 | 肽及其制造方法 |
CN117999272A (zh) | 2021-09-22 | 2024-05-07 | Agc株式会社 | 肽 |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA209468A (en) * | 1921-03-15 | Mitchell William | Stocking | |
US4053638A (en) * | 1970-05-06 | 1977-10-11 | William Wrigley Jr. Company | Anticaries confectioneries and oral health products |
US3915800A (en) * | 1972-03-30 | 1975-10-28 | Kelco Co | Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation |
US4083974A (en) * | 1977-03-07 | 1978-04-11 | The Upjohn Company | Topical steroidal anti-inflammatory preparations containing polyoxypropylene 15 stearyl ether |
US4847240A (en) | 1978-01-16 | 1989-07-11 | The Trustees Of Boston University | Method of effecting cellular uptake of molecules |
US4701521A (en) | 1978-07-17 | 1987-10-20 | The Trustees Of Boston University | Method of effecting cellular uptake of molecules |
JPS55500053A (es) | 1978-01-16 | 1980-01-31 | ||
US4631190A (en) | 1981-06-26 | 1986-12-23 | Shen Wei C | Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers |
US4532207A (en) | 1982-03-19 | 1985-07-30 | G. D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
US4880911A (en) | 1982-03-19 | 1989-11-14 | G. D. Searle & Co. | Fused polypeptides and methods for their detection |
US4883661A (en) * | 1987-10-09 | 1989-11-28 | Daly John M | Use of arginine as an lymphokine synergist |
JP2804273B2 (ja) * | 1988-03-09 | 1998-09-24 | 株式会社メニコン | 高含水性眼用レンズ材料 |
US5241078A (en) * | 1988-06-14 | 1993-08-31 | Cetus Oncology | Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5162505A (en) | 1989-09-19 | 1992-11-10 | Centocor | Proteins modified with positively charged carriers and compositions prepared therefrom |
AU658818B2 (en) | 1989-12-21 | 1995-05-04 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Method of delivering molecules into eukaryotic cells using tat protein conjugate |
US5576351A (en) * | 1989-12-29 | 1996-11-19 | Mcgaw, Inc. | Use of arginine as an immunostimulator |
US5115075A (en) * | 1990-05-08 | 1992-05-19 | The Dow Chemical Company | Amide and hydroxymethyl functionalized polyethers as thermoplastic barrier resins |
US5409764A (en) * | 1990-07-17 | 1995-04-25 | Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. | Curable adhesive composition and sheet thereof |
GB9017024D0 (en) * | 1990-08-03 | 1990-09-19 | Erba Carlo Spa | New linker for bioactive agents |
US5831001A (en) | 1990-10-24 | 1998-11-03 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Treatment of herpesvirus infection |
US5646120A (en) | 1990-10-24 | 1997-07-08 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | Peptide-based inhibitors of HIV replication |
US5633230A (en) | 1990-10-24 | 1997-05-27 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | Treatment of cytomegalovirus infection |
CA2092075A1 (en) * | 1990-10-24 | 1992-04-25 | Martin Sumner-Smith | Peptide-based inhibitors of hiv replication |
US5674849A (en) | 1990-10-24 | 1997-10-07 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Anti-viral compositions |
KR100252547B1 (ko) | 1991-09-05 | 2000-09-01 | 프레드 마리얀스키 | 폴리-또는 올리고누클레오티드의 세포로의 표적화된 전달 |
CA2094658A1 (en) * | 1992-04-23 | 1993-10-24 | Martin Sumner-Smith | Intracellular delivery of biochemical agents |
DE69320469D1 (de) | 1992-04-23 | 1998-09-24 | Allelix Biopharma | Behandlung von herpesvirus infektion |
US5434257A (en) * | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
NZ255831A (en) | 1992-08-21 | 1997-04-24 | Biogen Inc | Fusion proteins comprising biologically active cargo moiety and transport peptides from the hiv tat protein, their preparation and use |
EP0599303A3 (en) * | 1992-11-27 | 1998-07-29 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Peptide conjugate |
WO1994014464A1 (en) | 1992-12-22 | 1994-07-07 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Synergistic compositions containing an antiviral nucleoside analogue and an antiviral oligopeptide |
AU685862B2 (en) | 1993-10-22 | 1998-01-29 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Treatment of cytomegalovirus infection |
US5716614A (en) | 1994-08-05 | 1998-02-10 | Molecular/Structural Biotechnologies, Inc. | Method for delivering active agents to mammalian brains in a complex with eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid-conjugated polycationic carrier |
US5783178A (en) * | 1994-11-18 | 1998-07-21 | Supratek Pharma. Inc. | Polymer linked biological agents |
AU4690596A (en) | 1994-12-30 | 1996-07-24 | Chiron Viagene, Inc. | Nucleic acid condensing agents with reduced immunogenicity |
ZA962455B (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-02 | B Eugene Guthery | Fast acting and persistent topical antiseptic |
KR100561788B1 (ko) | 1996-03-12 | 2006-09-20 | 피지-티엑스엘 컴파니,엘.피. | 수용성파클리탁셀전구약물을포함하는조성물및이러한조성물을포함하는이식가능한의료장치 |
EP0966303A2 (en) | 1996-05-01 | 1999-12-29 | Antivirals Inc. | Polypeptide conjugates for transporting substances across cell membranes |
US5795909A (en) * | 1996-05-22 | 1998-08-18 | Neuromedica, Inc. | DHA-pharmaceutical agent conjugates of taxanes |
US5842441A (en) * | 1996-08-26 | 1998-12-01 | Pharmalett Denmark A/S | Medicated and individualized treatment shampoo for dermatological disturbances of companion animals |
JP2002502376A (ja) * | 1997-05-21 | 2002-01-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法 |
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