KR20020079768A - 안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법 - Google Patents

안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020079768A
KR20020079768A KR1020027008681A KR20027008681A KR20020079768A KR 20020079768 A KR20020079768 A KR 20020079768A KR 1020027008681 A KR1020027008681 A KR 1020027008681A KR 20027008681 A KR20027008681 A KR 20027008681A KR 20020079768 A KR20020079768 A KR 20020079768A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
coli
oligomer
bacterial
sequence
Prior art date
Application number
KR1020027008681A
Other languages
English (en)
Inventor
아이버슨페트릭엘
Original Assignee
에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 filed Critical 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
Publication of KR20020079768A publication Critical patent/KR20020079768A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring

Abstract

박테리아 세포분열 및 세포주기 코딩 핵산으로 방향짓는 안티센스 올리고머는 그것의 생체활성을 선택적으로 변형하는 능력이 있으며, 박테리아 감염의 치료와 예방에 유용하다. 안티센스 올리고머는 실질적으로 비하전이고, 적어도 10 뉴클레오티드 길이이고, (i) 박테리아 tRNA 또는 (ii) 세포분열 또는 세포주기와 관련된 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산 내의 번역 개시 코돈을 함유하는 표적서열에 혼성화하는데 효과적인 표적화 핵산 서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트를 함유한다. 이 같은 단백질은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA, 및 ddlB 단백질, 카르바메이트 키나제, D-ala D-ala 리가제, 토포이소머라제, 알킬 하이드로페르옥사이드 리덕타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 및 세포벽 효소를 포함한다.

Description

안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법{ANTISENSE ANTIBACTERIAL CELL DIVISION COMPOSITION AND METHOD}
현재, 박테리아 병원체에 대하여 사용되는 항생제는 다양한 항-박테리아 기작을 가진 몇몇 유형이 있다. 페니실린과 세팔로스포린 같은 β- 락탐 항생제는 펩티도글리칸 합성의 마지막 단계를 저해하도록 작용한다. 반코마이신과 테이코플라닌을 포함하는 글리코펩티드 항생제 또한 펩티도글리칸 합성을 방해하면서 뮤라밀-펜타펩티드의 트랜스글리코실레이션과 트렌스펩티데이션 모두를 저해한다. 다른 주지의 항생제는 박테리아 DNA 복제를 저해하는 퀴놀론, 리팜핀 같은 박테리아 RNA중합효소의 제해제, 및 술폰아미드를 포함하는 테트라히드로폴레이트의 생성 경로의 효소의 제해제를 포함한다.
항생제를 사용한 박테리아 감염의 조절 또는 제거의 두드러진 성공에도 불구하고, 인간 의약에서와 가금류와 가축류 생산에서 사료첨가제로서의 항생제의 광범위한 사용은 많은 병원성 박테리아에 대한 약물 내성을 유발하였다.
항생제 내성 기작은 다양한 형태를 취할 수 있다. β- 락탐, 특히 그람-네거티브 박테리아의 β- 락탐에 대한 주요 내성 기작의 하나는 항생제 불활성을 부여하는 효소 β- 락타마제이다. 마찬가지로, 아미노글리코시드에 대한 내성은 종종 항생제를 불활성화시킬 수 있는 효소가 관여하는데 이 경우 포스포릴, 아데닐, 또는 아세틸기를 첨가함으로써이다. 항생제의 능동 유출은 많은 박테리아가 내성을 발전시키는 다른 방법이다. 테트라마이신 유출에 대한 tetA, tetG, teL, 및 tetK 유전자 같은 유출 단백질을 코딩하는 유전자가 동정되었다. 박테리아 표적은 약물의 표적을 변화스킴으로써 내성을 발전시킨다. 예를 들어, 다수의 β- 락탐 내성 박테리아에서의 소위 페니실린 결합 단백질(PBPs)은 변화되어 표적 단백질로의 결정적 항생제 결합을 저해한다. 증강된 유출에 추가하여, 테트라사이클린에 대한 내성은 항생제에 대한 결합에 대하여 리보솜과 경쟁할 수 있는 세포질 단백질의 출현이 관여한다. 술폰아미드 같은 박테리아 효소를 저해함에 의하여 항생제가 작용하는 경우, 표적 효소의 점 돌연변이가 내성을 부여한다.
많은 경우 다중-약물 내성이 관여하는, 많은 병원성 박테리아에서의 항생제 내성의 출현은 다수의 박테리아 병원체가 단순히 의학적 개입에 의하여 치료될 수없었던 항생제-이전 시대의 공포를 불러일으켰다. 이런 시나리오에 공헌할 수 있는 두가지 주요 요인이 있다. 첫째는 자기-전달가능 플라스미드가 그 중 가장 중요한 융합 인자에 의한 내성과 박테리아 균주, 종 및 속 간의 다중-내성 유전자의 급속한 확산이다. 제 2의 요인은 부분적으로는 경우에 따라서는 20-년 연구 노력이 요구되는 과정인 새로운 항생제를 발견하고 그것을 임상적 시험을 하는데 필요한 시간과 돈의 의식적 투자에 기인하는 새로운 유형의 항생제를 개발하는 현재 연구 노력의 부재이다.
이들 요인 중 제 2의 것을 설명하면서, 새로운 항생제에 대한 탐색을 가속화하는 몇몇의 약물-발견 접근방법이 제안되었다. 예를 들어, 고-효율 스크리닝에 의한 새로운 항생제 화합물에 대한 스크리닝과 동정 노력이 보고되었으나, 이 경로에 의하여서는 현재까지 중요한 선두 화합물이 발견되지 않았다.
펩티드 핵산의 사용(PNAs ; Good, L. and Nielsen, P. E., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95 : 2073-2076, 1998a 참조) 및 원핵 생물 16S rRNA에 상보적인 3- 내지 6-뉴클레오티드 메틸카르바메이트 DNA 유사체의 사용(Rahman, M. A., Summerton, J. et al., Antisense Res. Dev. 1 (4) : 319-27, 1991)을 포함하는, 박테리아 내성 유전자의 발현을 차단하기 위하거나 세포성 RNA 표적을 표적화하기 위하여 고안된 안티센스제가 관련된 몇몇의 접근방법이 제안되었다. E. coli (E. 콜리) β-갈락토시다제와 β-락타마제 유전자의 개시 코돈을 표적화하도록 고안된 펩티드 핵산(PNA) 안티센스 서열은 시험관내에 나노몰 PNA 농도에서 및 생체내 미크로몰 농도에서 농도-의존, 특이적 저해를 나타냈다. (Good, L. and Nielsen, P.E., Nat Biotechnol 16 (4) : 355-8, 1998a). 그러나, 일반적으로 이들 접근방법은, 아마도 안티센스제의 불량한 섭취 때문에 거의 성공적이지 못했다(예를 들어, 상기 인용된 Summerton, J. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug. Dev. 7 (2) : 63-70, 1997 ; Good, L. and Nielsen, P. E., 1998a).
따라서, (i) 박테리아의 항생제 처리를 현재 방해하는 항생제 내성 유형에 의한 영향을 받지 않고, (ii) 신속하게 개발될 수 있고 표적-박테리아 특이성에 대하여 다소간 합리적 정도의 예견가능성을 가지고, (iii) 야생형 박테리아나 항생제에 대하여 감소된 투과성을 가지는 박테리아에 의해서도 효과적으로 섭취되는 것을 부분적으로 의미하는, 낮은 투여량에서 효과적이고, (iv) 부작용을 거의 나타내지 않는 새로운 항생제에 대한 증가하는 요구가 있다.
(발명의 개요)
한 양태에서, 본 발명은 (i) 박테리아 tRNA 서열 또는 (ii) 세포분열이나 세포주기에 관여하는 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산내에 번역개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 상보적인 적어도 10 뉴클레오티드 길이의 표적화 핵산서열을 포함하는, 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트를 함유하는 실질적으로 비하전된 안티센스 올리고머로 구성된 항박테리아 화합물을 제공한다. 각 서브유니트는 표적 핵산 서열내 각 뉴클레오티드 염기에 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 결합하는데 효과적인 염기-짝짓기 부분을 지지하는 5- 또는 6-원 고리를 포함한다. 인접하는 서브유니트는 비하전 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드, 포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트, 실옥산, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 티오포름아세틸, 및 메틸렌-N-메틸히드록실아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 비하전 결합 또는 인산염, 하전 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하전 결합에 의하여 연결된다. 올리고머 내의 비하전 결합 대 하전 결합의 비는 적어도 4:1, 바람직하게는 적어도 5:1, 더 바람직하게는 적어도 8:1이다. 한 구체예에서, 올리고머는 완전히 비하전이다.
바람직하게는, 올리고머는 대응하는 DNA 및 동일 박테리아 서열을 포함하는 이중체의 Tm보다 실질적으로 더 큰 Tm에서 박테리아 서열과 혼성화할 수 있다. 대안으로, 올리고머는 37 ℃보다 실질적으로 큰, 바람직하게는 50 ℃보다 실질적으로큰, 더 바람직하게는 60 내지 80 ℃ 범위보다 실질적으로 큰 Tm에서 박테리아 서열과 혼성화될 수 있다.
한 구체예에서, 올리고머는 모르폴린 올리고머이다. 이같은 올리고머에서 비하전 결합, 및, 한 구체예에서는 모든 결합이 도 2A 내지 2D에 나타난 구조로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택된다. X=NR2, R은 수소 또는 메틸, Y=O이고 Z=O일 때의 도 2B에 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트-결합 올리고머가 특히 바람하다.
올리고머의 길이는 바람직하게는 12 내지 25 뉴클레오티드 서브유니트이다. 한 구체예에서, 올리고머는 길이 15 내지 20 뉴클레오티드 서브유니트, 더 바람직하게는 17 내지 18 뉴클레오티드 서브유니트를 가지는 포스포로디아미데이트-결합 모르폴린 올리고머이다.
본 발명은 약제학적 유효량의 실질적으로 비하전인 안티센스 올리고머를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간이나 포유동물 피험체에서 박테리아 감염을 치료하는 대응하는 방법 또한 제공한다.
표적화 박테리아 단백질은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA, 및 ddlB 단백질, 카르바메이트 키나제, D-ala D-ala 리가제, 토포이소머라제, 알킬 하이드로페르옥사이드 리덕타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 및 세포벽 효소로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택된다. 화합물과 치료방법의 선택된 구체예에서, 박테리아 표적화 서열은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, mu, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddlB으로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 유전자로부터 전사되는 mRNA내의 번역 개시 영역이다.
dicA, dicB, dicC 및 dicF로 구성된 군으로부터 선택되는 dic 유전자로부터 전사되는 mRNA의 번역 개시 영역으로 방향짓는 표적화 서열의 예는 여기에서 SEQ ID NO : 45 (E. coli(E. 콜리) dicF), SEQ ID NO : 48 (E. coli(E. 콜리) dicA), SEQ ID NO : 49 (E. coli(E. 콜리) dicB), SEQ ID NO : 50 (E. coli(E. 콜리) dicC) ; 및 SEQ ID NO : 61 (S. thyphi.(S. 타이피무리움) dicA)로 나타낸 것을 포함한다. 한 구체예에서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 45로 나타낸 서열을 가지며 안티센스 올리고머는 모르폴린 올리고머이다.
ftsL, ftsW, ftsQ, ftsA, 및 ftsZ로 구성되는 군으로부터 선택되는 dcw 유전자로부터 전사되는 mRNA내의 번역 개시 영역으로 방향짓는, 특히 ftsZ mRNA로 방향짓는 표적화 서열의 예는 여기에서 (a) SEQ ID NO : 51 (E. coli ftsA), SEQ ID NO : 46 및 SEQ ID NO : 52 (E. coli ftsZ) ; (b) SEQ ID NO : 62 (Pseudomonas aeruginosa ftsZ) ; (c) SEQ ID NO : 65 (Neisseria gonorrhoea ftsZ) ; (d) SEQ ID NO : 69 (Staphylococcus aureus ftsA) and SEQ ID NO : 68 (Staphylococcus aureus ftsZ) ; (e) SEQ ID NO : 74 (Mycobacterium tuberculosis ftsZ) ; (f) SEQ ID NO : 80 (Helicobacter pylori ftsA) 및 SEQ ID NO : 81 (Helicobacter pylori ftsZ) ; (g) SEQ ID NO : 87 (Streptococcus pneurnoniae ftsA) 및 SEQ ID NO : 88 (Streptococcus pneumonias ftsZ) ; (h) SEQ ID NO : 92 (Treponetna pallidum ftsA) and SEQ ID NO : 93 (Treponema pallidum ftsZ) ; (i) SEQ ID NO : 99 (Chlamydia trachomatis ftsW) ; 및 (j) SEQ ID NO : 100 (Bartonella henselae ftsZ)로 나타낸 것을 포함한다.
sec 유전자로부터 전사되는 mRNA내의 번역 개시 영역으로 방향짓는, 특히 secA mRNA로 방향짓는 표적화 서열의 예는 여기에서: SEQ ID NO : 47 (E. coli(E. 콜리) secA), SEQ ID NO : 67 (Staph. aureus(스타필로코코스 아우리우스) secA), SEQ ID NO : 79 (H. pylori(H. 파일로리) secA), and SEQ ID NO : 91 (Treponema pallidum(트레포네마 팔리둠) secA)로 나타낸 것을 포함한다. 한 구체예에서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 47로 나타난 서열을 가지며 안티센스 올리고머는 모르폴린 올리고머이다.
더 나아간 구체예에서, 특히Enterococcus faecium(엔테로코커스 피시움) 또는Enterococcus faecalis(엔테로코커스 피칼리스)에 의한 감염의 치료를 위하여, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 103 (E. faecium(E. 피시움) 카르바메이트 키나제) ; SEQ ID NO : 104 (E. faecium(E. 피시움) D-ala D-ala 리가제) ; SEQ ID NO : 105 (E. faecalis(E. 피칼리스) 토포이소머라제) ; SEQ ID NO : 107 (E. faecalis(E. 피칼리스) repA) ; SEQ ID NO : 108 (E. faecalis(E. 피칼리스) 알킬 수소 페르옥사이드 리덕타제) ; SEQ ID NO : 109 (E. faecalis(E. 피칼리스) thioredoxin reductase) ; SEQ ID NO : 110 (E. faecalis(E. 피칼리스) 디하이드로폴레이트 리덕타제) ; SEQ ID NO : 111 (E. faecalis(E. 피칼리스) ftsA) ; 및 SEQ ID NO : 112 (E. faecalis(E. 피칼리스) 세포벽 효소)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가진다. 선택된 구체예에서, 올리고머는 모르폴린 올리고머이고, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 105 (E. faecalis(E. 피칼리스) 토포이소머라제) ; SEQ ID NO : 107 (E. faecalis(E. 피칼리스) repA) ; SEQ ID NO : 108 (E. faecalis(E. 피칼리스) 알킬 수소 페르옥사이드 리덕타제) ; SEQ ID NO : 109 (E. faecalis(E. 피칼리스) thioredoxin reductase) ; SEQ ID NO : 110 (E. faecalis(E. 피칼리스) 디하이드로폴레이트 리덕타제)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가진다.
치료방법을 실시할 때, 안티센스 올리고머는 적어도 200 내지 400 nM 안티센스 올리고머 정점 혈 농도를 결과하는데 효과적인 양과 방식으로 바람직하게 투여된다. 선택된 구체예에서, 올리고머는 피부의 박테리아 감염을 치료하기 위하여 국소적 경로에 의하여, 또는 호흡성 박테리아 감염을 치료하기 위하여 흡입에 의하여투여된다.
본 발명의 더 나아간 양태는, 모르폴린 안티센스 올리고머를 피험체에게 투여한 다음 항생제나 다른 치료학적 치료를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염을 치료하는 방법이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 유형의 항박테리아성 화합물의 치료학적 분량 이하가 첨가된 사료 곡물을 포함하는 가축류 및 가금류 사료 조성물을 포함한다. 항생제의 치료학적 분량 이하가 첨가된 사료 곡물로 가축류 및 가금류를 사육하는 방법에서는, 사료 곡물이 상기된 바와 같은 항박테리아성 올리고뉴클레오티드가 첨가되는 개선 또한 고려된다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은 (a) zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddlB로 구성된 군으로부터 선택되는 선택의 박테리아의 유전자로부터 전사되는 mRNA 내 번역개시영역에 혼성화되는데 효과적인 표적화 염기서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트; 및 (b) 도 2A 내지 2D에 나타난 바와 같은 비 하전 포스포러스-함유 서브유니트간 결합을 가지는, 안티센스 모르폴린-기초 안티센스 올리고머가 복제-손상된, 형태학적으로 비정상인 박테리아 세포를 생산하는데 효과적인 양으로 존재하는 조건하에서 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 선택된 박테리아에 대한 백신을 생산하는 방법을 제공한다. 따라서, 박테리아를 이같이 모르폴린-기초 안티센스 올리고머 존재하의 박테리아로 항온처리 함에 의하여 준비된 박테리아의 복제-손상된, 형태학적으로 비정상인 세포를 피험체에 투여함으로써, 인간이나 동물 피험체가 선택된 박테리아에 대하여 백신화될 수 있다.
이하 상세한 설명이 첨부된 도면 및 실시예와 함께 읽히면 본 발명의 이들 및 다른 목적과 양태는 더 완전히 명백해질 것이다.
본 발명은 세포분열과 세포주기에 관여하는 박테리아 핵산에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 조성물, 및 이 같은 조성물을 포유동물에서 박테리아 감염의 치료에 사용하는 방법에 관련된다.
참고문헌
Agrawal, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (4) : 1401-5 (1990).
Bonham, M. A. et al., Nucleic Acids Res. 23 (7) : 1197-1203 (1995).
Boudvillain, M. et al., Biochemistry 36 (10) : 2925-31 (1997).
Cross, C. W. et al., Biochemistry 36 (14) : 4096-107 (1997년 4 월 8일).
Dagle, J. M. et al., Nucleic Acids Research 28 (10) : 2153-7 (2000년 5월 15일).
Ding, D. et al., Nucleic Acids Research 24 (2) : 354-60 (1996년 1월 15일).
Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84 : 7413 (1987).
Gait, M. J. ; Jones, A. S. and Walker, R. T., J. Chem. Soc. Perkin 1, 1684-86 (1974).
Gee, J. E. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 8 : 103-111 (1998).
Huie, E. M. et al., J. Org. Chem. 57 : 4569 (1992).
Lesnikowski, Z. J. et al., Nucleic Acids Research 18 (8) : 2109-15 (1990년 4월 25일).
Matteucci, M., Tetrahedron Lett. 31 : 2385-88 (1990).
McElroy, E. B. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4 : 1071 (1994).
Mertes, M. P. and Coates, E. A., J. Med. Chem. 12 : 154-157 (1969).
Miller, P. S. et al., in : Antisense Research Applications, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, Boca Raton, FL, p. 189. (1993).
Stein, D. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 7 (3) : 151-7 (Jun 1997) ; 또한 Touhne, J. J. et al., Biochimie 78 (7) : 663-73 (1996) 참조.
Vasseur, J. J. et al., J. Am. Chem. Soc. 114 : 4006 (1992).
도 1A 내지 D는 중합체를 형성하기 적당한 5-원소 (A), 6-원소 (B) 및 7-원소 (C-D)결합기를 가지는 몇몇의 바람직한 모르폴린-유형 서브유니트를 나타내고;
도 2A 내지 D는 각각 도 1 의 서브유니트 A 내지 D를 사용하여 제작된 A 내지 D로 표시되는 전형적 모르폴린 올리고뉴클레오티드의 반복 서브유니트 단편을 나타내고;
도 3A 내지 3G는 올리고뉴클레오티드 유사체내 비하전 결합 유형을 나타내고;
도 4A 내지 C는 다양한 농도의, 각각 서열 SEQ ID NOs : 45, 47, 및 59를 가지는 E. coli DicF (A), SecA (B), 및 met-tRNA (C)에 특이적인 포스포로디아미데이트-결합 모르폴린 안티센스 올리고머의 E. coli 콜로니 형성에의 효과를 도시한다.
I. 정의
다르게 지시되지 않는 한 하기 용어는 여기에서 사용될 때 다음의 의미를 가진다:
용어 "세포 주기"는 분열하는 세포가 거치는, 세포 성장과 분열의 추이의 정규적 순서를 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 전형적 폴리뉴클레오티드에 수소결합능 있는 염기를 지지하는 백본을 가지는 중합적 분자로서, 중합체 백본은 중합적 분자와 전형적 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 특이적 방식으로 이같은 수소결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시하는 분자 (예를 들어, 단일-사슬 RNA, 이중-사슬 RNA, 단일-사슬 DNA, 이중-사슬 DNA)를 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 퓨린이나 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 뉴클레오티드를 가지는 중합체, 및 비-표준 뉴클레오티드 백본, 예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴린 화학, 폴리아미드 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산 또는 PNAs) 및 다른 합성 서열-특이적 핵산 분자를 함유하는 중합체를 포함한다.
용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 및 "안티센스 올리고머"는 안티센스 올리고머를 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 표적 핵산 (예를 들어, RNA)서열에 혼성화시키는 것을 허용하여 핵산:올리고머 헤테로 이중체를 표적 서열 내에 형성시키는 뉴클레오티드 염기와 서브유니트-대-서브유니트 백본의 서열에 호환적으로 사용되고 이를 지칭한다. 전형적으로, 이같은 올리고머는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트 길이이고, 더 전형적으로는 약 12 내지 25 뉴클레오티드 서브유니트 길이이다. 올리고머는 표적 서열에 정확히 상보적인 서열 또는 거의 상보적 서열을 가진다. 이같은 안티센스 올리고머는 예를 들어 핵산 표적 서열의 이중-사슬 또는 단일-사슬 부분에 결합하고 이로써 mRNA 번역 및/또는 단백질 합성을 저해함으로써주어진 표적 서열을 함유하는, 박테리아 세포분열 또는 세포주기 단백질의 형성을 차단하거나 저해하고, 그것이 특이적으로 혼성화하는 서열로 "방향짓는다"고 일컬어진다.
37 ℃보다, 바람직하게는 적어도 50 ℃보다, 전형적으로는 60 내지 80 ℃보다 실질적으로 높은 또는 더 높은 Tm으로 생리학적 조건하에서 올리고머가 표적에 혼성화하면, 올리고뉴클레오티드나 안티센스 올리고머는 표적 뉴클레오티드에 "특이적으로 결합한다" 이 같은 혼성화는 바람직하게는 긴축 혼성화 조건에 대응한다. 주어진 이온강도 및 pH에서, Tm은 표적서열의 50 %가 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 온도이다.
"뉴클레아제-내성" 올리고머 분자 (올리고머)는 그 백본이 포스포디에스테르 결합의 뉴클라제 절단을 받기에 용이하지 않은 것이다. 전형적 뉴클레아제 내성 안티센스 올리고머는 둘 모두 하전 백본을 가지는 포스포로티오에이트 및 포스페이트-아민 DNA (pnDNA), 및 모두 비하전 백본을 가지는 메틸-포스포네이트, 모르폴린, 및 펩티드 핵산 (PNA) 올리고뉴클레오티드 같은 올리고뉴클레오티드 유사체이다.
생리학적 조건하에서 제 1의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드가 제 2의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 혼성화하면 제 1의 서열은 제 2의 서열에 대한 "안티센스 서열"이다.
두 단일-사슬 폴리뉴클레오티드 사이에서 비평형적 입체구조에서 혼성화가일어날 때, 폴리뉴클레오티드가 상호 "상보적"이라고 기재된다. 제 1의 뉴클레오티드 및 제 2의 뉴클레오티드의 가닥 중 하나 사이에서 혼성화가 일어날 수 있으면, 한 이중-사슬 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드에 "상보적"일 수 있다. 상보성(한 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드에 대하여 상보적인 정도)은 일반적으로 수용되는 염기-짝짓기 규칙에 따라 서로 수소결합을 형성할 것으로 예상되는 상대 가닥 내의 염기의 비율의 관점에서 정량적이다.
올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 "서브유니트"는 올리고머의 한 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 유사체) 단위를 지칭한다. 이 용어는 비록 "하전 서브유니트"를 지칭할 때 전하는 전형적으로 서브유니트간 결합(예를 들어 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 결합) 내의 잔기에 있지만, 부착된 서브유니트간 결합이 있거나 없는 뉴클레오티드 단위를 지칭한다.
"모르폴린 올리고머" 또는 "모르폴린-기초 올리고머"는 전형적 폴리뉴클레오티드에 수소결합할 수 있는 염기를 지지하는 백본을 가지는 올리고뉴클레오티드 유사체로서, 올리고머는 핵산에서 발견되는 것 같은 오탄당 백본 부분 대신 고리 질소를 통한 커플링을 가지며 모르폴린 백본 부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 유사체를 지칭한다. 전형적 "모르폴린" 올리고 뉴클레오티드는 도 1A 내지 1D 및 2A 내지 2D에 나타난 형태의 모르폴린 서브유니트 구조로 구성되는데, (i) 그 구조는 한 서브유니트의 모르폴린 질소를 인접 서브유니트의 5' 엑소고리 탄소에 연결시키는 포스포러스-함유 결합에 의하여 서로 연결되고, (ii) Pi와 Pj 각각은 염기-짝짓기 수소결합에 의하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 결합하는데 효율적인 퓨린 또는피리미딘 염기-짝짓기 부분이다.
용어 "PMO"는 더 하기되는 바와 같이 포스포로디아미데이트 모르폴린 올리고머를 지칭한다. 본 발명의 이 바람직한 구체예는 두 서브유니트가 포스포로디아미데이트 결합에 의하여 연결된 도 2B에서 도시된다.
"표적 RNA가 관련된 염기-특이적 세포내 결합 사건"은 올리고머의 세포내 표적 RNA 서열에의 특이적 결합을 지칭한다. 예를 들어, 단일-사슬 폴리뉴클레오티드는 서열이 상보적인 단일-사슬 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
"뉴클라제-내성 헤테로 이중체"는 헤테로 이중체가 산재성 세포내 및 세포외 뉴클레아제 생체내 분해에 내성을 가지도록 안티센스 올리고머가 그것에 상보적인 표적에 결합함으로써 형성되는 이중체를 지칭한다.
다양한 전형적 박테리아는 다음 약어:Escherichia coli(에스케리키아 콜리) (E. coli),Salmonella thyphimurium(살모넬라 타이피무리움) (S. thyphi.), Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 에루지노사) (P. aeruginosa),Vibrio cholera(비브리오 콜레라),Neisseria gonorrhoea(나이세리아 고노레아) (N. gonorrhoea),Staphylococcus aureus(스타필로코커스 아우리우스) (Staph. aureus),Mycobacterium tuberculosis(마이코박테리움 투베르쿨로시스) (M. tuberculosis),Helicobacter pylori(헬리코박터 파일로리) (H. pylori),Streptococcus prieumoniae(스트렙토코커스 프리우모니이) (Strep. pneumoniae),Treponema palladium(트레포네마 팔라디움) (T. palladium),Chlamydia trachomatis(클라미디아 트라코마티스) (C. trachomatis),Bartonella henselae(바토넬라 헨셀리) (B. henselae),Hemophilis influenza(헤모필리스 인플루엔자) (H. influenza) 및Shigella dysenterae(시겔라 디센터리) (S. dysenterae)에 의하여 여기에서 지칭된다.
"보존 서열"은 특정 단백질을 코딩하는 특정 군의 생체의 핵산서열에 관련하여, 각 위치에서, 그 군의 생체에 대응하는 각 서열 중 그 위치에서 가장 공통적으로 발견되는 뉴클레오티드를 포함한다. 그람-네거티브 박테리아 세포 분열 또는 세포 주기 단백질-코딩 핵산 보존 서열은 그람-네거티브 박테리아에서 일반적이고 그람-네거티브가 아닌 박테리아에서는 일반적으로 발견되지 않는다.
용어 "보존된"은, 세포 분열 또는 세포 주기 단백질-코딩 핵산 서열과 관련하여, 특정 군의 생체(예를 들어, 그람-네거티브 박테리아)에서 일반적이거나 공유되는 서열을 지칭한다.
용어 "넓은 스펙트럼 박테리아 서열"은, 특정 세포분열 또는 세포주기 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산 서열로 방향짓는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭하면서, 세포분열 또는 세포주기 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산 서열의, 전부가 아니라면, 일정 단편에 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "좁은 스펙트럼 박테리아 서열"은 특정 세포분열 또는 세포주기 단백질을 코딩하는 특정, 그러나 대부분이나 전부는 아닌, 박테리아 핵산 서열에 안티센스인, 발명의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. "좁은 스펙트럼 박테리아 서열"은 하나를 초과하는 유형의 박테리아에 특이적일 수 있는데, 예를 들어, SEQ ID NO : 57에 의하여 예시되는 바와 같이E. coli와S. thyphizipA 핵산 서열에는 안티센스이지만 여기에 기재된 다른 알려진 박테리아 zipA 핵산서열에는 안티센스가 아닌 안티센스 올리고머 또는 SEQ ID NO : 101에 의하여 예시되는 바와 같이H. influenzazipA 핵산 서열에는 안티센스이지만 여기에 기재된 다른 알려진 박테리아 zipA mRNA에는 안티센스가 아닌 안티센스 올리고머이다.
용어 "발현을 조절하는"은, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 그 단백질을 코딩하는 핵산의 전사 또는 번역을 방해하는 결과로서 주어진 단백질의 발현의 증강 또는 감소를 지칭한다.
"유효량"은 안티센스 올리고머와 관련하여, 예를 들어 선택된 표적 핵산 서열의 발현같은 생체활성을 저해하는데 효과적인, 단일 투여 또는 일련의 투여의 부분으로서 포유 동물 피험체에 투여되는 안티센스 올리고머의 양을 지칭한다.
개체 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연적 경로를 변화시키는 방법으로서 제공되는 어떤 유형의 개입이다. 치료는 예를 들어 약제학적 조성물의 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 예방적으로 또는 병리학적 사건의 시작 또는 병인학적 접촉에 바로 이어서 수행된다.
용어 "개선된 치료학적 결과"는 특정 박테리아에 감염된 것으로 진단된 환자와 관련하여 박테리아 성장의 감속 또는 감소 및/또는 그 특정 박테리아에 의한 감염에 전형적으로 부수되는 검출 가능한 증상의 감소 또는 제거를 지칭한다.
II. 안티센스 올리고머: 선택 기준
본 발명에서 채용되는 안티센스 화합물은 하기 서브섹션에서 고려되는 구조와 성질의 기준을 바람직하게 만족시킨다.
A. 염기 서열, 길이 및 이중체 안정성
안티센스 화합물은 선택된 박테리아 핵산 서열에 대하여 표적화하는 염기 서열을 갖는다. 표적 핵산 서열에 대한 상보성 영역은 하기 논의된 바와 같이 세포 유입과 결합 Tm의 필수적 균형을 성취하기 위하여 10 내지 12 염기 길이만큼 짧을 수도 있지만, 바람직하게는 15 내지 20 염기, 더 바람직하게는 17 내지 18 염기이다. 바람직하게는, 박테리아 표적 서열은 표적 박테리아 단백질을 코딩하는 mRNA에 대한 번역 개시 코돈에 걸치는 것이다.
올리고머는 박테리아 핵산 표적 서열에 100 % 상보적이거나, 올리고머와 박테리아 핵산 표적 서열 사이에 형성된 헤테로 이중체가 세포성 뉴클라제와 생체내에서 일어날 수 있는 다른 분해 방식들의 작용에 견딜만큼 충분히 안정하다면, 예를 들어 돌연변이를 수용하기 위하여 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치가 만일 존재한다면 혼성화 이중체의 중간 영역보다 말단 영역 방향으로 덜 불안정화한다. 허용되는 미스매치의 수는 잘 이해되는 이중체 안정도의 원리에 따라, 올리고머의 길이, 이중체내 G:C 염기짝 백분율, 및 이중체내 미스매치의 위치에 의존할 것이다. 이 같은 안티센스 올리고머는 박테리아 핵산 표적 서열에 반드시 100 % 상보적일 필요는 없지만, 예를 들어 박테리아 단백질의 발현 같은 핵산 표적의 생체활성을 변형할 수 있도록 표적 서열에 안정하고 특이적으로 결합하는 것이 효과적이다.
적어도 최소한의 염기 수 예를 들어, 10 내지 15 염기가 표적 핵산 서열에 상보적이면, 40 염기 길이의 올리고머는 안정하다. 일반적으로, 그러나, 세포내 촉진 또는 능동 섭취는 올리고머 길이 약 30, 바람직하게는 약 25, 더 바람직하게는약 20 또는 그 미만의 염기에서 최적화된다. 하기 더 기술되는 PMO 올리고머에 대하여는, 결합 안정성과 섭취의 최적 균형은 일반적으로 17 내지 18 염기 길이에서 일어난다.
올리고머는 표적서열과 안정한 혼성화 이중체를 형성하여야 한다. 바람직하게는, 올리고머는 표적 핵산 서열에 대응하는 DNA와 동일 표적 핵산 서열로 이루어지는 이중체의 Tm보다 실질적으로 큰 Tm으로 혼성화될 수 있다. 안티센스 올리고머는 상보-서열 핵산에 대하여 체온보다 크고 바람직하게는 50 ℃보다 큰 결합 Tm을 가질것이다. 60 내지 80 ℃ 범위 또는 더 큰 Tm이 바람직하다. 안티센스 화합물의 상보-서열 핵산에 대한 Tm은 Hames et al.,NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, IRL Press, 1985, pp. 107-108에 의하여 기재된 것 같은 전통적인 방법에 의하여 측정된다. 운반의 목적을 위하여, 15 내지 20 염기 또는 미만의 길이에서 (50 ℃보다 큰) 고 Tm을 나타내는 화합물이 20 염기 이상을 필요로하는 것보다 바람직할 것이다.
C:G 짝의 염기 비율을 증가시키는 것은 일반적으로 올리고머 화합물의 Tm을 증가시키는 것이 알려져 있다. 본 발명을 지지하는 연구는 안티센스 올리고머에서 C 염기의 수를 최대화하는 것이 특히 유리함을 시사한다.
B. 세포에 의한 섭취
적당한 세포내 수준을 달성하기 위하여, 안티센스 올리고머는 세포에 의하여 능동적으로 섭취되어야 하는데, 이는 자유 (착화되지 않은) 형태로 투여되는 경우 촉진 또는 능동 수송에 의하여 화합물이 섭취되어야 하거나, 착화된 형태로 투여되는 경우 세포내편입에 의하여 섭취되어야 함을 의미한다.
안티센스 화합물이 착화된 형태로 투여될 때, 착화제는 전형적으로 안티센스 화합물 상의 전체 전하에 대하여 반대의 전하를 가지는 예를 들어 양이온성 지질, 폴리펩티드, 또는 비-생물학적 양이온 중합체 같은 중합체이다. 음이온성 올리고뉴클레오티드와 양이온성 지질 또는 다른 중합체 구성요소 사이의 이중층 착체를 포함하는 착체를 형성하는 방법은 주지이다. 예를 들어, 양이온 지질인 DOTMA (N- [1- (2, 3디올레일옥시) 프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로리드) 및 중성 인산지질인 DOPE (디올레일 포스파티딜 에탄올아민)을 함유하는 리포좀계 조성물 Lipofectin(Felgner et al., 1987)는 널리 사용된다. 투여 후, 착체는 전형적으로 엔도솜체 내 입자 캡슐화가 관련되는 세포내편입 기작에 의하여 세포에 의하여 섭취된다. 안티센스제의 세포성 뉴클라제에 저항할 수 있는 능력은 세포질로 작용제의 생존과 궁극적 송달을 촉진한다.
작용제가 자유 형태로 투여될 경우, 작용제는 실질적으로 비하전이어야 하는데, 이는 그것의 서브유니트간 결합의 대다수가 생리학적 pH에서 비하전임을 의미한다. 본 발명을 뒷받침 하여 수행된 실험은 예를 들어 15- 내지 20-원 올리고머에 대하여 1 내지 2의 적은 수의 전체전하는 실제로 실질적으로 비하전 백본을 가진 특정 올리고머의 세포 섭취를 촉진시킬 수 있는 것을 나타낸다. 전하는 예를 들어 백본 결합 상의 올리고머 자체 또는 말단 하전-기 부속체에서 운반할 수 있다. 바람직하게는, 하전 결합의 수는 4 개의 비하전 결합 당 1 개의 하전 결합을 넘지 않는다.
올리고머는 또한 두 상반된 전하가 거의 동일한 수인 한 네거티브 및 포지티브 전하 모두의 백본 결합을 포함한다. 바람직하게는, 올리고머는 3 내지 5 개를 초과하는 인접하는 두 전하의 서브유니트를 가지지 않는다. 예를 들어, 올리고머는 주어진 수의 음이온 결합, 예를 들어 N3'→P5' 포스포르아미데이트 결합과 비교할만한 수의, N, N-디에틸렌디아민 포스포르아미데이트(Dagle) 양이온성 결합을 가진다. 전체 전하는 바람직하게는 중성 또는 많아도 올리고머당 1 내지 2 전체 전하이다.
실질적으로 또는 완전히 하전되는 것에 추가하여, 안티센스제는 바람직하게는 세포막을 가로질러 올리고머를 촉진 수송 또는 능동 수송할 수 있는 막 수송 시스템에 대한 기질 (즉, 막 단백질 또는 단백질들)이다. 이 성질은 올리고머 상호작용 또는 세포 섭취에 대한 다음의 다수의 시험 중 하나에 의하여 측정될 수 있다:
제 1의 시험은 올리고머 화합물의 선택된 하전 올리고머, 예를 들어, 포스포로티도에이트 올리고머를 대체하거나 그것에 의하여 대체되는 올리고머 화합물의 능력을 시험함으로써, 세포 표면 리셉터에서의 결합을 평가한다. 세포는 전형적으로 최종 올리고머 농도 약 10 내지 300 nM 사이에서 형광적으로 표지되는 주어진 양의 시험 올리고머와 항온처리된다. 그 후 단시간 후에, 예를 들어 10 내지 30 분 후(시험 올리고머의 유의한 개시화가 일어날 수 있기 전)에, 대체된 화합물이 점차 증가되는 농도로 첨가된다. 시험 화합물이 세포 표면 리셉터에 결합할 수 있으면, 대체 화합물은 시험화합물을 대체하는 것으로 괄찰될 것이다. 만약 제거 화합물이 10X 시험 화합물 농도 또는 그 이하에서 50 % 대체를 나타내는 것으로 나타나면,세포 수송에 대하여 시험 화합물은 대체 화합물과 동일한 인지 부위에 결합하는 것으로 간주된다.
제 2의 시험은 시험 화합물의 표지된 리포터, 예를 들어 형광 리포터의 세포내로의 수송 능력을 시험함으로써 세포수송을 측정한다. 세포는 약 10 내지 300 nM 사이의 최종 농도로 첨가되는, 표지된 시험 화합물의 존재하에서 항온처리된다. 30 내지 120 분 항온처리 후, 예를 들어 현미경에 의하여 세포내 표지에 대하여, 세포를 시험한다. 유의한 세포내 표지의 존재는 시험 화합물이 촉진 또는 능동 수송에 의하여 수송된다는 증거이다.
제 3의 시험은 박테리아 세포분열이나 세포주기 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산서열에 대하여 표적화될 때 특정 안티센스 화합물의 박테리아 성장을 효과적으로 저해하는 능력에 의존한다. 본 발명을 뒷받침하여 수행된 연구는 박테리아 세포막을 가로지르는 능동 또는 촉진 수송이 저해에 필요함을 나타낸다. 시험 화합물은 박테리다 성장을 저해하는데 효과적으로 나타났던 안티센스 서열로 제공된다. 예를 들어, 여기의 SEQ ID. NO : 45는E. coliDicF 유전자에 대항하는 대표적인 것이다. 화합물은 성장하는 박테리아 배양물에 증가하는 농도, 전형적으로 10 nM과 1 mM 사이로 첨가된다. 박테리아 성장을 저해하는 능력은 시험 화합물의 첨가 24 내지 72 시간 후 세포 콜로니 수로부터 측정된다. 100 내지 500 nM 또는 그 미만의 농도에서 50 % 저해를 보일 수 있는 화합물은 능동 수송을 위한 양호한 후보이다.
C. RNaseH에 대한 mRNA 내성
안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 발현 저해를 설명하기 위하여 두가지일반적 기작이 제안되었다 (예를 들어, Agrawal et al., 1990 ; Bonham et al., 1995 ; 및 Boudvillain et al., 1997 참조).
첫째로, 올리고뉴클레오티드와 mRNA 사이에서 형성된 헤테로 이중체가 RNaseH의 기질이 되어, mRNA의 절단을 유도한다는 것이다. 이 부류에 속하거나 속하는 것으로 제안된 올리고뉴크레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 포스포디에스테르 (비변형 "천연" 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 그러나 이 같은 화합물은 올리고머:RNA 이중체 구조에서 mRNA를 RNaseH에 의한 단백질 분해와 그에 따르는 이중체 손실에 노출시키기 때문에, 본 발명에서 사용되기에 최적 이하이다. "입체적 차단자" 또는 대안으로 "RNaseH 불활성" 또는 "RNaseH 내성"이라 불리는 제 2 부류의 올리고뉴클레오티드 유사체는 RNaseH에 대한 기질로 작용되는 것으로 관찰되지 않았고, 표적 RNA 핵-세포질 수송, 스플라이싱 또는 번역을 입체적으로 차단함으로써 작용하는 것으로 믿어진다. 이 부류는 메틸포스포네이트 (Toulme et al., 1996), 모르폴린 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA's), 2'-O-올일 또는 2'-O-알킬 변형 올리고뉴클레오티드 (Bonham, 1995), 및 N3'→P5'포스포르아미데이트(Gee, 1998 ; Ding)를 포함한다.
시험 올리고머는 RNA:올리고머 이중체를 시험 화합물로 형성시킨 다음, 그 이중체를 Stein et al.에 기재된 바와 같이 표준 분석 조건하에서 RNaseH와 항온처리함으로써 그것의 RNaseH로부터 mRNA를 보호하는 능력에 대하여 분석될 수 있다. RNaseH에 노출시킨 후, 완전한 이중체의 존재 또는 부재가 겔 전기영동 또는 질량분석학에 의하여 탐지될 수 있다.
III. 비하전 올리고뉴클레오티드 유사체
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체에서 사용되는 비하전 결합의 예는 도 3A 내지 3G에 나타난다. 하기 언급된 바와 같이, 작은 수의 하전 결합 예를 들어 하전 포스포르아미데이트 또는 포스포로티오에이트 결합 또한 올리고머에 삽입될 수 있다. 비하전 결합은 카르보네이트 (3A, R=O) 및 카르바메이트 (3A, R=NH2) 결합, (Mertes ; Gait); 알킬 포스포네이트 및 포스포트리에스테르 결합 (3B, R=알킬 또는-O-알킬) (Miller ; Lesnikowski) ; 아미드 결합 (3C) ; 술폰 (3D, Rl, R2= CH2) (Roughten) ; 술폰아미드 (3D, R1=NH, R2=CH2또는 그 역) (McElroy) ; 술파메이트 (3D, Rl, R2= NH) (Huie) ; 및 티오포름아세틸 결합 (3E) (Matteucci ; Cross)을 포함한다. 후자는 포스포로티오에이트 안티센스 화합물에 대하여 이중체 및 삼중체의 안정성을 증강시키는 것으로 보고되었다 (Cross). 3F 구조의 3'-메틸렌-N-메틸히으록시아미노 화합물 또한 보고되었다 (Vasseur). 도 3A 내지 3G에서, B는 염기-특이적 수소 결합에 의한 폴리뉴클레오티드내 염기, 바람직하게는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 유라실로부터 선택되는 염기에 대한 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-짝짓기 부분을 나타낸다.
결합은 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 박테리아 핵산 서열 내 각각의 뉴클레오티드 염기에 결합하기에 효과적인 염기-짝짓기 부분을 지지하는 각각 5- 또는 6-원 고리로 구성된 뉴클레오티드 서브유니트를 연결한다. 비록 도 3A 내지 F는 데옥시리보스 고리를 도시하지만, 더 하기된 바와 같이 서브유니트는 또한 예를 들어치환 리보스 고리, 또는 모르폴린 고리(도 3G)를 포함할 수 있다. 2'-산소에서 치환된 올리고머 리보스뉴크레오티드는 고 RNA 결합 친화도를 나타내고, 비치환 리보뉴클레오티드에 비하여, 내인성 뉴클레아제에 대한 감소된 민감도를 나타내었다. 메틸-치환 리보뉴클레오티드는 더 큰 2'-산소 치환체(예를 들어 에틸, 프로필, 올일, 또는 펜틸)보다 더 큰 결합 친화도와 세포성 섭취를 제공하는 것으로 보고된다.
한 바람직한 올리고머 구조는 염기-짝짓기 부분을 함유하는, 상기 요약된 바와 같이 비하전 결합에 의하여 연결된 모르폴린-기초 서브유니트를 채용한다. 포스포로디아미데이트-유사 화합물에 의하여 도 3G에 도시된 바와 같은 실질적으로 비하전인 모르폴린 올리고머가 특히 바람직하다. 안티센스 올리고머를 포함하는 모르폴린 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 공유 U. S. 특허 번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185,444, 5,521,063, 및 5,506,337에 자세히 기재된다. 모르폴린-기초 서브유니트의 바람직한 화학적 성질은 안정한, 비하전 백본 결합에 의하여 올리고머 형태로 결합되는 능력, 그같이 형성된 중합체의, 고 Tm에서 10 내지 14 염기의 짧은 올리고머로도 상보-염기 표적 핵산과 혼성화되는 중합체 능력, 포유 동물 세포내로 능동수송되는 올리고머의 능력, 및 올리고머:RNA 헤테로 이중체의 RNAse 분해에 내성을 띠는 능력이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 전형적 백본 구조는 도 1 A 내지 D에 나타나는, 각각 비하전, 포스포러스-함유 서브유니트 결합에 의하여 결합된 모르폴린 서브유니트 유형을 포함한다. 이들 도에서 및 도 2A 내지 D에서, 포스포러스로부터 나온 X부분은 다음: 불소; 알킬 또는 치환 알킬; 알콕시 또는 치환 알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는 환상 구조를 포함하는, 비치환, 단치환, 또는 이치환 질소의 어떤 것일 수 있다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게는 1 내지 6 탄소원자, 및 더 바람직하게는 1 내지 4 탄소 원자를 포함할 수 있다. 단치환 또는 이치환 질소는 헤테로고리 저 알킬 치환을 바람직하게 지칭하고 환상 구조는 바람직하게는 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 1 내지 2 개의 추가적 헤테로 원자를 선택적으로 함유하는 5- 내지 7-원 질소 헤티로고리이다. Z는 황이나 산소이고 바람직하게는 산소이다.
도 1A는 모르폴린 고리는 1-원소 포스포아미드 결합에 의하여 결합된, 도 2A에 나타난 5 원소 반복-단위 백본을 형성시키는 포스포러스-함유 결합을 나타낸다.
도 1B의 서브유니트 B는 도 2B에 나타난 바와 같이 6-원소 반복-단위 백본에 대하여 고안되었다. 도 1B에서, 5' 모르폴린 탄소를 포스포러스기에 결합시키는 원소 Y는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소이다. X와 Z 부분은 상기 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 모르폴린 올리고뉴클레오티드는 도 2B에서 나타난 형태의 모르폴린 서브유니트 구조에 포함되는 것을 포함하는데, 여기서 X=NH2또는 N(CH3)2, Y=O, 및 Z=O이다.
도 1C 내지 D에서의 서브유니트 C 내지 D는 도 2C 내지 D의 구조에 대하여 나타낸 것과 같이 7-원소 단위-길이 백본에 대하여 고안되었다. 구조 C에서, X 부분은 구조 B에서와 같고, Y 부분은 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소이다. 구조D에서, X와 Y 부분은 구조 B에서와 같다. 도 1 과 2에서 도시된 모든 서브유니트에서 각 Pi와 Pj는 염기-특이적 수소결합에 의하여 폴리뉴클레오티드의 염기와 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-짝짓기 부분이고 바람직하게는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 유라실이다.
상기 언급된 바와 같이, 실질적으로 비하전인 올리고는 한정된 수의, 예를 들어 5개의 비하전 결합당 약 1 개까지의 하전 결합을 유리하게 포함한다. 모르폴린 올리고머의 경우, 이 같은 하전 결합은 도 2A 내지 D의 어느 것, 바람직하게는 도 2B에 의하여 나타낸 바와 같은 결합이며, 여기서 X는 옥사이드 (-O-) 또는 술파이드 (-S-)이다.
본 발명의 안티센스 화합물은 상기 인용된 참고문헌에서 상세하게 기술된 방법을 채용하여 단계적 고상 합성에 의하여 합성될 수 있다. 서브유니트 첨가의 순서는 선택된 염기 서열에 의하여 결정될 수 있다. 몇몇 경우에는, 예를 들어 화합물의 약학적동력학을 증강시키기 위하거나 화합물의 포획이나 탐지를 촉진시키기 위하여, 올리고머 화합물에 추가적 화학적 부분을 첨가하는 것이 바람직하다. 이같은 부분은 표준 합성방법에 따라 전형적으로 올리고머의 5'- 또는 3'- 말단에 공유적으로 결합된다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 부분 또는 다른 친수성 중합체, 예를 들어 10 내지 100 중합체 서브유니트의 첨가는 용해도의 증강에 유용하다. 하나 이상의 하전기, 예를 들어 유기산 같은 음이온 하전기는 세포 섭취를 증강시킨다. 플로레신 또는 방사성표지기 같은 리포터 부분은 검출의 목적으로 부착된다. 대안으로, 올리고머에 부착된 리포터 표지는 표지된 항체나 스트렙트아비딘에 결합할 수 있는 항원이나 비오틴 같은 리간드이다. 올리고머 안티센스의 부착이나 변형을 위한 부분의 선택에 있어, 바람직하지 않은 부작용 없이 피험체에 의하여 생물학적으로 공존가능하고 관용될만한 군의 화학적 화합물을 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다.
IV. 대표적 박테리아 표적
Escherichia coli (에스케리키아 콜리)(E. coli)는 위장관의 정상세균총의 일부인 그람 네거티브 박테리아이다.E.coli의 수백가지의 균주가 있는데, 대부분 무해하고 건강한 인간과 동물의 위장관에 산다. 현재, 인간의 위장염을 일으키는 장내독성E.coli("EEC 군")의 알려진 네가지 부류가 있다. 장병원성(EPEC) 균주가 이중에 있고 독성 기작은 전형적E. coli장독소의 분비와 관련된다. 이같은E. coli의 균주는 위장관과 요로의 감염증, 패혈증, 폐렴, 및 수막염을 포함한 다양한 질병을 유발할 수 있다. 항생제는 몇몇 균주에 대하여는 효과적이지 않고 감염의 재발을 반드시 방지하지는 않는다.
예를들어E. coli균주 0157:H7은 매년 미국에서 10,000 내지 20,000 건의 감염을 유발하는 것으로 추산된다 (Federal Centers for Disease Control and Prevention). 출혈성 대장염은E. coli0157:H7에 의한 급성 질환의 명칭이다. 미취학 아동과 노인은 중증의 합병증의 위험이 크다.E. coli균주 0157:H7는 최근 Pacific Northwest 지방의 한 패스트푸드 식당으로부터의 덜익힌 햄버거를 먹은 네명의 아동의 사망을 유발한 것으로 보고되었다. (예를 들어, Jackson et al.,Epidemiol. Infect. 120 (1) : 17-20, 1998 참조.)
장내 독성 E. coli 균주에 대한 전형적인 서열은 GenBank 접근번호 AB011549, X97542, AF074613, Y11275 및 AJ007716를 포함한다.
Salmonella thyphimurium (살모넬라 타이피무리움)은 임상적으로 국소 위장감염증, 위장염(설사, 복부 경련, 및 발열)부터 중증의 전신 질환인 (장티푸스를 포함하는) 장열에 이르는 범위의 다양한 상태를 유발하는 그람 네거티브 박테리아이다.Salmonella감염증은 또한 가축의 중대한 손실을 유발하기도 한다.
그람-네거티브 bacilli에서 전형적인Salmonella균종들의 세포벽은 그것이 세포의 용균시 발산되어 내독소로 기능하여 생체의 독성에 기여하는 복합 리포다당체 (LPS) 구조를 함유한다.
Salmonella가 완전히 익힌 고기와 동물 생산품에서 생존하여 있다는 사실 때문에, 오염된 식품은 비-장티푸스성Salmonella감염에 의한 주요한 전이 방식이다. 가장 일반적인 동물 기원은 다른 다수의 가축과 야생동물에 추가하여 닭, 칠면조, 돼지, 및 암소이다. 장티푸스와Salmonella균종들에 의한 다른 장열의 역학은 인간 배설물로 오염된 식수와 연관된다.
장티푸스에 대하여는 백신이 이용가능하고 부분적으로 효과적이다; 그러나 비-장티푸스성Salmonella감염에 대하여는 백신이 이용가능하지 않다. 비-장티푸스성Salmonella감염은 위생적 도축 시행 및 식품을 완전히 익힘 및 냉장에 의하여 조절할 수 있다. 전신성 질환에 대하여 항생제가 지시되고 암피실린은 다소간의 성공을 나타내며 사용되었다. 그러나, 과량의 항생제로 치료받는 환자; 면역억제약물치료중인 환자; 장수술 후; 및 용혈성 빈혈, 백혈병, 림프종, 또는 AIDS 환자에서Salmonella감염은 의학적 문제로 남아있다.
Pseudomonas spp. 는 대부분의 항생제에 내성을 가지고 원내감염의 주요 원인이므로 임상적으로 중요한 운동성 그람-네거티브 간균이다. 감염은 면역 절충된 개체, 화상 희생자, 인공호흡기 상의 개체, 내재 카테테르 중인 환자, IV 마취제 사용자 및 만성 폐 질환 환자(예를 들어 세포성 섬유증)에서 가장 일반적이다. 건강한 개체에게는 감염이 드물지만, 다수의 부위에서 발생할 수 있고 요로감염, 패혈증, 폐렴, 인두염, 및 다수의 다른 문제로 발전되고 치료는 종종 크게 유의한 사망률로 실패하곤 한다.
Vibrio cholera 는 인간에 감염되어 불량한 위생상태에 의하여 퍼지며 오염된 물 공급을 결과하는 질병인 콜레라를 일으키는 그람 네거티브 간균이다.Vibrio cholera는 인간의 소장에 잠입할 수 있고 거기서 점막을 통한 이온 수송을 교란시키는 독소를 생산하여 설사와 탈수를 유발한다.Vibrio cholera로 감염된 개체는 정맥내 또는 경구로 전해질을 함유한 용액으로 재수화시키는 것이 필요하다. 질병은 일반적으로 자기-제한적이지만 탈수와 필수 전해질의 상실로 사망이 발생할 수 있다. 테트라사이클린 같은 항생제가 질병의 기간을 감소시키는 것으로 알려졌고 경구용 백신이 현재 개발 중이다.
Neisseria gonorrhoea 는 일반적 성병인 임질의 원인균인 그람 네거티브 구균이다.Neisseria gonorrhoea는 재감염의 면역성 발달을 막기위하여 표면 항원을 변화시킬 수 있다. 미보고의 추가적 750,000 건과 함께 거의 750,000 건의 임질이 주로 십대와 청소년 사이에서 매년 미국에서 보고된다. 암피실린, 아목시실린 또는 페니실린의 몇몇 유형의 임질의 치료에 사용되도록 추천된다. 그러나, 페니실린-내성 임질의 출현이 증가되어, 주사에 의하여 주어지는 새로운 항생제, 예를 들어 세프트리액손 또는 스펙티노마이신이 현재 대부분의 임질구균 감염증 치료에 사용된다.
Staphylococcus aureus 는 인간의 코에 정상적으로 거주하고 때때로 피부에서 발견되는 그람 포지티브 구균이다.Staphylococcus는 원내환경에서의 (즉, 원내감염) 혈류 감염증, 폐렴, 및 수술-부위 감염을 일으킬 수 있다. 일반적 항생제, 예를 들어 반코마이신에 대한Staphylococcus내성은 미국과 외국에서 주요한 공중 보건 문제로 나타났다. 최근 반코마이신-내성Staph. aureus분리체가 일본에서도 또한 동정되었다.
Mcobactefium tuberculosis 는 종종 장애와 사망을 일으키는 질병인 결핵의 원인균인 그람 포지티브 박테리아이다. 결핵은 상승 추세에 있고 전세계적이며 (현재 매년 3백만의 사망률을 나타내어) 단일 감염 질병으로부터의 사망의 가장 큰 원인이다. 이것은 뇌, 신장 및 뼈를 포함하는 인간의 몇몇 기관에 침범할 수 있으나 가장 일반적으로 결핵은 허파에 침범한다.
미국에서, 매년 약 26,000의 새로운 건의 활동성 질병과 함께, 포지티브 피부 시험에 의하여 나타나는 바와 같이 약 천만 명이Mcobactefium tuberculosis로 감염된다. 결핵(TB) 건의 증가는 HIV/AIDS, 노숙자, 약물남용 및 활동성 감염 환자의 이민과 관련되었다. 약물-치료가능 TB에 대한 현재 치료 프로그램은 6 내지 9개월 기간 동안, TB 병원균의 모두가 단일 약물에 의하여 제거될 수 없으므로, 두 가지 또는 네 가지 약물(예를 들어, 이소니아지드, 리팜피신, 피라진아미드, 에탐부톨 또는 스트랩토마이신)의 복용이 관련된다. 추가로,Mcobactefium tuberculosis의 약-내성 및 다중 약물 내성 균주의 관찰이 증가하고 있다.
Helicobacter pylore (H. pylori)는 위벽에 감염되는 나선 또는 S-자형을 가지는, 미호기성, 그람 네거티브, 더디게 성장하는, 편모 생체이다.H. pylori는 만성 표재성 위염, 소화성 궤양 질환, 및 만성 표재성 위염, 소화성 궤양 질병, 및 위선암종으로 발전되는 만성 위축성 위염과 관련되는 인간 위병원체이다.H. pylori은 인간에서 가장 일반적 만성 박테리아 감염 중 하나이고 활동성 위염 환자의 90 % 이상에서 발견된다. 현재 치료법은 대부분의 경우H. pylori를 사멸시키는 비스무트, 메트로니다졸, 및 테트라사이클린이나 아목시실린의 삼중 약물 요법을 포함한다. 삼중 요법의 문제점은 환자 합병증, 부작용, 및 메트로니다졸 내성을 포함한다. 유망한 이중 요법의 대안의 섭생은 아목시실린 + 메트로니다졸 또는 오메프라졸 + 아목시실린이다.
Streptococcus pneumoniae 는 그람 포지티브 구균이고 박테리아성 폐렴 뿐 아니라 중이 감염 (중이염) 및 수막염의 가장 일반적인 원인 중의 하나이다. 매년 미국에서, 폐렴구균성 질병은 약 50,000 건의 균혈증; 3,000 건의 수막염; 100,000 내지 135,000 건의 입원; 7백만 건의 중이염의 원인이 된다. 폐렴구균성 감염은 매년 미국에서 약 40,000 건의 사망을 유발한다. 2세 미만의 어린이, 65세가 넘은 성인 및 울혈성 심장 질환, 당뇨병, 기종, 간질환, 낫형세포증, HIV, 및 예를 들어요양원과 장기간 치료시설 같은 특별한 환경에서 지내는 것과 같은 것을 포함하는 의학적 조건에 있는, 임의 연령의 환자는 감염의 위험이 높다.
약물-내성S. pneumoniae균주는 미국에서 일반적이되었고, 다수의 페니실린-내성 폐렴구균은 에리트로마이신 또는 트리메토프림-술프아케톡사졸 같은 다른 항미생물 약물에 대하여 또한 내성이 가진다.
Treponema pallidium 은 매독을 유발시키는 스피로헤타이다.T. pallidium은
매독, 매종 및 비성병성 토착성 매독 또는 핀타을 유발하는 유일한 병원체이다.Treponema pallidium은 시험관내에서 성장할 수 없고 포유동물 세포 부재하에서 복제한다. 최초 감염은 감염부위에서 궤양을 유발하지만; 박테리아는 전신을 통하여 이동하여 시간경과에 따라 다수의 기관에 손상을 준다. 감염 후기에는 치료되지 않은 매독은 비록 접촉전염성이 아니더라도 중증 심장 이상, 정신 장애, 실명, 다른 신경학적 문제, 및 사망을 야기할 수 있다.
매독은 일반적으로 주사에 의하여 투여되는 페니실린으로 치료한다. 페니실린에 알레르기가 있는 환자 또는 통상적 투여량의 페니실린에 반응하지 않는 환자에 대하여는 다른 항생제가 이용가능하다. 매독의 모든 단계에서, 적당한 치료는 질병을 치료할 것이지만, 후발매독에서는, 신체 기관에 이미 가하여진 손상은 복구할 수 없다.
Chlamydia trachomatis 는 미국에서 가장 일반적인 박테리아성 성행위전염병이고 매년 약 4백만의 새로운 건이 추산된다. 가장 높은 감염율은 15 내지 19 세에서 나타난다. 클라미디아는 비-임균성 요도염(NGU), 자궁경부염, 박테리아성 질염,및 골반염증성질환(PID)의 주요 원인이다. 클라미디아 감염은 매우 온화한 증세를 가지거나 증세가 거의 없지만, 만일 치료하지 않고 방치하면 클라미디아 감염은 생식기관, 특히 여성에서 중증의 손상으로 발전할 수 있다. 아지트로마이신, 에리트로마이신, 오플록사신, 아목시실린 또는 독시사이클린 같은 항생제가 클라미디아 감염을 치료하기 위하여 전형적으로 처방된다.
Bartonella henselae . 묘소열(CSF) 또는 묘소병(CSD)은 고양이에 노출되는 것을 통하여 감염되는, 원래Rochalimaea henselae로 명명되고Bartonella henselae로 알려진 그람 네거티브 간균에 의하여 유발되는 인간 질환이다. 증상은 발열, 림프절 팽대이고 CSF는 인간에서 일반적으로 상대적으로 양성이며 자기-제한적 질환이지만,Bartonella henselae로의 감염은 면역기능저하 환자에서는 균혈증, 간균성 혈관종증, 간자반병, 간균성 비장염, 및 AIDS 뇌병증 같은 다른 만성 질환 징후들과 함께 급성 열성 질환을 포함하여 유의한 임상적 증상을 나타낼 수 있다.
이런 질환은 독시사이클린, 에리트로마이신, 리팜피신, 페니실린, 겐타마이신, 세프트리액손, 씨프로프록사신, 및 아지트로마이신 같은 항생제로 치료한다.
Haertophilus influenzae (H. irafluenza)는 그람 네거티브 박테리아의 한 부류이고; 여섯 유형이 알려져있으며, 대부분의H. irafluenza-관련 질병은 유형 B,즉 "HIB"에 의하여 유발된다. HIB에 대한 백신이 개발될 때까지, HIB는 중이염, 동감염, 기관지염의 일반적인 원인, 수막염의 가장 일반적 원인, 및 폐렴, 패혈성 관절염(관절 감염), 봉소염(연부조직 감염), 및 심막염(심장 주위 막의 감염)의 경우 빈번한 범인이었다.H. irafluenza유형 B 박테리아는 인간에서 널리 퍼져있고일반적으로 질병을 유발하지 않고 인후와 코에서 산다. 백신화되지 않은 5세 미만의 어린이는 HIB 질환의 위험이 있다. 수막염과 다른H. irafluenza에 의하여 유발되는 중증 감염은 뇌손상 또는 사망에 이를 수도 있다.
Shigella dysenteriae (Shigella dys.)는 이질을 유발하는 그람 네거티브 간균이다. 결장에서, 이 박테리아는 점막세포로 침입하여 점막세포 내에서 분열하여 광범위한 염증 반응을 결과한다.Shigella감염은 탈수로 발전되는 중증 설사를 야기하고 매우 어리거나 매우 늙은, 또는 만성적으로 질환중인 사람에 대하여 위험할 수 있다.Shigella dys.는 세포독성, 장내독성, 신경독성이고 단백질 합성의 저해제로 작용하는 잠재 독소(shiga 독소)를 형성한다. 암피실린과 TMP-SMX 같은 항생제에 대한 내성은 발전되었지만, 씨프로플록사신, 노르플록사신 및 에녹사신 같은 더 새롭고 고가의 항생제에 의한 치료는 효과적이다.
Listeria 는 인간과 동물 분변에서 발견되는 그람-포지티브, 운동성 박테리아 속이다.Listeria monocytogenes는 수막뇌염 및 수막염 같은 질병을 야기한다. 소와 양에서, 리스테리아 감염은 뇌염 및 자연유산을 야기한다.
수의학적 응용. 가축류의 위-장관에서의 건강에 좋은 미생물은 건강과 관련 식품의 대응하는 생산에 필수적으로 중요하다. 인간에서와 마찬가지로, 건강한 동물의 위장관은 서로 생태학적 균형을 유지하며 살아가는 다수 유형의 박테리아(즉,E. coli, Peudomonas aeruginosa및Salmonella spp.)를 함유한다. 이런 균형은 식사의 변화, 스트레스, 또는 항생제나 다른 치료학적 치료법에 대한 반응에서 교란될 수 있고,Salmonella, Campylobacter, Enterococci, Tularemia및E. coli같은박테리아에 의하여 일반적으로 유발되는 동물에서의 박테리아성 질환을 결과한다. 이들 동물에서의 박테리아 감염은 빈번하게 분번하게 생산성 감소와 연관되는 치료비용을 가지는 치료학적 개입을 필수적으로 요구한다.
결과적으로, 가축은 위장관에서 세균의 균형을 유지하기 위하여 항생제로 일상적으로 처리된다. 이런 접근방법의 단점은 항생제 내성 박테리아의 발전과 이같은 항생제의, 인간 수요를 위한 결과적 식품으로의 이동이다.
V.세포분열과 세포주기 유전자 및 단백질
본 발명의 안티센스 올리고머는 생리학적 조건에서 37 ℃보다 신질적으로 큰 Tm으로, 예를 들어 적어도 50 ℃ 및 바람직하게는 60 ℃ 내지 80 ℃ 박테리아 세포분열 또는 세포주기 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 영역에 혼성화되도록 고안된다. 대안으로, 안티센스 올리고머는 박테리아 tRNA, 바람직하게는 met-tRNA로 표적화된다. 상기 더 기술된 바와 같이, 올리고머는 표적 핵산 서열에 고-결합친화도를 가지도록 고안되고 세포분열 또는 세포주기-코딩 핵산 표적 서열에 100 % 상보적이거나 미스매체를 함유한다.
다수의 양태에서, 본 발명은 다음: (1) 식중독에 관련된 E. coli 균주, 예를 들어 0157:H 같은 박테리아의 주어진 종의 특정 균주에 특이적인 서열(표 1 참조); (2) 박테리아 둘 이상의 종에 공통적인 서열; (3) 박테리아 둘 이상의 관련된 속(즉, 유사한 계통발생학적 기원의 박테리아 속)에 공통적인 서열; (4) 그람-네거티브 박테리아 사이에서 일반적으로 보존적인 서열; (5) 그람-포지티브 박테리아 사이에서 일반적으로 보존적인 서열; 또는 (6) 일반적으로 박테리아 세포분열 또는세포주기 단백질-코딩 핵산 서열에 대한 보존 서열을 포함하는 박테리아 세포분열 또는 세포주기 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하는데 효과적인 핵산 서열인 안티센스 올리고머를 제공한다.
일반적으로, 본 발명의 안티센스 방법을 사용하여 유전자 발현의 조절하기 위한 표적은 zipS, sulA, secS, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddlB를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포분열 및 세포벽 합성(dcw) 유전자 클러스터의 유전자로부터 전사되는 mRNA 같은 활성 박테리아 성장 또는 복제 동안 발현되는 mRNA를 포함한다. E.coli의 박테리아 세포분열과 세포주기의 일반적 리뷰를 위하여는 각각 Bramhill, D., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13 : 395-424, 1997, 및 Donachie, W. D., Annu. Rev. Microbiol. 47 : 199-230, 1993을 참조하시오.
E. coli에서의 세포분열은 세포 외피 3 층(세포질막, 견고한 펩티도글리칸 층 및 외막) 모두의 조화된 함입이 연관된다. 격막의 협착은 세포를 두 부분으로 가르고 복제된 DNA를 나눈다. 적어도 9 가지 필수적 유전자 산물이 이 과정에 참여한다: ftsZ, ftsA, ftsQ, ftsL, ftsI, ftsN, ftsK, ftsW 및 zipA (Hale, C. A., 및 DeBoer, P. A., J. Bactetiol. 181 (1) : 167-176, 1999).
E. coli에서의 조기 필수 세포분열 유전자의 하나인 FtsZ는 박테리아의 분열부위에서 막-연결 고리를 형성하는 가용성, 튜불린-유사 GTPase이다. 이 고리는 세포 협착을 유도하는 것으로 생각되고 세포벽 함입에 영향을 주는 것으로 보인다.FtsZ는 zipA라 불리우는, E. coli에서 세포분열을 매개하는 격막 고리 구조의 필수구성요소인 E. coli 내 신규 세포내막내 단백질에 직접 결합한다 (Lutkenhaus, J. and Addinall, S. G., Ann. Rev. Biochem. 66 : 93-116, 1997).
정상적 세포분열을 위하여, ftsZ 유전자는 근접 상류 유전자인 ddlB, ftsQ, 및 ftsA (Smith, R. W. et al., J. Bacteriol. 175 (9) : 2788-91, 1993)내에 위치하는 다수의 프로모터로부터 전사된다. ftsA와 ftsZ 유전자 사이의 연결부에 놓인 490-bp DNA 단편은 고복제수로 존제하는 경우에 세포분열을 저해하는 것으로 나타났다(Dewar, S. J. and Donachie, W. D., J. Bacteriol. 175 (21) : 7097-101, 1993).
보존적 세포분열 저해제인 MinCD는, MinD와 함께 연결하여 세포극에서 분열을 방지하는, 세포분열 저해제인 MinC로 구성되어 있다. E. coli에서의 그 외 단백질 MinE가 MinCD 작용의 조절에서 역할을 한다 (Marston, A. L. et al., Genes Dev. 12 (21) : 3419-3430, 1998 ; Pogliano, J. et al., J. Bacteriol. 180 (13) : 3486-90, 1998).
Pmra로 표시되는 프로모터는 E. coli에서의 mra 클러스터의 제 1의 9 가지 유전자: mraZ (oral), mraW (orB), ftsL (mraR), ftsI, murE, murF, mraY, murD, 및 ftsW의 발현에 필수적인 것으로 발견되었다 (Mengin-Lecreulx, D. et al., J. Bacteriol. 180 (17) : 4406-4412, 1998).
murD, murE, murF 및 murC 유전자는 Lu, M. et al., Cell 77 : 413-426, 1994 ; Tao, J. S. and Ishiguro, E. E., Can. J. Microbiol. 35 : 1051-1054,1989 ; Menguin-Lecreulx, D. and Van Heijenoort, J., Nucleic Acids Res. 18 : 183-183, 1990 ; Ikeda, M. et al., Nucleic Acids Res. 18 : 1058-1058, 1990 ; 및 Ikeda, M. et al., Nucleic Acids Res. 18 : 4014-4014, 1990에 기재된 바와 같이 세포벽 형성에 관련된다.
SecA 유전자는 E. coli에서 단백질 배출에 관계하는데, 거기에서 막을 통한 ATP의 가수분해와 분비-전 주변세포질 및 외막 단백질의 전달의 커플링에서 중심적 역할을 한다. SecA는 원핵세포 단백질 번역 기구를 포함하는 일곱 가지 분비 단백질 (secA-secF 및 secY) 중 하나이다.
SeqA 유전자는 E. coli에서 복제 개시의 네거티브 조절자이다 (Lu, M. et al., Cell 77 : 413-426, 1994).
세포분열을 저해하는 소단백질에 대한 코드로 밝혀진 E. coli의 dicB 오페론은 제 2의 저해제인 dicF를 발현한다. dicF에 의하여 코딩되는 53-뉴클레오티드 RNA 분자는 ftsZ mRNA의 번역을 저해함으로써 E. coli에서 세포분열을 차단하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 dicF가 안티센스 RNA를 코딩함으로써 기능한다는 것을 나타낸다. (예를 들어, Tetart, F. and Bouche, J. P., Mol. Microbiol. 6 (5) : 615-620, 1992 ; Faubladier, M. et al., J. Mol. Biol. 212 (3) : 461-471, 1990 ; Delihas, N., Mol. Microbiol. 15 (3) : 411-414, 1995 참조.) dicA 유전자는 분열 저해 유전자인 dicB에 작용하는 억제제를 코딩하는 것으로 밝혀졌다 (Bejar, S. et al., Nucleic Acids Res. 14 (17) : 6821-33, 1986).
SulA 유전자는 술폰아미드 내성에 관련된다. DHPS (SuIS)는 엽산의 직전 전구체의 형성을 촉매하고 또한 술폰아미드에 대한 내성에 관여한다 (Lopez, P. et al., J. Bacteriol. 169 (9) : 4320-4326, 1987). E. coli 및 S. typhimurium sulA 유전자는 세포분열 저해제를 코딩한다. (예를 들어, Freudl, R. et al., Gene 52 : 31-40, 1987 참조.)
다수의 세포분열 및 세포주기 유전자에 대한 코딩 서열을 함유하는 전형적 박테리아 서열에 대한 GenBank 참조부호가 하기 표 1에 나타난다.
전형적인 박테리아 세포분열 및 세포주기 핵산서열
VI.세포분열 및 세포주기 핵산에 대하여 안티센스인 전형적 올리고머
다수의 양태에서, 본 발명은 다음: (1) 즉 E. coli 균주 0157:H 같은 박테리아의 주어진 종 또는 균주의 특정 균주 특유의; (2) 박테리아 둘 이상의 종 사이에서 상동성을 공유하는; (3) 그람-네거티브 박테리아 사이에서 공통적인 (상동성을 공유하는); (4) 그람-포지티브 박테리아 사이에서 공통적인 (상동성을 공유하는); 또는 (5) 전부는 아니라도 대부분 박테리아 사이에서 공통적인 (상동성을 공유하는) 단백질을 코딩하는 mRNA에 대한 번역 개시 부분을 포괄하는 표적 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하는데 효과적인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고머를 제공한다.
상기 표 1에 예시된 것과 같은, 다양한 박테리아 세포분열 및 세포주기 핵산 서열에 대한 GenBank 참조부호는 본 발명의 교시에 기초하여 주어진 세포분열 또는 세포주기 단백질/박테리아 조합에 대한 안티센스 올리고머를 고안하기 위하여 당업계 숙련자가 사용할 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머의 표적 서열은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddlB를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포분열 및 세포벽 합성 유전자 클러스터 내의 박테리아 유전자에 상보적이다. 일반적으로, 이 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 고안된다: (1) 관심의 세포분열 또는 세포주기 단백질에 대하여 번역 개시 코돈의 위치를 확인한다; (2) 선택의 단백질에 대한 개시점으로부터 5' 방향의 약 3 내지 9 뉴클레오티드와 함께 코딩 서열의 최초 약 12 내지 18 뉴클레오티드를 함유하는 약 12 내지 25 뉴클레오티드의 서열을 선택한다; (3) 선택된 서열을 기초로 안티센스 올리고머를 고안한다.
박테리아 핵산 서열이 일단 선택되면, 서열은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다른 박테리아 서열과 비교된다. BLAST 분석은 선택된 서열이 데이터베이스 내의 다른 서열에 상동성인지 결정하기 위하여 임의의 주어진 서열을 공유 데이터베이스에 비교하기 위하여 수행된다(예를 들어, 상기 SEQ ID NO : 58 참조). 여기에 기재된 BLAST 분석을 수행함에 있어서, http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 에서 발견되는 BLAST 검색 프로그램이 채용되었고, 뉴클레오티드 조회 서열을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교하는 "BLASTN" 검색이 수행되었다. BLASTN의 버젼 2.0.10 (1999년 8월 26일)이 비-중복 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 서열을 검색하기 위하여 사용되었다 (예를 들어, Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402, 1997 참조).
이 같은 분석에서, 핵산 서열 데이터베이스에 대한 핵산 서열을 검색하기 위하여는 BLASTN 프로그램이 바람직하고, GenBank Protein Sequence 데이터베이스 및 다른 공유 데이터베이스에서의 아미노산 서열에 대한 모든 리딩프레임에서 번역된 핵산 서열을 검색하기 위하여는 BLSTX 프로그램이 바람직하다. BLASTN 및 BLASTX 둘 모두 BLOSUM-62 매트릭스를 이용하고 오픈 갭 페널티 11.0와 익스텐디드 갭 패널티 1.0의 디폴트 매개변수를 사용하여 구동된다.(상기 인용된 Altschul et al., 1997 참조)
이 같은 서열 비교의 결과는 두 서열 사이의 "백분율 동일성" 또는 "백분율상동성"의 관점에서 보고된다. 용어 "백분율 동일성"은 정의된 알고리즘에 의하여 결정되는 바와 같은, 두 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 수준을 지칭하고, 따라서 주어진 서열의 상동성은 주어진 서열의 전 길이에서 적어도 약 70 % 또는 80 %, 바람직하게는 약 90, 95 또는 98 % 서열 동일성을 가진다. 여기에서 사용될 때 "70 % 상동성"은 70 % 서열 동일성과 같은 것을 의미한다는 것이 이해될 것이다.
안티센스 조절을 위한 표적인 전형적 박테리아 세포분열 또는 세포주기 핵산 서열과 그 같은 서열을 표적화하기 위한 대응하는 전형적인 안티센스 올리고머가 하기 표 2A 내지 C 및 3에 제공된다. 각각의 경우 지시된 표적에 대한 안티센스 올리고머는 주어진 GenBank 접근 번호의 지시된 위치에서 발견되는 핵산 서열에 기초하여 고안되었다. 예를 들어, E. coli dicF에 대한 전형적 안티센스 올리고머는 SEQ ID NO : 45 (표 2A)로 표시되는 서열을 가지며 GenBank 접근번호 X07465, 뉴클레오티드 1864-1886에서 발견되는 핵산 서열을 기초로 (즉, 그 서열에 안티센스로) 고안되었다. 유사하게, E. coli secA에 대한 전형적 안티센스 올리고머는 SEQ ID NO : 47 (표 2A)로 표시되는 서열을 가지며, GenBank 접근 번호 X55034 (뉴클레오티드 24798-24817)에서 발견되는 핵산 서열과 GenBank 접근 번호 CAA38851에서 발견되는 대응하는 단백질 서열을 기초로 고안되었다.
박테리아 세포분열 및 세포주기로 방향짓는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오티드
박테리아 세포분열 및 세포주기 서열로 방향짓는 추가적 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오티드
박테리아 세포분열 및 세포주기로 방향짓는 추가적 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오티드
하기 표 3은Enterococcus faecium또는Enterococcus faecalis의 세포분열과 복제에 관련되는 박테리아 단백질에 표적화되는 추가적 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적을 표시한다. 카르바메이트 키나제(CK)는 가역반응 NH2COO-+ ATP ↔NHCOOPO3 (2-)+ ADP를 촉매하여, 아르기닌 디히드롤라제 경로를 통하여 혐기성 아르기닌 분해로부터 에너지를 유도하는 이 미생물 내에서, 카르바모일 포스페이트로부터 ATP를 합성하는 역할을 한다 (Marina, A. et al., Eur. J. Biochem. 253 (1) : 280-91, 1998). D-알라닌 : D-알라닌 리가제 (dll)는 펩티도글리칸 가교에 사용되는 서브유니트 중 하나를 어셈블하기 때문에 박테리아 세포벽 합성에 필수적이다. (Ellsworth, B. A. et al., Chem. & Biol. 3 (1) : 37-44, 1996).
토포아이소머라제는 감긴 DNA의 위상기하학을 조절하고, 따라서 DNA 복제에필수적이다. 티오레독신 리덕타제는 환원 티오레독신의 재생성을 촉매하여 리보뉴클레오티드 포스페이트를 데옥시리보뉴클레오티드 포스페이트로 환원시키는 역할을 한다. 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)는 유사하게 테트라하이드로폴레이트로부터 디하이드로폴레이트의 재생산을 촉매함으로써 데옥시우리딜레이트로부터 데옥시티미딜레이트를 합성하는 역할을 한다.
알킬 수소 페르옥사이드 리덕타제는 산화적 스트레스 박테리아에 의하여 유도되고 (Storz, G. et al., J. Bacteriol. 171 (4) : 2049-55, 1989 ; Jacobson, F. S. et al., J. Biol. Chem. 264 (3) : 488-96, 1989), 산화적 돌연변이화에 대항하여 DNA를 보호하는 것으로 이해된다.
Enterococcus aecium 또는 Enterococcus faecalis 내 표적 단백질로 방향짓는 추가적 안티센스 올리고뉴클레오티드
VII.전형적 안티센스 올리고머의 평가와 생체 활성
본 발명에 적합성에 대한 올리고머의 시험에서, 상기 II절에 상세하게 기술된 각각의 성질은 바람직하게 만족된다. "실질적으로 비하전인" 성질은 결합이 비하전인 경우에 본절적으로 만족되는 것과, 표적-서열의 상보성은 염기-서열 고안에의하여 성취되는 것이 이해된다. 따라서, 올리고머는 그것의 (i) 바람직하게 이중체 길이 12 내지 20 염기짝에서의 표적 RNA에 대한 Tm, (ii) 능동 또는 촉진 수송에 의한 세포막을 통한 피수송능, 및 (iii) 상기 II 절에서 기재된 바와 같이, 이중체 형태에서 RNaseH에 의한 RNA 단백질분해 방지능에 대하여 바람직하게 시험된다.
주어진 안티센스 올리고머의 효과는 당업계에 알려진 방법에 의하여 측정된다. 예를 들어, 올리고머는 시험관내 박테리아 배양물과 함께 항온처리되고 표적 핵산에 대한 효과는 (1) 당업계 숙련자에게 알려진 방법, 예를 들어 전기영동적 겔 운동성 분석을 사용한 표적 서열 및 비-표적 서열과의 헤테로 이중체 형성; (2) RT-PCR 또는 노던 블롯팅 같은 표준 기술에 의하여 측정되는 것과 같은 표적 세포분열 또는 세포주기 단백질에 대한 mRNA의 양; (3) ELISA 또는 웨스턴 블롯팅 같은 표준 기술에 의하여 측정되는 것과 같은 박테리아 단백질 생산의 양; 또는 (4) 표적 핵산 RNA 서열을 가지는 것으로 알려진 두 가지 박테리아 모두에 대한 시험관내 박테리아 성장의 양의 존재 또는 부재에 대하여 탐지함으로써 평가된다.
후보 안티센스 올리고머는 또한 각각3H-류신 및3H-티미딘 삽입을 통하여 측정되는 바와 같이, 단백질과 DNA 합성에 대한 효과와 같은 급성 및 만성 세포 독성에 대하여 주지의 방법에 따라 평가될 수 있다. 추가로, 후보 안티센스 올리고머의 결합의 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 조절 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 센스, 넌센스 또는 혼합 안티센스 서열 같은 하나 이상의 조절 올리고뉴클레오티드또는 미스매치 염기를 함유하는 서열이 일반적으로 평가 과정에 포함된다. 이 같은 시험의 결과는 비분별 억제로부터 유전자 발현의 안티센스 저해의 특이적 효과를 구별하는데 중요하다 (예를 들어, Bennett, M. R. et al., Circulation 92 (7) : 1981-1993, 1995 참조). 따라서, 안티센스 올리고의 비-표적 서열에의 비-특이적 결합을 제한하기 위하여 필요한 바에 따라 서열이 변형될 수 있다.
내인성 박테리아 세포분열 및 세포주기 유전자의 발현 또는 박테리아 tRNA에 대하여 표적화된 선택의 포스포디아미데이트 모르폴린 올리고머 (PMOs)의 효과는 E. coli를 SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47, and SEQ ID NO : 59로 각각 표시되는 서열을 가지는 E. coli dicF mRNA, secA mRNA, 또는 met-tRNA에 대하여 안티센스인 PMOs와 항온처리함으로써 평가되었다. 하기 재료와 방법에서 기재된 바와 같이 과정이 수행되었다. 도 4A-C에 기재된 바와 같이, E. coli 의 이들 PMOs로의 처리는 100 nM 미만의 안티센스 올리고머 농도에서 유의한 박테리아 세포 사멸을 결과하였다. 도 4A에서 나타난 바와 같이, dicF에 대한 안티센스 PMO는 1.0 μM 올리고뉴클레오티드에서 약 80% 저해 (20% 생존률)를 결과하였다.
표 3에 표시된 서열을 가지는 PMO 1.0 μM의Enterococcus faecium의 생존률에 대한 효과가 유사하게 시험되었다. 결과는 표 4에 주어진다.
선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드(1.0 μM)의 E. faecium 의 생존률에 대한 효과
따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 항박테리아제로서 효과적이며, 전형적으로 50 내지 60 %, 및 몇몇 경우에는 80 %까지 성장의 저해에 영향을 준다. 본 발명을 뒷받침하는 연구는 또한 10 세대 후에 내성 균주로 돌연변이유발되는 것이 생체에서 실패한 것을 나타내었다.
본 발명의 안티센스 PMO's에 대하여 노출되었을 때, 몇몇의 박테리아는 수송을 중지하고 비정상적 콜리플라워 형태학을 특징으로 하는 준-동면 상태로 돌입하였다. 따라서, 이 같은 올리고뉴클레오티드는 또한 항-박테리아 백신의 제조에서 용도를 발견할 수 있다. 본 발명의 이 양태에서, 박테리아의 특정 유형의 배양물은 복제-손상 및/또는 형태학적으로 비정상 박테리아 세포를 생산하는데 효과적인 양의 모르폴린-기초 안티센스 올리고머의 존재하에서 배양된다. 이 같은 복제-손상 및/또는 형태학적으로 비정상인 박테리아 세포는 피험체에 투여되고 백신으로 작용한다.
IX.안티센스 올리고머의 생체내 투여
한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 생체내 박테리아 감염을 지연시키거나제한하고/또는 특정 박테리아에 의한 감염과 전형적으로 관련된 검출 가능한 증상을 감소시키거나 제거하는 것에 목적을 둔다. 그 방법은 관심의 박테리아 세포분열 또는 세포주기 단백질의 생체활성을 저해하는데 효과적인 안티센스제의 분량을 적당한 약제학적 담체 내에서 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그것을 함유하는 약제학적 조성물은 포유동물에서 박테리아의 감염을 생체내 저해하는데, 및 숙주에서 박테리아의 성장을 저해하거나 정지시키는데 유용하다. 박테리아는 수가 감소되거나 숙주의 정상적이 성장이나 발생에 검출 가능한 효과가 거의 또는 완전히 없도록 제거된다.
몇몇 경우에는, 안티센스 올리고머는 일반적으로 박테리아의 성장을 저해할 것이다. 다른 경우에는, 안티센스 올리고머는 특정 유형의 박테리아, 예를 들어 특정 속, 종 또는 균주 하나 이상에 특이적일 것이다.
이 같은 안티센스 올리고머의 본 발명의 방법을 사용한 피험체내 생체내 효험은 (1)표적 서열; (2) 안티센스 투여의 기간, 투여량 및 빈도; 및 (3) 피험체의 일반적 조건을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 요인에 의존된다.
다른 경우에, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 항-박테리아 백신의 제조에서 용도를 발견한다. 본 발명의 이 양태에서, 박테리아의 특정 유형의 배양물은 복제-손상 및/또는 형태학적으로 비정상 박테리아 세포를 생산하는데 효과적인 양의 상기 유형의 모르폴린-기초 안티센스 올리고머의 존재하에서 배양된다. 이 같은 복제-손상 및/또는 형태학적으로 비정상인 박테리아 세포는 피험체에 투여되고 백신으로 작용한다.
본 발명의 생체내 투여된 안티센스 올리고머의, 하나 이상의 유형의 박테리아의 성장을 저해 또는 제거하는 효험은 안티센스 올리고머의 투여전, 투여 동안 또는 투여 직후에 피험체로부터 미리 취하여진 생물학적 샘플(조직, 혈 등)의 시험관내 배양 또는 현미경적 시험에 의하여 측정된다. (예를 들어, Pari, G. S. et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 39 (5) : 1157-1161, 1995 ; Anderson, K. P. et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 40 (9) : 2004-2011, 1996 참조.) 안티센스 올리고머-처리 박테리아의 생체내 투여 백신의 효험은 면역 반응의 검출을 위한 표준 면역학적 기술, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 방사성면역분석 (RIA), 혼합 림프구 반응 (MLR), 박테리아-특이적 세포상해 T 림프구 (CTL)에 대한 분석 등에 의하여 측정된다.
A.투여 방법
안티센스 올리고머의 표적 핵산에 대한 올리고머의 효과적 송달은 치료의 중요한 측면이다. 본 발명에 따라, 안티센스 올리고머 송달의 이 같은 경로는 경구 및 비경구 경로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 및 근육내 뿐 아니라 흡입, 경피적 및 국소 송달을 포함하는 다양한 전신성 경로를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 적당한 경로는 치료중인 피험체의 상태에 적당하도록 당업계 숙련자에 의하여 측정된다. 예를 들어, 피부의 박테리아 감염의 치료에서의 안티센스 올리고머의 송달을 위한 적당한 경로는 국소 송달인 반면, 박테리아성 호흡기 감염의 치료에서 안티센스올리고머의 송달은 흡입에 의한 것이다. 올리고머를 박테리아 감염의 부위에 송달하거나 올리고뉴클레오티드를 혈류내로 도입시키는데 효과적인 방법 또한 고려된다.
안티센스 올리고머의 피부통과 송달은 예를 들어 국소 투여를 위하여 적용되는 약제학적으로 허용되는 담체의 사용에 의하여 성취된다. 모르폴린 올리고머 송달의 한 예는 PCT 특허 출원 WO 97/40854에 기재된다.
한 바람직한 구체예에서, 올리고머는 모르폴린 올리고머이고, 약제학적으로 허용되는 담체에 함유되어 구강으로 송달된다.
안티센스 올리고머는 생리학적으로 허용되는, 편리한 어떤 부형제 내에서 투여된다. 이 같은 올리고뉴클레오티드 조성물은 당업자에 의하여 채용되는 약제학적으로 허용되는 다양한 표준 담체를 함유할 수 있다. 이 같은 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수, 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 물, 에탄올 수용액, 오일/물 에멀젼, 트리글리세라이드 에멀젼 같은 에멀젼, 습윤제, 정제 및 캡슐을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적당한 생리학적으로 허용되는 담체는 선택된 투여 방식에 따라 다양할 수 있음이 이해되어야 한다.
몇몇 예에서는 리포솜이 안티센스 올리고머의 세포내로의 섭취를 용이하게 하기 위하여 채용된다. (예를 들어, Williams, S. A., Leukemia 10 (12) : 1980-1989, 1996 ; Lappalainen et al., Antiviral Res. 23 : 119, 1994 ; Uhlmann etal., ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES : A NEW THERAPEUTIC PRINCIPLES, Chemical Reviews, Volume 90, No. 4, pages 544-584, 1990 ; Gregoriadis, G., Chapter 14, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341, Academic Press, 1979 참조). 예를 들어 WO 93/01286에 기재된 바와 같이, 하이드로겔 또한안티센스 올리고머 투여를 위한 부형제로서 사용된다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 마이크로 구체 또는 마이크로 입자 내에서 투여될 수 있다.(예를 들어, Wu, G. Y. and Wu, C. H., J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432, 1987 참조.)
지속적 배출 조성물 또한 이 적용의 범위 내에서 고려된다. 이들은 필름이나 마이크로캡슐 같은 형체 입자의 형태인 반투과성 중합체성 매체를 포함한다.
전형적으로, 안티센스 올리고머의 하나 이상의 투여량은 일반적으로 약 1 내지 2 주의 기간 동안의 규칙적 간격에서 투여된다. 경구 투여의 바람직한 투여량은 (70 kg의 체중을 기준으로) 약 1 mg 올리고머/환자 내지 약 25 mg 올리고머/환자이다. 몇몇 경우에는, 25 mg 올리고머/환자보다 큰 투여량이 필수적이다. 정맥내 투여를 위하여는, 바람직한 투여량은 (70 kg의 체중을 기준으로) 약 0.5 mg 올리고머/환자 내지 약 10 mg 올리고머/환자이다. 안티센스 화합물은 일반적으로 적어도 200 내지 400 nM 안티센스 올리고머의 정점 혈 농도를 결과하는데 효과적인 양과 방식으로 투여된다.
이 구체예의 더 나아간 양태에서, 모르폴린 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단기간 동안의 규칙적 간격에서, 예를 들어 두 주 이하 기간 동안 매일 투여된다. 그러나, 몇몇 경우에서는 안티센스 올리고머는 장기간을 통하여 간헐적으로 투여된다. 피험체로의 모르폴린 안티센스 올리고머의 투여는 또한 항생제나 다른 치료학적 치료의 투여 후 또는 그와 동시에 이루어질 수 있다.
방법의 한 양태에서, 피험체는 인간 피험체, 예를 들어 국소 또는 전신성 박테리아 감염을 가진 것으로 진단된 환자이다. 예를 들어 (1) 면역손상된; (2)화상의 희생자인; (3) 유치 카테테르를 가지는; 또는 (4) 외과수술을 받게 되거나 최근 받은 환자의 경우, 환자의 상태는 또한 본 발명의 안티센스 올리고머 또는 안티센스 올리고머 처리 박테리아 백신의 예방적 투여를 한정시킬 수 있다.
방법의 다른 적용에서, 피험체는 가축인 동물, 예를 들어 닭, 칠면조, 돼지 또는 염소 등이고 치료는 예방적 또는 치료적이다. 본 발명은 또한 치료학적 분량 미만으로 상기 기재된 유형의 항-박테리아성 안티센스 화합물이 첨가된 사료 곡물을 함유하는 가축류와 가금류 사료 조성물을 포함한다. 치료학적 분량 미만으로 상기 기재된 유형의 항-박테리아성 안티센스 화합물이 첨가된 사료 곡물로 가축류와 가금류를 먹이는 방법에서는 식품 사료가 치료학적 분량 미만으로 상기 기재된 바와 같은 항-박테리아성 올리고뉴클레오티드 조성물이 첨가되는 개선이 또한 고려된다.
본 발명의 방법은 박테리아 성장의 저해나 제거가 치료중인 피험체에 대하여 개선된 치료학적 결과를 유발하는데 효과적일 수 있는 어떤 상태의 치료에도 일반적으로 적용 가능하다.
본 발명의 한 양태는 항생제나 다른 치료학적 치료의 피험체로의 투여가 따르거나 동시에 이루어지는 피험체로의 모르폴린 안티센스 올리고머의 투여를 포함하는, 박테리아 감염의 치료를 위한 방법이다.
B.치료 탐지 방법
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 효과적 생체내 치료 섭생은 투여의 빈도와 경로 뿐 아니라 치료받는 피험체의 상태(즉, 예방적 투여 대국소 또는 전신 감염에 대항한 투여)에 따라 다양할 것임이 이해될 것이다. 따라서, 이 같은 생체내 치료법은 일반적으로 최적의 치료학적 결과를 성취하기 위하여 치료하의 특정 유형의 박테리아 감염에 적당한 시험에 의한 탐지 및 대응하는 투여량 또는 치료 섭생의 조정을 필요로 할 것이다.
여기에 기재된 방법이 관련된, 주어진 치료학적 섭생의 효능은, 예를 들어, 전혈 카운트 (CBC), 핵산 검출 방법, 명역진단 시험, 또는 박테리아 배양 같은 감염의 일반적 지표에 의하여 탐지될 수 있다.
박테리아 감염의 확인 및 탐지는 일반적으로 (1) 핵산 검출 방법, (2) 혈청학적 검출 방법, 즉 전통적 면역 분석, (3) 배양 방법, 및 (4) 생화학적 방법 중 하나 이상과 관련된다. 이 같은 방법은 정성적 또는 정량적이다.
핵산 프로브는 공공의 이용 가능한 박테리아 핵산 서열에 기초하여 고안되고 박테리아 감염의 지표가 되는 표적 유전자나 대사산물(즉, 독소)를 검출하는데 사용되는데, 이것은 특정 박테리아 유형, 예를 들어 특정 종이나 균주에 특이적이거나 하나를 초과하는 박테리아의 종이나 유형(즉, 그람 포지티브 또는 그람 네거티브 박테리아)에 공통적이다. 핵산 증폭 시험(예를 들어, PCR) 또한 이 같은 검출 방법에서 사용된다.
혈청학적 동정은 박테리아 샘플 또는 생물학적 시료로부터 분리된 배양물, 예를 들어 분변, 소변, 뇌척수액, 혈 등을 사용하여 성취될 수 있다. 박테리아에 대한 면역분석은 일반적으로 당업자에 의하여 일상적으로 채용되는 방법, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의하여 수행된다. 또한, 특정 박테리아 균주나 종에특이적인 단일 클론 항체가 빈번하게 시중구입 가능하다.
호기성 대 혐기성 배양, 성장 및 다양한 배양 조건에서의 형태학을 포함하지만 이에 한정되지 않는 기술을 채용함으로써 배양 방법이 특정 유형의 박테리아를 분리하고 동정하는데 사용될 수 있다. 전형적인 생화학적 시험은 그람 염색 (Gram, 1884 ; 그람 포지티브 박테리아는 심청색으로 염색되고 그람 네거티브 박테리아는 붉은색으로 염색됨), 효소적 분석 (즉,Pseudomonas aeruginosa에 대하여 옥시다제, 카탈라제 포지티브), 및 파지 시험을 포함한다.
이 같은 진단의 정확한 방식, 및 정량적 시험 뿐 아니라 박테리아 감염의 지표가 되는 다른 생리학적 요인이 박테리아 표적, 처리되는 상태 및 치료가 예방적인지 치료학적인지에 따라 다양할 것임이 이해될 것이다.
피험체가 특정 유형의 박테리아 감염을 가지는 것으로 진단된 경우, 치료중인 박테리아 감염의 특정 유형을 탐지하기 위하여, 박테리아 감염의 상태 또한 당업자에 의하여 사용되는 진단적 기술을 사용하여 탐지된다.
안티센스 올리고머 치료 섭생은 지시된 바에 따라 치료중인 피험체의 면역분석, 다른 생화학적 시험 및 생리학적 시험의 결과에 기초하여 (투여량, 빈도, 경로 등이) 조정될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하지만 어떤 방법으로든 본 발명의 범위를 한정하려고 의도되지 않는다.
재료와 방법
표준 재조합 DNA 기술이 Ausubel, FM et al., in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA, 1992 및 Sambrook, J. et al., in MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Vol. 2, 1989에 기재된 바와 같이 모든 구성체에서 채용되었다.
박테리아 배양. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효율을 평가함에 있어, 4.5 mg의 암피실린과, 100 ㎍/mL 암피실린 함유 LB 한천 플레이트에서 신선하게 채취된 pCiNeo(myc)lucA 단일 콜로니를 함유하는 Luria-Bertani (LB) 육즙내의 시작 배양물 45 ml로부터 약 3 ml 박테리아 배양물을 플라스틱 스냅 캡 시험관 내로 분획하였다. 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 희석된 포스포로 디아미데이트 모르폴린 올리고머를 배양물에 첨가하였고 37 ℃에서 특정 시간, 예를 들어 16 또는 26 시간 동안 210 rpm에서 교반한 다음, 빙상에 15 분간 방치하였다.
배양물 염색 현미경 관찰 및 콜로니 검색. 박테리아 배양물은 그람 염색법 프로토콜에 따라 염색하였다. 염색된 박테리아를 Nikon Optiphot-2 직립 현미경을 사용하여, 100x 오일 투입 렌즈 및 10x 카메라 확대의 조합을 사용한 1000x 확대된 영상으로서 가시화하였다. 이 영상을 잡기 위하여 Nikon N8008S가 사용되었다. 브라이트필드 현미경을 사용하여 5 라이트 아웃풋 상에서 4초 노출로 영상을 잡았다. 바람직한 필름은 Kodak Gold 400 ASA였다. 현상한 다음, 영상을 Microtek Scan Maker 4를 사용하여 스캐닝한 다음, Adobe PhotoShop을 사용하여 나타내었다.

Claims (41)

  1. 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트를 함유하는 실질적으로 비하전된 안티센스 올리고머로 구성된 항박테리아성 화합물로서, 상기 올리고머는 (i) 박테리아 tRNA 서열 또는 (ii) 세포분열이나 세포주기에 관여하는 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산내에 번역개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 혼성화되기에 효과적인 적어도 10 뉴클레오티드 길이의 표적화 핵산서열을 포함하고,
    상기 단백질은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA, 및 ddlB 단백질, 카르바메이트 키나제, D-ala D-ala 리가제, 토포이소머라제, 알킬 하이드로페르옥사이드 리덕타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 및 세포벽 효소로 구성된 군으로부터 선택되며;
    각각의 상기 서브유니트는 박테리아 핵산 서열내 각 뉴클레오티드 염기에 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 결합하는데 효과적인 염기-짝짓기 부분을 지지하는 5- 또는 6-원 고리를 포함하며,
    인접하는 서브유니트는 비하전 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드, 포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트, 실옥산, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 티오포름아세틸, 및 메틸렌-N-메틸히드록실아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 비하전 결합, 또는 인산염, 하전 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하전 결합에 의하여 연결되며,
    올리고머 내의 비하전 결합 대 하전 결합의 비는 적어도 4:1인 항박테리아성 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서, 표적화 핵산 서열은 번역 개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 3 항에 있어서, 각 비하전 결합은 도 2B에서 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트 결합으로서, X=NR2이며, 여기서 R은 수소 또는 메틸, Y=O, 및 Z=O인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 3 항에 있어서, 각 결합은 도 2B에서 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트 결합으로서, X=NR2이며, 여기서 R은 수소 또는 메틸, Y=O, 및 Z=O인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 15 내지 20 서브유니트 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 2 항에 있어서, 표적서열은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddl로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, 표적 서열은 dicA, dicB, dicC 및 dicF로 구성된 군으로부터 선택되는 dic 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 45 (E. coli(E. 콜리) dicF), SEQ ID NO : 48 (E. coli(E. 콜리) dicA), SEQ ID NO : 49 (E. coli(E. 콜리) dicB), SEQ ID NO : 50 (E. coli(E. 콜리) dicC) ; 및 SEQ ID NO : 61 (S. thyphi.(S. 타이피무리움) dicA)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 9 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 45 (E. coli(E. 콜리) dicF)로서 나타난 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 2 항에 있어서, 표적화 서열은 secA 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역에 상보적이고, SEQ ID NO : 47 (E. coli(E. 콜리) secA), SEQ ID NO : 67 (Staph. aureus(스타필로코코스 아우리우스) secA), SEQ ID NO : 79 (H. pylori(H. 파일로리) secA), and SEQ ID NO : 91 (Treponema pallidum(트레포네마 팔리둠) secA)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 12 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 47 (E. coli(E. 콜리) secA)로서 나타난 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 13 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 2 항에 있어서 표적화 서열은 SEQ ID NO : 103 (E. faecium(E. 피시움) 카르바메이트 키나제) ; SEQ ID NO : 104 (E. faecium(E. 피시움) D-ala D-ala 리가제) ; SEQ ID NO : 105 (E. faecalis(E. 피칼리스) 토포이소머라제) ; SEQ ID NO: 107 (E. faecalis(E. 피칼리스) repA) ; SEQ ID NO : 108 (E. faecalis(E. 피칼리스) 알킬 수소 페르옥사이드 리덕타제) ; SEQ ID NO : 109 (E. faecalis(E. 피칼리스) thioredoxin reductase) ; SEQ ID NO : 110 (E. faecalis(E. 피칼리스) 디하이드로폴레이트 리덕타제) ; SEQ ID NO : 111 (E. faecalis(E. 피칼리스) ftsA) ; 및 SEQ ID NO : 112 (E. faecalis(E. 피칼리스) 세포벽 효소)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. (i) 박테리아 tRNA 서열 또는 (ii) 세포분열이나 세포주기에 관여하는 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산내에 번역개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 혼성화되기에 효과적인 적어도 10 뉴클레오티드 길이의 표적화 핵산서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트를 함유하는, 실질적으로 비하전된 안티센스 올리고머를 약학적으로 유효한 양으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 또는 포유동물에서 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서,
    상기 단백질은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA, 및 ddlB 단백질, 카르바메이트 키나제, D-ala D-ala 리가제, 토포이소머라제, 알킬 하이드로페르옥사이드 리덕타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 및 세포벽 효소로 구성된 군으로부터 선택되며;
    각각의 상기 서브유니트는 박테리아 핵산 서열내 각 뉴클레오티드 염기에 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 결합하는데 효과적인 염기-짝짓기 부분을 지지하는 5- 또는 6-원 고리를 포함하며,
    인접하는 서브유니트는 비하전 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드, 포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트, 실옥산, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 티오포름아세틸, 및 메틸렌-N-메틸히드록실아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 비하전 결합, 또는 인산염, 하전 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하전 결합에 의하여 연결되며,
    올리고머 내의 비하전 결합 대 하전 결합의 비는 적어도 4:1인, 인간 또는 포유 동물 피험체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 표적화 핵산 서열은 번역 개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 비하전 결합은 도 2A 내지 2D에 표시된 구조로 구성된군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 각 비하전 결합은 도 2B에서 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트 결합으로서, X=NR2이며, 여기서 R은 수소 또는 메틸, Y=O, 및 Z=O인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 각 결합은 도 2B에서 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트 결합으로서, X=NR2이며, 여기서 R은 수소 또는 메틸, Y=O, 및 Z=O인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 15 내지 20 서브유니트 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 17 항에 있어서, 표적 서열은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddl로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 표적 서열은 dicA, dicB, dicC 및 dicF로 구성된 군으로부터 선택되는 dic 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 45 (E. coli(E. 콜리) dicF), SEQ ID NO : 48 (E. coli(E. 콜리) dicA), SEQ ID NO : 49 (E. coli(E. 콜리) dicB), SEQ ID NO : 50 (E. coli(E. 콜리) dicC) ; 및 SEQ ID NO : 61 (S. thyphi(S. 타이피) dicA)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 45 (E. coli(E. 콜리) dicF)로서 나타난 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 24 항에 있어서, 표적화 서열은 secA 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역에 상보적이고, SEQ ID NO : 47 (E. coli(E. 콜리) secA), SEQ ID NO : 67 (Staph. aureus(스타필로코코스 아우리우스) secA), SEQ ID NO : 79 (H. pylori(H. 파일로리) secA), and SEQ ID NO : 91 (Treponema pallidum(트레포네마팔리둠) secA)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 표적화 서열은 SEQ ID NO : 47 (E. coli(E. 콜리) secA)로서 나타난 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 18 항에 있어서 표적화 서열은 SEQ ID NO : 103 (E. faecium(E. 피시움) 카르바메이트 키나제) ; SEQ ID NO : 104 (E. faecium(E. 피시움) D-ala D-ala 리가제) ; SEQ ID NO : 105 (E. faecalis(E. 피칼리스) 토포이소머라제) ; SEQ ID NO : 107 (E. faecalis(E. 피칼리스) repA) ; SEQ ID NO : 108 (E. faecalis(E. 피칼리스) 알킬 수소 페르옥사이드 리덕타제) ; SEQ ID NO : 109 (E. faecalis(E. 피칼리스) thioredoxin reductase) ; SEQ ID NO : 110 (E. faecalis(E. 피칼리스) 디하이드로폴레이트 리덕타제) ; SEQ ID NO : 111 (E. faecalis(E. 피칼리스) ftsA) ; 및 SEQ ID NO : 112 (E. faecalis(E. 피칼리스) 세포벽 효소)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제 17 항에 있어서, 피부의 박테리아 감염을 치료하기 위하여 상기 투여하는 단계가 국소 경로에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 17 항에 있어서, 박테리아 호흡기 감염을 치료하는데 사용하기 위하여 상기 투여하는 단계가 흡입에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 치료학적 양 이하의 항박테리아성 화합물이 첨가된 사료 곡물를 함유하는, 가축류와 가금류 사료 조성물로서, 상기 화합물은 (i) 박테리아 tRNA 서열 또는 (ii) 세포분열이나 세포주기에 관여하는 단백질을 코딩하는 박테리아 핵산내에 번역개시 코돈을 함유하는 표적 서열에 혼성화되기에 효과적인 적어도 10 뉴클레오티드 길이의 표적화 핵산서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트를 함유하는, 실질적으로 비하전된 안티센스 올리고머로 구성되고,
    상기 단백질은 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA, 및 ddlB 단백질, 카르바메이트 키나제, D-ala D-ala 리가제, 토포이소머라제, 알킬 하이드로페르옥사이드 리덕타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 및 세포벽 효소로 구성된 군으로부터 선택되며;
    각각의 상기 서브유니트는 박테리아 핵산 서열내 각 뉴클레오티드 염기에왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의하여 결합하는데 효과적인 염기-짝짓기 부분을 지지하는 5- 또는 6-원 고리를 포함하며,
    인접하는 서브유니트는 비하전 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드, 포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트, 실옥산, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 티오포름아세틸, 및 메틸렌-N-메틸히드록실아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 비하전 결합, 또는 인산염, 하전 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하전 결합에 의하여 연결되며,
    올리고머 내의 비하전 결합 대 하전 결합의 비는 적어도 4:1인 사료 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 올리고머는 모르폴린 올리고머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 각 비하전 결합은 도 2B에서 나타난 바와 같은 포스포로디아미데이트 결합으로서, X=NR2이며, 여기서 R은 수소 또는 메틸, Y=O, 및 Z=O인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 36 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 15 내지 20 서브유니트 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. (a) zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddl로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역에 혼성화 되기에 효과적인 표적화 염기 서열을 함유하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트; 및
    (b) 도 2A 내지 2D에 나타난 바와 같은 비하전 포스포러스-함유 서브유니트간 결합을 가지는 안티센스 모르폴린-기초 안티센스 올리고머가 복제-손상된, 형태학적으로 비정상인 박테리아 세포를 생산하기에 효과적인 양으로 존재하는 조건에서 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 선택된 박테리아에 대한 백신의 제조방법.
  41. (a) zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murG, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddl로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 유전자로부터 전사되는 mRNA 내의 번역 개시 영역에 혼성화 되기에 효과적인 표적화 염기 서열을 함유하는 8 내지 40 뉴클레오티드 서브유니트; 및
    (b) 도 2A 내지 2D에 나타난 바와 같은 비하전 포스포러스-함유 키랄 서브유니트간 결합을 가지는 안티센스 모르폴린-기초 안티센스 올리고머 존재 하에서 박테리아를 배양함으로써 제조되는, 복제-손상된, 형태학적으로 비정상인 박테리아세포를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 선택된 박테리아에 대하여 인간 또는 동물 피험체를 백신화하는 방법.
KR1020027008681A 2000-01-04 2001-01-04 안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법 KR20020079768A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17448400P 2000-01-04 2000-01-04
US60/174,484 2000-01-04
PCT/US2001/000222 WO2001049775A2 (en) 2000-01-04 2001-01-04 Antisense antibacterial cell division composition and method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020079768A true KR20020079768A (ko) 2002-10-19

Family

ID=22636319

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027008681A KR20020079768A (ko) 2000-01-04 2001-01-04 안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7049431B2 (ko)
EP (1) EP1248813A2 (ko)
JP (1) JP2003518946A (ko)
KR (1) KR20020079768A (ko)
AU (1) AU781676B2 (ko)
CA (1) CA2396068A1 (ko)
WO (1) WO2001049775A2 (ko)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6720139B1 (en) 1999-01-27 2004-04-13 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli
US6677153B2 (en) * 1999-11-29 2004-01-13 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and composition
US6764823B2 (en) 2000-04-06 2004-07-20 Pharmacia & Upjohn Company Antimicrobial methods and materials
CA2408011A1 (en) 2000-05-04 2001-11-08 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
EP1432814A2 (en) * 2001-09-28 2004-06-30 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Antimicrobial methods and materials
DK2351844T3 (da) 2003-04-29 2014-09-22 Sarepta Therapeutics Inc Præparater til forøgelse af transport- og antisense-effektivitet af nukleinsyreanalog i celler
AU2004263124B2 (en) * 2003-08-07 2009-01-15 Avi Biopharma, Inc. Sense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US20050222068A1 (en) * 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
US20050171044A1 (en) * 2003-12-24 2005-08-04 Stein David A. Oligonucleotide compound and method for treating nidovirus infections
CA2553104A1 (en) * 2004-01-23 2005-08-11 Avi Biopharma, Inc. Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression
US7402574B2 (en) * 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US7807816B2 (en) 2004-06-28 2010-10-05 University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ATE510914T1 (de) * 2004-07-02 2011-06-15 Avi Biopharma Inc Antisinn antibakterielle verfahren und verbindungen
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) * 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) * 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
US20060240032A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-26 Hinrichs David J Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases
US20060293268A1 (en) * 2005-05-05 2006-12-28 Rieder Aida E Antisense antiviral compounds and methods for treating foot and mouth disease
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US7790694B2 (en) * 2005-07-13 2010-09-07 Avi Biopharma Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8329668B2 (en) * 2005-09-08 2012-12-11 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
US8524676B2 (en) * 2005-09-08 2013-09-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds
US8501704B2 (en) * 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
WO2007117371A2 (en) * 2006-03-01 2007-10-18 Anza Therapeutics, Inc. Engineered listeria and methods of use thereof
WO2007103529A2 (en) * 2006-03-07 2007-09-13 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
DK2024499T3 (da) * 2006-05-10 2018-01-29 Sarepta Therapeutics Inc Oligonukleotidanaloger med kationiske intersubunit-koblinger
US8785407B2 (en) * 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
US7989608B2 (en) 2007-12-28 2011-08-02 Avi Biopharma Inc. Immunomodulatory agents and methods of use
EP2350281B1 (en) 2008-10-24 2014-05-14 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
CA2746508A1 (en) * 2008-12-17 2010-07-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
HUE040445T2 (hu) 2009-11-12 2019-03-28 Univ Western Australia Antiszensz molekulák és eljárások betegségek kezelésére
WO2011060320A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US9050373B2 (en) 2010-05-13 2015-06-09 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Pharmaceutical compositions comprising antisense oligonucleotides and methods of using same
CA2799501C (en) 2010-05-28 2022-02-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
US8198429B2 (en) 2010-08-09 2012-06-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
US10017763B2 (en) 2010-09-03 2018-07-10 Sarepta Therapeutics, Inc. dsRNA molecules comprising oligonucleotide analogs having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
AU2011326181C1 (en) 2010-11-10 2017-06-29 Nigel L. Webb Nuclions and ribocapsids
WO2012109296A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
EA035030B1 (ru) 2011-11-18 2020-04-20 Сарепта Терапьютикс, Инк. Модифицированные морфолиновые аналоги олигонуклеотидов
BR112014023347A2 (pt) 2012-03-20 2017-07-18 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de ácido borônico de análogos oligonucleotídeos
BR122020016865B1 (pt) 2013-03-14 2022-12-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotídeo antisenso, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso da dita composição para o tratamento de distrofia muscular de duchenne (dmd)
CA2906812A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved compositions for treating muscular dystrophy
SG11201507142QA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Techulon Inc Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection
EP2790017A1 (en) * 2013-04-11 2014-10-15 Institut Pasteur Methods to obtain a novel class of gram negative bacteria antibiotics which target an unknown cell division associated protein LOP1
US20180002692A1 (en) * 2015-01-30 2018-01-04 Anushree Chatterjee Sequence Specific and Organism Specific Antimicrobials and Related Materials and Methods
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3302489A4 (en) 2015-06-04 2019-02-06 Sarepta Therapeutics, Inc. METHOD AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND SUFFERING IN CONNECTION WITH LYMPHOCYTES
WO2018140613A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Conformation switchable antimicrobial peptides and methods of using the same
AU2022325553A1 (en) * 2021-08-13 2024-02-15 1E Therapeutics Ltd. Dnazymes targeting cell wall synthesis enzymes and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3398378B2 (ja) * 1989-12-20 2003-04-21 アンチビラルス・インコーポレイテツド リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー
US5821052A (en) * 1992-04-16 1998-10-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Control of the synthesis of proteins by anitisense RNA-tRNA complex
GB9505438D0 (en) * 1995-03-17 1995-05-03 Sod Conseils Rech Applic Antisense oligonucleotides
WO1998003533A1 (en) * 1996-07-24 1998-01-29 Oligos Etc. And Oligos Therapeutics, Inc. Antisense oligonucleotides as antibacterial agents
AU742521B2 (en) * 1997-01-24 2002-01-03 Avi Biopharma, Inc. Method and conjugate for treating H. pylori infection
EP0975370B9 (en) * 1997-05-21 2004-11-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6204019B1 (en) * 1997-06-04 2001-03-20 Smithkline Beecham Corporation Sec A2 from Streptococcus pneumoniae
US6610539B1 (en) * 1997-07-10 2003-08-26 Genesense Technologies, Inc. Antisense oligonucleotide sequences as inhibitors of microorganisms
EP0894857A3 (en) * 1997-08-01 2001-09-26 Smithkline Beecham Corporation SecA gene from Streptococcus pneumoniae
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins

Also Published As

Publication number Publication date
AU2628201A (en) 2001-07-16
WO2001049775A3 (en) 2002-03-21
EP1248813A2 (en) 2002-10-16
US7049431B2 (en) 2006-05-23
AU781676B2 (en) 2005-06-02
US20050192237A1 (en) 2005-09-01
CA2396068A1 (en) 2001-07-12
JP2003518946A (ja) 2003-06-17
WO2001049775A2 (en) 2001-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20020079768A (ko) 안티센스 항박테리아 세포분열 조성물 및 방법
EP1238071B1 (en) Uncharged antisense oligonucleotides targeted to bacterial 16s and 23s rrnas and their uses
US7790694B2 (en) Antisense antibacterial method and compound
EP1915161B1 (en) Antisense antibacterial method and compound
EP1766012B1 (en) Antisense antibacterial method and compound

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid