JP2003518946A - アンチセンス抗細菌性細胞分裂組成物、およびその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細菌の細胞分裂および細胞周期を指向するアンチセンスオリゴマーをコードする核酸は、選択的にこれらの生物学的活性を調節し得、細菌感染の処置および予防に有用である。このアンチセンスオリゴマーは、実質的に非荷電であり、（ｉ）細菌性ｔＲＮＡ配列、または（ｉｉ）細胞分裂または細胞周期に関連するタンパク質をコードする細菌性核酸配列の中に翻訳開始コドンを含む標的配列と、ハイブリダイズするのに有効な少なくとも１０ヌクレオチド長である標的化核酸配列を含む８〜４０ヌクレオチドサブユニットを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、細胞分裂および細胞周期に関与する細菌性核酸に対してアンチセン
スである、オリゴヌクレオチド組成物、ならびに哺乳動物での細菌感染の処置に
おけるこのような組成物の使用のための方法に関連する。

【０００２】 （参考文献） Ａｇｒａｗａｌ、Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
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６（１９９２）もまた参照のこと。

【０００３】 （発明の背景） 現在、細菌性の病原体に対する使用において、様々な抗細菌機構によるいくつ
かのタイプの抗生物質が存在する。ペニシリンおよびセファロスポリンのような
βラクタム抗生物質は、ペプチドグリカン合成の最終段階を阻害するように作用
する。バンコマイシンおよびテイコプラニン（ｔｅｉｃｈｏｐｌａｎｉｎ）を含
むグリコペプチド抗生物質は、ムラミルペンタペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ ｐｅ
ｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）のグリコシド転移およびペプチド転移の両方を阻害し、
これもまたペプチドグリカン合成を妨害する。別の周知の抗生物質は、細菌のＤ
ＮＡ複製を阻害するキノロン類、リファンピンのような細菌のＲＮＡポリメラー
ゼのインヒビター、およびスルホンアミドを含む、テトラヒドロ葉酸産生につい
ての経路における酵素のインヒビターを含む。

【０００４】 抗生物質の使用による細菌感染の制御または除去おける目覚しい成功にもかか
わらず、ヒトの医薬において、および家禽類または家畜生産における栄養補助物
としての両方における抗生物質の広範な使用は、多くの病原性細菌における薬剤
耐性を引き起こした。

【０００５】 抗生物質耐性の機構は、種々の形態を取り得る。特にグラム陰性細菌おける、
βラクタムに対する主要な耐性機構の一つは、酵素のβ−ラクタマーゼであり、
これは抗生物質を不活性にする。同様に、アミノ配糖体への耐性はしばしば、抗
生物質を不活性化し得る酵素を含み、この場合においては、ホスホリル基、アデ
ニル基、またはアセチル基を加えることによる。抗生物質の活性な流出（ｅｆｆ
ｌｕｘ）は、多くの細菌が耐性を発達させる別の手段である。流出タンパク質（
ｅｆｆｌｕｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子（例えば、テトラサイクリ
ン流出についてのｔｅｔＡ、ｔｅｔＧ、ｔｅｔＬおよびｔｅｔＫ遺伝子）がこれ
まで同定されている。細菌の標的は、この薬剤の標的を改変することにより、耐
性を発達させ得る。例えば、多くのβラクタム耐性細菌のいわゆるペニシリン結
合タンパク質（ＰＢＰ）は、抗生物質のこの標的タンパク質に対する決定的な結
合を阻害するように改変される。テトラサイクリンへの耐性は、増強された流出
物に加え、抗生物質に結合することについてリボソームと競合し得る、細胞質の
タンパク質の出現を含み得る。この抗生物質が細菌の酵素を阻害することにより
作用する場合、例えばスルホンアミドについては、標的酵素における点変異が耐
性を与え得る。

【０００６】 多くの病原性細菌における抗生物質耐性の出現は、多くの場合、多剤耐性を含
み、そして多くの細菌性病原は、医学的な介入により簡単に処置できないという
前抗生物質時代（ｐｒｅ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｒａ）の不安を高めた。こ
のシナリオに寄与し得る２つの主要な要因がある。第一のものは、細菌の株、種
、および属を超える結合性エレメントによる耐性および多耐性遺伝子の急速な広
がりであり、これの最も重要なものが、自己伝播性プラスミドである、。第二の
要因は、新しいタイプの抗生物質を見出すための現在における研究努力の欠如で
あり、新規の抗生物質剤を見出し、そしてそれらを臨床試験まで持ち込むまでに
必要な時間および資金の認識される投入に部分的に起因し、これらはいくつかの
場合において、２０年もの研究努力が必要とされ得る過程である。

【０００７】 これらの要因の第二のものの取組みにおいて、新しい抗生物質の探索を加速し
得るいくつかの薬剤発見アプローチが提案されてきた。例えば、ハイスループッ
トスクリーニングにより新しい抗生物質化合物をスクリーニングし、同定する試
みが報告されているが、今のところ、重要なリード化合物はこの経路により発見
されていない。

【０００８】 細菌の耐性遺伝子の発現をブロックするために、または細胞のＲＮＡ標的を標
的化するために設計された、アンチセンス薬剤に関するいくつかのアプローチが
提案され、これは、ペプチド核酸の使用（ＰＮＡｓ；Ｇｏｏｄ，Ｌ．およびＮｉ
ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：
２０７３−２０７６、１９９８ａを参照のこと）および原核生物の１６ＳｒＲＮ
Ａと相補的な３〜６ヌクレオチドメチルカルバメートＤＮＡアナログ使用（Ｒａ
ｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅ
ｓ．Ｄｅｖ．１（４）：３１９−２７、１９９１）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉのβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の開始コドンを標的化す
るために設計された、ペプチド核酸（ＰＮＡ）アンチセンス配列は、インビトロ
でナノモル濃度のＰＮＡ、およびインビボでマイクロモル濃度において、濃度依
存的な特異的阻害を提示した（Ｇｏｏｄ，Ｌ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．
、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（４）：３５５−８、１９９８ａ）。し
かし、一般にこれらのアプローチは辛うじて成功しており、推定されるように、
これはアンチセンス薬剤の乏しい取込みに起因する（例えば，上記に引用された
、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ， Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．７（２）：６３〜７０，１９９７；Ｇｏｏｄ，Ｌ
．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．、１９９８ａ）。

【０００９】 従って、以下のような新しい抗生物質に対する高い要求が存在する：（ｉ）細
菌の抗生物質処置を現在妨げている抗生物質耐性のタイプに左右されない、抗生
物質、（ｉｉ）迅速にそして標的細菌の特異性に関していくらか妥当な程度の予
測可能性を伴い開発され得る、抗生物質（ｉｉｉ）低用量で有効であり、部分的
には、これらが効率的に野生型細菌に、または抗生物質に対して透過性を減じた
細菌にさえも取込まれることを意味する、抗生物質、および（ｉｖ）ほとんど副
作用がない、抗生物質。

【００１０】 （発明の要旨） １つの局面において、本発明は抗細菌性化合物を提供する。この化合物は、８
〜４０ヌクレオチドサブユニットを含有している実質的に非荷電のアンチセンス
オリゴマーからなり、このサブユニットは、以下に対して相補的である少なくと
も１０ヌクレオチドの長さの標的核酸を含む：（ｉ）細菌性ｔＲＮＡ配列、また
は（ｉｉ）細胞分裂もしくは細胞周期に関連するタンパク質をコードする細菌性
核酸配列の中に翻訳開始コドンを含む、標的配列。サブユニットのそれぞれは、
標的核酸配列中のそれぞれのヌクレオチド塩基に対してワトソン−クリック塩基
対合によって結合するために有効である塩基対部分を支持する５員環または６員
環を含む。隣接しているサブユニットは、非荷電のホスホルアミデート（ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉ
ａｍｉｄａｔｅ）、カルボネート、カルバメート、アミド、ホスホトリエステル
、アルキルホスホネート、シロキサン、スルホン、スルホンアミド、スルファメ
ート、チオホルムアセチル、およびメチレン−Ｎ−メチルヒドロキシルアミノか
らなる群より選択される非荷電の結合によってか、あるいは、ホスフェート、荷
電したホスホルアミデート、およびホスホロチオエートからなる群より選択され
る荷電した結合によって連結される。オリゴマー中での非荷電の結合：荷電した
結合の比は、少なくとも４：１であり、好ましくは、少なくとも５：１であり、
およびより好ましくは少なくとも８：１である。一つの実施形態においては、こ
のオリゴマーは完全に非荷電である。

【００１１】 好ましくは、このオリゴマーは細菌の配列と、対応するＤＮＡとそれと同じ細
菌の配列からなる二重鎖のＴｍより実質的には大きいＴｍで、ハイブリダイズし
得る。あるいは、このオリゴマーは細菌性配列と、実質的には、３７℃より高い
、好ましくは、５０℃より高い、そしてより好ましくは６０〜８０℃の範囲にあ
る、Ｔ_ｍでハイブリダイズし得る。

【００１２】 一つの実施形態において、オリゴマーはモルホリノオリゴマーである。このよ
うなオリゴマーにおいて、非荷電の結合が、そして、一つの実施形態においては
、その結合の全てが、好ましくは、図２Ａ〜図２Ｄに表された構造からなる群よ
り選択される。図２Ｂに示されるホスホロジアミデート結合オリゴマーが特に好
ましく、ここでＸ＝ＮＲ_２であり、Ｒは水素またはメチルであり、Ｙ＝Ｏであり
、そしてＺ＝Ｏである。

【００１３】 オリゴマーの長さは好ましくは、１２〜２５ヌクレオチドサブユニットである
。一つの実施形態において、このオリゴマーは、１５〜２０ヌクレオチドサブユ
ニット、そしてより好ましくは、１７〜１８ヌクレオチドサブユニットの長さを
有する、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである。

【００１４】 本発明はまた、ヒト被験体または哺乳動物被験体において対応する細菌感染の
処置方法を提供し、この方法は薬学的に有効な量で、上記の実質的に非荷電であ
るアンチセンスオリゴマーをこの被験体に投与する工程を包含する。

【００１５】 標的化された細菌のタンパク質は、好ましくは、以下からなる群より選択され
る：ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ
、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、
ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍ
ｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢ
タンパク質、カルバメートキナーゼ、Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ、トポイ
ソメラーゼ、アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ（ａｌｋｙｌ ｈｙｄｒ
ｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、チオレドキシンレダクターゼ、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素、ならびに細胞壁酵素。この化合物および処置方法の選択さ
れた実施形態において、細菌の標的配列は、以下からなる群より選択された細菌
の遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳開始領域である：ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、
ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆ
ｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕ
ｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａ
Ｙ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢ。

【００１６】 ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、およびｄｉｃＦからなる群より選択されるｄ
ｉｃ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の、翻訳開始領域に指向された標的化配列
の例は、本明細書中で、配列番号４５（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＦ）、配列番号４
８（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＡ）、配列番号４９（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＢ）、配
列番号５０（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＣ）；および配列番号６１（Ｓ．ｔｈｙｐｈ
ｉ．ｄｉｃＡ）として表される配列を包含する。一つの実施形態では、標的化配
列は配列番号４５で表された配列であり、そしてそのアンチセンスオリゴマーは
モルホリノオリゴマーである。

【００１７】 ｆｔｓＬ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、およびｆｔｓＺからなる群より選
択されるｄｃｗ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域、そして特にｆ
ｔｓＺ ｍＲＮＡに指向された標的化配列の例は、本明細書中で以下のように表
される配列を包含する：（ａ）配列番号５１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｆｔｓＡ）、配列
番号４６および配列番号５２（Ｅ．ｃｏｌｉ ｆｔｓＺ）；（ｂ）配列番号６２
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｆｔｓＺ）；（ｃ）配列番
号６５（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ ｆｔｓＺ）；（ｄ）配列
番号６９（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｆｔｓＡ）および配
列番号６８（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｆｔｓＺ）；（ｅ
）配列番号７４（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｆｔ
ｓＺ）；（ｆ）配列番号８０（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｆｔ
ｓＡ）および配列番号８１（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｆｔｓ
Ｚ）；（ｇ）配列番号８７（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ ｆｔｓＡ）および配列番号８８（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａ ｆｔｓＺ）；（ｈ）配列番号９２（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉ
ｄｕｍ ｆｔｓＡ）および配列番号９３（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕ
ｍ ｆｔｓＺ）；（ｉ）配列番号９９（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉｓ ｆｔｓＷ）；ならびに（ｊ）配列番号１００（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ
ｈｅｎｓｅｌａｅ ｆｔｓＺ）。

【００１８】 ｓｅｃ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域に、そして特にｓｅｃ
Ａ ｍＲＮＡに指向された標的化配列の例は、本明細書中で以下のように表され
る配列を包含する：配列番号４７（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｅｃＡ）、配列番号６７（
Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ ｓｅｃＡ）、配列番号、７９（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
ｓｅｃＡ）および配列番号９１（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｅ
ｃＡ）。一つの実施形態において、標的化配列は配列番号４７として示される配
列を有し、そして、このアンチセンスオリゴマーはモルホリノオリゴマーである
。

【００１９】 さらなる実施形態において、特に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕ
ｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓによる感染の処置のため
に、標的化配列は、以下からなる群より選択される配列を有する：配列番号１０
３（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ カルバメートキナーゼ）；配列番号１０４（Ｅ．ｆａ
ｅｃｉｕｍ Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ）；配列番号１０５（Ｅ．ｆａｅ
ｃａｌｉｓ トポイソメラーゼ）；配列番号１０７（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｒ
ｅｐＡ）；配列番号１０８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ アルキルハイドロジェンペ
ルオキシドレダクターゼ（ａｌｋｙｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ））；配列番号１０９（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ チオレドキ
シンレダクターゼ）；配列番号１１０（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ジヒドロ葉酸還
元酵素）；配列番号１１１（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｆｔｓＡ）；および配列番
号１１２（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ 細胞壁酵素）。選択された実施形態において
、オリゴマーはモルホリノオリゴマーであり、そして標的化配列は、以下のから
なる群より選択される配列を有する：配列番号１０５（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ
トポイソメラーゼ）；配列番号１０７（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｒｅｐＡ）；配
列番号１０８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ アルキルハイドロジェンペルオキシドレ
ダクターゼ）；および配列番号１１０（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ジヒドロ葉酸還
元酵素）。

【００２０】 この処置方法を実施するために、アンチセンスオリゴマーは、好ましくは、少
なくとも２００〜４００ｎＭのピーク血中濃度（ｐｅａｋ ｂｌｏｏｄ ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のアンチセンスオリゴマーを生じるのに有効な量および
様式で投与される。

【００２１】 選択された実施形態において、このオリゴマーは、皮膚の細菌感染を処置する
ために局所的な経路により、または細菌の呼吸器感染を処置するための吸入によ
り、投与され得る。

【００２２】 本発明のさらなる局面は、細菌感染を処置するための方法であって、この方法
はモルホリノアンチセンスオリゴマーの被験体への投与、次ぐ被験体への抗生物
質の投与または他の治療的処理を包含する。

【００２３】 さらに別の局面において、本発明は、上記の型の抗細菌性化合物の治療量以下
の量を補充した穀類食品を含有している家畜および家禽動物の飼料組成物を含む
。 また、抗生物質の治療量以下のレベルで補充された穀類食品を家畜および家禽に
給餌する方法においては、この穀類食品が上記のような抗細菌性オリゴヌクレオ
チド組成物の治療量以下の量で補充されるという改善も意図される。

【００２４】 さらなる局面において、本発明は選択された細菌に対するワクチンを調製する
方法を提供し、この方法は、以下： （ａ）ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉ
ｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓ
Ｗ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ
、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄ
ｌＢからなる群より選択される、この選択された細菌の遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡ中の翻訳開始領域にハイブリダイズするために有効な標的化塩基配列を含
む８〜４０ヌクレオチドのサブユニット、ならびに （ｂ）本明細書中の図２Ａ〜図２Ｄに示されるような、非荷電のリン含有サブ
ユニット間結合を有するアンチセンスモルホリノベースのアンチセンスオリゴマ
ーの存在下で、複製欠損の形態学的に異常な細菌細胞を産生するのに有効なオリ
ゴマーの量において、この細菌をインキュベートする工程を包含する。従って、
ヒトまたは動物被験体は、モルホリノベースのアンチセンスオリゴマーの存在下
でこの細菌をインキュベーションすることにより調製された、複製欠損の形態学
的に異常な細菌細胞を、この被験体に投与することにより、選択された細菌に対
してワクチン接種され得る。

【００２５】 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が、添付の図
面および実施例と組合せて読み取られた場合に、より完全に明らかとなる。

【００２６】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 以下の用語は、本明細書中で使用される場合に、他に示されない限りは、以下
の意味を有する： 用語「細胞周期」は、分裂している細胞が通過する、細胞増殖および細胞分裂
の事象の規則正しい順序をいう。

【００２７】 用語「ポリヌクレオチド」は、典型的なポリヌクレオチドに対して水素結合し
得る塩基を支持する骨格を有しているポリマー分子をいう。ここでは、ポリマー
骨格は、ポリマー分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖のＲＮＡ、
二本鎖のＲＮＡ、一本鎖のＤＮＡ、または二本鎖のＤＮＡ）との間で配列特異的
な方法でのこのような水素結合を可能にする様式で塩基を与える。「ポリヌクレ
オチド」は、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドであるヌ
クレオチドを含むポリマー、および標準的ではないヌクレオチド骨格（例えば、
ホスホロジアミデートモルホリノ化学、ポリアミド結合（例えば、ペプチド核酸
すなわちＰＮＡ）、および他の合成の配列特異的核酸分子を使用して形成される
骨格）を含有しているポリマーを含む。

【００２８】 用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴマー」
は交換可能に使用され、そして、アンチセンスオリゴマーが、標的配列内で核酸
：オリゴマーのヘテロ二重鎖を形成するようにワトソン−クリック塩基対合によ
って標的の核酸（例えば、ＲＮＡ）配列に対してハイブリダイズすることを可能
にする、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニットからサブユニットへの骨格
をいう。代表的には、このようなオリゴマーは、８〜約４０ヌクレオチドサブユ
ニット長であり、そしてより代表的には約１２〜２５ヌクレオチドサブユニット
長である。このオリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性を有し得るか
、またはほぼ相補性である。このようなアンチセンスオリゴマーは、例えば、核
酸標的配列の二本鎖または一本鎖部分に結合し、それによって、ｍＲＮＡの翻訳
および／またはタンパク質合成を阻害することにより、所定の標的配列を含む細
菌の細胞分裂または細胞周期タンパク質の形成をブロックまたは阻害し得、そし
て、これが特異的にハイブリダイズする配列に「指向される（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ）」といわれる。

【００２９】 オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、このオリゴマーが生理
学的な条件下（３７℃よりも実質的に高いＴ_ｍ、好ましくは、少なくとも５０℃
、そして代表的には、６０〜８０℃またはそれより高温）で標的に対してハイブ
リダイズする場合に、標的のポリヌクレオチドに対して「特異的にハイブリダイ
ズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件に相当する。所定のイオン強度およびｐＨでは
、Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドに対してハイブリダイ
ズする温度である。

【００３０】 「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格がホスホジ
エステル結合のヌクレアーゼによる切断に対する感受性がないオリゴマーである
。例示的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエートお
よびホスフェート−アミンＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）のようなオリゴヌクレオチドア
ナログであり、これらの両方ともが、荷電した骨格を有し、ならびにメチルホス
ホネート（ｍｅｔｈｙ−ｌｐｈｏｓｈｏｎａｔｅ）、モルホリノ、およびペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドであり、これらの全ては非荷電の骨格を有
する。

【００３１】 第一の配列が第二の配列に対して「アンチセンス配列」であるのは、第一の配
列を有するポリヌクレオチドが、第二の配列を有するポリヌクレオチドに生理学
的条件下で、特異的に結合するか、または特異的にハイブリダイズする場合であ
る。

【００３２】 ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖のポリヌクレオ
チド間のアンチパラレルな立体配置で生じる場合に、互いに「相補的」であると
記載される。二本鎖のポリヌクレオチドが、別のポリヌクレオチドに対して「相
補的」であり得るのは、第一のポリヌクレオチドのうち一つの鎖と第二のポリヌ
クレオチド間で、ハイブリダイズが生じ得る場合である。相補性（１つのポリヌ
クレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に受け容れ
られている塩基対合の規則に従って互いに水素結合を形成すると予想される反対
の鎖の中の塩基の割合（すなわち、パーセンテージ）に関しての定量化が可能で
ある。

【００３３】 オリゴヌクレオチドまたオリゴヌクレオチドアナログの「サブユニット」は、
オリゴマーの一つのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）単位をいう。
この用語は、付着したサブユニット間結合を有するかまたはそれを有さないヌク
レオチド単位をいい得るが、「荷電したサブユニット」をいう場合には、電荷は
代表的には、サブユニット間結合（例えば、ホスフェートまたはホスホロチオエ
ート結合）の内部に存在する。

【００３４】 「モルホリノオリゴマー」または「モルホリノベースのオリゴマー」は、代表
的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するオリゴヌク
レオチドアナログをいい、ここでオリゴマーは、核酸に見出されるようなペント
ース糖骨格部分の代わりに、モルホリノ骨格部分を含み、この環の窒素を通して
の結合を伴う。代表的な「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図１Ａ〜１Ｄお
よび図２Ａ〜図２Ｄに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され
る。ここでは、（ｉ）この構造は、隣接しているサブユニットの５’環外炭素に
対して１つのサブユニットのモルホリノ窒素を連結する、１〜３個の原子の長さ
のリン含有結合によって互いに連結され、そして（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊのそれ
ぞれは、塩基特異的な水素結合により、ポリヌクレオチド内の塩基に結合にする
のに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部分である。

【００３５】 用語「ＰＭＯ」は、以下にさらに記載されているような、ホスホロジアミデー
トモルホリノオリゴマーをいう。本発明のこの好ましい局面は、図２Ｂに説明さ
れる。ここでは、２つのサブユニットが、ホスホロジアミデート結合により連結
される。

【００３６】 「標的ＲＮＡに関する塩基特異的な細胞内結合事象」は、細胞内での標的ＲＮ
Ａ配列に対するオリゴマーの特異的な結合をいう。このような結合の塩基特異性
は配列特異的である。例えば、一本鎖のポリヌクレオチドは、配列上、相補的で
ある一本鎖のポリヌクレオチドに対して特異的に結合し得る。

【００３７】 「ヌクレアーゼ耐性のヘテロ二重鎖」は、その相補的な標的に対するアンチセ
ンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重鎖であり、その結果、その
ヘテロ二重鎖は、至るところにある細胞内および細胞外ヌクレアーゼによるイン
ビボでの分解に対して耐性である、ヘテロ二重鎖をいう。

【００３８】 種々の例示的な細菌は、本明細書中で以下のような略記により参照され得る：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｈｙｐｈｉ．）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌ
ｅｒａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕ
ｓ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｍ．ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌ
ｏｒｉ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ（Ｔ．ｐａ
ｌｌａｄｉｕｍ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃ．ｔｒａ
ｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ（Ｂ．ｈｅｎｓ
ｅｌａｅ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａ）およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒａｅ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒ
ａｅ）。

【００３９】 「コンセンサス配列」は、特定のタンパク質をコードする生物の特定の群の核
酸配列に関連して、それぞれの位置で、生物群に対応する各配列中のその位置に
おいて、ほぼ共通に見出されるヌクレオチドを含む。グラム陰性細菌の細胞分裂
また細胞周期のタンパク質をコードする核酸のコンセンサス配列は、グラム陰性
細菌に共通であり、そして一般的に、グラム陰性菌ではない細菌では見出されな
い。

【００４０】 用語「保存された」は、細胞分裂または細胞周期のタンパク質をコードする核
酸配列に関して、特定の生物群（例えば、グラム陰性菌）に共通または、共有さ
れている配列をいう。

【００４１】 用語「広域スペクトルの細菌配列」は、特定の細胞分裂または細胞周期のタン
パク質をコードした細菌の核酸配列に指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドに関して、全部ではないが、ほとんど細菌の細胞分裂または細胞周期のタンパ
ク質をコードする核酸配列のうちのいくつかのセグメントに対してアンチセンス
であるオリゴヌクレオチドをいう。

【００４２】 用語「狭域スペクトルの細菌配列」は、大多数でもなくまたは全てでもないが
、特定の細胞分裂または細胞周期のタンパク質をコードする特定の細菌核酸配列
に対して、アンチセンスである本発明のオリゴヌクレオチドをいう。「狭域スペ
クトルの細菌配列」は、一つより多いタイプの細菌に特異的であり得、例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｈｙｐｈｉ ｚｉｐＡ核酸配列に対してアンチセンス
であるが、本明細書中に記載の他の公知の細菌のｚｉｐＡ核酸配列に対してはア
ンチセンスではない、配列番号５７で例示されるような、アンチセンスオリゴマ
ー、または、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｚｉｐＡ核酸配列に対してアンチセンス
であるが、本明細書中に記載の他の公知の細菌のｚｉｐＡ ｍＲＮＡ配列に対し
てアンチセンスではない、配列番号１０１に例示されるような、アンチセンスオ
リゴマーであり得る。

【００４３】 用語「発現を調節する」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、その
タンパク質をコードする核酸の転写または翻訳を妨害する結果としての、所定の
タンパク質の発現の増大または減少をいう。

【００４４】 「有効な量」は、アンチセンスオリゴマーに関して、哺乳動物の被験体に対し
て投与されるアンチセンスオリゴマーの量であって、生物学的活性（例えば、選
択された標的の核酸配列の発現）を阻害するために有効な、単回の用量または一
連の用量の一部のいずれかとしての量をいう。

【００４５】 個体または細胞の「処置」とは、個体または細胞の天然の経過を変化する手段
として挙げられる、介入の任意のタイプをいう。処置としては、例えば、薬学的
組成物の投与が挙げられるがこれに限定はされず、そして予防的または病理学的
事象の開始もしくは病因学的因子との接触の後のいずれかに、行われ得る。

【００４６】 用語「改善された治療上の結果」は、特定の細菌に感染していると診断された
患者に関して、細菌の増殖の遅延もしくは減少、および／または、特定の細菌に
よる感染に代表的に関連する検出可能な症状の減少もしくは除去をいう。

【００４７】 （ＩＩ．アンチセンスオリゴマー：選択基準） 本発明において使用されるアンチセンス化合物は、好ましくは、以下のサブセ
クションで考察される、構造および特性のいくつかの基準を満たす。

【００４８】 （Ａ．塩基配列、長さおよび二重鎖の安定性） アンチセンス化合物は、選択された細菌の核酸標的配列に対して標的化された
塩基配列を有する。標的核酸配列と相補的である領域は、１０〜１２塩基の程度
の短さであり得るが、以下に議論するように、細胞への進入および結合Ｔｍの不
可欠なバランスを達成するために、好ましくは１５〜２０塩基であり、より好ま
しくは１７〜１８塩基である。好ましくは、細菌の標的配列は、標的細菌タンパ
ク質をコードするｍＲＮＡについて翻訳開始コドンにまたがる配列である。

【００４９】 オリゴマーは、細菌の核酸標的配列に対して１００％相補的であり得るか、ま
たはオリゴマーは、例えば、オリゴマーと細菌の核酸標的配列との間で形成され
るヘテロ二重鎖が、細胞のヌクレアーゼの作用およびインビボで生じ得る他の分
解の様式に耐性があるように十分に安定である限り、改変体を受け入れるように
ミスマッチを含み得る。ミスマッチは、存在する場合には、中央部分よりもハイ
ブリッド二重鎖の末端領域に向かって不安定性が低くなる。許容されるミスマッ
チの数は、二重鎖の安定性の十分に理解されている原理に従って、オリゴマーの
長さ、二重鎖の中のＧ：Ｃ塩基対の割合、および二重鎖の中のミスマッチ（単数
または複数）の位置に依存する。このようなアンチセンスオリゴマーは細菌の核
酸標的配列に対して必ずしも１００％の相補性ではないが、標的配列に対して安
定かつ特異的に結合するために有効であり、その結果、核酸標的の生物学的活性
（例えば、細菌タンパク質の発現）が調節される。

【００５０】 ４０塩基程度の長さのオリゴマーが、少なくとも最少の数の塩基（例えば、１
０〜１５塩基）が標的核酸配列に対して相補的である場合には、適切であり得る
。しかし、一般的には、促進的または能動的な細胞中への取り込みは、約３０未
満の長さの、好ましくは、２５未満、そしてより好ましくは、２０以下の塩基の
オリゴマーの長さで、最適化される。以下にさらに記載されるＰＭＯオリゴマー
については、結合安定性および取り込みの最適なバランスは、一般的には、１７
〜１８塩基の長さで生じる。

【００５１】 オリゴマーは、標的配列と安定なハイブリッド二重鎖を形成しなければならな
い。好ましくは、オリゴマーは、対応しているＤＮＡおよび同じ標的核酸配列か
ら構成される二重鎖のＴｍよりも実質的に高いＴｍで、標的核酸配列に対してハ
イブリダイズし得る。アンチセンスオリゴマーは、相補的な配列の核酸に関して
、体温よりも高い、そして好ましくは５０℃よりも高い、結合Ｔｍを有する。６
０〜８０℃の範囲またはそれよりも高いＴｍが好ましい。相補的な配列の核酸に
関してアンチセンス化合物のＴｍは、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８５、１０７−１０
８頁によって記載されているもののような、従来の方法によって測定され得る。
輸送目的のため、１５〜２０塩基またはそれ未満の長さで、高いＴｍ（５０℃以
上）を示す化合物は、高いＴｍ値について２０＋の塩基を必要とするものより好
ましい。

【００５２】 二重鎖の中のＣ：Ｇ対合塩基の割合が増大すると、一般的には、オリゴマー化
合物のＴｍが増大することが公知である。本発明を支持する研究は、アンチセン
スオリゴマーのＣ塩基の数を最大にすることが特に好ましいことを示唆している
。

【００５３】 （Ｂ．細胞による取込み） 適切な細胞内レベルを達成するために、アンチセンスオリゴマーは、細胞によ
って積極的に取り込まれなければならない。このことは、遊離（複合体化してい
ない）形態で投与される場合には、促進輸送または能動輸送によって化合物が取
り込まれることを、または複合体化された形態で投与される場合には、エンドサ
イトーシスの機構によって取込まれることを意味する。

【００５４】 アンチセンス化合物が複合体化された形態で投与される場合には、複合体化薬
剤は、代表的には、アンチセンス化合物上の正味の電荷に対して反対の電荷を有
しているポリマー（例えば、カチオン性脂質、ポリペプチド、または非生物学的
なカチオン性ポリマー）である。アニオン性のオリゴヌクレオチドとカチオン性
脂質または他のポリマー成分との間で複合体（二分子層の複合体を含む）を形成
する方法は周知である。例えば、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，
３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロ
ライド）および中性のリン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノール
アミン）を含有しているリポソーム組成物であるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商
標）（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）が、広範に使用されている。投与後、複合
体は、エンドサイトーシス機構を通じて細胞によって取り込まれる。これは、代
表的には、エンドソーム体中への粒子のカプセル化を含む。細胞のヌクレアーゼ
に耐性を有するアンチセンス薬剤の能力は、生存性を促進し、そして最終的には
細胞の細胞質への薬剤の送達を促進する。

【００５５】 薬剤が遊離の形態で投与される場合には、薬剤は、実質的に非荷電であるべき
で、このことは、そのサブユニット間結合の大部分が生理学的なｐＨで非荷電で
あることを意味する。本発明の支持において行われた実験は、少数の正味の電荷
（例えば、１５〜２０マーのオリゴマーについて１〜２）が、実質的に非荷電の
骨格を有する特定のオリゴマーの細胞による取込みを増強し得ることを示す。電
荷は、例えば、骨格の結合において、オリゴマー自体の上に保有され得るか、ま
たは末端の荷電した基の付属物であり得る。好ましくは、荷電結合の数は、４個
の非荷電結合当たり１個の荷電結合にずぎない。

【００５６】 オリゴマーはまた、２つの反対の電荷が実質的にほぼ等しい限りは、負に荷電
した骨格および正に荷電した骨格の結合の両方を含み得る。好ましくは、このオ
リゴマーは、いずれかの電荷が３〜５個より多く連続したサブユニットの連続を
含まない。例えば、オリゴマーは、所定の数のアニオン性の結合（例えば、ホス
ホロチオエート、またはＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合）および匹敵す
る数のカチオン性結合（例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチレンジアミンホスホルアミデー
ト（Ｄａｇｌｅ））を有し得る。正味の電荷は好ましくは中性であるか、または
多くても１つのオリゴマーあたり１〜２の正味の電荷である。

【００５７】 実質的にまたは完全に非荷電であることに加えて、アンチセンス薬剤は、好ま
しくは、細胞膜を通過するオリゴマーの輸送を促進し得るかまたはオリゴマーを
能動的に輸送し得る、膜輸送システム（すなわち、膜タンパク質）についての基
質である。この特徴はオリゴマーの相互作用または細胞の取り込みについての以
下のような多数の試験の一つによって決定され得る。

【００５８】 第一の試験は、細胞表面上で選択された荷電したオリゴマー（例えば、ホスホ
ロチオエートオリゴマー）を置き換えるかまたはそれによって置き換えられるオ
リゴマー化合物の能力を試験することにより、細胞表面レセプターでの結合を評
価する。細胞が、所定の量の試験オリゴマー（これは、代表的には、蛍光標識さ
れている）とともに、約１０〜３００ｎＭの最終オリゴマー濃度でインキュベー
トされる。その後すぐに（例えば、１０〜３０分後に（試験オリゴマーの有意な
内在化が起こり得る前に））、置換化合物が、徐々に増加する濃度で添加される
。その試験化合物が細胞表面レセプターに結合し得る場合には、置換化合物が試
験化合物を置換することが観察される。置換化合物が、試験化合物濃度の１０×
またはそれ未満の濃度で５０％の置換を生じることが示される場合には、試験化
合物は、細胞輸送システムについて、置換化合物と同じ認識部位に結合すると考
えられる。

【００５９】 第二の試験は、標識されたレポーター（例えば、蛍光レポーター）を細胞の中
へ輸送する試験化合物の能力を試験することによって、細胞の輸送を測定する。
細胞は、約１０〜３００ｎＭの間の最終濃度で添加された、標識された試験化合
物の存在下でインキュベートされる。３０〜１２０分のインキュベーションの後
、細胞内標識について、細胞が例えば、顕微鏡検査法により試験される。有意な
細胞内標識の存在は、試験化合物が促進輸送または能動輸送により輸送されると
いう証拠である。

【００６０】 第三の試験は、細菌の細胞分裂または細胞周期タンパク質をコードする細菌の
核酸配列に対して標的化された場合に、細菌増殖を有効に阻害する特定のアンチ
センス化合物の能力を基にする。本発明の支持によりなされた研究は、この阻害
が、細菌の細胞膜を通過する能動輸送または促進輸送を必要とすることを示す。
この試験化合物は、細菌の増殖を阻害することにおいて効率的であると示された
アンチセンス配列を用いて調製される。例えば、本明細書中の配列番号４５は、
Ｅ．ｃｏｌｉのＤｉｃＦ遺伝子に対する代表的な配列である。この化合物は、代
表的には１０ｎＭと１ｍＭの間にある増大する濃度で、増殖している細菌の培養
物に添加される。細菌増殖を阻害する能力は、試験化合物を添加してから２４〜
７２時間後の細胞コロニー数から測定される。約１００〜５００ｎＭの間またそ
れより低い濃度で、５０％の阻害を生じ得る化合物は、能動輸送についての十分
な候補として考えられる。

【００６１】 （Ｃ．ＲＮａｓｅＨに対して耐性なｍＲＮＡ） 二つの一般的な機構が、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を
説明するため提案されている（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、１９９０；Ｂｏｎｈ
ａｍら、１９９５；およびＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら、１９９７を参照のこと）
。第一のものにおいて、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとの間で形成されたヘテ
ロ二重鎖がＲＮａｓｅＨの基質であり、ｍＲＮＡの切断をもたらす。このクラス
に属しているかまたはこのクラスに属していると提案されるオリゴヌクレオチド
として、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホジエステル（
改変されていない「天然の」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。しかし、この
ような化合物が、ＲＮａｓｅＨによるタンパク質分解に、オリゴマー：ＲＮＡ二
重鎖構造中のｍＲＮＡを暴露し、従って二重鎖を損失するので、これらは、本発
明における使用について最適状態には及ばない。「立体化学的遮断薬（ｓｔｅｒ
ｉｃ ｂｌｏｃｋｅｒ）」あるいは「ＲＮａｓｅＨ不活性」または「ＲＮａｓｅ
Ｈ耐性」と呼ばれるオリゴヌクレオチドアナログの第２のクラスは、ＲＮａｓｅ
Ｈの基質として作用することは観察されておらず、そして標的ＲＮＡの核細胞質
輸送（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、スプライ
シング、または翻訳を立体化学的に遮断することによって作用すると考えられて
いる。このクラスには、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅら、１９９６）、モ
ルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリルまた
は２’−Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ、１９９５）、お
よびＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（Ｇｅｅ、１９９８；Ｄｉｎｇ）が含ま
れる。

【００６２】 試験オリゴマーは、試験化合物とＲＮＡ：オリゴマー二重鎖を形成させ、次い
でＳｔｅｉｎらに記載されているような標準的なアッセイ条件下でＲＮａｓｅＨ
とともに二重鎖をインキュベートすることによって、ＲＮａｓｅＨに対してｍＲ
ＮＡを保護するその能力についてアッセイされ得る。ＲＮａｓｅＨに対する暴露
の後、完全な二重鎖の存在または非存在が、ゲル電気泳動または質量分析によっ
てモニターされ得る。

【００６３】 （ＩＩＩ．非荷電のオリゴヌクレオチドアナログ） 本発明のオリゴヌクレオチドアナログにおいて使用され得る非荷電結合の例が
、図３Ａ〜３Ｇに示される。以下に記載されるように、少数の荷電した結合（例
えば、荷電したホスホルアミデートまたはホスホロチオエート）もまたオリゴマ
ー中に取り込まれ得る。非荷電の結合として、以下が挙げられる：カーボネート
（３Ａ、Ｒ＝Ｏ）およびカルバメート（３Ａ、Ｒ＝ＮＨ_２）結合（Ｍｅｒｔｅｓ
；Ｇａｉｔ）；アルキルホスホネートおよびホスホトリエステル結合（３Ｂ、Ｒ
＝アルキルまたは−Ｏ−アルキル）（Ｍｉｌｌｅｒ；Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ）
；アミド結合（３Ｃ）；スルホン（３Ｄ、Ｒ_１、Ｒ_２＝ＣＨ_２）（Ｒｏｕｇｈｔ
ｅｎ）；スルホンアミド（３Ｄ、Ｒ_１＝ＮＨ、Ｒ_２＝ＣＨ_２またはその逆）（Ｍ
ｃＥｌｒｏｙ）；スルファメート（３Ｄ，Ｒ_１、Ｒ_２＝ＮＨ）（Ｈｕｉｅ）；な
らびにチオホルムアセチル結合（３Ｅ）（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ；Ｃｒｏｓｓ）。
後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物（Ｃｒｏｓｓ）に対して、増強
された二重鎖および三重鎖の安定性を有することが報告されている。構造３Ｆの
３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物（Ｖａｓｓｅｕｒ）もまた
報告されている。図３Ａ〜３Ｇにおいては、Ｂは、アデニン、シトシン、グアニ
ン、およびウラシルから好ましくは選択される、ポリヌクレオチド中の塩基に対
して、塩基特異的水素結合により結合するために有効である、プリンまたはピリ
ミジン塩基対合部分を示す。

【００６４】 この結合は、細菌の核酸配列中のそれぞれのヌクレオチド塩基に対するワトソ
ン−クリック塩基対合による結合に有効である塩基対合部分を支持する、各々が
５または６員環からなるヌクレオチドサブユニットを連結する。図３Ａ〜Ｆにて
デオキシリボース環が示されているが、サブユニットはまた、例えば、さらに以
下に記載するように、置換リボース環またはモルホリノ環（図３Ｇ）を包含し得
る。２’酸素で置換されたオリゴマーのリボヌクレオチドは高いＲＮＡ結合親和
性を示し、そして非置換リボヌクレオチドと比較して内因性のヌクレアーゼに対
する感受性を減少する。メチル置換リボヌクレオチドは、より大きな２’酸素に
おける置換基（例えば、エチル、プロピル、アリル、またはペンチル）を有する
リボヌクレオチドより高い結合親和性および細胞内への取込みを提供すると報告
されている。

【００６５】 １つの好ましいオリゴマー構造は、上記で概要を説明したような非荷電結合に
より連結された塩基対合部分を保有するモルホリノベースのサブユニットを使用
する。図３Ｇに示されているホスホロジアミデート結合化合物によって例示され
るような、実質的に非荷電のモルホリノオリゴマーが特に好ましい。モルホリノ
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有に係る
米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２
，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，
１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７
号に詳細に記載されている。モルホリノベースのサブユニットの所望される化学
的な特性は、安定な非荷電である骨格の結合によりオリゴマーの形態に連結され
る能力、標的ＲＮＡを含む相補性塩基標的核酸と１０〜１４塩基のような短いオ
リゴマーを用いてもなお高いＴｍでハイブリダイズする、そのように形成された
ポリマーの能力、哺乳動物細胞中に能動的に輸送されるオリゴマーの能力、なら
びにＲＮＡｓｅによる分解に耐性であるオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力
である。

【００６６】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造は、図１Ａ〜Ｄ
に示されるモルホリノサブユニットタイプを含む。これらの各々が、非荷電のリ
ンを含有しているサブユニット結合により連結されている。これらの図および図
２Ａ〜Ｄにおいては、リンからぶら下がっているＸ部分は、以下の任意のもので
あり得る：フッ素；アルキルまたは置換されたアルキル；アルコキシまたは置換
されたアルコキシ；チオアルコキシまたは置換されたチオアルコキシ；あるいは
、置換されていないか、１置換されたか、または２置換された窒素（環式構造を
含む）。アルキル、アルコキシ、およびチオアルコキシは、好ましくは、１〜６
個の炭素原子を、そしてより好ましくは、１個〜４個の炭素原子を含む。１置換
されたかまたは２置換された窒素は、好ましくは、低級アルキル置換といわれ、
そして環式構造は好ましくは、酸素、窒素、およびイオウから選択される１〜２
個のさらなるヘテロ原子を必要に応じて含有している、５〜７員環の窒素ヘテロ
環である。Ｚはイオウまたは酸素であり、そして好ましくは酸素である。

【００６７】 図１Ａは、図２Ａに示される５個の原子の繰返し単位の骨格を形成する、リン
含有結合を示す。ここでは、モルホリノ環が、１原子のホスホアミド結合により
連結される。

【００６８】 図１Ｂ中のサブユニットＢは、図２Ｂに示されるような、６原子の繰返し単位
骨格について設計される。図１Ｂにおいては、リン基に対して５’モルホリノ炭
素を連結している原子Ｙは、イオウ、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり
得る。ＸおよびＺ部分は、上記に定義される。特に好ましいモルホリノオリゴヌ
クレオチドとして、図２Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構
成されるものが挙げられる。ここでは、Ｘ＝ＮＨ_２またはＮ（ＣＨ_３）_２であり
、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである。

【００６９】 図１Ｃ〜Ｄ中のサブユニットＣ〜Ｄは、図２ＣおよびＤ中の構造について示さ
れるような、７原子ユニットの長さの骨格について設計される。構造Ｃにおいて
は、Ｘ部分は、構造Ｂにおいてと同じであり、そして部分Ｙはメチレン、イオウ
、または好ましくは酸素であり得る。構造Ｄにおいては、ＸおよびＹ部分は、構
造Ｂにおいてと同じである。図１および２に示される全てのサブユニットにおい
ては、ＰｉおよびＰｊのそれぞれは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する、塩基
特異的水素結合による結合に有効であるプリンまたはピリミジン塩基対合部分で
あり、そして好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから
選択される。

【００７０】 上に記載されるように、実質的に非荷電のオリゴマーは、制限された数の荷電
した結合（例えば、５個の非荷電結合当たり約１個まで）を都合よく含み得る。
モルホリノオリゴマーの場合においては、このような荷電した結合は、図２Ａ〜
Ｄ、好ましくは図２Ｂの任意のものにより示されるような結合であり得る。ここ
では、Ｘは、オキサイド（−Ｏ⁻）またはスルフィド（−Ｓ⁻）である。

【００７１】 本発明のアンチセンス化合物は、上記で引用されている参考文献中に詳細に記
載されている方法を使用して、段階的な固相合成によって合成され得る。サブユ
ニットの付加の順序は、選択される塩基配列により決定される。いくつかの場合
においては、例えば、化合物の薬物動態学を増強するため、または化合物の捕捉
もしくは検出を容易にするために、オリゴマー化合物に対してさらなる化学的な
部分を付加することが所望され得る。このような部分は、代表的には、標準的な
合成方法に従って、オリゴマーの５’または３’末端に対して、共有結合させら
れ得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマーの付加
（例えば、１０〜１００個のポリマーサブユニットを有しているもの）が、溶解
度の増強に有用であり得る。１つ以上の荷電した基（例えば、有機酸のようなア
ニオン性に荷電した基）は細胞による取り込みを増強し得る。レポーター部分（
例えば、フルオレセインまたは蛍光標識された基）が、検出の目的のために付着
させられ得る。あるいは、オリゴマーに付着させられたレポーター標識は、標識
された抗体またはストレプトアビジンに結合し得る抗原またはビオチンのような
リガンドであり得る。オリゴマーアンチセンスの付着または改変のための部分を
選択することにおいては、生体適合性であり、そしておそらく所望されない副作
用を伴わずに被験体によって寛容されるグループの化合物を選択することが、一
般的にはもちろん所望される。

【００７２】 （ＩＶ．例示的な細菌標的） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、胃腸管の正常な微生
物叢の一部である、グラム陰性細菌である。Ｅ．ｃｏｌｉの何百の株が存在し、
それらのほとんどは無害であり、そして健康なヒトおよび動物の胃腸管中で生存
している。現在は、ヒトにおいて胃腸炎を引き起こす腸管毒性（ｅｎｔｅｒｏｖ
ｉｒｕｌｅｎｔ）のＥ．ｃｏｌｉ（「ＥＥＣグループ」）の４つのクラスが認識
されている。これらの中には、腸病原性（ＥＰＥＣ）株およびビルレンス機構が
代表的なＥ．ｃｏｌｉ腸毒素の排出に関係しているものが存在する。このような
Ｅ．ｃｏｌｉ株は、胃腸管および尿路の感染、敗血症、肺炎、および髄膜炎に関
係しているものを含む種々の疾患を引き起こし得る。抗生物質は、いくつかの株
に対しては有効ではなく、そして感染の再発を必ずしも妨げるわけではない。

【００７３】 例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７は、米国において毎年、１０，０００
から２０，０００症例の感染を引き起こしていると推定される（Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅ
ｖｅｎｔｉｏｎ）。出血性大腸炎は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７によって引
き起こされる急性疾患の名称である。就学前の子供および高齢者は、重篤な合併
症の危険性が最も高い。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７は、最近、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔにおいてファーストフードレストランによる調理不充分
のハンバーガーを食べた４人の子供の死亡の原因として、報告された（例えば、
Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ．１２０（１）：１７
−２０、１９９８）。

【００７４】 腸管毒性のＥ．ｃｏｌｉ株の典型的な配列として、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号
のＡＢ０１１５４９、Ｘ９７５４２、ＡＦ０７４６１３、Ｙ１１２７５、および
ＡＪ００７７１６が挙げられる。

【００７５】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、局在化した胃腸管の感
染および胃腸炎（下痢、腹部の痙攣、および発熱）から重篤な全身性の疾病であ
る腸熱（腸チフスを含む）までの臨床的な範囲にわたる、種々の症状を引き起こ
すグラム陰性細菌である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染はまた、家畜の相当の損失
を引き起こす。

【００７６】 グラム陰性のｂａｃｉｌｌｉの代表的なものである、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｓｐｐ．の細胞壁は、細胞の溶解の際に開放され、そして生物体の病原性に寄与
する内毒素として機能し得る、複雑なリポポリサッカライド（ＬＰＳ）構造を含
む。

【００７７】 汚染された食物が、腸チフス様ではないサルモネラ感染の伝播の主要な態様で
ある。これは、十分に調理されていない肉および動物産物中でＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａが生存可能であるという事実に起因する。最も一般的な動物の感染源は、ニ
ワトリ、シチメンチョウ、ブタ、およびウシ、さらには多数の他の家畜および野
生動物である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．によって引き起こされる腸チフ
スおよび他の腸熱の流行病学は、ヒトの便が混入した水に関係している。

【００７８】 ワクチンは、腸チフスについて利用可能であり、そして部分的に有効である；
しかし、腸チフス様ではないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染について利用可能である
ワクチンは存在しない。腸チフス様ではないサルモネラ症は、衛生的な屠殺の実
行、ならびに食物の十分な調理および冷蔵を通じて制御される。抗生物質は、全
身的な疾患について指示され、そしてアンピシリンがいくらかの成功を伴って使
用されている。しかし、過剰な量の抗生物質での処置を受けた患者、免疫抑制剤
での処置を受けた患者、それに続く胃の外科手術を受けた患者、および溶血性貧
血、白血病、リンパ腫、またはＡＩＤＳの患者においては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ感染は医学的な問題のままである。

【００７９】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．は、それらがほとんどの抗生物質に対して
耐性であり、そして病院で取得された（院内）感染の主な原因であるので、臨床
的に重要である、運動性のグラム陰性桿菌である。感染は、免疫無防備状態の個
体、やけどの犠牲者、人工呼吸器をつけた個体、留置カテーテルをつけた個体、
ＩＶ麻酔の使用者、および慢性的な肺疾患（例えば、嚢胞性繊維症）を有してい
る個体において最も一般的である。感染は、健康な個体においてはまれであるが
、これは、多くの部位で生じ得、そして尿路感染、敗血症、肺炎、咽頭炎、およ
び多数の他の問題を導き得、そして処置はしばしば、より大きな有意な死亡率を
伴って失敗する。

【００８０】 Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは、ヒトに感染し、そしてコレラ生じる、グ
ラム陰性桿菌である。コレラは、乏しい公衆衛生によって拡大し、それによって
汚染された水の供給に至る。Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは、ヒトの小腸に
コロニーを形成し得、ここでこれは、粘膜を通過するイオンの輸送を崩壊させる
毒素を産生し、それによって下痢および脱水を引き起こす。Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅに感染した個体は、電解質を含有している溶液で静脈内または経口
のいずれかによる再水和が必要である。この疾病は一般的には、自己限定性があ
る；しかし、死亡が、脱水および必須の電解質の欠失によって生じ得る。テトラ
サイクリンのような抗生物質が、この質病の経過を短くすることが実証されてお
り、そして経口によるワクチンが現在開発下にある。

【００８１】 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、一般的な性感染病である淋
病の原因因子である、グラム陰性球菌である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅは、その表面抗原を変化させ得、それによって再感染に対する免疫
の発生を妨げる。淋病の７５０，０００に近い症例が、米国で毎年報告されてお
り、毎年７５０，０００のさらなる未報告の症例が推定され、ほとんどが１０代
および若い成人である。アンピシリン、アモキシリン、またはいくつかのタイプ
のペニシリンが、以前には淋病の処置のために推奨されてた。しかし、ペニシリ
ン耐性の淋病の出現が増大しつつあり、そして注射によって与えられる新しい抗
生物質（例えば、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）またはスペクチ
ノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ））が、ほとんどの淋菌感染を処置す
るために現在使用されている。

【００８２】 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、通常はヒトの鼻にコロニー
を形成し、そして皮膚上にしばしば見出される、グラム陽性球菌である。Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、病院を舞台として（すなわち、院内感染）血流感染
、肺炎、および外科手術の部位の感染を生じ得る。Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓは
、重篤な食中毒を生じ得、そして多くの株が、食物中で増殖し、そして対外毒素
を産生し得る。一般的な抗生物質（例えば、バンコマイシン）に対して耐性であ
るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが、社会および病院の両方を舞台として主要な
公の健康問題として米国および外国で出現した。最近、バンコマイシン耐性のＳ
ｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ単離物が、日本で同定されている。

【００８３】 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、しばしば壊滅的
でありそして致命的な疾患である、結核症の原因因子である、グラム陽性細菌で
ある。結核は増加し、世界規模であり、そして単一の感染性疾患による主要な死
亡原因である（現在は、１年間で３００万人の死亡率である）。これは、ヒトの
体のいくつかの器官（脳、腎臓、および骨を含む）に罹患し得る；しかし、結核
は、ほとんど共通して肺に罹患し得る。

【００８４】 米国では、約１０００万人の個体が、ポジティブ皮膚試験によって示されるよ
うに、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染し、毎年
、約２６，０００の新しい活性な疾患の症例が生じる。結核（ＴＢ）の症例の増
大は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ホームレス、薬物の濫用、および活性な感染を有する
ヒトの移動に関係している。薬物に敏感なＴＢについての現在の処置プログラム
は、６ヶ月から９ヶ月の期間の間、２個から４個の薬物（例えば、イソニアジド
、リファンピン、ピラジンアミド、エタンブトール、またはストレプトマイシン
）を服用することを含む。なぜなら、全てのＴＢ微生物は、単一の薬物によって
は破壊させられ得ないからである。さらに、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの薬物耐性および多剤耐性株の観察が、増加している。

【００８５】 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、胃の内層
に感染する、螺旋形またはＳ型の形態を有する、微好気性の、グラム陰性の、ゆ
っくりと増殖する、鞭毛を有する微生物である。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、慢性的な
表相の胃炎、消化性潰瘍疾患、および胃の腺癌を導く慢性の萎縮性胃炎に関係し
ている、ヒトの胃の病原体である。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、ヒトの最も一般的な慢
性の細菌感染の１つであり、そして活性な胃炎の患者の９０％以上に見られる。
現在の処置は、ビスマス、メトロニダゾル、およびテトラサイクリンまたはアモ
キシリンのいずれかでの３重薬物治療を含む。これによってほとんどの症例にお
いてＨ．ｐｙｌｏｒｉが根絶させられる。３重治療の問題点として、患者のコン
プライアンス、副作用、およびメトロニダゾル耐性が挙げられる。見こみを示す
二重治療の別のレジメは、アモキシリンおよびメトロニダゾル、またはオメプラ
ゾールおよびアモキシリンである。

【００８６】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、グラム陽性球菌であ
り、そして細菌性の肺炎、ならびに中耳の感染（中耳炎）および髄膜炎の最も一
般的な原因の１つである。米国においては、毎年、肺炎球菌による疾患は、菌血
症の約５０，０００の症例の原因であり；髄膜炎の３，０００の症例の原因であ
り；１００，０００〜１３５，０００の入院の原因であり；そして中耳炎の７０
０万の症例の原因である。肺炎球菌による感染は、米国において毎年、推定して
４０，０００人の死亡を生じる。２歳未満の子供、６５歳以上の成人、潜在的な
医学的な状態（例えば、うっ血性の心疾患、糖尿病、気腫、肝臓疾患、鎌状赤血
球、ＨＩＶが挙げられる）を有している任意の年齢のヒト、および特別な環境（
例えば、療養所、および長期ケア施設）で生活しているヒトが、感染の最も高い
危険性を有する。

【００８７】 薬物耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株は、米国で一般的となり、多くのペニシ
リン耐性ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉはまた、エリスロマイシンまたはトリメトプリ
ム−スルファメトキサゾールのような、他の抗菌剤に対しても耐性である。

【００８８】 Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍは、梅毒を生じるスピロヘーターで
ある。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｉｕｍは、梅毒、イチゴ種、および性病ではない地方性
の梅毒または熱帯白斑性皮膚病を生じる、独占的な病原体である。Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍは、インビトロで増殖することはできず、そして哺
乳動物細胞の非存在下では複製される。最初の感染によって、感染部位に潰瘍を
生じる；しかし、この細菌は、体全体に移動し、経時的に多くの器官を損傷させ
る。その後期の段階には、未処置の梅毒は、感染性ではないが、重篤な心臓の異
常、精神障害、失明、他の神経学的な問題、および死を生じ得る。

【００８９】 梅毒は、通常は、注射によって投与されるペニシリンで処置される。他の抗生
物質は、ペニシリンに対してアレルギーである患者、またはペニシリンの通常の
用量には応答しない患者について利用される。梅毒の全ての段階で、適切な処置
によって疾患を治癒するが、後期の梅毒においては、体の器官にすでに生じた損
傷を取り消すことはできない。

【００９０】 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは、米国において最も一般的な
細菌による性感染症であり、そして毎年、４百万人の新しい症例が生じると見積
もられる。最も高い感染率は、１５〜１９歳である。クラミジアは、ほとんどの
非淋菌性の尿道炎（ＮＧＵ）、子宮頸管炎、細菌による膣炎、および骨盤炎症性
疾患（ＰＩＤ）の主要な原因である。クラミジア感染は、非常に穏やかな症状を
有し得るか、または全く症状を有さない場合がある；しかし、未処置のまま放置
するとＣｈｌａｍｙｄｉａ感染は、生殖器官（特に、女性において）に対して重
篤な損傷を導き得る。抗生物質（例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシン
、オフロキサシン、アモキシリン、またはドキシサイクリン）が、Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ感染を処置するために記載される代表的なものである。

【００９１】 Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ。ネコ引っ掻き熱（Ｃａｔ Ｓｃｒ
ａｔｃｈ Ｆｅｖｅｒ）（ＣＳＦ）またはネコ引っ掻き病（Ｃａｔ Ｓｃｒａｔ
ｃｈ Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＳＤ）は、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌ
ａｅと最初に命名されそして現在はＢａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅと
して公知の、グラム陰性の桿菌によって引き起こされる、猫に対する暴露を通じ
て獲得されるヒトの疾患である。症状として、発熱および膨らんだリンパ節が挙
げられる。ＣＳＦは、ヒトにおいては、一般的には、比較的良性であり、自己限
定性の疾患である；しかし、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅの感染は
、免疫無防備状態にあるヒトにおいては、異なる臨床的な症状（菌血症、細菌性
血管腫症、肝臓紫斑病、細菌性の脾臓炎、およびＡＩＤＳ脳症のような他の慢性
的な疾患の発現を伴う急性の発熱性の疾病を含む）を生じ得る。

【００９２】 この疾患は、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リファンピン、ペニシリ
ン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、シプロフ
ロキサシン、およびアジスロマイシンのような抗生物質で処置される。

【００９３】 Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）
は、グラム陰性細菌のファミリーである；これらの６個のタイプが公知であり、
Ｂ型または「ＨＩＢ」によってほとんどのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａに関連する疾
患が引き起こされる。ＨＩＢのためのワクチンが開発されるまでは、ＨＩＢは、
中耳炎、鼻腔感染、気管支炎の共通の原因であり、髄膜炎の最も共通の原因であ
り、そして肺炎、敗血症による関節炎（関節の感染）、蜂巣炎（柔組織の感染）
、および心外膜炎（心臓を取り巻いている膜の感染）の症例においては頻繁な原
因であった。Ｂ型のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａの細菌は、ヒトにおいて広範囲にわ
たっており、そして通常は、疾病を生じることなく、喉および鼻の中で生存して
いる。ワクチンを接種していない５歳以下の子供は、ＨＩＢ疾患の危険がある。
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ感染によって引き起こされる髄膜炎および他の重篤な感
染症は、脳の損傷または死に導き得る。

【００９４】 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｔｅｒｉａｅ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ．）は
、赤痢を生じるグラム陰性桿菌である。結腸中で、この細菌は粘膜細胞中に侵入
し、そして粘膜細胞内で分割し、それによって広範囲にわたり炎症性の応答を生
じる。Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染は、脱水を導き得る重篤な下痢を生じ得、そして非
常に若い、非常に高齢の、または慢性的な病気のヒトについては危険を伴い得る
。Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ．は、強力な毒素（シガ毒素（ｓｈｉｇａ ｔｏｘ
ｉｎ））を形成し、これは、細胞毒性、腸毒性、神経毒性であり、そしてタンパ
ク質合成のインヒビターとして作用する。アンピシリンおよびＴＭＰ−ＳＭＸの
ような抗生物質に対する耐性が生じる；しかし、より新しい、より広範囲の抗生
物質（例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびエノキサシン）
での処置は依然として有効である。

【００９５】 Ｌｉｓｔｅｒｉａは、ヒトおよび動物の便の中に見出される運動性のグラム陽
性細菌の属である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、髄膜脳
炎および髄膜炎のような疾患を引き起こす。ウシおよびヒツジにおいては、リス
テリア感染は、脳炎および自然流産を生じる。

【００９６】 獣医学的適用。家畜の胃腸管中の健康な微生物叢は、健康および関連する食物
製品の対応している製造のために、生命にとって重要である。ヒトの場合には、
健康な動物の胃腸管は、多数の細菌のタイプ（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｏｓａ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｓｐ
．）を含み、これらは、互いに生態学的な平衡で生存している。この平衡は、食
生活の変化、ストレスによって混乱させられ得るか、または抗生物質もしくは他
の治療的な処置に応答して混乱させられ得、それによってＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
、 Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｔｕｌａｒｅｍｉ
ａ、およびＥ．ｃｏｌｉのような細菌によって一般的には引き起こされる動物中
での細菌性の疾患を生じる。これらの動物中での細菌感染はしばしば、治療的な
介入を必然的に伴い、その上、これはしばしば生殖能力の減少に関係している処
置コストを有する。

【００９７】 結果として、家畜は、胃腸管の叢の平衡を維持するために抗生物質で日常的に
処置される。このアプローチの欠点は、抗生物質耐性である細菌の発生であり、
ヒトが消費するための得られる食物製品中にこのような抗生物質を持ちこむこと
である。

【００９８】 （Ｖ．細胞分裂および細胞周期の遺伝子およびタンパク質） 本発明のこのアンチセンスオリゴマーは、細菌の細胞分裂または細胞周期のタ
ンパク質をコードする核酸配列の領域に、３７℃より実質的に大きい（例えば、
少なくとも５０℃および好ましくは６０〜８０℃）Ｔｍである生理学的条件下で
ハイブリダイズするように設計される。あるいは、このアンチセンスオリゴマー
は、細菌のｔＲＮＡ、好ましくはｍｅｔ−ｔＲＮＡに対して標的化され得る。こ
のオリゴマーは、標的核酸配列に対して高い結合親和性を有するように設計され
、そして、細胞分裂または細胞周期をコードしている核酸標的配列に対して１０
０％相補的であり得るか、またはさらに上述したようにミスマッチを含み得る。

【００９９】 様々な局面において、本発明は、以下を含む細菌の細胞分裂または細胞周期の
タンパク質をコードする核酸標的配列に対して安定かつ特異的に結合することが
有効である核酸配列であるアンチセンスオリゴマーを提供する：（１）食中毒に
関連するＥ．ｃｏｌｉの株（例えば、Ｏ１５７：Ｈ７（以下の表１を参照のこと
））のような、細菌の所定の種の特定の株に特異的な配列；（２）細菌の２つ以
上の種に共通な配列；（３）細菌の２つの関連する属に共通な配列（すなわち、
細菌の同様の系統的起源の属）；（４）グラム陰性細菌間で一般に保存されてい
る配列；（５）グラム陽性細菌間で一般に保存されている配列；または（６）一
般に、細菌の細胞分裂または細胞周期のタンパク質をコードしている核酸配列に
ついてのコンセンサス配列。

【０１００】 一般に、本発明のアンチセンスの方法を用いる遺伝子発現の調節についての標
的は、以下を含むがこれらに限定されない細胞分裂および細胞壁合成の遺伝子（
ｄｃｗ）クラスターの遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列のような活性な細菌増
殖または複製の間に発現するｍＲＮＡを含有する：ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃ
Ａ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ
、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、
ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍ
ｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢ。細菌の細胞分裂およびＥ．ｃｏ
ｌｉの細胞周期についての一般的な総説については、それぞれ、Ｂｒａｍｈｉｌ
ｌ、Ｄ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １３：３９５−
４２４、１９９７およびＤｏｎａｃｈｉｅ、Ｗ．Ｄ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ． ４７：１９９−２３０， １９９３を参照のこと。

【０１０１】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞分裂は、細胞のエンベロープの全三層（細胞質膜、
堅いペプチドグリカン層および外膜）の協調した陥入を包含する。隔膜のくびれ
はその細胞が２つの区画に分割し、そして複製されたＤＮＡを分離する。すくな
くとも９つの不可欠な遺伝子産物がこの過程に加わっている：ｆｔｓＺ、ｆｔｓ
Ａ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＷおよびｚｉ
ｐＡ（Ｈａｌｅ、Ｃ．Ａ．および、ＤｅＢｏｅｒ、Ｐ．Ａ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｔ
ｉｏｌ．１８１（１）：１６７−１７６、１９９９）。

【０１０２】 ＦｔｓＺ、つまりＥ．ｃｏｌｉの最も初期の必須の細胞分裂遺伝子の一つは、
細菌細胞の分裂部位において、膜に会合したリングを形成する可溶性のチューブ
リン様ＧＴＰアーゼである。このリングは細胞のくびれを駆動すると考えられて
おり、そして細胞壁の陥入に影響を与えると思われる。ＦｔｓＺは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの中のｚｉｐＡと呼ばれる新しい内在性の内膜のタンパク質に直接結合し、こ
のタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで細胞分裂を媒介する隔膜リング構造の必要不可
欠な構成成分である（Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓ、Ｊ．およびＡｄｄｉｎａｌｌ、Ｓ
．Ｇ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：９３−１１６、１９９７）
。

【０１０３】 正常な細胞分裂について、ｆｔｓＺ遺伝子は、近接した上流遺伝子であるｄｄ
ｌＢ、ｆｔｓＱ、およびｆｔｓＡ内に位置する多くのプロモーターから転写され
る（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（９）：２７８
８−９１、１９９３）。ｆｔｓＡとｆｔｓＺ遺伝子の間の接合部にかかる４９０
ｂｐのＤＮＡセグメントが、高いコピー数で存在した場合、細胞分裂を阻害する
ことが示された（Ｄｅｗａｒ、Ｓ．Ｊ．およびＤｏｎａｃｈｉｅ、Ｗ．Ｄ．、Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（２１）：７０９７−１０１、１９９３）。

【０１０４】 保存されている細胞分裂インヒビターであるＭｉｎＣＤは、ＭｉｎＤと共に、
細胞極で分裂を阻害する、細胞分裂インヒビターであるＭｉｎＣからなる。Ｅ．
ｃｏｌｉにおけるＭｉｎＥとして称されるさらなるタンパク質はＭｉｎＣＤ作用
の制御下で役割を担う（Ｍａｒｓｔｏｎ、Ａ．Ｌ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１
２（２１）：３４１９−３４３０、１９９８；Ｐｏｇｌｉａｎｏ，Ｊ．ら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１３）：３４８６−９０、１９９８）。

【０１０５】 Ｐｍｒａとして称されるプロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｒａクラス
ターの以下に示す最初の９つの遺伝子の発現に必要であることが見出された：ｍ
ｒａＺ（ｏｒｆＣ）、ｍｒａＷ（ｏｒｆＢ）、ｆｔｓＬ（ｍｒａＲ）、ｆｔｓＩ
、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、およびｆｔｓＷ（Ｍｅｎｇｉｎ−
Ｌｅｃｒｅｕｌｘ、 Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１７）：４４
０６−４４１２、１９９８）。

【０１０６】 ｍｕｒＤ， ｍｕｒＥ， ｍｕｒｆおよびｍｕｒＣ遺伝子は、以下に記載され
ているように細胞壁の形成に関与する：Ｌｕ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ７７：４１３
−４２６、１９９４；Ｔａｏ，Ｊ．Ｓ．およびＩｓｈｉｇｕｒｏ、Ｅ．Ｅ．、Ｃ
ａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１０５１−１０５４、１９８９；Ｍｅｎ
ｇｕｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘ、Ｄ．およびＶａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：１８３−１８３、１９９０；
Ｉｋｅｄａ、Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０５８−
１０５８，１９９０；ならびにＩｋｅｄａ， Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１８：４０１４−４０１４，１９９０。

【０１０７】 ＳｅｃＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉの蛋白質排出（ｅｘｐｏｒｔ）に関与し、こ
こで、これはＡＴＰの加水分解を、膜を横断する分泌前のペリプラズムおよび外
膜のタンパク質の移送に共役する際に中心的な役割を担う。ＳｅｃＡは、原核生
物のタンパク質トランスロケーション装置を含む７つの分泌タンパク質（Ｓｅｃ
Ａ〜ＳｅｃＦおよびｓｅｃＹ）の一つである。

【０１０８】 ＳｅｑＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製開始ネガティブモジュレーター
（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である（Ｌｕ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ７７：４１３−４２６、１９９４）。

【０１０９】 Ｅ．ｃｏｌｉのｄｉｃＢオペロンは、細胞分裂を阻害する小さなタンパク質の
遺伝コードを指定することが示されており、これは、第二のインヒビターである
ｄｉｃＦを発現する。ｄｉｃＦ遺伝子によりコードされた５３ヌクレオチドＲＮ
Ａ分子は、ｆｔｓＺのｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、Ｅ．ｃｏｌｉにお
ける細胞分裂をブロックすることが示され、このことは、ｄｉｃＦがアンチセン
スＲＮＡをコードすることにより機能することを示している（例えば、Ｔｅｔａ
ｒｔ、Ｆ．およびＢｏｕｃｈｅ、Ｊ．Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６
（５）：６１５−６２０、１９９２；Ｆａｕｂｌａｄｉｅｒ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ２１２（３）：４６１−４７１，１９９０；Ｄｅｌｉｈａｓ、
Ｎ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５（３）：４１１−４１４， １９９
５を参照のこと）。ｄｉｃＡ遺伝子は、分裂阻害遺伝子ｄｉｃＢに作用するリプ
レッサータンパク質をコードすることが示されている（Ｂｅｊａｒ、Ｓ．ら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（１７）：６８２１−３３、１９８
６）。

【０１１０】 ＳｕｌＡ遺伝子はスルホンアミド耐性に関与する。ＤＨＰ（ＳｕｌＳ）は、葉
酸の即時（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）前駆体の形成を触媒し、そしてまたスルホンア
ミドに対する耐性に関与している（Ｌｏｐｅｚ、Ｐ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１６９ （９）：４３２０−４３２６、１９８７）。Ｅ．ｃｏｌｉおよび
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｓｕｌＡ遺伝子は細胞分裂のインヒビターをコー
ドしいる（例えば、Ｆｒｅｕｄｌ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｅ ５２：３１−４０、１９
８７を参照のこと）。

【０１１１】 様々な細胞分裂および細胞周期の遺伝子のコード配列を含む例示的な細菌配列
についてのＧｅｎＢａｎｋの参照については、以下の表１に提示する。

【０１１２】

【表１】 （ＶＩ．細胞分裂および細胞周期の核酸に対してアンチセンスである例示的な
オリゴマー） 様々な局面において、本発明は、以下のようなタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａについて翻訳開始までかかる標的配列に安定かつ特異的に結合するのに有効な
核酸配列を含む、アンチセンスオリゴマーを提供する：（１）所定の種の特定の
株または細菌の株、すなわちＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株で独特である；（
２）２種以上の細菌間で相同性を共有している；（３）グラム陰性細菌に共通で
ある（相同性を共有している）；（４）グラム陽性細菌で共通である（相同性を
共有している）；（５）全てではないがほとんどの細菌で共通である（相同性を
共有している）。

【０１１３】 様々な細菌の細胞分裂および細胞周期の核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋの
参照は、例えば上記の表１で例示したものは、本発明の教示に基づいて、所定の
細胞分裂または細胞周期のタンパク質／細菌の組合せについてアンチセンスオリ
ゴマーを設計するために、当業者によって使用され得る。好ましくは、アンチセ
ンスオリゴマーの標的化配列は、以下を含むがこれらに限定されない細胞分裂お
よび細胞壁合成の遺伝子クラスター中の細菌性遺伝子と相補的である：ｚｉｐＡ
、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、
ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍ
ｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉ
ｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢ。一般に、こ
のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、次のように設計される：（１）翻
訳開始コドンの位置を、目的とする所定の細菌の細胞分裂または細胞周期のタン
パク質について同定する；（２）コード配列の最初の１２〜１８ヌクレオチドと
ともに、選択したタンパク質についてその開始から５’側にある約３〜９ヌクレ
オチド含む、約１２〜２５ヌクレオチドからの配列を選択する；（３）アンチセ
ンスオリゴマーを選択された配列に基づいて設計する。

【０１１４】 一旦細菌核酸配列が選択されると、この配列は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌ
ｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）のようなコンピュー
タプログラムを使用して他の細菌性配列と比較され得る。ＢＬＡＳＴ分析は、選
択された配列が公のデータベース中の他の配列に対して相同であるか否かを決定
するために、任意の所定配列をこのデータベース中の配列と比較するために実行
され得る（例えば、上記の配列番号５８を参照のこと）。本明細書中で記載され
るＢＬＡＳＴ分析を実行する際に、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において見出されるＢＬＡＳＴ探索プログラムが用い
られ、そしてヌクレオチド問合せ配列をヌクレオチド配列データベースに対して
比較する「ＢＬＡＳＴＮ」探索が実行される。ＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０
．１０（１９９９年８月２６日）を使用して、非冗長的（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄ
ａｎｔ）ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列を探索した（例えば
、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３
３８９−３４０２、１９９７を参照のこと）。

【０１１５】 このような分析において、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、核酸配列を核酸配列デ
ータベースに対して探索するために好ましく、そしてＢＬＡＳＴＸプログラムは
、全てのリーディングフレーム中で翻訳された核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースおよび他の公のデータベース中の
アミノ酸配列に対して探索するてために好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳ
ＴＸはＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを使用し、そしてオープンギャップペナ
ルティを１１．０、伸長ギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ ｐｅ
ｎａｌｔｙ）を１．０としたデフォルトパラメーターを用いて実行される（Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌ，Ｓら、１９９７、上述を参照のこと）。

【０１１６】 このような配列比較の結果は、２配列間の「同一性パーセント」また「相同性
パーセント」によって報告され得る。用語「同一性パーセント」とは、２つの核
酸またはアミノ酸配列間の同一性のレベルをいい、規定されたアルゴリズムによ
り決定され、従って所定配列のホモログは、この所定配列の長さにわたって少な
くとも約７０％または８０％、好ましくは約９０、９５、または９８％の配列同
一性を有する。本明細書中で使用される場合、用語「７０％相同性」とは、７０
％配列同一性と同じものであることを意味することが理解される。

【０１１７】 アンチセンス調節の標的である例示的な細菌の細胞分裂または細胞周期の核酸
配列およびこのような配列を標的化するための対応する例示的なアンチセンスオ
リゴマーを、以下の表２Ａ〜Ｃおよび表３に提供する。各場合において、示した
標的に対するアンチセンスオリゴマーは、所定のＧｅｎＢａｎｋ登録番号の示し
た位置において見出される核酸配列に基づいて設計された。例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのｄｉｃＦに対する例示的なアンチセンスオリゴマーは、配列番号４５として
提示される配列を有し（表２Ａ）、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０７４６５
のヌクレオチド１８６４〜１８８６に見出される核酸配列に基づいて（すなわち
、これに対してアンチセンスに）設計された。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｅｃＡ
に対する例示的なアンチセンスオリゴマーは、配列番号４７として提示される配
列を有し（表２Ａ）、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５０３４（ヌクレオチ
ド２４７９８〜２４８１７）に見出される核酸配列およびＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＣＡＡ３８８５１として見出される対応するタンパク質配列に基づいて設計さ
れた。

【０１１８】

【表２】

【０１１９】

【表３】

【０１２０】

【表４】 以下の表３は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍまたはＥｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの細胞分裂および複製に関与する細菌のタン
パク質に標的化されたさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。カルバ
メートキナーゼ（ＣＫ）は、可逆反応ＮＨ_２ＣＯＯ−＋ＡＴＰ←→ＮＨＣＯＯＰ
Ｏ_３ ^（２−）＋ＡＤＰを触媒し、アルギニンジヒドロラーゼ経路を介して嫌気的
なアルギニン分解からエネルギーを駆動する微生物において、カルバモイルリン
酸からＡＴＰを合成するのに役立つ（Ｍａｒｉｎａ、Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２５３（１）：２８０−９１、１９９８）。Ｄ−アラニン：Ｄ−ア
ラニンリガーゼ（ｄｌｌ）は、細菌の細胞壁合成のために必要不可欠であり、ペ
プチドグリカン架橋に使用されるサブユニットの一つを組立てる（Ｅｌｌｓｗｏ
ｒｔｈ，Ｂ．Ａ．ら、 Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ． ３（１）：３７−４４、１９
９６）。

【０１２１】 トポイソメラーゼは、コイル状ＤＮＡのトポロジーを制御し、従ってＤＮＡ複
製にとって重要である。チオレドキシンレダクターゼは、還元型チオレドキシン
の再生を触媒することにより、リボヌクレオチドリン酸のデオキシリボヌクレオ
チドリン酸への還元の役割を担っている。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は
、テトラヒドロ葉酸からのジヒドロ葉酸の再生を触媒することにより、同様にデ
オキシウリジル酸からのデオキシチミジル酸合成の役割を担う。

【０１２２】 アルキルハイドロジェンペルオキシドレダクターゼは、細菌内の酸化的ストレ
スにより誘導され（Ｓｔｏｒｚ、Ｇ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１（４
）：２０４９〜５５、１９８９；Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｆ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６４（３）：４８８〜９６、１９８９）そしてＤＮＡを酸化的な
変異誘発から防御することが理解される。

【０１２３】

【表５】 （ＶＩＩ．例示的なアンチセンスオリゴマーの評価および生物学的活性） 本発明における適性についてオリゴマーを試験する際、上記のＩＩ節において
詳細が述べられた性質の各々が、満たされることが好ましい。「実質的に非荷電
」であるという特徴は、結合が非荷電であり、そして標的配列の相補性が塩基配
列設計により達成される場合に、本質的に満たされる。従って、オリゴマーは好
ましくは、以下について試験される：（ｉ）好ましくは１２〜２０塩基対の間の
長さである二重鎖の標的ＲＮＡについてのＴｍ、（ｉｉ）能動輸送または促進輸
送により細胞膜を通過して輸送される能力（ｉｉｉ）上記のＩＩ節に記載したよ
うな、二重鎖形成の際のＲＮａｓｅＨによるＲＮＡタンパク質分解を妨げる能力
。

【０１２４】 所定のアンチセンスオリゴマーの有効性は、当該分野で公知の方法により決定
され得る。例えば、オリゴマーは、インビトロで、細菌培養物とともにインキュ
ベートされ得、そして以下の有無をモニターすることによって標的核酸に対する
影響が評価され得る：（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動ゲル移動度
アッセイ）を使用する、標的配列と非標的配列とのヘテロ二重鎖の形成；（２）
標準的な技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット）によって決定さ
れるような、標的細胞分裂または標的細胞周期のタンパク質についてのｍＲＮＡ
の量；（３）標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティン
グ）によって決定されるような、細菌のタンパク質の産生の量；あるいは（４）
標的核酸ＲＮＡ配列を有することが公知である両方の細菌についての、インビト
ロでの細菌増殖の量。

【０１２５】 候補のアンチセンスオリゴマーはまた、周知の方法に従って、^３Ｈ−ロイシン
および^３Ｈ−チミジンのそれぞれの取り込みを通じて測定されるような、タンパ
ク質およびＤＮＡ合成に対する影響のような、急性および慢性の細胞性の毒性に
ついて、周知の方法に従って評価され得る。さらに、種々のコントロールオリゴ
ヌクレオチド（例えば、１つ以上のコントロールオリゴヌクレオチド（例えば、
センス、非センス、またはスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）アンチセンス配
列）あるいはミスマッチ塩基を含有する配列が、一般的に、候補のアンチセンス
オリゴマーの結合の特異性を確認するために、評価のプロセスに含まれる。この
ような試験の結果は、無差別の抑制から遺伝子発現のアンチセンス阻害の特異的
影響の区別することを可能にする（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｍ．Ｒ．ら、Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（７）：１９８１−１９９３，１９９５を参照のこと
）。従って、配列は非標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの非特異的な結
合を制限するために必要とされるように改変され得る。

【０１２６】 内因性の細菌の細胞分裂および細胞周期の遺伝子の発現、または細菌のｔＲＮ
Ａに対して標的化された選択されたホスホジアミデートモルホリノオリゴマー（
ＰＭＯ）の効果は、配列番号４５、配列番号４７、および配列番号５９にそれぞ
れ提示された配列を有する、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＦ ｍＲＮＡ、ｓｅｃＡ ｍ
ＲＮＡ、またはｍｅｔ−ｔＲＮＡに対するアンチセンスであるＰＭＯとともにＥ
．ｃｏｌｉをインキュベートすることにより評価された。この手順は、以下の「
材料および方法」で記載されるように実行した。図４Ａ〜Ｃに示されるように、
これらのＰＭＯを用いるＥ．ｃｏｌｉの処置は、１００ｎＭ未満のアンチセンス
オリゴマー濃度で、有意な細菌細胞の死滅を生じた。図４Ａに示されるように、
ｄｉｃＦに対するアンチセンスＰＭＯは、１．０μＭのオリゴヌクレオチドで８
０％の阻害（２０％が生存可能）を生じた。

【０１２７】 上記の表３に示した配列を有する１．０μＭのＰＭＯの、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの生存度に与える影響が、同様に試験された。結果を表
４に与える。

【０１２８】

【表６】 従って、本発明のアンチセンスオリゴマーは、抗細菌剤として有効であり、代
表的には５０〜６０％、およびいくつかの場合では、８０％までの増殖の阻害を
もたらす。本発明を支持する研究はまた、１０世代後に、生物が耐性株に変異で
きなかったことを示した。

【０１２９】 本発明のアンチセンスＰＭＯへの曝露の際、いくつかの細菌は輸送を遮断する
ようであり、そして異常なカリフラワー形態により特徴付けられる半休止状態に
入る。従って、このようなオリゴヌクレオチドはまた、抗細菌性ワクチンの調製
における有用性を見出し得る。本発明のこの局面において、特定タイプの細菌の
培養物は、上記の型のモルホリノベースのアンチセンスオリゴマーの存在下にお
いて、複製欠損および／または形態学的に異常である細菌細胞を産生するのに有
効な量で、インキュベートされる。このような複製欠損および／または形態学的
異常である細菌細胞は、被験体に投与されそしてワクチンとして作用する。

【０１３０】 （ＩＸ．インビボでのアンチセンスオリゴマーの投与） 一つの局面においては、本発明は、哺乳動物中おけるインビボの細菌感染の遅
延または制限をすること、ならびに／あるいは代表的に特定の細菌による感染に
関係する検出可能な症状を減少または排除することに関する。この方法は、被験
体に、適切な薬学的キャリア中で、細菌の細胞分裂または細胞周期の目的のタン
パク質の生物化学的活性を阻害するのに有効なアンチセンス剤の量を投与する工
程を包含する。

【０１３１】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびこれらを含有する薬学的組成
物は、哺乳類においてインビボで細菌感染を阻害するため、および宿主細胞内で
の細菌の増殖を阻害また停止するために有用である。細菌は宿主細胞の正常な増
殖もしくは発生に対して有害な効果を殆どもしくは全く伴わずに、数を減少させ
得るか、または除去され得る。

【０１３２】 いくつかの場合、アンチセンスオリゴマーは、一般に細菌の増殖を阻害する。
他の場合、このアンチセンスオリゴマーは、１つ以上の特定の型の細菌（例えば
、特定の属、種、または株）に対して特異的である。

【０１３３】 本発明の方法を使用する、被験体中におけるこのようなアンチセンスオリゴマ
ーのインビボでの効力は、以下を含むがこれらに限定されない多数の因子に依存
することが理解される：（１）標的配列；（２）アンチセンス投与の持続時間、
用量、および頻度；ならびに（３）被験体の一般的な状態。

【０１３４】 他の場合、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗細菌性ワクチンの
調製における有用性が見出される。本発明のこの局面において、細菌の特定の型
の培養物は、複製欠損および／または形態学的に異常な細菌細胞を生成するのに
有効な量で、上記のタイプのモルホリノベースのアンチセンスオリゴマーの存在
下でインキュベートされる。このような複製欠損および／または形態学的に異常
な細菌細胞は、被験体に投与され、そしてワクチンとして作用する。

【０１３５】 インビボで投与される本発明のアンチセンスオリゴマーの、１つ以上の型の細
菌の増殖の阻害または排除における効力は、アンチセンスオリゴマーの投与の前
、この投与の間、およびこの投与の後で被験体から採取された生物学的サンプル
（組織、血液など）のインビトロでの培養または顕微鏡試験によって決定され得
る。（例えば、Ｐａｒｉ、Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３９（５）：１１５７−１１６１、１９９
５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０（９）：２００４−２０１１、１９９６
を参照のこと）。アンチセンスオリゴマー処理した細菌のインビボ投与されたワ
クチンの効力は、例えば、以下のような免疫応答の検出のための標準的な免疫学
的技術に決定され得る：ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）、リンパ球混合反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）（ＭＬＲ）、細菌特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）につい
てのアッセイなど。

【０１３６】 （Ａ．投与方法） 標的核酸に対するアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の重要な局面
である。本発明に従って、アンチセンスオリゴマー送達のこのような経路は、以
下を含むがこれらに限定されない：経口および非経口の経路を含む種々の全身性
経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋内、ならびに吸入）、経皮的送
達、および局所的送達。適切な経路が、処置下にある被験体の状態に対して適切
なように、当業者により決定され得る。例えば、皮膚の細菌感染の処置において
、アンチセンスオリゴマーの送達に適切な経路は局所的送達であり、その一方で
、呼吸器の細菌感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの送達は、吸入によ
る送達である。オリゴマーを細菌感染の部位へ送達するか、またはオリゴヌクレ
オチドを血流内へ導入するのに有効な方法もまた意図される。

【０１３７】 アンチセンスオリゴマーの経皮送達は、例えば、局所的投与に適合させた薬学
的に受容可能なキャリアの使用により達成され得る。モルホリノオリゴマー送達
の一つの例は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４に記載される。

【０１３８】 一つの好ましい実施形態において、オリゴマーは、モルホリノオリゴマーであ
り、これは薬学的に受容可能なキャリアに含まれ、そして経口送達される。

【０１３９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に受容可能である任意の便利なビヒ
クルで投与され得る。このようなオリゴヌクレオチド組成物は、当業者により用
いられる任意の種々の標準的な薬学的に受容されるキャリアを含み得る。このよ
うな薬学的キャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）、水、水性エタノール、油／水乳濁物のような乳濁物、トリグリセリド乳濁物
、湿潤剤、錠剤、およびカプセル剤が挙げられるが、これらに限定されない。適
切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択される投与の形態に依存して
変化することが理解される。

【０１４０】 いくつかの例においては、リポソームが、細胞中へのアンチセンスオリゴヌク
レオチドの取り込みを促進するために使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０〜１９８９、１９９６
；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２３：１１９、１
９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩ
ＤＥＳ：Ａ ＮＥＷ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ、Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、Ｎｏ．４、５４４〜５８４頁、１９９
０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８
７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。ヒド
ロゲルもまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載されるように、アンチセン
スオリゴマーの投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、このオリ
ゴヌクレオチドは、ミクロスフェアまたは微粒子中で投与され得る（例えば、Ｗ
ｕ Ｇ．Ｙ．およびＷｕ Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２
９−４４３２、１９８７を参照のこと）。

【０１４１】 徐放組成物もまた、この適用の範囲内で意図される。これらは、フィルムまた
はマイクロカプセルのような造形品の形態で、半透過性のポリマーマトリックス
を含み得る。

【０１４２】 代表的には、アンチセンスオリゴマーの１つ以上の用量が、一般的には約１〜
２週間の期間にわたって一定の間隔で投与される。経口投与のための好ましい用
量は、約１ｍｇのオリゴマー／患者〜約２５ｍｇのオリゴマー／患者（７０ｋｇ
の体重を基準とする）である。いくつかの場合においては、２５ｍｇのオリゴマ
ー／患者よりも多い用量が必要であり得る。ＩＶ投与については、好ましい用量
は、約０．５ｍｇのオリゴマー／患者〜約１０ｍｇのオリゴマー／患者（７０ｋ
ｇの成人体重を基準とする）である。このアンチセンス化合物は、一般的には、
少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度を生
じるために有効な量および様式で、投与される。

【０１４３】 この実施形態のさらなる局面では、モルホリノアンチセンスオリゴマーが短期
間で一定の間隔（例えば２週間以下の間、毎日）で投与される。しかし、いくつ
かの場合において、アンチセンスオリゴマーは長期間にわたって断続的に投与さ
れる。被験体に対するモルホリノアンチセンスオリゴマーの投与はまた、抗生物
質投与もしくは他の治療的処置の前でもよいし、これらと同時でもよい。

【０１４４】 この方法の一つの局面において、被験体はヒト被験体で（例えば、局所的また
は全身的な細菌感染を有すると診断された患者）である。患者の状態はまた、本
発明のアンチセンスオリゴマー、またはアンチセンスオリゴマーで処理した細菌
ワクチンの予防的な投与を決定し得る。例えば、以下のような患者の場合である
：（１）免疫無防備状態である患者；（２）やけどの犠牲者である患者；（３）
留置カテーテルを有する患者；あるいは（４）外科手術を受ける直前の患者か、
または最近に外科手術をうけた患者などである。

【０１４５】 この方法の別の適用において、被験体は家畜動物（例えば、ニワトリ、シチメ
ンチョウ、ブタ、ウシ、またはヤギなど）であり、そして処置は、予防的または
治療的のいずれかである。本発明は、上記の型の抗細菌性アンチセンス化合物の
治療量以下を補充した穀類食品を含有している家畜および家禽動物の飼料組成物
もまた含む。抗生物質の治療量以下のレベルで補充された穀類食品を家畜および
家禽に給餌する方法においては、この穀類食品を上記のような抗細菌性オリゴヌ
クレオチド組成物の治療量以下の量で補充するという改善も意図される。

【０１４６】 本発明の方法は、一般に任意の条件の処置に適用可能であり、ここで細菌の増
殖の阻害または除去することは、処置の下にある被験体の改善した治療的結果を
生じるのに有効である。

【０１４７】 本発明の一つの局面は、被験体への抗生物質の投与または他の治療的処置の後
またはこの処置と同時の、モルホリノアンチセンスオリゴマーの被験体への投与
を含む、細菌感染の処置にのための方法である。

【０１４８】 （Ｂ．処置のモニタリング法） 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する有効なインビボ処置レジ
メンは、投与の頻度および経路、ならびに処置下の被験体の状態（すなわち、予
防的投与対局所的または全身性の感染に対する投与）に従って変化すると理解さ
れる。従って、このようなインビボ治療は、一般に、治療下にある細菌感染の特
定の型に対する適切な試験によるモニタリング、および最適な治療結果を達成す
るためにの用量または治療レジメンに対応した調整を必要とする。

【０１４９】 本明細書中に記載されている方法に関する所定の治療レジメンの効力は、例え
ば、全血球計算値（ＣＢＣ）、核酸検出方法、免疫診断試験、または細菌培養の
ような、一般的な感染の指標によってモニターされ得る。

【０１５０】 細菌感染の同定およびモニタリングは、一般的には、以下、の１つ以上を含む
：（１）核酸検出方法；（２）血清学的な検出方法（すなわち、通常のイムノア
ッセイ）；（３）培養方法；および（４）生化学的な方法。このような方法は、
定量的または定性的であり得る。

【０１５１】 核酸プローブは、公に入手可能な細菌の核酸配列に基づいて設計され得、そし
て細菌感染の指標である標的遺伝子または代謝物（すなわち、毒素）を検出する
ために使用され得る。これは、特定の細菌型（例えば、特定の種または株）につ
いて特異的であり得るか、あるいは１より多くの細菌の種または型（すなわち、
グラム陽性またはグラム陰性細菌）について共通し得る。核増幅試験（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）（例えば、ＰＣＲ）もまた、
このような検出方法において使用され得る。

【０１５２】 血清学的な同定は、生物学的な標本（例えば、便、尿、脳脊髄液、血液など）
から単離された細菌サンプルまたは培養物を使用して達成され得る。細菌の検出
のためのイムノアッセイは、一般的には、当業者によって日常的に使用される方
法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）によって行われる。さらに
、特定の細菌の株または種に特異的なモノクローナル抗体がしばしば、商業的に
入手可能である。

【０１５３】 培養方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない技術を使用する
ことによって、特定の型の細菌を単離しそして同定するために使用され得る：好
気対嫌気培養、ならびに種々の培養条件下での増殖および形態学。例示的な生化
学的試験として、グラム染色（Ｇｒａｍ、１８８４；グラム陽性細菌は暗い青色
に染色され、そしてグラム陰性細菌は赤色に染色される）、酵素的分析（すなわ
ち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて陽性であるオキシ
ダーゼ、カタラーゼ）、およびファージタイピング（ｐｈａｇｅ ｔｙｐｉｎｇ
）が挙げられる。

【０１５４】 このような診断および定量試験、ならびに細菌感染を示す他の生理学的な因子
の正確な性質は、細菌標的、処置される状態、および処置が予防的であるか、ま
たは治療的であるかに依存して変化することが理解される。

【０１５５】 被験体が特定の型の細菌感染を有していると診断されている場合には、細菌感
染の状態もまた、処置下にある特定の型の細菌感染をモニターするために、当業
者によって代表的に使用される診断技術を使用してモニターされる。

【０１５６】 アンチセンスオリゴマー処置レジメンは、示されるように、処置下にある被験
体のイムノアッセイ、他の生化学的試験、および生理学的試験の結果に基づいて
調整（用量、頻度、経路など）され得る。

【０１５７】 以下の実施例は、本発明の範囲の例示をするが、決して本発明の発明の範囲を
限定するものではない。

【０１５８】 （材料および方法） 標準的な組換えＤＮＡ技術を、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、ＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ，１９９２およびＳ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲ
ＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、第
２巻、１９８９）に記載されているように、全ての構築物において使用した。

【０１５９】 （細菌培養物） 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の評価において、約３ｍｌ
の細菌培養物を、４．５ｍｇのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのアンピ
シリンを含む新しく画線したＬＢ寒天プレート由来の単一コロニーのｐＣｉＮｅ
ｏ（ｍｙｃ）ｌｕｃ Ａを含む、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で
の４５ｍｌの出発培養物から、プラスチックのスナップキャップチューブ中に等
分した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に稀釈したホスホロジアミデート
モルホリノオリゴマーを、この培養物に添加し、所定の時間（例えば、１６〜２
６時間）、２１０ｒｐｍで振盪させながら３７℃でインキュベートし、次いで１
５分間氷上に置いた。

【０１６０】 （培養物の染色鏡検およびコロニーのスキャニング） 細菌培養物は、標準的なグラム染色プロトコルに従って染色される。染色され
た細菌は、Ｎｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ−２正立顕微鏡（ｕｐｒｉｇｈｔ ｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して、１００×の油液浸レンズおよび１０×倍率の
カメラの組合せを使用して、１０００×の画像倍率で可視化される。Ｎｉｋｏｎ
８００８Ｓカメラを画像の取り込みのために使用した。画像は、５の光出力（
５ ｌｉｇｈｔ ｏｕｔｐｕｔ）の設定で４秒間の露出を用いて、明視野顕微鏡
を使用して得られる。好ましいフィルムは、Ｋｏｄａｋ Ｇｏｌｄ ４００ Ａ
ＳＡであった。現像後、画像を、Ｍｉｃｒｏｔｅｋ Ｓｃａｎ Ｍａｋｅｒ ４
を使用してスキャンし、次いでＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用してクロ
ップする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ〜１Ｄは、ポリマーを形成するのに適切な５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）
、および７原子（Ｃ〜Ｄ）の連結基を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型
のサブユニットを示す。

【図２】 図２Ａ〜Ｄは、図１のサブユニットＡ〜Ｄをそれぞれ使用して構築された、Ａ
〜Ｄと称される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰返しサブユニットセ
グメントを示す。

【図３】 図３Ａ〜図３Ｇは、オリゴヌクレオチドアナログにおける非荷電結合型の例を
示す。

【図４Ａ】 図４Ａは、配列番号４５の配列を有するＥ．ｃｏｌｉのＤｉｃＦに特異的なホ
スホロジアミデート結合モルホリノアンチセンスオリゴマーの様々なＥ．ｃｏｌ
ｉのコロニー形成に対する濃度効果を示している。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、配列番号４７の配列を有するＥ．ｃｏｌｉのＳｅｃＡに特異的なホ
スホロジアミデート結合モルホリノアンチセンスオリゴマーの様々なＥ．ｃｏｌ
ｉのコロニー形成に対する濃度効果を示している。

【図４Ｃ】 図４Ｃは、配列番号５９の配列を有するＥ．ｃｏｌｉのｍｅｔ−ｔＲＮＡに特
異的なホスホロジアミデート結合モルホリノアンチセンスオリゴマーの様々なＥ
．ｃｏｌｉのコロニー形成に対する濃度効果を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2B005 DA00 MB03 2B150 AA01 AA05 AB10 BB05 4B024 AA01 CA04 CA05 CA07 CA11 DA06 EA04 GA11 HA17 HA20 4C085 AA03 BA02 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZB35

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １０〜４０ヌクレオチドサブユニットを含有している実質的
   に非荷電のアンチセンスオリゴマーからなる、抗細菌性化合物であって、該サブ
   ユニットの各々が、それぞれのヌクレオチド塩基に対してワトソン−クリック塩
   基対合によって結合するために有効である塩基対合部分を支持する５員環または
   ６員環を含み、該塩基対合部分は、（ｉ）細菌性ｔＲＮＡ配列、または（ｉｉ）
   細胞分裂もしくは細胞周期に関連するタンパク質をコードする細菌性核酸の中に
   ある翻訳開始コドンを含む標的配列とハイブリダイズするのに有効な少なくとも
   １０ヌクレオチドの長さの標的化核酸配列を含み、 該タンパク質は、ｚｉｐＡタンパク質、ｓｕｌＡタンパク質、ｓｅｃＡタンパ
   ク質、ｄｉｃＡタンパク質、ｄｉｃＢタンパク質、ｄｉｃＣタンパク質、ｄｉｃ
   Ｆタンパク質、ｆｔｓＡタンパク質、ｆｔｓＩタンパク質、ｆｔｓＮタンパク質
   、ｆｔｓＫタンパク質、ｆｔｓＬタンパク質、ｆｔｓＱタンパク質、ｆｔｓＷタ
   ンパク質、ｆｔｓＺタンパク質、ｍｕｒＣタンパク質、ｍｕｒＤタンパク質、ｍ
   ｕｒＥタンパク質、ｍｕｒＦタンパク質、ｍｕｒＧタンパク質、ｍｉｎＣタンパ
   ク質、ｍｉｎＤタンパク質、ｍｉｎＥタンパク質、ｍｒａＹタンパク質、ｍｒａ
   Ｗタンパク質、ｍｒａＺタンパク質、ｓｅｑＡタンパク質、およびｄｄｌＢタン
   パク質、カルバメートキナーゼ、Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ、トポイソメ
   ラーゼ、アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ、チオレドキシンレダクター
   ゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ならびに細胞壁酵素からなる群より選択され、 ここで、隣接しているサブユニットは、非荷電のホスホルアミデート、ホスホ
   ロジアミデート、カルボネート、カルバメート、アミド、ホスホトリエステル、
   アルキルホスホネート、シロキサン、スルホン、スルホンアミド、スルファメー
   ト、チオホルムアセチル、およびメチレン−Ｎ−メチルヒドロキシルアミノから
   なる群より選択される非荷電の結合によってか、あるいは、ホスフェート、荷電
   したホスホルアミデート、およびホスホロチオエートからなる群より選択される
   荷電結合によって連結され、 そして、該オリゴマー中での非荷電結合：荷電結合の比は、少なくとも４：１
   である、抗細菌性化合物。
2. 【請求項２】 前記標的化核酸配列が、翻訳開始コドンを含む標的配列に対
   して相補的である、請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】 前記オリゴマーがモルホリノオリゴマーである、請求項１に
   記載の化合物。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の化合物であって、ここで各非荷電結合が図
   ２Ｂで表されるようなホスホロジアミデート結合であり、ここでＸ＝ＮＲ_２であ
   り、ここでＲは水素またはメチルであり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである、
   化合物。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の化合物であって、ここで各結合が図２Ｂで
   表すようなホスホロジアミデート結合であり、ここでＸ＝ＮＲ_２であり、ここで
   Ｒは水素またはメチルであり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである、化合物。
6. 【請求項６】 前記標的化核酸配列が１３〜２０塩基の長さを有する、請求
   項１の化合物。
7. 【請求項７】 請求項２に記載の化合物であって、ここで前記標的配列が、
   ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆ
   ｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔ
   ｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎ
   Ｄ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢから
   なる群より選択される細菌遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域であ
   る、化合物。
8. 【請求項８】 前記標的配列が、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、およびｄ
   ｉｃＦからなる群より選択されるｄｉｃ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳
   開始領域である、請求項７に記載の化合物。
9. 【請求項９】 前記標的化配列が、配列番号４５（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＦ
   ）、配列番号４８（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＡ）、配列番号４９（Ｅ．ｃｏｌｉ
   ｄｉｃＢ）、配列番号５０（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＣ）；および配列番号６１（
   Ｓ．ｔｈｙｐｈｉ．ｄｉｃＡ）からなる群より選択される配列を有する、請求項
   ８に記載の化合物。
10. 【請求項１０】 前記標的化配列が配列番号４５（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＦ
    ）として表される配列を有する、請求項９に記載の化合物。
11. 【請求項１１】 前記アンチセンスオリゴマーがモルホリノオリゴマーであ
    る、請求項１０に記載の化合物。
12. 【請求項１２】 請求項２に記載の化合物であって、ここで前記標的化配列
    がｓｅｃＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域と相補的であり、そ
    して、配列番号４７（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｅｃＡ）、配列番号６７（Ｓｔａｐｈ．
    ａｕｒｅｕｓ ｓｅｃＡ）、配列番号７９（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｓｅｃＡ）およ
    び配列番号９１（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｅｃＡ）からなる
    群より選択された配列を有する、化合物。
13. 【請求項１３】 前記標的化配列が配列番号４７（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｅｃＡ
    ）に表された配列を有する、請求項１２に記載の化合物。
14. 【請求項１４】 前記オリゴマーがモルホリノオリゴマーである、請求項１
    ３に記載の化合物。
15. 【請求項１５】 請求項２に記載の化合物であって、ここで前記標的化配列
    が、配列番号１０３（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ カルバメートキナーゼ）、配列番号
    １０４（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ）；配列番号１
    ０５（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ トポイソメラーゼ）；配列番号１０７（Ｅ．ｆａ
    ｅｃａｌｉｓ、ｒｅｐＡ）；配列番号１０８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ アルキル
    ハイドロジェンペルオキシドレダクターゼ）；配列番号１０９（Ｅ．ｆａｅｃａ
    ｌｉｓ チオレドキシンレダクターゼ）；配列番号１１０（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉ
    ｓ ジヒドロ葉酸還元酵素）；配列番号１１１（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｆｔｓ
    Ａ）および配列番号１１２（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ 細胞壁酵素）からなる群よ
    り選択された配列を有する、化合物。
16. 【請求項１６】 前記オリゴマーが、モルホリノオリゴマーである、請求項
    １５に記載の化合物。
17. 【請求項１７】 ヒト被験体または哺乳動物被験体における細菌感染を処置
    する方法であって、該方法は１０〜４０ヌクレオチドサブユニットを含有してい
    る実質的に非荷電のアンチセンスオリゴマーを、薬学的に有効な量で該被験体に
    投与する工程を包含し、該サブユニットの各々が、それぞれのヌクレオチド塩基
    に対してワトソン−クリック塩基対合によって結合するために有効である塩基対
    合部分を支持する５員環または６員環を含み、該塩基対合部分は、（ｉ）細菌性
    ｔＲＮＡ配列、または（ｉｉ）細胞分裂もしくは細胞周期に関連するタンパク質
    をコードする細菌性核酸配列の中に翻訳開始コドンを含む標的配列と、ハイブリ
    ダイズするのに有効な少なくとも１０ヌクレオチドの長さの標的化核酸配列を含
    み、 該タンパク質は、ｚｉｐＡタンパク質、ｓｕｌＡタンパク質、ｓｅｃＡタンパ
    ク質、ｄｉｃＡタンパク質、ｄｉｃＢタンパク質、ｄｉｃＣタンパク質、ｄｉｃ
    Ｆタンパク質、ｆｔｓＡタンパク質、ｆｔｓＩタンパク質、ｆｔｓＮタンパク質
    、ｆｔｓＫタンパク質、ｆｔｓＬタンパク質、ｆｔｓＱタンパク質、ｆｔｓＷタ
    ンパク質、ｆｔｓＺタンパク質、ｍｕｒＣタンパク質、ｍｕｒＤタンパク質、ｍ
    ｕｒＥタンパク質、ｍｕｒＦタンパク質、ｍｕｒＧタンパク質、ｍｉｎＣタンパ
    ク質、ｍｉｎＤタンパク質、ｍｉｎＥタンパク質、ｍｒａＹタンパク質、ｍｒａ
    Ｗタンパク質、ｍｒａＺタンパク質、ｓｅｑＡタンパク質、およびｄｄｌＢタン
    パク質、カルバメートキナーゼ、Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ、トポイソメ
    ラーゼ、アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ、チオレドキシンレダクター
    ゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ならびに細胞壁酵素からなる群より選択され、 ここで、隣接しているサブユニットは、非荷電のホスホルアミデート、ホスホ
    ロジアミデート、カルボネート、カルバメート、アミド、ホスホトリエステル、
    アルキルホスホネート、シロキサン、スルホン、スルホンアミド、スルファメー
    ト、チオホルムアセチル、およびメチレン−Ｎ−メチルヒドロキシルアミノから
    なる群より選択される非荷電の結合によってか、または、ホスフェート、荷電し
    たホスホルアミデート、およびホスホロチオエートからなる群より選択される荷
    電結合によって連結され、 そして、該オリゴマー中での非荷電結合：荷電結合の比は、少なくとも４：１
    である、方法。
18. 【請求項１８】 前記標的化核酸配列が、翻訳開始コドンを含む標的配列と
    相補的である、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記オリゴマーがモルホリノオリゴマーである、請求項１
    ７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記非荷電結合が、図２Ａ〜２Ｄで表される構造からなる
    群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 非荷電結合の各々が図２Ｂで表されるようなホスホロジア
    ミデート結合であり、ここで、Ｘ＝ＮＲ_２であり、ここでＲが水素またはメチル
    であり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである、請求項１９に記載の方法。
22. 【請求項２２】 結合の各々が、図２Ｂに表されるようなホスホロジアミデ
    ート結合であり、ここでＸ＝ＮＲ_２であり、ここでＲが水素またはメチルであり
    、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記標的化核酸配列が、１３〜２０塩基の長さを有する、
    請求項１７に記載の方法。
24. 【請求項２４】 請求項１７に記載の方法であって、ここで前記標的配列が
    、ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、
    ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆ
    ｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ、ｍｉ
    ｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢか
    らなる群より選択される遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域である
    、方法。
25. 【請求項２５】 前記標的配列が、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、および
    ｄｉｃＦからなる群より選択されるｄｉｃ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻
    訳開始領域である、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記標的化配列が、配列番号４５（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃ
    Ｆ）、配列番号４８（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＡ）、配列番号４９（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＢ）、配列番号５０（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｉｃＣ）；および配列番号６１
    （Ｓ．ｔｈｙｐｈｉ．ｄｉｃＡ）からなる群より選択される配列を有する、請求
    項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記標的化配列が配列番号４５として表される配列を有す
    る、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記アンチセンスオリゴマーがモルホリノオリゴマーであ
    る、請求項２７の方法。
29. 【請求項２９】 請求項２４の方法であって、ここで前記標的化配列がｓｅ
    ｃＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の翻訳開始領域と相補的であり、そして、
    配列番号４７（Ｅ．ｃｏｌｉ ＳｅｃＡ）、配列番号６７（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒ
    ｅｕｓ ｓｅｃＡ）、配列番号７９（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｓｅｃＡ）および配列
    番号９１（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｅｃＡ）からなる群より
    選択された配列を有する、方法。
30. 【請求項３０】 前記標的化配列が配列番号４７として表された配列を有す
    る、請求項２９の方法。
31. 【請求項３１】 前記オリゴマーがモルホリノオリゴマーである、請求項３
    ０の方法。
32. 【請求項３２】 請求項１８に記載の方法であって、ここで前記標的化配列
    が、配列番号１０３（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ カルバメートキナーゼ）、配列番号
    １０４（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ）；配列番号１
    ０５（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ トポイソメラーゼ）；配列番号１０７（Ｅ．ｆａ
    ｅｃａｌｉｓ、ｒｅｐＡ）；配列番号１０８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ アルキル
    ハイドロジェンペルオキシドレダクターゼ）；配列番号１０９（Ｅ．ｆａｅｃａ
    ｌｉｓ チオレドキシンレダクターゼ）；配列番号１１０（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉ
    ｓ ジヒドロ葉酸還元酵素）；配列番号１１１（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｆｔｓ
    Ａ）および配列番号１１２（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ 細胞壁酵素）からなる群よ
    り選択された配列を有する、方法。
33. 【請求項３３】 前記オリゴマーが、モルホリノオリゴマーである、請求項
    ３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記投与する工程が局所経路による、皮膚の細菌感染の処
    置のための、請求項１７に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記投与する工程が吸入による、呼吸器細菌感染を処置す
    る際の使用のための、請求項１７に記載の方法。
36. 【請求項３６】 抗細菌性化合物の治療量未満の量を補充した穀類食品を含
    有している、家畜および家禽動物の飼料組成物であって、該化合物が、１０〜４
    ０ヌクレオチドサブユニットを含有している実質的に非荷電のアンチセンスオリ
    ゴマーからなり、該サブユニットの各々が、それぞれのヌクレオチド塩基に対し
    てワトソン−クリック塩基対合によって結合するために有効である塩基対合部分
    を支持する５員環または６員環を含み、該塩基対合部分は、（ｉ）細菌性ｔＲＮ
    Ａ配列、または（ｉｉ）細胞分裂もしくは細胞壁合成に関連するタンパク質をコ
    ードする細菌性核酸配列の中に翻訳開始コドンを含む標的配列と、ハイブリダイ
    ズするのに有効な少なくとも１０ヌクレオチドの長さの標的化核酸配列を含み、 該タンパク質は、ｚｉｐＡタンパク質、ｓｕｌＡタンパク質、ｓｅｃＡタンパ
    ク質、ｄｉｃＡタンパク質、ｄｉｃＢタンパク質、ｄｉｃＣタンパク質、ｄｉｃ
    Ｆタンパク質、ｆｔｓＡタンパク質、ｆｔｓＩタンパク質、ｆｔｓＮタンパク質
    、ｆｔｓＫタンパク質、ｆｔｓＬタンパク質、ｆｔｓＱタンパク質、ｆｔｓＷタ
    ンパク質、ｆｔｓＺタンパク質、ｍｕｒＣタンパク質、ｍｕｒＤタンパク質、ｍ
    ｕｒＥタンパク質、ｍｕｒＦタンパク質、ｍｕｒＧタンパク質、ｍｉｎＣタンパ
    ク質、ｍｉｎＤタンパク質、ｍｉｎＥタンパク質、ｍｒａＹタンパク質、ｍｒａ
    Ｗタンパク質、ｍｒａＺタンパク質、ｓｅｑＡタンパク質、およびｄｄｌＢタン
    パク質、カルバメートキナーゼ、Ｄ−ａｌａ Ｄ−ａｌａリガーゼ、トポイソメ
    ラーゼ、アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ、チオレドキシンレダクター
    ゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ならびに細胞壁酵素からなる群より選択され， ここで、隣接しているサブユニットは、非荷電のホスホルアミデート、ホスホ
    ロジアミデート、カルボネート、カルバメート、アミド、ホスホトリエステル、
    アルキルホスホネート、シロキサン、スルホン、スルホンアミド、スルファメー
    ト、チオホルムアセチル、およびメチレン−Ｎ−メチルヒドロキシルアミノから
    なる群より選択される非荷電結合によってか、または、ホスフェート、荷電した
    ホスホルアミデート、およびホスホロチオエートからなる群より選択される荷電
    結合によって連結され、 そして、該オリゴマー中での非荷電結合：荷電結合の比は、少なくとも４：１
    である、飼料組成物。
37. 【請求項３７】 前記オリゴマーがモルホリノオリゴマーである、請求項３
    ６に記載の組成物。
38. 【請求項３８】 請求項３７に記載の組成物であって、ここで各結合が、図
    ２Ｂで表すようなホスホロジアミデート結合であり、ここでＸ＝ＮＲ_２であり、
    ここでＲは水素またはメチルであり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏである、化合
    物。
39. 【請求項３９】 前記標的化核酸配列が１３〜２０塩基の長さを有する、請
    求項３６に記載の組成物。
40. 【請求項４０】 選択した細菌に対するワクチンを調製する方法であって、
    複製が損なわれた、形態学的に異常な細菌細胞を産生するのに有効なオリゴマー
    の量のアンチセンスモルホリノベースのアンチセンスオリゴマーの存在下で、該
    細菌をインキュベートする工程を包含し、該アンチセンスモルホリノベースのア
    ンチセンスオリゴマーは、 （ａ）ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉ
    ｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓ
    Ｗ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ
    、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄ
    ｌＢからなる群より選択される該選択された細菌配列の遺伝子から転写されたｍ
    ＲＮＡ中の翻訳開始領域にハイブリダイズするのに有効な標的化塩基配列を含む
    、８〜４０ヌクレオチドサブユニット、および （ｂ）本明細書中の図２Ａ〜図２Ｄに示されるような、非荷電のリン含有サブ
    ユニット間結合 を有する、方法。
41. 【請求項４１】 選択された細菌に対して、ヒト被験体または動物被験体に
    ワクチン接種する方法であって、モルホリノベースのアンチセンスオリゴマーの
    存在下で該細菌をインキュベーションすることにより調製された、複製が損なわ
    れた、形態学的に異常な細菌の細胞を被験体に投与する工程を包含し、該モルホ
    リノベースのアンチセンスオリゴマーが、 （ａ）ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉ
    ｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓ
    Ｗ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒＧ、ｍｉｎＣ
    、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄ
    ｌＢからなる群より選択される該選択された細菌配列の遺伝子から転写されたｍ
    ＲＮＡ中の翻訳開始領域にハイブリダイズするのに有効な標的化塩基配列を含む
    、８〜４０ヌクレオチドのサブユニット、および （ｂ）本明細書中の図２Ａ〜図２Ｄに示されるような、非荷電のリン含有キラ
    ルサブユニット間結合 を有する、方法。