JP3398378B2 - リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー - Google Patents
リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマーInfo
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Description
【０００１】
本発明の分野
本発明は、モルホリノー基体ポリマーに関する。
【０００２】
文献
アガルヴアル、Proc Nat Acad Sci 85:7079（198
8）． アテンシオ、E.J.,等、（編集者）、Nucleotide Sequ
ences:a compilation from GENBANK and EMBL data lib
raries,第６巻ウイルス、アカデミックプレス（1986−8
7）． バルゴビン、N.,等、テトラヘドロンレター、22:3667
（1981）． ベリコバ、テトラヘドロンレター、37:3557（196
7）． ブラケ等、Biochem,24:6132（1985a）． ブラケ等、Biochem 24:6139（1985b）． ボバー等、Nucleic Acids Res.15:4915（1987）． デクスヒト等、Canadian J Chem,66:2989（1988）． フローラー等、Nucleic Acids Res.16:4831（198
8）． ホックス、J.J.,等、J Am Chem Soc,80:1669（195
8）． ガイト、″オリゴヌクレオチド合成 実験的″アプロ
ーチ″第31−33頁、IRL Press（オックスホード、英
国）（1984）． グリフエン等、Biomed.＆ Environ.Mass Spectrometr
y 17:105（1987）． ゴールドバーグ、M.L.等、酵素学の方法68:206（197
9）． グリーンリー、J Org Chem,49 2632（1984）． グルンスタイン、M.等；68:379（1979）． ヒンメルスバッハ、F.,and W.プスライターラー、テ
トラヘドロンレター、24:3583（1983）． ジェアーマン等、Proc Natl Acad Sci USA 78:1537
（1981）． カミムラ等、Chem Lett（The Chem.Soc.of Japan）p
g.1051（1983） ラプランチ等、Nucleic Acids Res,14:9081（198
6）． レーマン、L.S.,″DNA Probes:Applications in Gene
tic and Infectious Disease and Cancer,″Current Co
mm in Molec Biol（Cold Spring Harbor Laboratory）
（1986）． レトジンガー及びミラー、J Amer Chem Soc,91:3356
（1969）． マイヤ、G.,等、（編集者）、Human Retroviruses an
d AIDS:A compilation and analysis of amino acid an
d nucleic acid sequences,Theoretical Biology and B
iophysics Group,Los Alamos NM（LAUR90−1393）（199
0）． マクブリッジ等、J Amer Chem Soc 108:2040（198
6）． Miller等、Biochemistry 18:5134（1979）． Miller等、J Biol Chem 255:6959（1980）． Miller等、Biochimie 67:769（1985）． Murakami等、Biochemistry 24:4041（1985）． ニードバルラ、U.,及びH.ホルブルゲン、J Org Chem,
39:3668（1974）． ピタ、Biochem Biophys Acta 204:39（1970a）． ピタ、Biopolymers ９:965（1970b）． Reese,C.B.,及びR.S.Saffhill,J Chem Soc Perkintra
ns,１:2937（1972）． スミス等、J.A.C.S.80:6204（1958）． スミス等、Proc Natl Acad Sci USA 83:2787（198
6）． Southern,E.;Methods in Enzymology 68:152（1979） スチルチャク E.P.等、Organic Chem.52:4202（198
7）． サマートン、J.,等、J Molec Biol 122:145（1978） サマートン、J.,等、J Molec Biol 78:61（1979
a）． サマートン、J.,J Molec Biol 78:77（1979b）． スゾスタック、J.W.等、Methods in Enzymology 68:4
19（1979）． トーマス、P.;Methods in Enzymology 100:255（198
3）． トウルメ等、Proc Nat Acad Sci USA,83:1227（198
6）． トリヒチンガー等、テトラヘドロンレター 24:711
（1983）． 本発明の背景 ポリヌクレオチドに塩基−特異的結合するためのポリ
マーは、病原体の特異的な遺伝子配列特徴の試験管内検
出及び多くの疾病−−特にウィルス疾病−−を引き起こ
す遺伝子配列の生体内不活性化の両方に著しい可能性を
有する。
8）． アテンシオ、E.J.,等、（編集者）、Nucleotide Sequ
ences:a compilation from GENBANK and EMBL data lib
raries,第６巻ウイルス、アカデミックプレス（1986−8
7）． バルゴビン、N.,等、テトラヘドロンレター、22:3667
（1981）． ベリコバ、テトラヘドロンレター、37:3557（196
7）． ブラケ等、Biochem,24:6132（1985a）． ブラケ等、Biochem 24:6139（1985b）． ボバー等、Nucleic Acids Res.15:4915（1987）． デクスヒト等、Canadian J Chem,66:2989（1988）． フローラー等、Nucleic Acids Res.16:4831（198
8）． ホックス、J.J.,等、J Am Chem Soc,80:1669（195
8）． ガイト、″オリゴヌクレオチド合成 実験的″アプロ
ーチ″第31−33頁、IRL Press（オックスホード、英
国）（1984）． グリフエン等、Biomed.＆ Environ.Mass Spectrometr
y 17:105（1987）． ゴールドバーグ、M.L.等、酵素学の方法68:206（197
9）． グリーンリー、J Org Chem,49 2632（1984）． グルンスタイン、M.等；68:379（1979）． ヒンメルスバッハ、F.,and W.プスライターラー、テ
トラヘドロンレター、24:3583（1983）． ジェアーマン等、Proc Natl Acad Sci USA 78:1537
（1981）． カミムラ等、Chem Lett（The Chem.Soc.of Japan）p
g.1051（1983） ラプランチ等、Nucleic Acids Res,14:9081（198
6）． レーマン、L.S.,″DNA Probes:Applications in Gene
tic and Infectious Disease and Cancer,″Current Co
mm in Molec Biol（Cold Spring Harbor Laboratory）
（1986）． レトジンガー及びミラー、J Amer Chem Soc,91:3356
（1969）． マイヤ、G.,等、（編集者）、Human Retroviruses an
d AIDS:A compilation and analysis of amino acid an
d nucleic acid sequences,Theoretical Biology and B
iophysics Group,Los Alamos NM（LAUR90−1393）（199
0）． マクブリッジ等、J Amer Chem Soc 108:2040（198
6）． Miller等、Biochemistry 18:5134（1979）． Miller等、J Biol Chem 255:6959（1980）． Miller等、Biochimie 67:769（1985）． Murakami等、Biochemistry 24:4041（1985）． ニードバルラ、U.,及びH.ホルブルゲン、J Org Chem,
39:3668（1974）． ピタ、Biochem Biophys Acta 204:39（1970a）． ピタ、Biopolymers ９:965（1970b）． Reese,C.B.,及びR.S.Saffhill,J Chem Soc Perkintra
ns,１:2937（1972）． スミス等、J.A.C.S.80:6204（1958）． スミス等、Proc Natl Acad Sci USA 83:2787（198
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a）． サマートン、J.,J Molec Biol 78:77（1979b）． スゾスタック、J.W.等、Methods in Enzymology 68:4
19（1979）． トーマス、P.;Methods in Enzymology 100:255（198
3）． トウルメ等、Proc Nat Acad Sci USA,83:1227（198
6）． トリヒチンガー等、テトラヘドロンレター 24:711
（1983）． 本発明の背景 ポリヌクレオチドに塩基−特異的結合するためのポリ
マーは、病原体の特異的な遺伝子配列特徴の試験管内検
出及び多くの疾病−−特にウィルス疾病−−を引き起こ
す遺伝子配列の生体内不活性化の両方に著しい可能性を
有する。
【０００３】
標準のリボ−及びデオキシリボヌクレオチドポリマー
は、相補的遺伝子配列の検出及び比較的最近ではターゲ
ットの遺伝子配列の不活性化の両方に広く使用されてい
る。しかし、標準のポリヌクレオチドは、ターゲットオ
リゴヌクレオチドに塩基−特異的結合するのに使用され
る場合、多くの制限に悩まされている。この制限は、
（ｉ）生体膜を横切る限定された通路、（ii）ヌクレア
ーゼ感受性、（ii）イオン濃度に敏感なターゲット結
合、及び（iv）細胞の標準−分離メカニズムに対する感
受率を含む。
は、相補的遺伝子配列の検出及び比較的最近ではターゲ
ットの遺伝子配列の不活性化の両方に広く使用されてい
る。しかし、標準のポリヌクレオチドは、ターゲットオ
リゴヌクレオチドに塩基−特異的結合するのに使用され
る場合、多くの制限に悩まされている。この制限は、
（ｉ）生体膜を横切る限定された通路、（ii）ヌクレア
ーゼ感受性、（ii）イオン濃度に敏感なターゲット結
合、及び（iv）細胞の標準−分離メカニズムに対する感
受率を含む。
【０００４】
原則的に、上記制限を、塩基が非電荷要素に沿って連
結されるポリ核酸同族体を形成することによって克服し
又は最小化することができる。非電荷核酸同族体の例
は、報告されている。Pitha等（1970a,b）は、核酸の正
常糖−ホスフエート要素をポリビニル要素によって置き
代えられた、種々のホモポリマーポリヌクレオチド同族
体について述べている。これらの核酸同族体は、相補的
ポリヌクレオチドと、しかし実質上減少されたTm値と共
に予想されるワトソン／クリックペアリング特異性を有
すると報告されている（Pitha,1970a）。この研究の１
つの重大な制限は、所望された塩基配列でポリマーを製
造するために、配列サブユニット付加によってポリマー
を構成することができない。かくてポリマーを、選択さ
れたターゲット配列に塩基−特異的結合するのに使用す
ることができない。デオキシリボヌクレオシドサブユニ
ットの間の非電荷の、しかし立体異性のメチルホスホナ
ートリンケージを有するポリヌクレオチド同族体も報告
されている（ミラー,1979,1980,ジェアーマン；ムラカ
ミ；ブラケ,1985a,1985b;スミス）。比較的最近、種々
の非電荷ホスホルアミダート−結合したオリゴヌクレオ
チド同族体も、報告されている（フエーラー,1988）。
これらのポリマーは、非電荷キラルリン−含有基を介し
て１個のサブユニットの３′OH基及び他のサブユニット
の５′OH基で結合したデオキシヌクレオシドを有する。
これらの化合物は、一本鎖ポリヌクレオチドターゲット
配列に結合する及び選択的にブロックすることが分る。
しかし、デオキシリボヌクレオシドフザユニットを用い
て非電荷リン−結合したポリヌクレオチド同族体は特に
高価で、製造が困難である；サブユニット出発材料は、
極めて高価であり、限定された入手可能性を有する。
結されるポリ核酸同族体を形成することによって克服し
又は最小化することができる。非電荷核酸同族体の例
は、報告されている。Pitha等（1970a,b）は、核酸の正
常糖−ホスフエート要素をポリビニル要素によって置き
代えられた、種々のホモポリマーポリヌクレオチド同族
体について述べている。これらの核酸同族体は、相補的
ポリヌクレオチドと、しかし実質上減少されたTm値と共
に予想されるワトソン／クリックペアリング特異性を有
すると報告されている（Pitha,1970a）。この研究の１
つの重大な制限は、所望された塩基配列でポリマーを製
造するために、配列サブユニット付加によってポリマー
を構成することができない。かくてポリマーを、選択さ
れたターゲット配列に塩基−特異的結合するのに使用す
ることができない。デオキシリボヌクレオシドサブユニ
ットの間の非電荷の、しかし立体異性のメチルホスホナ
ートリンケージを有するポリヌクレオチド同族体も報告
されている（ミラー,1979,1980,ジェアーマン；ムラカ
ミ；ブラケ,1985a,1985b;スミス）。比較的最近、種々
の非電荷ホスホルアミダート−結合したオリゴヌクレオ
チド同族体も、報告されている（フエーラー,1988）。
これらのポリマーは、非電荷キラルリン−含有基を介し
て１個のサブユニットの３′OH基及び他のサブユニット
の５′OH基で結合したデオキシヌクレオシドを有する。
これらの化合物は、一本鎖ポリヌクレオチドターゲット
配列に結合する及び選択的にブロックすることが分る。
しかし、デオキシリボヌクレオシドフザユニットを用い
て非電荷リン−結合したポリヌクレオチド同族体は特に
高価で、製造が困難である；サブユニット出発材料は、
極めて高価であり、限定された入手可能性を有する。
【０００５】
より最近では、非電荷のアキラルサブユニットリンケ
ージを有するデオキシリボヌクレオチド同族体が、構成
されている（スチルチャック1987）。これらの非電荷の
アキラルデオキシリボヌクレオシド−誘導された同族体
は、上述の様に、出発材料の比較的高い価格によって制
限される。
ージを有するデオキシリボヌクレオチド同族体が、構成
されている（スチルチャック1987）。これらの非電荷の
アキラルデオキシリボヌクレオシド−誘導された同族体
は、上述の様に、出発材料の比較的高い価格によって制
限される。
【０００６】
本発明の要旨
一つの一般的、本発明の目的は、ポリヌクレオチドへ
の配列−特異的結合を可能にするポリマーを提供し、上
記ポリマーに準じるポリヌクレオチドに関連する多くの
問題及び制限を克服する又は最小化することである。
の配列−特異的結合を可能にするポリマーを提供し、上
記ポリマーに準じるポリヌクレオチドに関連する多くの
問題及び制限を克服する又は最小化することである。
【０００７】
本発明は、次の形：
【０００８】
【化１０】
のモルホリノ環構造を有するポリマーを包含する。
【０００９】
環構造は、１個の環構造のモルホリノ窒素を隣接環構
造の５′エキソ環状炭素に結合する、長さ１〜３個の原
子の、非電荷リン−含有キラルリンケージによって一緒
に連結されている。
造の５′エキソ環状炭素に結合する、長さ１〜３個の原
子の、非電荷リン−含有キラルリンケージによって一緒
に連結されている。
【００１０】
夫々の環構造は、ポリヌクレオチド中でターゲット配
列中の塩基に塩基特異的水素結合によって連結するのに
有効なプリン又はピリミジン残基Piを有する。
列中の塩基に塩基特異的水素結合によって連結するのに
有効なプリン又はピリミジン残基Piを有する。
【００１１】
これら及び他の目的及び本発明の特色は、本発明の次
の詳細な記載が添付された例及び図面と共に読まれた時
に、より一層十分に明らかとなる。
の詳細な記載が添付された例及び図面と共に読まれた時
に、より一層十分に明らかとなる。
【００１２】
図面の簡単な説明
第１図は、塩基性β−モルホリノ環構造を示し、これ
は非電荷の、リン−含有キラルリンケージによって連結
され、本発明のポリマーを形成する。Piはプリン又はピ
リミジン塩基残基である。
は非電荷の、リン−含有キラルリンケージによって連結
され、本発明のポリマーを形成する。Piはプリン又はピ
リミジン塩基残基である。
【００１３】
第２図は、いくつかの典型的なプリン−及びピリミジ
ン塩基残基（第１図中に示される環構造のPiとして表わ
される）を示し、その際Ｘ＝H,CH3,F,Cl,Br又はＩ。
ン塩基残基（第１図中に示される環構造のPiとして表わ
される）を示し、その際Ｘ＝H,CH3,F,Cl,Br又はＩ。
【００１４】
第３図は、ポリマー形成に適する５−原子（Ａ）,6−
原子（Ｂ）及び７−原子（Ｃ−Ｅ）連結基を有するいく
つかの好ましいサブユニットを示す。この際Ｘ＝−CH
2R,−Ｏ−CH2R,−Ｓ−CH2R,−NR1R2,又はF,CH3,又はタ
ーゲット結合を妨害しない他の部分。R1及びR2は、
（ｉ）同一又は異なり、（ii）Ｒ又は脂環式又は芳香族
部分から選択されてよい。Y1＝O,S,CH2,又はNR。Y2＝O,
S,又はCH2,Y3＝O,S,又はNR。Ｚ＝Ｏ又はＳ。
原子（Ｂ）及び７−原子（Ｃ−Ｅ）連結基を有するいく
つかの好ましいサブユニットを示す。この際Ｘ＝−CH
2R,−Ｏ−CH2R,−Ｓ−CH2R,−NR1R2,又はF,CH3,又はタ
ーゲット結合を妨害しない他の部分。R1及びR2は、
（ｉ）同一又は異なり、（ii）Ｒ又は脂環式又は芳香族
部分から選択されてよい。Y1＝O,S,CH2,又はNR。Y2＝O,
S,又はCH2,Y3＝O,S,又はNR。Ｚ＝Ｏ又はＳ。
【００１５】
第４図は、典型的なモルホリノ−基体ポリマーのくり
返しサブユニットセグメントを示し、これは第３図の、
サブユニットＡ−Ｅ夫々を用いて構成され、Ａ−Ａから
Ｅ−Ｅで表わされる。X,Y,及びＺは第３図中と同じであ
る。Pi及びPjは、プリン又はピリミジン塩基残基であ
る。
返しサブユニットセグメントを示し、これは第３図の、
サブユニットＡ−Ｅ夫々を用いて構成され、Ａ−Ａから
Ｅ−Ｅで表わされる。X,Y,及びＺは第３図中と同じであ
る。Pi及びPjは、プリン又はピリミジン塩基残基であ
る。
【００１６】
第５図は、リボヌクレオシドからいくつかのタイプの
モルホリノサブユニットを合成する工程を示す。
モルホリノサブユニットを合成する工程を示す。
【００１７】
第６図は、塩基性モルホリノサブユニットの別の合成
を示す。
を示す。
【００１８】
第７図は、７−原子くり返し−単位要素を有するポリ
マーの構造で示されるモルホリノサブユニットを合成す
る工程を示す。
マーの構造で示されるモルホリノサブユニットを合成す
る工程を示す。
【００１９】
第８図は、２−アミン−含有プリンの夫々のターゲッ
ト塩基−対の極性主要−溝基（第8a図）及び二重−結合
ポリマーの代表的塩基配列（第8b図）への結合様式を示
す。第8b図中、ａ＝アデニン;c＝チトシン;g＝グアニ
ン;t＝チミン;u＝ウラシル;D＝2,6−ジアミノプリン又
は２−アミノプリン;G＝グアニン又はチオグアニン;l＝
高特異性水素結合；及び：＝低特異性水素結合。
ト塩基−対の極性主要−溝基（第8a図）及び二重−結合
ポリマーの代表的塩基配列（第8b図）への結合様式を示
す。第8b図中、ａ＝アデニン;c＝チトシン;g＝グアニ
ン;t＝チミン;u＝ウラシル;D＝2,6−ジアミノプリン又
は２−アミノプリン;G＝グアニン又はチオグアニン;l＝
高特異性水素結合；及び：＝低特異性水素結合。
【００２０】
第９図は、ホスホンアミドリンケージによって２個の
モルホリノサブユニットを連結する工程を示す。
モルホリノサブユニットを連結する工程を示す。
【００２１】 第10図は、ホスホルアミダートリンケー
ジによってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
ジによってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
【００２２】第11図は、ホスホンエステルリンケージに
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
【００２３】第12図は、モルホリノ環構造を同時に生じ
るサブユニットカップリング操作を示す。
るサブユニットカップリング操作を示す。
【００２４】第13図は、（モルホリノ）（６）6/ポリ
（Ｇ）複合に関する末端変性プロットを示し、そこで
（モルホリノ）（Ｃ）６ポリマーを、本発明に従って構
成する。
（Ｇ）複合に関する末端変性プロットを示し、そこで
（モルホリノ）（Ｃ）６ポリマーを、本発明に従って構
成する。
【００２５】
第14図は、プローブ−診断システム中でモルホリノポ
リマーの使用を示す。
リマーの使用を示す。
【００２６】
本発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチドのターゲット配列に塩基
−特異的結合するためのモルホリノ−基体ポリマーを含
む。このポリマーは、モルホリノ−基体環構造から成
り、この構造は隣接構造の５′オキソ環状炭素に１つの
構造のモルホリノ窒素を接続する、長さ１又は３個の原
子の、非電荷の、キラルリンケージによって一緒に連結
する。
−特異的結合するためのモルホリノ−基体ポリマーを含
む。このポリマーは、モルホリノ−基体環構造から成
り、この構造は隣接構造の５′オキソ環状炭素に１つの
構造のモルホリノ窒素を接続する、長さ１又は３個の原
子の、非電荷の、キラルリンケージによって一緒に連結
する。
【００２７】
A.モルホリノ−基体サブユニット
第１図は、ポリマーサブユニットを基体とするβ−モ
ルホリノ環構造を示す。そこでモルホリノ炭素原子に、
親リボースに於ける様に番号をつける。第１図中に見ら
れる様に、環構造はβ−配向で４′炭素に結合する５′
−メチレンを有する。
ルホリノ環構造を示す。そこでモルホリノ炭素原子に、
親リボースに於ける様に番号をつける。第１図中に見ら
れる様に、環構造はβ−配向で４′炭素に結合する５′
−メチレンを有する。
【００２８】
夫々の環構造は、プリン又はピリミジンあるいは関連
する水素−結合部分、β−配向でリンケージによって骨
格モルホリン部分に結合するPiを有する。
する水素−結合部分、β−配向でリンケージによって骨
格モルホリン部分に結合するPiを有する。
【００２９】
プリン水素−結合部分又は塩基は、プリン及び原子１
又は数個、たとえばN3,N7,又はN9が適当な原子、たとえ
ば炭素によって、又はC8は窒素によって代えられる５−
６員縮合環を有するプリン−様プレーナー環構造を有す
る。ピリミジン部分も同様に、ピリミジン及び原子１又
は数個、たとえばN1が適する原子、たとえば炭素によっ
て代えられるピリミジン−様プラナー６−員環を有す
る。本発明に於て、好ましい水素−結合部分は、第２図
中に示される一連のプリン及びピリミジンを有する。夫
々の塩基は、ポリヌクレオチド塩基又は塩基−対に特異
的な、水素−結合部位少なくとも２個を有する。ポリマ
ーを一本鎖ポリヌクレオチドへの配列−特異的に結合に
使用する場合、プリン構造１から３はチアミン又はウラ
シル塩基に；構造７−８はグアニン塩基に、構造４−６
はチトシン塩基；及び構造９はアデニン塩基に結合す
る。
又は数個、たとえばN3,N7,又はN9が適当な原子、たとえ
ば炭素によって、又はC8は窒素によって代えられる５−
６員縮合環を有するプリン−様プレーナー環構造を有す
る。ピリミジン部分も同様に、ピリミジン及び原子１又
は数個、たとえばN1が適する原子、たとえば炭素によっ
て代えられるピリミジン−様プラナー６−員環を有す
る。本発明に於て、好ましい水素−結合部分は、第２図
中に示される一連のプリン及びピリミジンを有する。夫
々の塩基は、ポリヌクレオチド塩基又は塩基−対に特異
的な、水素−結合部位少なくとも２個を有する。ポリマ
ーを一本鎖ポリヌクレオチドへの配列−特異的に結合に
使用する場合、プリン構造１から３はチアミン又はウラ
シル塩基に；構造７−８はグアニン塩基に、構造４−６
はチトシン塩基；及び構造９はアデニン塩基に結合す
る。
【００３０】
本発明のポリマーは、以下に説明する様に、一本鎖中
にほとんどプリン塩基及び相補的鎖中にほとんどピリミ
ジン塩基を有する二重ポリヌクレオチド中で主要−溝に
よって接近可能な水素−結合部位と結合するのに有利で
ある。
にほとんどプリン塩基及び相補的鎖中にほとんどピリミ
ジン塩基を有する二重ポリヌクレオチド中で主要−溝に
よって接近可能な水素−結合部位と結合するのに有利で
ある。
【００３１】
二重核酸の様々の塩基−対中で２個の中央極性主要−
溝部位の類似タイプ及び位置に基づき（すなわちCG塩基
−対のNH6及び04はAT−塩基−対のNH6および04として同
一Ｈ−結合配列を提示する。）、二重−結合ポリマーの
Ｈ−結合部分は、ターゲット遺伝子二重体中に一定の塩
基対を特有に認めるために、そのターゲット塩基−対の
N7への水素−結合がなければならない。かくて、一方の
鎖に主にプリン及びもう一方の鎖にピリミジンを有する
二重遺伝子配列をターゲットとする本発明のポリマーに
於て、ポリマーの水素−結合部分は２位にアミンを有す
るプリンを含有するのが好ましい。というのはそのアミ
ンをターゲット塩基−対のN7へのＨ−結合に対して位置
づけるのが適当であるからである。より特異的に、第２
図の構造２のよび３は、TA又はUA塩基−対への特異的結
合を提供し、一方構造４及び６はCG塩基−対への特異的
結合を提供する。二重−結合ポリマー中で特に有用であ
る２個の塩基は、2,6−ジアミノプリン（構造３）及び
グアニン（構造４）である。第8A図は、この２個の塩基
が二重核酸中でその夫々のターゲット塩基対の極性主要
−溝への結合を示す。第8B図は、二重状態でターゲット
遺伝子配列を結合するポリマーの代表的な塩基配列を示
す。
溝部位の類似タイプ及び位置に基づき（すなわちCG塩基
−対のNH6及び04はAT−塩基−対のNH6および04として同
一Ｈ−結合配列を提示する。）、二重−結合ポリマーの
Ｈ−結合部分は、ターゲット遺伝子二重体中に一定の塩
基対を特有に認めるために、そのターゲット塩基−対の
N7への水素−結合がなければならない。かくて、一方の
鎖に主にプリン及びもう一方の鎖にピリミジンを有する
二重遺伝子配列をターゲットとする本発明のポリマーに
於て、ポリマーの水素−結合部分は２位にアミンを有す
るプリンを含有するのが好ましい。というのはそのアミ
ンをターゲット塩基−対のN7へのＨ−結合に対して位置
づけるのが適当であるからである。より特異的に、第２
図の構造２のよび３は、TA又はUA塩基−対への特異的結
合を提供し、一方構造４及び６はCG塩基−対への特異的
結合を提供する。二重−結合ポリマー中で特に有用であ
る２個の塩基は、2,6−ジアミノプリン（構造３）及び
グアニン（構造４）である。第8A図は、この２個の塩基
が二重核酸中でその夫々のターゲット塩基対の極性主要
−溝への結合を示す。第8B図は、二重状態でターゲット
遺伝子配列を結合するポリマーの代表的な塩基配列を示
す。
【００３２】
主に２−アミン−含有プリンを含有し、しかも二重遺
伝子配列の極性主要−溝部位への高−特異性結合に適す
るポリマーは、モルホリノ−基体骨格に加えて、他の骨
格を用いてそのターゲットとされる遺伝子二重体への有
効な結合を提供することができる。この様な他の骨格の
例は、ホスホジエステル−結合されたデオキシリボヌク
レオシドを有し、そこでリン上のペンダント基は次のも
のの１つである：負に電荷した酸素（すなわち天然DNA
骨格）；メチル又は他のアルキル基（アルキルホスホナ
ートと呼ばれる）；メトキシ又は他のアルコキシ基（ホ
スホトリエステルと呼ばれる）；又はモノ−又はジアル
キルアミン（ホスホルアミダートと呼ばれる）。この二
重−結合ポリマーに対する他の骨格は上述の様にリン上
にペンダント基を有する及び２′−酸素上にメチルを有
する又は有しないホスホジエステル−結合されたリボヌ
クレオシドも有する。
伝子配列の極性主要−溝部位への高−特異性結合に適す
るポリマーは、モルホリノ−基体骨格に加えて、他の骨
格を用いてそのターゲットとされる遺伝子二重体への有
効な結合を提供することができる。この様な他の骨格の
例は、ホスホジエステル−結合されたデオキシリボヌク
レオシドを有し、そこでリン上のペンダント基は次のも
のの１つである：負に電荷した酸素（すなわち天然DNA
骨格）；メチル又は他のアルキル基（アルキルホスホナ
ートと呼ばれる）；メトキシ又は他のアルコキシ基（ホ
スホトリエステルと呼ばれる）；又はモノ−又はジアル
キルアミン（ホスホルアミダートと呼ばれる）。この二
重−結合ポリマーに対する他の骨格は上述の様にリン上
にペンダント基を有する及び２′−酸素上にメチルを有
する又は有しないホスホジエステル−結合されたリボヌ
クレオシドも有する。
【００３３】
本発明のモルホリノサブユニットを一緒にし、サブユ
ニットを安定な、キラル、非電荷リンケージで連結する
ことによってポリマーを形成する。サブユニットの連結
基は、リン−含有求電子試薬を有し、通常これを連結し
うるサブユニットの求核試薬と反応させる。
ニットを安定な、キラル、非電荷リンケージで連結する
ことによってポリマーを形成する。サブユニットの連結
基は、リン−含有求電子試薬を有し、通常これを連結し
うるサブユニットの求核試薬と反応させる。
【００３４】
ポリマー合成に使用するためのサブユニット結合基の
選択は、いくつかの考慮によって導かれる。有望なイン
ターサブユニットリンケージの最初のスクリーニング
（すなわち不安定にならないことを予測し、リンケージ
のまわりを自由に回転するか又は単一コンホーメーショ
ンで存在する、これらのリンケージ）は、空間−充填CP
Kの又は二重DNA又はRNAのコンピュータ分子モデルの使
用を伴う。DNA及びRNA二重体は、Ｂ−型でオリゴデオキ
シリボヌクレオチド及びＡ−型でオリゴリボヌクレオチ
ド−含有二重体のＸ−線回析によって決定されたパラメ
ーターに従って構成される。
選択は、いくつかの考慮によって導かれる。有望なイン
ターサブユニットリンケージの最初のスクリーニング
（すなわち不安定にならないことを予測し、リンケージ
のまわりを自由に回転するか又は単一コンホーメーショ
ンで存在する、これらのリンケージ）は、空間−充填CP
Kの又は二重DNA又はRNAのコンピュータ分子モデルの使
用を伴う。DNA及びRNA二重体は、Ｂ−型でオリゴデオキ
シリボヌクレオチド及びＡ−型でオリゴリボヌクレオチ
ド−含有二重体のＸ−線回析によって決定されたパラメ
ーターに従って構成される。
【００３５】
この構成された二重体の夫々は、２つの糖ホスフアー
ト骨格の１つを除き、モルホリノ環及びインターサブユ
ニットリンケージを含む予期される骨格を、可能な場合
本来の糖−ホスフアート骨格が除かれた塩基の部位で置
き代える。次いで夫々の生じるポリヌクレオチド／ポリ
マー二重体を、ワトソン／クリック塩基対の共平面性、
予期される結合ポリマー骨格中のねじれ及び角ひずみ、
核酸鎖上に加わるゆがみの度合、及び内部鎖及び外部鎖
の非結合相互作用に関して測定する。本発明に支持され
て行われるこのタイプの最初の研究は、モノホリノ−基
体ポリマーが、６個の原子の好ましい単位骨格の長さ
（すなわちポリマー中のくり返し骨格鎖中の原子の数）
を有することを示す。しかしモデル研究は、一定の５−
原子及び７−原子くり返し−単位モノホリノ−基体骨格
がターゲットにされた遺伝子配列への結合に対する要求
を満たすことも示す。
ト骨格の１つを除き、モルホリノ環及びインターサブユ
ニットリンケージを含む予期される骨格を、可能な場合
本来の糖−ホスフアート骨格が除かれた塩基の部位で置
き代える。次いで夫々の生じるポリヌクレオチド／ポリ
マー二重体を、ワトソン／クリック塩基対の共平面性、
予期される結合ポリマー骨格中のねじれ及び角ひずみ、
核酸鎖上に加わるゆがみの度合、及び内部鎖及び外部鎖
の非結合相互作用に関して測定する。本発明に支持され
て行われるこのタイプの最初の研究は、モノホリノ−基
体ポリマーが、６個の原子の好ましい単位骨格の長さ
（すなわちポリマー中のくり返し骨格鎖中の原子の数）
を有することを示す。しかしモデル研究は、一定の５−
原子及び７−原子くり返し−単位モノホリノ−基体骨格
がターゲットにされた遺伝子配列への結合に対する要求
を満たすことも示す。
【００３６】
モルホリノ構造それ自体が、４個の原子を夫々のくり
返し骨格単位に分配するので、５−原子、６−原子、及
び６−原子くり返し−単位骨格中のリンケージは、夫々
1,2,及び３個の原子を骨格の長さに分配する。すべての
場合、環構造間のリンケージは、（ａ）非電荷、（ｂ）
キラル、（ｃ）安定であり、及び（ｄ）ターゲットポリ
ヌクレオチドに結合するのに適するコンホメーションの
採用を許可しなければならない。
返し骨格単位に分配するので、５−原子、６−原子、及
び６−原子くり返し−単位骨格中のリンケージは、夫々
1,2,及び３個の原子を骨格の長さに分配する。すべての
場合、環構造間のリンケージは、（ａ）非電荷、（ｂ）
キラル、（ｃ）安定であり、及び（ｄ）ターゲットポリ
ヌクレオチドに結合するのに適するコンホメーションの
採用を許可しなければならない。
【００３７】
次いで上記モデル研究に於て満足な判断を受けたサブ
ユニット骨格構造を、合成の容易度で決める。インター
サブユニットリンケージの実際の化学安定性は、しばし
ばモデル化合物又は二量体を用いて決める。
ユニット骨格構造を、合成の容易度で決める。インター
サブユニットリンケージの実際の化学安定性は、しばし
ばモデル化合物又は二量体を用いて決める。
【００３８】
第３図は、上記概略を述べた制限及び要求を満たすリ
ンケージ基を有するいくつかの好ましいβ−モルホリノ
サブユニットタイプを示す。ポリマーが１より多くのリ
ンケージタイプを有するのが好ましい。
ンケージ基を有するいくつかの好ましいβ−モルホリノ
サブユニットタイプを示す。ポリマーが１より多くのリ
ンケージタイプを有するのが好ましい。
【００３９】
第３図中のサブユニットＡは、第４図中にＡ−Ａで示
されたくり返し単位骨格を形成する１−原子リン含有リ
ンケージを有する。そこではモルホリノ環を１−原子ホ
スホンアミドリンケージによって結合する。対応するキ
ラルチオニル−含有リンケージ（リン−含有基でＳ＝Ｏ
部分を置換している）は、水性溶液中で不十分な安定性
を有することが分ったことをここに述べる。
されたくり返し単位骨格を形成する１−原子リン含有リ
ンケージを有する。そこではモルホリノ環を１−原子ホ
スホンアミドリンケージによって結合する。対応するキ
ラルチオニル−含有リンケージ（リン−含有基でＳ＝Ｏ
部分を置換している）は、水性溶液中で不十分な安定性
を有することが分ったことをここに述べる。
【００４０】
第３図中にサブユニットＢを、第４図中のＢ−Ｂで示
した様に６−原子くり返し単位骨格で示す。構造Ｂに於
て、５′モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙは、
イオウ、窒素、炭素又は、好ましくは、酸素であってよ
い。リンから伸びたＸ部分は次のもののどれかであって
よい：フッ素；アルキル又は置換されたアルキル；アル
コキシ又は置換されたアルコキシ；チオアルコキシ又は
置換されたチオアルコキシ；又は非置換、モノ置換、又
はジ置換された窒素、これらは環状構造を含む。Ｘ部分
に適するいくつかの環状置換された窒素はモルホリン、
ピロール、及びピラゾールである。
した様に６−原子くり返し単位骨格で示す。構造Ｂに於
て、５′モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙは、
イオウ、窒素、炭素又は、好ましくは、酸素であってよ
い。リンから伸びたＸ部分は次のもののどれかであって
よい：フッ素；アルキル又は置換されたアルキル；アル
コキシ又は置換されたアルコキシ；チオアルコキシ又は
置換されたチオアルコキシ；又は非置換、モノ置換、又
はジ置換された窒素、これらは環状構造を含む。Ｘ部分
に適するいくつかの環状置換された窒素はモルホリン、
ピロール、及びピラゾールである。
【００４１】
第３図中のサブユニットＣ−Ｅを、第４図中にＣ−Ｃ
からＥ−Ｅでしめされている様に７−原子単位−長さの
骨格で表わされる。構造Ｃ中で、Ｘ部分は構造Ｂに於け
るのと同一であり、部分Ｙはメチレン、イオウ、又は好
ましくは酸素であってよい。構造Ｄ中、Ｘ及びＹ部分は
構造Ｂ中に於けると同一である。構造Ｅ中、Ｘは構造Ｂ
中に於けると同一であり、ＹはO,S,又はNRである。
からＥ−Ｅでしめされている様に７−原子単位−長さの
骨格で表わされる。構造Ｃ中で、Ｘ部分は構造Ｂに於け
るのと同一であり、部分Ｙはメチレン、イオウ、又は好
ましくは酸素であってよい。構造Ｄ中、Ｘ及びＹ部分は
構造Ｂ中に於けると同一である。構造Ｅ中、Ｘは構造Ｂ
中に於けると同一であり、ＹはO,S,又はNRである。
【００４２】
B.サブユニット合成
モルホリノ−サブユニットの合成に最も経済的な出発
材料は、一般にリボヌクレオシドである。一般に、水−
結合部分又は塩基（たとえばA,U,G,C）を含有するリボ
ヌクレオシドを合成して、ポリマー合成のためのサブユ
ニットの完全な一組を提供する。適するリボヌクレオシ
ドは入手できないので、１−ハロリボース又は、好まし
くは、１α−ブロモグルコース誘導体を適する塩基に結
合することができ、次いでこのヌクレオシド同族体を所
望のβ−モルホリノ構造にペリオダート開裂を介して変
え、次いで適するアミン上で生じるジアルデヒドを閉環
することができる。
材料は、一般にリボヌクレオシドである。一般に、水−
結合部分又は塩基（たとえばA,U,G,C）を含有するリボ
ヌクレオシドを合成して、ポリマー合成のためのサブユ
ニットの完全な一組を提供する。適するリボヌクレオシ
ドは入手できないので、１−ハロリボース又は、好まし
くは、１α−ブロモグルコース誘導体を適する塩基に結
合することができ、次いでこのヌクレオシド同族体を所
望のβ−モルホリノ構造にペリオダート開裂を介して変
え、次いで適するアミン上で生じるジアルデヒドを閉環
することができる。
【００４３】
サブユニット合成、活性化、及び／又はカップリング
に使用される化合物の反応性のために、塩基のオキソ環
状窒素を保護に通常望まれ、かつしばしば必要である。
この保護基の選択を、（ｉ）保護されるべき窒素の比反
応性、（ii）サブユニット合成及びカップリングに関係
する反応のタイプ、及び（iii）塩基脱保護の前に完成
されたポリマーの安定性によって決定する。
に使用される化合物の反応性のために、塩基のオキソ環
状窒素を保護に通常望まれ、かつしばしば必要である。
この保護基の選択を、（ｉ）保護されるべき窒素の比反
応性、（ii）サブユニット合成及びカップリングに関係
する反応のタイプ、及び（iii）塩基脱保護の前に完成
されたポリマーの安定性によって決定する。
【００４４】
多くのより普通のリボヌクレオシドを塩基保護する方
法を、例１中に示す。例中に詳述された方法は、一般に
アミン−保護基を有するヌクレオシドを形成するのに利
用できる。核酸化学に使用される標準の塩基−保護基
は、しばしば好ましくは次のグループに含まれる:CのN4
に関するベンゾイル；アデニン（Ａ）のN6に関するベン
ゾイル又はｐ−ニトロベンベイル；グアニン（Ｇ）のN2
に関するアセチル、フエニルアセチル又はイソブチリ
ル；及び2,6−ジアミノプリン残基に関するN2,N6−ビス
（イソブチリル）。この保護基を、水酸化アンモニウム
で処理してポリマーを集めた後に除くことができる。
法を、例１中に示す。例中に詳述された方法は、一般に
アミン−保護基を有するヌクレオシドを形成するのに利
用できる。核酸化学に使用される標準の塩基−保護基
は、しばしば好ましくは次のグループに含まれる:CのN4
に関するベンゾイル；アデニン（Ａ）のN6に関するベン
ゾイル又はｐ−ニトロベンベイル；グアニン（Ｇ）のN2
に関するアセチル、フエニルアセチル又はイソブチリ
ル；及び2,6−ジアミノプリン残基に関するN2,N6−ビス
（イソブチリル）。この保護基を、水酸化アンモニウム
で処理してポリマーを集めた後に除くことができる。
【００４５】
ときどき、求核塩基以外のものによって容易に除くこ
とができる基でモルホリノサブユニットの塩基部分を保
護することが望ましい。β−脱離メカニズムを介して強
い非−求核塩基によって除かれる、適当な塩基保護基は
次のものを含む:CのN4及びＡのN6の両方に関する２−
（４−ニトロフエニル）エトキシカルボニル又は２−
（フエニルスルホニル）エトキシカルボニル；及びＧの
N2に関する９−フルオレニルメトキシカルボニル及び2,
6−ジアミノプリンのN2及びN6。ポリマーをきびしい無
水条件下に、強い非求核塩基1,8−ジアザビシクロ〔5.
4.0〕−ウンデセ−７−エン（DBU）で処理して集めた
後、これらの基を除去することができる。
とができる基でモルホリノサブユニットの塩基部分を保
護することが望ましい。β−脱離メカニズムを介して強
い非−求核塩基によって除かれる、適当な塩基保護基は
次のものを含む:CのN4及びＡのN6の両方に関する２−
（４−ニトロフエニル）エトキシカルボニル又は２−
（フエニルスルホニル）エトキシカルボニル；及びＧの
N2に関する９−フルオレニルメトキシカルボニル及び2,
6−ジアミノプリンのN2及びN6。ポリマーをきびしい無
水条件下に、強い非求核塩基1,8−ジアザビシクロ〔5.
4.0〕−ウンデセ−７−エン（DBU）で処理して集めた
後、これらの基を除去することができる。
【００４６】
代表的なモルホリノサブユニットの合成を、特に例２
−７中に記載する。第５図中に描かれた合成式に関し
て、塩基−保護されたリボヌチレオシドとナトリウムペ
リオダートとを反応させ、中間体２′,3′−ジアルデヒ
ドを形成し、これはその時アンモニアによって閉環し、
２′及び３′ヒドロキシル基（親リボースに於ける様に
番号づける、第１図参照）を形成する。次いで化合物を
ナトリウムシアノボロヒドリドで処理し、環ヒドロキシ
ル基を還元する。環窒素をトリチル誘導化によって又は
次のサブユニットカップリングに対するベンズヒドラー
ルオキシカルボニル基によって保護するのが好ましい。
保護基を、モルホリノサブユニットとトリチルクロライ
ドと又はニトロフエニルベンズヒドリルカルボナートと
の反応によってあるいはジアルデヒドと第一アミンとの
反応によって、第６図中に示されかつ例３及び５に記載
される様に付加することができる。ヌクレオシド出発材
料の立体化学は、イミニウム段階で反応混合物のphが約
10以上又は約４以下にならない限り保たれる。
−７中に記載する。第５図中に描かれた合成式に関し
て、塩基−保護されたリボヌチレオシドとナトリウムペ
リオダートとを反応させ、中間体２′,3′−ジアルデヒ
ドを形成し、これはその時アンモニアによって閉環し、
２′及び３′ヒドロキシル基（親リボースに於ける様に
番号づける、第１図参照）を形成する。次いで化合物を
ナトリウムシアノボロヒドリドで処理し、環ヒドロキシ
ル基を還元する。環窒素をトリチル誘導化によって又は
次のサブユニットカップリングに対するベンズヒドラー
ルオキシカルボニル基によって保護するのが好ましい。
保護基を、モルホリノサブユニットとトリチルクロライ
ドと又はニトロフエニルベンズヒドリルカルボナートと
の反応によってあるいはジアルデヒドと第一アミンとの
反応によって、第６図中に示されかつ例３及び５に記載
される様に付加することができる。ヌクレオシド出発材
料の立体化学は、イミニウム段階で反応混合物のphが約
10以上又は約４以下にならない限り保たれる。
【００４７】
上記合成は、入手可能な５′−ヒドロキシルを有する
モルホリノ−環を生じる。５′−ヒドロキシルを、５′
アミン及びスルフヒドラール（例６）又は５′ホスホナ
ート（例４）を含む他の活性基に変えることができる。
モルホリノ−環を生じる。５′−ヒドロキシルを、５′
アミン及びスルフヒドラール（例６）又は５′ホスホナ
ート（例４）を含む他の活性基に変えることができる。
【００４８】
上記モルホリノ合成で、種々の窒素源を使用すること
ができる−−特にアンモニア、水酸化アンモニウム、炭
酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムが挙げられ
る。最良の結果が、反応溶液を酸化及びモルホリノ環閉
環反応の間ほぼ中性を保つ場合に得られる。これは連続
的に反応混合物を滴定して又はより一層好都合にアンモ
ニア起源としてアンモニアビボラートを用いて行うこと
ができる。溶液があまりにも酸性である場合、生成物の
収量は低く、そしてあまりにも塩基性である場合、副生
成物（恐らく１′及び／又は４′炭素のエピマー化に基
づき）を生じ、これは所望の生成物から分離するのが困
難である。還元剤を、酸化工程の前、その間、又はその
後、生成物収量に関してほとんど注目されない効果と共
に添加することができる。
ができる−−特にアンモニア、水酸化アンモニウム、炭
酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムが挙げられ
る。最良の結果が、反応溶液を酸化及びモルホリノ環閉
環反応の間ほぼ中性を保つ場合に得られる。これは連続
的に反応混合物を滴定して又はより一層好都合にアンモ
ニア起源としてアンモニアビボラートを用いて行うこと
ができる。溶液があまりにも酸性である場合、生成物の
収量は低く、そしてあまりにも塩基性である場合、副生
成物（恐らく１′及び／又は４′炭素のエピマー化に基
づき）を生じ、これは所望の生成物から分離するのが困
難である。還元剤を、酸化工程の前、その間、又はその
後、生成物収量に関してほとんど注目されない効果と共
に添加することができる。
【００４９】
リボヌクレオシド欠損塩基保護基を、酸化し、閉環
し、水性溶液中で還元して、モルホリノ環を生じるのこ
ともうまくゆく。しかし塩基保護せずに、所望されない
副生成物の数及び量はしばしば、特にシチジンの場合に
増加する。
し、水性溶液中で還元して、モルホリノ環を生じるのこ
ともうまくゆく。しかし塩基保護せずに、所望されない
副生成物の数及び量はしばしば、特にシチジンの場合に
増加する。
【００５０】
上記方法によって形成されるサブユニットは、５′−
OH,SH又は変性され、以下に記載する様に反応させ及び
／又は活性化して、第二モルホリノサブユニットへのカ
ップリングに適するアミンを含有する。たとえば、第５
図は、モルホリノサブユニットの５′−OHをホスホニル
結合部分に変えて、５−原子単位長さの骨格ポリマーを
形成するサブユニット（構造10）を形成することを示
す。サブユニット合成の詳細を、例４中に示す。チオホ
スホニル結合部分に対する変性も記載する。
OH,SH又は変性され、以下に記載する様に反応させ及び
／又は活性化して、第二モルホリノサブユニットへのカ
ップリングに適するアミンを含有する。たとえば、第５
図は、モルホリノサブユニットの５′−OHをホスホニル
結合部分に変えて、５−原子単位長さの骨格ポリマーを
形成するサブユニット（構造10）を形成することを示
す。サブユニット合成の詳細を、例４中に示す。チオホ
スホニル結合部分に対する変性も記載する。
【００５１】
その代りに、サブユニットを、モルホリノ環窒素に直
接又は間接的に結合されたリン−含有基を有する様に作
る。この窒素を、第二モルホリノサブユニットの５′部
分に結合させる（第７図）。このタイプのサブユニット
は、７−原子くり返し単位骨格を有するモルホリノポリ
マーを構成するのに適する。
接又は間接的に結合されたリン−含有基を有する様に作
る。この窒素を、第二モルホリノサブユニットの５′部
分に結合させる（第７図）。このタイプのサブユニット
は、７−原子くり返し単位骨格を有するモルホリノポリ
マーを構成するのに適する。
【００５２】
７−原子単位−長さ骨格に適するサブユニットの合成
の例は、例５中に詳述する（第７図に関係する）。
の例は、例５中に詳述する（第７図に関係する）。
【００５３】
例７ち、第３図の構造Ｅに関連して、ポリマー集合の
間モルホリノ構造に変えられる非−モルホリノサブユニ
ットの製造を記載する。
間モルホリノ構造に変えられる非−モルホリノサブユニ
ットの製造を記載する。
【００５４】
C.活性化及びカップリング反応
上記の様に製造されたサブユニットを、制限された連
続方法で、しばしば例９中に記載した様にサブユニット
１個の５′ヒドロキシルを活性化して、この活性化され
たサブユニットを非保護モルホリノ窒素を有する他のサ
ブユニットと接触させてカップリングする。リンケージ
の種々のタイプ、たとえば下記のものを、単一ポリマー
の構成中に使用することが認められる。
続方法で、しばしば例９中に記載した様にサブユニット
１個の５′ヒドロキシルを活性化して、この活性化され
たサブユニットを非保護モルホリノ窒素を有する他のサ
ブユニットと接触させてカップリングする。リンケージ
の種々のタイプ、たとえば下記のものを、単一ポリマー
の構成中に使用することが認められる。
【００５５】
最も簡単なモルホリノ−タイプ結合ポリマーは、カル
バマート−連結ポリマーであり、そこでモルホリノ窒素
を、他のサブユニットの５′酸素にカルボニルによって
結合する。本発明に従って行われる実験は、このような
ポリマーは、一本−鎖DNAターゲット配列に有効に結合
することを示す。しかし、RNAターゲットを用いる結合
研究で、ポリマーは、通常でない結合を示し、このこと
は320ないし230nmスペクトル範囲で高い非定型の淡色性
側面によって証明される。
バマート−連結ポリマーであり、そこでモルホリノ窒素
を、他のサブユニットの５′酸素にカルボニルによって
結合する。本発明に従って行われる実験は、このような
ポリマーは、一本−鎖DNAターゲット配列に有効に結合
することを示す。しかし、RNAターゲットを用いる結合
研究で、ポリマーは、通常でない結合を示し、このこと
は320ないし230nmスペクトル範囲で高い非定型の淡色性
側面によって証明される。
【００５６】
初期のモデル研究は、Ｂ−コンポメーション中に存在
するDNAへのカーバマート−連結ポリマー結合に於て、
ポリマーの骨格は結合に適した長さを提供し、ポリマー
骨格のカーバマート部分は、ほとんどプレーナーコンホ
メーションを推測することができることを示す。このモ
デルの結果は、DNAへのカーバマート−連結ポリマーの
有効な結合に良好に一致した。対照的に、類似のモデル
研究は、RNAターゲットへのカーバマート−連結ポリマ
ーの結合が次の１つを要求することを提案する：（ｉ）
ポリマーのカーバマートリンケージは、実質上ノンプラ
ーナーコンホメーションを採用する、又は（ii）RNAタ
ーゲット配列は、塩基−スタッキング相互作用が標準Ａ
コンホメーション中のそれと全く異なっているひずんだ
コンホマーションを採用する。この観察は、カーバマー
ト−連結ポリマーのRNAターゲット配列への非定型結合
を説明する。
するDNAへのカーバマート−連結ポリマー結合に於て、
ポリマーの骨格は結合に適した長さを提供し、ポリマー
骨格のカーバマート部分は、ほとんどプレーナーコンホ
メーションを推測することができることを示す。このモ
デルの結果は、DNAへのカーバマート−連結ポリマーの
有効な結合に良好に一致した。対照的に、類似のモデル
研究は、RNAターゲットへのカーバマート−連結ポリマ
ーの結合が次の１つを要求することを提案する：（ｉ）
ポリマーのカーバマートリンケージは、実質上ノンプラ
ーナーコンホメーションを採用する、又は（ii）RNAタ
ーゲット配列は、塩基−スタッキング相互作用が標準Ａ
コンホメーション中のそれと全く異なっているひずんだ
コンホマーションを採用する。この観察は、カーバマー
ト−連結ポリマーのRNAターゲット配列への非定型結合
を説明する。
【００５７】
更に、モデル研究は、カルボニルインターサブユニッ
ト結合部分をアキラルスルホニル−含有インターサブユ
ニットリンケージかアキラルリン−含有リンケージのど
ちらかと置き代えることが、インターサブユニットリン
ケージにつき約0.32オングストロームの付加的な長さを
提供することを示す。この様なリンケージは、キー結合
のまわりに比較的大きい回転自由、及びインターサブユ
ニットリンケージの結合角度も提供し、その角度はオリ
ゴマー骨格標準コンホメーション中で二つのRNA及びDNA
ターゲットに対するペアリングに適するオリゴマー骨格
コンホメーションに一致する。
ト結合部分をアキラルスルホニル−含有インターサブユ
ニットリンケージかアキラルリン−含有リンケージのど
ちらかと置き代えることが、インターサブユニットリン
ケージにつき約0.32オングストロームの付加的な長さを
提供することを示す。この様なリンケージは、キー結合
のまわりに比較的大きい回転自由、及びインターサブユ
ニットリンケージの結合角度も提供し、その角度はオリ
ゴマー骨格標準コンホメーション中で二つのRNA及びDNA
ターゲットに対するペアリングに適するオリゴマー骨格
コンホメーションに一致する。
【００５８】
第４図中の構造Ａ−Ａ中のリンケージ（５−原子骨
格）を、第９図中に示され、かつ例８中に詳述された反
応式に従って形成することができる。簡単にモルホリノ
サブユニットの５′−OHを、例４中に記載されている様
にリン−含有部分に変える。この基を活性化し、第９図
中に示されかつ例８中に記載されている様に保護されて
いない環窒素を有する第二サブユニットと結合させる。
ポリマー集団を二量体のモルホリノ環窒素を脱保護し、
次いでに二量体と第三の活性サブユニットとを反応させ
ることによって続ける。
格）を、第９図中に示され、かつ例８中に詳述された反
応式に従って形成することができる。簡単にモルホリノ
サブユニットの５′−OHを、例４中に記載されている様
にリン−含有部分に変える。この基を活性化し、第９図
中に示されかつ例８中に記載されている様に保護されて
いない環窒素を有する第二サブユニットと結合させる。
ポリマー集団を二量体のモルホリノ環窒素を脱保護し、
次いでに二量体と第三の活性サブユニットとを反応させ
ることによって続ける。
【００５９】
第４図の構造Ｂ−Ｂ中のホスホルアミドリンケージ
（６−原子単位−長さの骨格）を、第10図中に示されか
つ例９中に詳述された反応式に従って形成することがで
きる。保護されたサブユニットの５′ヒドロキシル（第
５図の構造４）を、活性化されたサブユニット中に生じ
る適するリン−含有化合物、たとえばジクロロ−N,N−
ジメチルアミノホスフアートと反応させる。次いでこの
サブユニットを非保護モノホリノ環窒素を有する第二サ
ブユニットと反応させる。多くの変法は、例９中に記載
されている様にペンダントＸ部分中で可能であり、Ｘ部
分の同定は、活性化及びカップリングの容易さ、生じる
リンケージの安定性、及び多少のターゲット−結合親和
性に影響を及ぼす。
（６−原子単位−長さの骨格）を、第10図中に示されか
つ例９中に詳述された反応式に従って形成することがで
きる。保護されたサブユニットの５′ヒドロキシル（第
５図の構造４）を、活性化されたサブユニット中に生じ
る適するリン−含有化合物、たとえばジクロロ−N,N−
ジメチルアミノホスフアートと反応させる。次いでこの
サブユニットを非保護モノホリノ環窒素を有する第二サ
ブユニットと反応させる。多くの変法は、例９中に記載
されている様にペンダントＸ部分中で可能であり、Ｘ部
分の同定は、活性化及びカップリングの容易さ、生じる
リンケージの安定性、及び多少のターゲット−結合親和
性に影響を及ぼす。
【００６０】
Ａ−Ａ及びＢ−Ｂリンケージのこの合成で、Ｐ＝Ｏ基
をＰ＝Ｓ基で実質上交替できる；一方との反応は、一般
に他方に応用できる。
をＰ＝Ｓ基で実質上交替できる；一方との反応は、一般
に他方に応用できる。
【００６１】
第４図のタイプＢ−Ｂのリンケージ、並びにホスホン
アミド及びホスホノエステルリンケージを形成するため
の他の方法は、カルボジイミドカップリングを使用する
ことができる：たとえばカルボジイミドはジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）である。カルボジイミドカ
ップリングを、例8,9及び10中に記載されている。スミ
ス等（1958）の観察を利用することによって、カルボン
ジイミド試薬を次のことに使用することもできる：
（ａ）サブユニットにリン（又はチオリン）結合部分を
加える；又は（ｂ）ペンダントＸ部分をリン（又はチオ
リン）結合部分に結合させる。
アミド及びホスホノエステルリンケージを形成するため
の他の方法は、カルボジイミドカップリングを使用する
ことができる：たとえばカルボジイミドはジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）である。カルボジイミドカ
ップリングを、例8,9及び10中に記載されている。スミ
ス等（1958）の観察を利用することによって、カルボン
ジイミド試薬を次のことに使用することもできる：
（ａ）サブユニットにリン（又はチオリン）結合部分を
加える；又は（ｂ）ペンダントＸ部分をリン（又はチオ
リン）結合部分に結合させる。
【００６２】
タイプＢ−Ｂ（第４図）の付加的なリンケージを、サ
ブユニットの活性化及びポリマーへのカップリングの前
に５′ヒドロキシルを他の官能基（たとえばSH,CH2,N
R）に変えることによって形成することができる。
ブユニットの活性化及びポリマーへのカップリングの前
に５′ヒドロキシルを他の官能基（たとえばSH,CH2,N
R）に変えることによって形成することができる。
【００６３】
モルホリノサブユニットから製造される、多くの７−
原子単位長さの骨格（第４図中で構造Ｃ−Ｃ及びＤ−Ｄ
に相当する）は、塩基の対合部分の間の距離を特定化す
るポリマーの構成に一層柔軟性を与える。７−原子単位
長さのリンケージを使用する場合、モルホリノ−サブユ
ニットの間、及びしたがって塩基の対合部分の間の距離
を伸ばすことができる。インターサブユニットリンケー
ジのこの様な伸長化は、特に有用である。その場合結合
モードを介するＢコンホメーション中で二重遺伝子配列
をターゲットにすることを、第８図中に示す。
原子単位長さの骨格（第４図中で構造Ｃ−Ｃ及びＤ−Ｄ
に相当する）は、塩基の対合部分の間の距離を特定化す
るポリマーの構成に一層柔軟性を与える。７−原子単位
長さのリンケージを使用する場合、モルホリノ−サブユ
ニットの間、及びしたがって塩基の対合部分の間の距離
を伸ばすことができる。インターサブユニットリンケー
ジのこの様な伸長化は、特に有用である。その場合結合
モードを介するＢコンホメーション中で二重遺伝子配列
をターゲットにすることを、第８図中に示す。
【００６４】
７−原子骨格ポリマーを、上記の様に構成されたサブ
ユニットＣ及びＤから、例10に記載された通常のカップ
リング反応を使用して容易に合成することができる。た
とえば、第４図中の構造Ｃ−Ｃを、（ａ）サブユニット
Ｃ（第３図）のホスホナート（又はチオホスホナート）
蓋とカルボジイミドとを反応させる、及び（ｂ）活性化
されたサブユニットを非保護のモルホリノ環窒素を有す
る第二サブユニットとカップリングすることによって製
造することができる。
ユニットＣ及びＤから、例10に記載された通常のカップ
リング反応を使用して容易に合成することができる。た
とえば、第４図中の構造Ｃ−Ｃを、（ａ）サブユニット
Ｃ（第３図）のホスホナート（又はチオホスホナート）
蓋とカルボジイミドとを反応させる、及び（ｂ）活性化
されたサブユニットを非保護のモルホリノ環窒素を有す
る第二サブユニットとカップリングすることによって製
造することができる。
【００６５】
第４図中の構造Ｄ−Ｄを、例10中に記載した様にホス
ホナート（又はチオホスホナート）をカルボジイミドで
活性化し、活性化されたサブユニットを非保護５′酸
素、イオウ、又はアミンを有する第二サブユニットでカ
ップリングすることによって製造することができる。
ホナート（又はチオホスホナート）をカルボジイミドで
活性化し、活性化されたサブユニットを非保護５′酸
素、イオウ、又はアミンを有する第二サブユニットでカ
ップリングすることによって製造することができる。
【００６６】
第４図の構造Ｄ−D/E−Ｅに相当するリンケージを形
成する新規方法は、一方のサブユニット（第3E図）の近
接ヒドロキシルを酸化し、もう一方のサブユニットの第
一アミンで生じるジアルデヒドを閉環し、次いでシアノ
ボロヒドリドで還元して行われる。原則的に、この同一
の式は、１つのサブユニットの第二アミンともう１つの
サブユニットのモノ−アルデヒドを結合するのにも使用
できる；しかし、リボース−誘導されたジアルデヒドの
第一アミンへのカップリングは実質上より一層速く進行
し、より良く収量が得られる。例７に、５′に第一アミ
ンを有するリボヌクレオシドの合成を示す。第12図に示
した様にモルホリノポリマーの形成でのその使用を、例
11中に記載する。
成する新規方法は、一方のサブユニット（第3E図）の近
接ヒドロキシルを酸化し、もう一方のサブユニットの第
一アミンで生じるジアルデヒドを閉環し、次いでシアノ
ボロヒドリドで還元して行われる。原則的に、この同一
の式は、１つのサブユニットの第二アミンともう１つの
サブユニットのモノ−アルデヒドを結合するのにも使用
できる；しかし、リボース−誘導されたジアルデヒドの
第一アミンへのカップリングは実質上より一層速く進行
し、より良く収量が得られる。例７に、５′に第一アミ
ンを有するリボヌクレオシドの合成を示す。第12図に示
した様にモルホリノポリマーの形成でのその使用を、例
11中に記載する。
【００６７】
D.ポリマーの集合
所望のポリマー長さ及び認識部分配列を選択した後
（このことに関するガイドラインを以下に示す。）ポリ
マーを上記の通常の操作を用いて集める。ポリマー集合
の１つの方法は、オリゴマーブロックの適切なセットを
最初に製造し、次いでこのブロックを結合して、最終的
長さのポリマーを形成することを含む。ポリマー合成中
に使用されるオリゴマーブロックは、等しいサイズであ
る必要はない。このブロックを、実質上例12及び13に関
係して記載されたカップリング法に従って、溶液中で製
造する。例13に、ペンタマーを形成する、この様なブロ
ック合成を略述する。
（このことに関するガイドラインを以下に示す。）ポリ
マーを上記の通常の操作を用いて集める。ポリマー集合
の１つの方法は、オリゴマーブロックの適切なセットを
最初に製造し、次いでこのブロックを結合して、最終的
長さのポリマーを形成することを含む。ポリマー合成中
に使用されるオリゴマーブロックは、等しいサイズであ
る必要はない。このブロックを、実質上例12及び13に関
係して記載されたカップリング法に従って、溶液中で製
造する。例13に、ペンタマーを形成する、この様なブロ
ック合成を略述する。
【００６８】
このブロック集合法の特別な利点は、完全な長さのポ
リマーの集合に於けるすべてのカップリング失敗が、所
望のポリマーから容易に分離される失敗配列を生じるこ
とである。例12に、この方法によって簡単なホモポリマ
ーの集合を示す。例13に、ヘテロポリマー中の使用に適
するブロックの製造を示す。例14及び15に生物学的に活
性なヘテロポリマーを形成するブロックの集合を示す。
かくして、例13,14,及び15一緒に集合方法の組合せを使
用する合成方法を示し、そこではオリゴマーブロックを
溶液中で段階的に集合させ、次いでこれらのオリゴマー
を完全−長さのポリマーに接続する。
リマーの集合に於けるすべてのカップリング失敗が、所
望のポリマーから容易に分離される失敗配列を生じるこ
とである。例12に、この方法によって簡単なホモポリマ
ーの集合を示す。例13に、ヘテロポリマー中の使用に適
するブロックの製造を示す。例14及び15に生物学的に活
性なヘテロポリマーを形成するブロックの集合を示す。
かくして、例13,14,及び15一緒に集合方法の組合せを使
用する合成方法を示し、そこではオリゴマーブロックを
溶液中で段階的に集合させ、次いでこれらのオリゴマー
を完全−長さのポリマーに接続する。
【００６９】
ポリマーを、例16に記載した様に固形担体上で段階的
サブユニット付加によって合成することができる。
サブユニット付加によって合成することができる。
【００７０】
一般に、固形担体、たとえば酸−安定な、長−鎖の開
裂しうるリンカーで誘導されたガラスビーズを、固相合
成用担体材料として使用し、例15及び16に記載した用に
第一サブユニットの結合又はサブユニットのブロックを
製造する。ガラスビーズを窒素上で容易に開裂しうる保
護基を一般に有するサブユニットと反応させる。モルホ
リノサブユニットを担体にそのモルホリノ窒素を介して
又は５′位である基を介して結合させるかどうかは、ポ
リマー合成の方向に基づく。すなわち次のサブユニット
を結合する基による。
裂しうるリンカーで誘導されたガラスビーズを、固相合
成用担体材料として使用し、例15及び16に記載した用に
第一サブユニットの結合又はサブユニットのブロックを
製造する。ガラスビーズを窒素上で容易に開裂しうる保
護基を一般に有するサブユニットと反応させる。モルホ
リノサブユニットを担体にそのモルホリノ窒素を介して
又は５′位である基を介して結合させるかどうかは、ポ
リマー合成の方向に基づく。すなわち次のサブユニット
を結合する基による。
【００７１】
担体に第二サブユニット（又は溶液中に集合されるオ
リゴマー）を担体上にカップリングした後、すべての非
反応求核部位を、すべての未反応求核部位を、適するキ
ヤピング剤、たとえばｐ−ニトロフエニルアセタート又
は無水酢酸の添加によってキヤップすることができ、そ
の後担体を洗滌する。末端サブユニットの窒素上の保護
基を、一般に酸処理及びその後中和によって除去し、担
体を過剰の先入れ配列（next−in−sequence）サブユニ
ット（又はポリマーユニット）と反応させる。このユニ
ットは上記方法の１つによって活性化されている。モノ
マーサブユニットの段階的添加を用いる固形担体集合法
の１つの特色は、夫々のサブユニット添加工程で高いカ
ップリング効率を要求する。この高いカップリング効率
を、一般に過剰の活性化されたサブユニットの添加によ
って達成し、このユニットは、鎖−伸長された多くの担
体−結合鎖を最大化する。
リゴマー）を担体上にカップリングした後、すべての非
反応求核部位を、すべての未反応求核部位を、適するキ
ヤピング剤、たとえばｐ−ニトロフエニルアセタート又
は無水酢酸の添加によってキヤップすることができ、そ
の後担体を洗滌する。末端サブユニットの窒素上の保護
基を、一般に酸処理及びその後中和によって除去し、担
体を過剰の先入れ配列（next−in−sequence）サブユニ
ット（又はポリマーユニット）と反応させる。このユニ
ットは上記方法の１つによって活性化されている。モノ
マーサブユニットの段階的添加を用いる固形担体集合法
の１つの特色は、夫々のサブユニット添加工程で高いカ
ップリング効率を要求する。この高いカップリング効率
を、一般に過剰の活性化されたサブユニットの添加によ
って達成し、このユニットは、鎖−伸長された多くの担
体−結合鎖を最大化する。
【００７２】
鎖伸長は、この方法で所望の長さ及び配列のポリマー
を得るまで、各サブユニット添加後失敗配列の任意のキ
ヤッピングで続ける。
を得るまで、各サブユニット添加後失敗配列の任意のキ
ヤッピングで続ける。
【００７３】
最終サブユニットの添加の後、最終骨格部分を、例12
中に記載した様に、適する電荷又は非電荷基と反応させ
る。担体−結合ポリマーに関して、次いでポリマーを、
たとえば担体にポリマーを接続するリンカー中でβ−脱
離を行うのに適する水酸化アンモニウム又は非−求核塩
基で処理することによって担体から切断する。塩基を脱
保護し、ポリマーを下記の様に及び例12,14,15及び16に
記載した様に精製する。
中に記載した様に、適する電荷又は非電荷基と反応させ
る。担体−結合ポリマーに関して、次いでポリマーを、
たとえば担体にポリマーを接続するリンカー中でβ−脱
離を行うのに適する水酸化アンモニウム又は非−求核塩
基で処理することによって担体から切断する。塩基を脱
保護し、ポリマーを下記の様に及び例12,14,15及び16に
記載した様に精製する。
【００７４】
E.ポリマー製造及び精製
溶液中に集められた結合ポリマー（例12及び14）を、
一般にDMSO又はDMF中に懸濁し、等量の濃水酸化アンモ
ニウムの懸濁液上に積層して、塩基−脱保護する。調製
物は封さがれ、次いで振とうして混合し、30℃16時間温
置する。処理は、減圧下でアンモニアの除去を伴う。保
護基（一般にトリチル又は関連する酸−不安定部分）が
存在する場合、この基を切断し、粗製ポリマー調製物
を、精製に適する緩衝液中に懸濁する。
一般にDMSO又はDMF中に懸濁し、等量の濃水酸化アンモ
ニウムの懸濁液上に積層して、塩基−脱保護する。調製
物は封さがれ、次いで振とうして混合し、30℃16時間温
置する。処理は、減圧下でアンモニアの除去を伴う。保
護基（一般にトリチル又は関連する酸−不安定部分）が
存在する場合、この基を切断し、粗製ポリマー調製物
を、精製に適する緩衝液中に懸濁する。
【００７５】
エステルリンケージを介して担体に結合する固相方法
によって集められた結合ポリマー（例15及び16）を、DM
SO中に乾燥担体を懸濁し、等量の濃NH4OH上に積層し、
徐々に16時間、30℃で撹拌する。固形担体を、濾過によ
って除去し、濾液を上述の様に処理する。
によって集められた結合ポリマー（例15及び16）を、DM
SO中に乾燥担体を懸濁し、等量の濃NH4OH上に積層し、
徐々に16時間、30℃で撹拌する。固形担体を、濾過によ
って除去し、濾液を上述の様に処理する。
【００７６】
その代りに、β−脱離−敏感なリンカーを介して担体
に連結する結合ポリマーを、DMF中の強い非求核塩基1,8
ジアズビシクロ（5.4.0）ウンデセ−７−エン（DBU）を
用いて担体から切断する。この方法を用いて、１つをま
だ保護されたその塩基を有するポリマーを遊離し、かく
てポリマーを高速原子衝撃質量分析を介して更なる変性
及び／又は構造確認に適する。
に連結する結合ポリマーを、DMF中の強い非求核塩基1,8
ジアズビシクロ（5.4.0）ウンデセ−７−エン（DBU）を
用いて担体から切断する。この方法を用いて、１つをま
だ保護されたその塩基を有するポリマーを遊離し、かく
てポリマーを高速原子衝撃質量分析を介して更なる変性
及び／又は構造確認に適する。
【００７７】
塩基−脱保護されたポリマーの精製を、ポリマー中の
塩基部分のpkに従ってpH2.5又はpH11で実施する。pH2.5
でチトシン、アデニン、及び2,6−ジアミノピリン部分
は正の電荷を有し、グアニンは部分的正の電荷を有す
る。pH11で、グアニン、ウラシル及びハイボキサンチン
は負の電荷を有する。塩基の対合部分約30％又はそれ以
上がpH2.5でイオン化されたポリマーに関して、精製
を、pH2.5で緩衝された浅いNaCl勾配で展開されたＳ−
セフアロースフアースト−フロー（フアルマシア）のカ
ラム上でカチオン交換体によって実施することができ
る。流出液を254nmで追跡し、分画コレクター中に集め
る。比較的短い失敗配列後に溶離する完全な長さのポリ
マーを、更に精製し、クロマトグラフィー度合いポリプ
ロピレン（ポリサイエンス社）のカラムで脱塩し、ギ酸
でpH2.5に調製されたアセトニトリル又はメタノールの
水性勾配で溶離し、溶出液を254nmで追跡する。純粋生
成物を含有する分画を中和し、減圧下に乾燥する。ポリ
マーをトリフルオロエタノール中に溶解し、濾過し、ト
リフルオロエタノールを蒸発することによって塩を除去
する。
塩基部分のpkに従ってpH2.5又はpH11で実施する。pH2.5
でチトシン、アデニン、及び2,6−ジアミノピリン部分
は正の電荷を有し、グアニンは部分的正の電荷を有す
る。pH11で、グアニン、ウラシル及びハイボキサンチン
は負の電荷を有する。塩基の対合部分約30％又はそれ以
上がpH2.5でイオン化されたポリマーに関して、精製
を、pH2.5で緩衝された浅いNaCl勾配で展開されたＳ−
セフアロースフアースト−フロー（フアルマシア）のカ
ラム上でカチオン交換体によって実施することができ
る。流出液を254nmで追跡し、分画コレクター中に集め
る。比較的短い失敗配列後に溶離する完全な長さのポリ
マーを、更に精製し、クロマトグラフィー度合いポリプ
ロピレン（ポリサイエンス社）のカラムで脱塩し、ギ酸
でpH2.5に調製されたアセトニトリル又はメタノールの
水性勾配で溶離し、溶出液を254nmで追跡する。純粋生
成物を含有する分画を中和し、減圧下に乾燥する。ポリ
マーをトリフルオロエタノール中に溶解し、濾過し、ト
リフルオロエタノールを蒸発することによって塩を除去
する。
【００７８】
塩基の対合部分約30％又はそれ以上がpH11でイオン化
されたポリマーに関して、精製を、NaClの水性pH11勾配
で展開されたＱセフアロースフアースト−フロー（フア
ルマシア）のアニオン交換体カラム上で、行う。比較的
短い失敗配列後に溶離する完全−長さのポリマーは、更
に精製され、アセトニトリルの水性pH11勾配で溶離され
るポリプロピレンカラム上で脱塩する。純粋精製物を含
有する分画を、上記の様に処理する。
されたポリマーに関して、精製を、NaClの水性pH11勾配
で展開されたＱセフアロースフアースト−フロー（フア
ルマシア）のアニオン交換体カラム上で、行う。比較的
短い失敗配列後に溶離する完全−長さのポリマーは、更
に精製され、アセトニトリルの水性pH11勾配で溶離され
るポリプロピレンカラム上で脱塩する。純粋精製物を含
有する分画を、上記の様に処理する。
【００７９】
上記精製法を、アデニン塩基の対合部分を有するポリ
マーを室温で数時間以上pH11にさらさず、潜在的塩基不
安定性問題を避ける様に実施しなければならない。精製
方法の詳細を、例12,14,及び15中に略述する。
マーを室温で数時間以上pH11にさらさず、潜在的塩基不
安定性問題を避ける様に実施しなければならない。精製
方法の詳細を、例12,14,及び15中に略述する。
【００８０】
中性、水性溶液中で、モルホリノポリマーは、所望さ
れるよりも低い溶解性を有する。それ故に、親水性部分
１又は数種、たとえばポリエチレングリコールの添加に
よってポリマー溶解度を増加させるのに有利である。こ
こに開示されたほとんどのポリマータイプに関して、こ
れは末端の骨格保護基を完全なポリマーから切断し、ま
だ保護された状態での塩基を有るポリマーと過剰のカル
ボニルジイミダゾール−活性化ポリエチレングリコール
（PEG）と反応させて行われる。その後結合ポリマーを
水酸化アンモニウムで処理し、塩基−保護基を除去し、
ポリマーを上述の様に精製する。溶解のレベルを、PEG
材料の割合選択によって容易に選択する。200,400,600,
1,000,1,540,3,400,4,000,6,000,7,500、及び18,500ダ
ルトンの平均分子量を有する、適するPEG分画は、最良
の溶解をしばしば提供するPEG1000を用いて化学的に入
手できる（たとえばポリサイエンス、社）。溶解化部分
を、開裂可能なリンケージによってポリマーを連結さ
せ、所望の場合ポリマーをたとえばエステラーゼ又はペ
プチターゼ酵素によって、溶解化剤から遊離させる。
れるよりも低い溶解性を有する。それ故に、親水性部分
１又は数種、たとえばポリエチレングリコールの添加に
よってポリマー溶解度を増加させるのに有利である。こ
こに開示されたほとんどのポリマータイプに関して、こ
れは末端の骨格保護基を完全なポリマーから切断し、ま
だ保護された状態での塩基を有るポリマーと過剰のカル
ボニルジイミダゾール−活性化ポリエチレングリコール
（PEG）と反応させて行われる。その後結合ポリマーを
水酸化アンモニウムで処理し、塩基−保護基を除去し、
ポリマーを上述の様に精製する。溶解のレベルを、PEG
材料の割合選択によって容易に選択する。200,400,600,
1,000,1,540,3,400,4,000,6,000,7,500、及び18,500ダ
ルトンの平均分子量を有する、適するPEG分画は、最良
の溶解をしばしば提供するPEG1000を用いて化学的に入
手できる（たとえばポリサイエンス、社）。溶解化部分
を、開裂可能なリンケージによってポリマーを連結さ
せ、所望の場合ポリマーをたとえばエステラーゼ又はペ
プチターゼ酵素によって、溶解化剤から遊離させる。
【００８１】
ポリマーを更に公知の操作に従って誘導する又は標識
するのが認められる。たとえばポリマーを、放射能標識
されたリボヌクレオシドからポリマーサブユニットを製
造して又は１つの末端で放射能標識されたアミノ酸を結
合させることによって、放射能標識される。ポリマーを
容易に誘導化し、たとえば酵素、発色基、等々との上記
サブユニットカップリング反応の変性を用いて行い、そ
こでポリマーを、診断用プローブとして使用することが
できる。更に、ポリマーに特異的組織又は細胞タイプを
標的にさせる生体分子で、ポリマーを誘導化する。
するのが認められる。たとえばポリマーを、放射能標識
されたリボヌクレオシドからポリマーサブユニットを製
造して又は１つの末端で放射能標識されたアミノ酸を結
合させることによって、放射能標識される。ポリマーを
容易に誘導化し、たとえば酵素、発色基、等々との上記
サブユニットカップリング反応の変性を用いて行い、そ
こでポリマーを、診断用プローブとして使用することが
できる。更に、ポリマーに特異的組織又は細胞タイプを
標的にさせる生体分子で、ポリマーを誘導化する。
【００８２】
F.構造の特性評価
中位のサイズの完全−保護された結合ポリマー（10な
いし20サブユニット）は、しばしばポリマー長さのキー
確認を提供するFAB（高速原子衝撃）中で強い分子イオ
ンを生じる。
いし20サブユニット）は、しばしばポリマー長さのキー
確認を提供するFAB（高速原子衝撃）中で強い分子イオ
ンを生じる。
【００８３】
更に、保護されたかつ精製されたポリマーのCOSY−NM
R（二次元相関クロマトグラフィー）は、ポリマー中で
異なる塩基の対合部分の割合に関する情報並びにポリマ
ーに結合したすべての可溶性又は他のタイプの部分に対
する結合ポリマーの割合に関する定量情報を提供する。
R（二次元相関クロマトグラフィー）は、ポリマー中で
異なる塩基の対合部分の割合に関する情報並びにポリマ
ーに結合したすべての可溶性又は他のタイプの部分に対
する結合ポリマーの割合に関する定量情報を提供する。
【００８４】イオン交換体カラム上の移動度は、また精
製をpH2.5で実施する場合、ポリマー中でＣ＋Ａ塩基の
対合部分の数に関する情報及び精製をpH11で行う場合、
Ｇ＋Ｕ残基の数に関する情報を提供する。構造の証明
は、ポリマーをオリゴマーブロックから、たとえば例1
2,14及び15の様に集める場合に最も簡単である。という
のはその時失敗配列が完全−長さ配列ともっと実質的に
異なるからである。
製をpH2.5で実施する場合、ポリマー中でＣ＋Ａ塩基の
対合部分の数に関する情報及び精製をpH11で行う場合、
Ｇ＋Ｕ残基の数に関する情報を提供する。構造の証明
は、ポリマーをオリゴマーブロックから、たとえば例1
2,14及び15の様に集める場合に最も簡単である。という
のはその時失敗配列が完全−長さ配列ともっと実質的に
異なるからである。
【００８５】
pH1,7及び13でポリマーのUV側面は、ポリマーの相対
ヌクレオチド組成についての情報を提供することができ
る。
ヌクレオチド組成についての情報を提供することができ
る。
【００８６】
そのターゲット配列に対するモルホリノ−基体ポリマ
ー親和性の評価を、例12中に示した様にポリマー／ター
ゲット二重体の熔融曲線を測定することによって行う。
更に、正規の核酸二重体（たとえばＰ（dC）6/P（dG）
６）の熔融曲線と対応するモルホリノ−基体ポリマーを
含有するハイブリッド二重体の熔融曲線との間で比較を
することができる。
ー親和性の評価を、例12中に示した様にポリマー／ター
ゲット二重体の熔融曲線を測定することによって行う。
更に、正規の核酸二重体（たとえばＰ（dC）6/P（dG）
６）の熔融曲線と対応するモルホリノ−基体ポリマーを
含有するハイブリッド二重体の熔融曲線との間で比較を
することができる。
【００８７】
上記特性評価工程を、モルホリノ−基体ホスホルジア
ミダート−結合ポリ（Ｃ）ヘキサマーを例12中に記載し
た様に適用する。式中Ｙは酸素、ＸはＮ（CH3）２、及
びＺは酸素である。完全−長さオリゴマーの特性評価
を、プロトンNMR及び負イオンFABマススペクトルによっ
て行う。このモルホリノオリゴマーを用いて、オリゴマ
ーのフラグメンテーションを著しく抑制するので、ほと
んど配列情報は入手できない。しかし親イオンシグナル
は、極めて強くかつモルホリノオリゴマーの組成のコン
ホメーションを可能にする（例12参照）。水溶解度を増
加するために、ポリエチレングリコール（PEG）テイル
をオリゴマーに結合させる。５当量のPEG 1000を、１当
量のビス（ｐ−ニトロフエニル）カーボナートで処理し
て、モノ活性化されたPEGを生じる。トリフルオロエタ
ノール中で１％酢酸を用いるヘキサマーの脱トリチル化
は、遊離モルホリノ環窒素を供給する。標準カップリン
グ条件下で活性化されたPEG 1000を用いて遊離アミンを
含有するヘキサマーの処理は、ヘキサマーへのPEGテイ
ルの結合を生じる。塩基を、24時間濃アンモニアで末端
につながれたヘキサマーの処理によって脱保護する。末
端につながれたヘキサマーを、pH2.5緩衝液中に取り、
塩化カリウム勾配で溶離されたＳ−セフアロースフアー
ストフローTM上でカチオン交換体クロマトグラフィーに
よって精製する。中和後、溶出液を、水／アセトニトリ
ル勾配で溶離されたポリプロピレンカラム上で脱塩す
る。末端につながれたヘキサマーは、pH7.5緩衝液中に
自由に溶解することが分る。
ミダート−結合ポリ（Ｃ）ヘキサマーを例12中に記載し
た様に適用する。式中Ｙは酸素、ＸはＮ（CH3）２、及
びＺは酸素である。完全−長さオリゴマーの特性評価
を、プロトンNMR及び負イオンFABマススペクトルによっ
て行う。このモルホリノオリゴマーを用いて、オリゴマ
ーのフラグメンテーションを著しく抑制するので、ほと
んど配列情報は入手できない。しかし親イオンシグナル
は、極めて強くかつモルホリノオリゴマーの組成のコン
ホメーションを可能にする（例12参照）。水溶解度を増
加するために、ポリエチレングリコール（PEG）テイル
をオリゴマーに結合させる。５当量のPEG 1000を、１当
量のビス（ｐ−ニトロフエニル）カーボナートで処理し
て、モノ活性化されたPEGを生じる。トリフルオロエタ
ノール中で１％酢酸を用いるヘキサマーの脱トリチル化
は、遊離モルホリノ環窒素を供給する。標準カップリン
グ条件下で活性化されたPEG 1000を用いて遊離アミンを
含有するヘキサマーの処理は、ヘキサマーへのPEGテイ
ルの結合を生じる。塩基を、24時間濃アンモニアで末端
につながれたヘキサマーの処理によって脱保護する。末
端につながれたヘキサマーを、pH2.5緩衝液中に取り、
塩化カリウム勾配で溶離されたＳ−セフアロースフアー
ストフローTM上でカチオン交換体クロマトグラフィーに
よって精製する。中和後、溶出液を、水／アセトニトリ
ル勾配で溶離されたポリプロピレンカラム上で脱塩す
る。末端につながれたヘキサマーは、pH7.5緩衝液中に
自由に溶解することが分る。
【００８８】
相補的核酸で末端につながれたヘキサマーの錯体の安
定性を、末端変性実験によって調べる。末端につながれ
たヘキサマーと選択されたホスホジエステル補体の混合
及び非混合サンプルの間の差スペクトルは14℃ないし85
℃で及び320から260nm範囲にわたって得られる（例12参
照）。Ｃモノマーで60マイクロモル及びＧモノマーで60
マイクロモルで、末端につながれたヘキサマー、ポリ
（dG）を有する（morph C）６、の差UVスペクトルが79
℃のTm値を生じる。ポリＧ）を有する対する（morphC）
６は、51.5℃のTm値を示す（例12及び第13図参照）。
定性を、末端変性実験によって調べる。末端につながれ
たヘキサマーと選択されたホスホジエステル補体の混合
及び非混合サンプルの間の差スペクトルは14℃ないし85
℃で及び320から260nm範囲にわたって得られる（例12参
照）。Ｃモノマーで60マイクロモル及びＧモノマーで60
マイクロモルで、末端につながれたヘキサマー、ポリ
（dG）を有する（morph C）６、の差UVスペクトルが79
℃のTm値を生じる。ポリＧ）を有する対する（morphC）
６は、51.5℃のTm値を示す（例12及び第13図参照）。
【００８９】
G.診断適用
本発明のターゲット−特異的ポリマーを、一定のター
ゲット配列を有するRNA又はDNAの種々の検出診断法中に
使用することができる。ある一般的適用で、ポリマー
を、適する放射能標識又は他の検出可能なリポーター基
で標識する。ターゲットポリヌクレオチド、一般に固形
担体に結合した一本鎖ポリヌクレオチドを、ハイブリッ
ド形成条件下にポリマーと反応させ、アニールし、次い
でサンプルをポリマーリポター基の存在について調べ
る。
ゲット配列を有するRNA又はDNAの種々の検出診断法中に
使用することができる。ある一般的適用で、ポリマー
を、適する放射能標識又は他の検出可能なリポーター基
で標識する。ターゲットポリヌクレオチド、一般に固形
担体に結合した一本鎖ポリヌクレオチドを、ハイブリッ
ド形成条件下にポリマーと反応させ、アニールし、次い
でサンプルをポリマーリポター基の存在について調べ
る。
【００９０】
診断法を、標準操作に従ってハイブリッド形成条件の
適する調整と共に実施し、ターゲット域を有するポリマ
ーハイブリッド形成をさせる。更に、ポリマーを相補的
ポリヌクレオチド鎖よりも高い熔融温度で、ターゲット
によりハイブリッド形成を行うことができる。というの
はポリマー結合は骨格電荷反発作用を伴うからである。
したがって、ポリマーを通常のポリヌクレオチド熔融温
度以上の温度でターゲットに結合させることができる：
これは従来のオリゴヌクレオチドプローブに関するポリ
マーの１つの利点である。高められた温度でのこの結合
は、プローブと診断混合物中に存在するすべての対応す
る一本鎖オリゴヌクレオチドとの間でターゲットへの結
合に対する競合の問題を最小化する。
適する調整と共に実施し、ターゲット域を有するポリマ
ーハイブリッド形成をさせる。更に、ポリマーを相補的
ポリヌクレオチド鎖よりも高い熔融温度で、ターゲット
によりハイブリッド形成を行うことができる。というの
はポリマー結合は骨格電荷反発作用を伴うからである。
したがって、ポリマーを通常のポリヌクレオチド熔融温
度以上の温度でターゲットに結合させることができる：
これは従来のオリゴヌクレオチドプローブに関するポリ
マーの１つの利点である。高められた温度でのこの結合
は、プローブと診断混合物中に存在するすべての対応す
る一本鎖オリゴヌクレオチドとの間でターゲットへの結
合に対する競合の問題を最小化する。
【００９１】
診断適用の第二一般タイプに於て、ポリマーをターゲ
ットRNA又はDNAの担体への捕獲に関して、固形担体と結
合させる。固体ポリマー、たとえばポリマー性微粒子
を、上記方法に従って又は従来の誘導化操作によって担
体にポリマーを結合させることによって製造することが
できる。その代りにポリマーを固形担体上で合成するの
で、この担体を検出担体としても役に立つ。
ットRNA又はDNAの担体への捕獲に関して、固形担体と結
合させる。固体ポリマー、たとえばポリマー性微粒子
を、上記方法に従って又は従来の誘導化操作によって担
体にポリマーを結合させることによって製造することが
できる。その代りにポリマーを固形担体上で合成するの
で、この担体を検出担体としても役に立つ。
【００９２】
この検定法の１つの特色に従って、ポリマーへの塩基
−特異的結合によって担体上に捕獲されるターゲットポ
リヌクレオチド分子を、その骨格電荷に基づいて検定す
ることができる。というのは担体−結合ポリマーはその
自体実質上非電荷である。この末端に検定法はポリカチ
オン性リポーター分子も伴い、この分子は選択された結
合条件下で、完全に電荷された被検体骨格へ結合を行う
が、非電荷（又は実質上非電荷）のポリマー骨格への結
合を行わない。
−特異的結合によって担体上に捕獲されるターゲットポ
リヌクレオチド分子を、その骨格電荷に基づいて検定す
ることができる。というのは担体−結合ポリマーはその
自体実質上非電荷である。この末端に検定法はポリカチ
オン性リポーター分子も伴い、この分子は選択された結
合条件下で、完全に電荷された被検体骨格へ結合を行う
が、非電荷（又は実質上非電荷）のポリマー骨格への結
合を行わない。
【００９３】
一つの具体例で、リポーター分子は、リポーター基が
診断剤上に有するより僅かな電荷又は非電荷結合ポリマ
ーに結合しない条件下で、ポリカチオン性分子又は静電
的に完全に電荷されたポリヌクレオチドへの結合を行う
テイルから成る；リポーター１又は数種を、末端に結合
させ、リポーターの存在を検出することができるシグナ
ルを産生するのに適する。
診断剤上に有するより僅かな電荷又は非電荷結合ポリマ
ーに結合しない条件下で、ポリカチオン性分子又は静電
的に完全に電荷されたポリヌクレオチドへの結合を行う
テイルから成る；リポーター１又は数種を、末端に結合
させ、リポーターの存在を検出することができるシグナ
ルを産生するのに適する。
【００９４】
ポリカチオン性分子の形成法及びカチオン化合物への
リポーター分子の結合法は知られている。
リポーター分子の結合法は知られている。
【００９５】
各リポーター分子は、リポーター基１又は数種を有
し、各ポリヌクレオチドは、一般的に数４又はそれ以上
のリポーター分子の結合を適合させることができる。か
くてこの系は、結合被検体分子につきリポーターシグナ
ルの間にいくつかの大きさの順序の増幅フアクターを有
する。更に、この方法は上述の様な利点を有し、それは
ポリヌクレオチド結合反応を相補的ヌクレオチド鎖との
結合競合が生じない条件下で実施することができること
である。
し、各ポリヌクレオチドは、一般的に数４又はそれ以上
のリポーター分子の結合を適合させることができる。か
くてこの系は、結合被検体分子につきリポーターシグナ
ルの間にいくつかの大きさの順序の増幅フアクターを有
する。更に、この方法は上述の様な利点を有し、それは
ポリヌクレオチド結合反応を相補的ヌクレオチド鎖との
結合競合が生じない条件下で実施することができること
である。
【００９６】
診断剤として使用するためのポリヌクレオチド結合ポ
リマーを製造するのに適用される考察される考慮は、被
検体を検定すべき条件下でターゲット被検体の性質及び
反応条件によって左右される。第一の考慮として、ポリ
マーが目ざす非−ホモポリマーターゲット塩基配列が選
択される。このターゲット配列を選択することである。
このターゲット配列は一般に一本−鎖であり、好ましく
は検定される被検体に特異的である。
リマーを製造するのに適用される考察される考慮は、被
検体を検定すべき条件下でターゲット被検体の性質及び
反応条件によって左右される。第一の考慮として、ポリ
マーが目ざす非−ホモポリマーターゲット塩基配列が選
択される。このターゲット配列を選択することである。
このターゲット配列は一般に一本−鎖であり、好ましく
は検定される被検体に特異的である。
【００９７】
一定のｎ−塩基ターゲット配列の発生の確立は、約
（1/4）ｎである、したがって、一定のｎ−塩基ターゲ
ット配列が、4n塩基を有するポリマー中でほぼ一度生じ
ることが予想される。したがってＮ非反復−配列塩基の
全量を含有するポリヌクレオチド中に一定のｎ−塩基配
列が生じる確立は、約Ｐ＝N/4nである。描写するため
に、20キロ塩基ポリヌクレオチド中に９−塩基ターゲッ
ト配列が認められる確立Ｐは、約20×103/2×105又は0.
08であり、16−塩基ターゲット配列が存在する確立は、
約20×103/4.3×109又は0.0000047である。この計算か
ら定義された９−16塩基ターゲット配列に特異的な９−
16認識部分を有するポリマーは、ウイルスゲノムしか含
有しない検定混合物中にターゲット配列に対して高い特
異性を有しなければならない。このゲノムの最も大きい
複合性は約400K非反復−配列に相当する。
（1/4）ｎである、したがって、一定のｎ−塩基ターゲ
ット配列が、4n塩基を有するポリマー中でほぼ一度生じ
ることが予想される。したがってＮ非反復−配列塩基の
全量を含有するポリヌクレオチド中に一定のｎ−塩基配
列が生じる確立は、約Ｐ＝N/4nである。描写するため
に、20キロ塩基ポリヌクレオチド中に９−塩基ターゲッ
ト配列が認められる確立Ｐは、約20×103/2×105又は0.
08であり、16−塩基ターゲット配列が存在する確立は、
約20×103/4.3×109又は0.0000047である。この計算か
ら定義された９−16塩基ターゲット配列に特異的な９−
16認識部分を有するポリマーは、ウイルスゲノムしか含
有しない検定混合物中にターゲット配列に対して高い特
異性を有しなければならない。このゲノムの最も大きい
複合性は約400K非反復−配列に相当する。
【００９８】
類似の計算は、12ないし16サブユニットポリマーがウ
イルス及び細菌ゲノム材料しか含有しない検定混合物中
でウイルス又は細菌ターゲット配列に適した特異性を提
供することができることを示す；最も大きいゲノムサイ
ズは約5,000キロ塩基。16ないし22サブユニットポリマ
ーは、哺乳類ゲノムDNA材料を含有するポリヌクレオチ
ド混合物中にターゲット配列に適する特異性を提供する
ことができる；非反復−配列DNAの約50億のゲノムサイ
ズ。
イルス及び細菌ゲノム材料しか含有しない検定混合物中
でウイルス又は細菌ターゲット配列に適した特異性を提
供することができることを示す；最も大きいゲノムサイ
ズは約5,000キロ塩基。16ないし22サブユニットポリマ
ーは、哺乳類ゲノムDNA材料を含有するポリヌクレオチ
ド混合物中にターゲット配列に適する特異性を提供する
ことができる；非反復−配列DNAの約50億のゲノムサイ
ズ。
【００９９】
ポリマー／被検体結合親和性、及び特にポリマーがタ
ーゲット配列と丁度結合する温度（熔融温度、又はTm）
を、次の基準に従って選択的に変えることができる：
（ａ）ポリマー中のサブユニットの数；（ｂ）塩基の対
合部分と対応する、被検体ターゲット配列の相補的塩基
との間に形成されうる水素結合の数；（ｃ）ポリマー骨
格の単位長さ；（ｄ）特別なインターサブユニットリン
ケージ；及び（ｅ）熔融温度を減少させる変性剤、たと
えばホルムアルデヒドの濃度。
ーゲット配列と丁度結合する温度（熔融温度、又はTm）
を、次の基準に従って選択的に変えることができる：
（ａ）ポリマー中のサブユニットの数；（ｂ）塩基の対
合部分と対応する、被検体ターゲット配列の相補的塩基
との間に形成されうる水素結合の数；（ｃ）ポリマー骨
格の単位長さ；（ｄ）特別なインターサブユニットリン
ケージ；及び（ｅ）熔融温度を減少させる変性剤、たと
えばホルムアルデヒドの濃度。
【０１００】
モデル核酸二重体に関する多くの研究から、10ないし
20bp範囲でオリゴヌクレオチド二重体の熔融温度は、２
個の水素結合によって形成される付加的な塩基対につき
約３℃、そして３個の水素結合によって形成される付加
的な塩基対につき約６℃上がることが知られている。し
たがってターゲットポリマーとの高い結合特異性を保証
するために、本来選択されたターゲット配列長さを伸ば
して選択された検定条件下に所望の熔融温度を達成す
る。
20bp範囲でオリゴヌクレオチド二重体の熔融温度は、２
個の水素結合によって形成される付加的な塩基対につき
約３℃、そして３個の水素結合によって形成される付加
的な塩基対につき約６℃上がることが知られている。し
たがってターゲットポリマーとの高い結合特異性を保証
するために、本来選択されたターゲット配列長さを伸ば
して選択された検定条件下に所望の熔融温度を達成す
る。
【０１０１】
また、ポリマーを構成するのに使用される確認部分
は、標準核酸塩基である場合、ターゲット配列を高百分
率のグアニン プラス チトシン塩基を有する様に選択
して、比較的高いポリマー／被検体熔融温度を達成す
る。一方、低い熔融温度を達成するために、比較的高い
百分率のグアニン プラス チミン塩基を含有するター
ゲット配列を選択する。
は、標準核酸塩基である場合、ターゲット配列を高百分
率のグアニン プラス チトシン塩基を有する様に選択
して、比較的高いポリマー／被検体熔融温度を達成す
る。一方、低い熔融温度を達成するために、比較的高い
百分率のグアニン プラス チミン塩基を含有するター
ゲット配列を選択する。
【０１０２】
診断システム中の結合成分は、丁度記載した固体−担
体診断法中で作用する様に第14図中に示す。この際
“S"、検定試剤は、固体−担体でありソーツース（sowt
ooth）ラインによって示されるスペーサーアームでその
表面に結合ひる多くの結合ポリマーを有する。検定操作
で、一本鎖形のターゲットDNAと担体−結合ポリマーと
をハイブリッド形成条件下に反応させ、次いで固体担体
を、洗滌して、非ハイブリッド形成核酸材料を除く。
体診断法中で作用する様に第14図中に示す。この際
“S"、検定試剤は、固体−担体でありソーツース（sowt
ooth）ラインによって示されるスペーサーアームでその
表面に結合ひる多くの結合ポリマーを有する。検定操作
で、一本鎖形のターゲットDNAと担体−結合ポリマーと
をハイブリッド形成条件下に反応させ、次いで固体担体
を、洗滌して、非ハイブリッド形成核酸材料を除く。
【０１０３】
次いで洗滌された担体と、ターゲットDNA骨格へのリ
ポーターカチオン性部分の静電的結合を助ける条件下で
リポーターとを反応させる。第14図に示されたリポータ
ーは、リポーター基Ｒを有するジカチオン分子である。
ポーターカチオン性部分の静電的結合を助ける条件下で
リポーターとを反応させる。第14図に示されたリポータ
ーは、リポーター基Ｒを有するジカチオン分子である。
【０１０４】
一般に室温で数秒間リポーター溶液と反応液、試剤を
洗滌し、未結合リポーターを除き、次いで検定試剤を結
合リポーターに関して評価する。試剤と結合するリポー
ターの量を決定するある方法、特に蛍光又は発色リポー
ターグループの場合の方法は、高い塩溶液を用いて試剤
からリポーターを溶離し、次いで溶出液をリポーターに
関して評価する。
洗滌し、未結合リポーターを除き、次いで検定試剤を結
合リポーターに関して評価する。試剤と結合するリポー
ターの量を決定するある方法、特に蛍光又は発色リポー
ターグループの場合の方法は、高い塩溶液を用いて試剤
からリポーターを溶離し、次いで溶出液をリポーターに
関して評価する。
【０１０５】
本発明のポリマーは、二重核酸への配列特異的結合
を、二重らせんの主要溝によって得られる塩基−対−特
異的水素結合部位を介して行うことができる。この結合
は、一本鎖上の少なくとも70％の塩基はプリンであり、
もう一方の鎖上の塩基の対応する百分率はピリミジンで
ある二重領域中に生じることができる。二重結合ポリマ
ーは、第８図中に示した様にＴ−Ａ又はＵ−Ａ塩基対へ
の結合に関する2,6−ジアミノプリン水素結合部分、及
びＣ−Ｇ塩基対への結合に関するグアニン水素結合部分
を含むのが好ましい。かくてこの特別をターゲット配列
に関して、本発明のポリマーを、丁度記載したタイプの
診断検定に使用することができ、しかしその際ターゲッ
ト核酸は、非変性、二重形である。
を、二重らせんの主要溝によって得られる塩基−対−特
異的水素結合部位を介して行うことができる。この結合
は、一本鎖上の少なくとも70％の塩基はプリンであり、
もう一方の鎖上の塩基の対応する百分率はピリミジンで
ある二重領域中に生じることができる。二重結合ポリマ
ーは、第８図中に示した様にＴ−Ａ又はＵ−Ａ塩基対へ
の結合に関する2,6−ジアミノプリン水素結合部分、及
びＣ−Ｇ塩基対への結合に関するグアニン水素結合部分
を含むのが好ましい。かくてこの特別をターゲット配列
に関して、本発明のポリマーを、丁度記載したタイプの
診断検定に使用することができ、しかしその際ターゲッ
ト核酸は、非変性、二重形である。
【０１０６】
H.他の適用
本発明のポリマーを、標準RNA又はDNAの代りに多くの
標準研究室操作に関して使用することができる。上述の
様に、モルホリノ−基体とするポリマーを固体担体に固
定し、相補核酸配列を、たとえば特異的mRNAの精製によ
ってポリ−Ａ分画（ゴールドバーク等）から単離するの
に使用することができる。本発明のポリマーは、この様
な適用に有利である。というのはこれらは活性化された
サブユニットから製造するのに安価かつ簡単であるから
である。
標準研究室操作に関して使用することができる。上述の
様に、モルホリノ−基体とするポリマーを固体担体に固
定し、相補核酸配列を、たとえば特異的mRNAの精製によ
ってポリ−Ａ分画（ゴールドバーク等）から単離するの
に使用することができる。本発明のポリマーは、この様
な適用に有利である。というのはこれらは活性化された
サブユニットから製造するのに安価かつ簡単であるから
である。
【０１０７】
分子生物学に於ける大多数の適用を、標識されたモル
ホリノ−基体ポリマーに関して見い出すことができる。
モルホリノ−基体ポリマーを、ポリマー合成の最後の工
程での包接によって，すなわち上述の様に活性化されか
つ標識されたモルホリノ−基体サブユニット又は好まし
くは35S−標識されたメチオニンによって容易にかつ効
果的に末端−標識することができる。使用されるべき標
識のタイプは、ポリマーの最終適用による；この様な標
識は、放射能活性（3H,14C,32P,又は35S）ヌクレオシド
又はアミノ酸、又はビオチンを含む。標識されたモルホ
リノ−基体オリゴヌクレオチド同族体は、たとえばコロ
ニーハイブリット形成（グルンスタイン等）、RNAハイ
ブリット形成（トーマス）、DNAハイブリット形成（サ
ウザーン）、及び遺伝子バンクスクリーンニング（スツ
オスタック等）中で有効なブローブとして作用すること
ができる。
ホリノ−基体ポリマーに関して見い出すことができる。
モルホリノ−基体ポリマーを、ポリマー合成の最後の工
程での包接によって，すなわち上述の様に活性化されか
つ標識されたモルホリノ−基体サブユニット又は好まし
くは35S−標識されたメチオニンによって容易にかつ効
果的に末端−標識することができる。使用されるべき標
識のタイプは、ポリマーの最終適用による；この様な標
識は、放射能活性（3H,14C,32P,又は35S）ヌクレオシド
又はアミノ酸、又はビオチンを含む。標識されたモルホ
リノ−基体オリゴヌクレオチド同族体は、たとえばコロ
ニーハイブリット形成（グルンスタイン等）、RNAハイ
ブリット形成（トーマス）、DNAハイブリット形成（サ
ウザーン）、及び遺伝子バンクスクリーンニング（スツ
オスタック等）中で有効なブローブとして作用すること
ができる。
【０１０８】
本発明のポリマーは、“アンチセンス”治療剤として
潜在的使用も有する。DNAとほぼ同型構造である、多く
の非電荷核酸同族体は、抗ウイルス及び抗−癌剤として
使用される。本発明のモルホリノ−基体ポリマーを、HI
V−Ｉ（ヒト免疫不全ウイルス）に対して試験管内でテ
ストする。HIV−Ｉ（メイヤー等）の第一結合部位への1
6−mer相補性は、約35％までウイルスP24プロテインの
合成を減少させることを示す。対応する非感染の細胞中
で、モルホリノ−基体ポリマーは、見掛け細胞毒性を生
じない。
潜在的使用も有する。DNAとほぼ同型構造である、多く
の非電荷核酸同族体は、抗ウイルス及び抗−癌剤として
使用される。本発明のモルホリノ−基体ポリマーを、HI
V−Ｉ（ヒト免疫不全ウイルス）に対して試験管内でテ
ストする。HIV−Ｉ（メイヤー等）の第一結合部位への1
6−mer相補性は、約35％までウイルスP24プロテインの
合成を減少させることを示す。対応する非感染の細胞中
で、モルホリノ−基体ポリマーは、見掛け細胞毒性を生
じない。
【０１０９】
本発明のポリマーを、HSV−Ｉ（Herpes Simplex Viru
s I）に対してマウスで目感染を生体内でもテストする
（例16）。HSV−Ｉ中でスプライス部位への12−mer相補
性を、HSIV−Ｉで感染されたマウスの目を保護するその
能力についてテストする。未処理マウスは、感染５日後
で65％の残存率を示すが、モルホリノ−基体ポリマーを
含有する局所軟膏で処理されたマウスは、90％の残存率
を有する。
s I）に対してマウスで目感染を生体内でもテストする
（例16）。HSV−Ｉ中でスプライス部位への12−mer相補
性を、HSIV−Ｉで感染されたマウスの目を保護するその
能力についてテストする。未処理マウスは、感染５日後
で65％の残存率を示すが、モルホリノ−基体ポリマーを
含有する局所軟膏で処理されたマウスは、90％の残存率
を有する。
【０１１０】
上記のモルホリノ−基体ポリマーの、試験管内及び生
体内抗−ウイルス性質に加えて、本発明のポリマーは、
従来のアンチ−センス剤に比していくつかの利点を提供
する。
体内抗−ウイルス性質に加えて、本発明のポリマーは、
従来のアンチ−センス剤に比していくつかの利点を提供
する。
【０１１１】
第一に、モルホリノポリマーは、デオキシリボヌクレ
オシド−誘導ポリマーよりも合成に費用がかからない。
これは、むしろより一層得がたくかつより一層高価なデ
オキシリボヌクレオシドよりもポリマー合成で使用され
るモルホリノサブユニットをリボヌクレオシドから導か
れるという事実に部分的に基づく。また上述の様に、リ
ンと第二サブユニットのアミンの間のカップリング反応
は、比較的穏やかな条件下に生じるので、保護工程及び
望まれない反応を避けるために必要とされる他の予防策
は簡略化される。このことは標準のリボ−及びデオキシ
リボヌクレオチドポリマー合成とは対照的であり、その
合成に於て、ホスフアートエステルリンケージによるカ
ップリングは、カップリング試剤が高度に反応でなけれ
ばならず、かつ反応をきびしい反応／保護条件下に実施
しなければならないことを要求する。ポリマー合成に於
けるこの利点は、当然のことながらポリマーの診断使用
にもむけられる。
オシド−誘導ポリマーよりも合成に費用がかからない。
これは、むしろより一層得がたくかつより一層高価なデ
オキシリボヌクレオシドよりもポリマー合成で使用され
るモルホリノサブユニットをリボヌクレオシドから導か
れるという事実に部分的に基づく。また上述の様に、リ
ンと第二サブユニットのアミンの間のカップリング反応
は、比較的穏やかな条件下に生じるので、保護工程及び
望まれない反応を避けるために必要とされる他の予防策
は簡略化される。このことは標準のリボ−及びデオキシ
リボヌクレオチドポリマー合成とは対照的であり、その
合成に於て、ホスフアートエステルリンケージによるカ
ップリングは、カップリング試剤が高度に反応でなけれ
ばならず、かつ反応をきびしい反応／保護条件下に実施
しなければならないことを要求する。ポリマー合成に於
けるこの利点は、当然のことながらポリマーの診断使用
にもむけられる。
【０１１２】
第二に、そのターゲットに結合するポリマーは、DNA
−タイプアンチセンス剤を用いるよりも良好なターゲッ
ト不活性化を生じる。というのはモルホリノポリマー／
ターゲット二重体が細胞中で二重にほどけるメカニズム
に敏感であるからである。
−タイプアンチセンス剤を用いるよりも良好なターゲッ
ト不活性化を生じる。というのはモルホリノポリマー／
ターゲット二重体が細胞中で二重にほどけるメカニズム
に敏感であるからである。
【０１１３】第三に、モルホリノ−基体ポリマーは、DN
A,RNA,及びそのチオホスフアート−結合同族体よりも細
胞内でも安定である。というのはモルホリノポリマー骨
格リンケージが細胞ヌクレアーゼによる開裂に敏感でな
いからである。
A,RNA,及びそのチオホスフアート−結合同族体よりも細
胞内でも安定である。というのはモルホリノポリマー骨
格リンケージが細胞ヌクレアーゼによる開裂に敏感でな
いからである。
【０１１４】第四に、化合物の細胞吸収を伴う治療適用
で、非電荷モルホリノポリマーは、電荷オリゴヌクレオ
チドよりももっと有効に細胞に入り込む。
で、非電荷モルホリノポリマーは、電荷オリゴヌクレオ
チドよりももっと有効に細胞に入り込む。
【０１１５】治療適用の状況に於て、本発明のモルホリ
ノポリマーを二本−鎖遺伝子配列をターゲットにし、第
８図に示した様にその配列中である鎖は主にプリンを有
し、もう一方の鎖は主にピリミジンを有する。
ノポリマーを二本−鎖遺伝子配列をターゲットにし、第
８図に示した様にその配列中である鎖は主にプリンを有
し、もう一方の鎖は主にピリミジンを有する。
【０１１６】更に、メッセンジャーRNAが二重ターゲッ
ト配列のほとんどプリン鎖によって暗号化される時、二
重鎖にターゲットされるモルホニノ結合ポリマーは、mR
NAを不活性化するための能力も有する。かくして、この
様なポリマーは、一本−鎖及び二本−鎖形の両方中に病
原体のキー遺伝子配列を不活性化するための能力を有す
る。
ト配列のほとんどプリン鎖によって暗号化される時、二
重鎖にターゲットされるモルホニノ結合ポリマーは、mR
NAを不活性化するための能力も有する。かくして、この
様なポリマーは、一本−鎖及び二本−鎖形の両方中に病
原体のキー遺伝子配列を不活性化するための能力を有す
る。
【０１１７】1981年に、原核mRNAsのシヤイン−ダルガ
ルノ共通配列の部分に相補的な短い（３ないし７サブユ
ニット）メチルホスホナート−結合されたDNA同族体
は、微生物ライゼート及び微生物の特別な浸透性株中で
微生物によるたん白合成を崩壊させるのに有効であると
報告された。しかし、この様な試剤は、標準の微生物中
でたん白合成を阻害するのに役立たなかった（ジエアー
マン,1981）。
ルノ共通配列の部分に相補的な短い（３ないし７サブユ
ニット）メチルホスホナート−結合されたDNA同族体
は、微生物ライゼート及び微生物の特別な浸透性株中で
微生物によるたん白合成を崩壊させるのに有効であると
報告された。しかし、この様な試剤は、標準の微生物中
でたん白合成を阻害するのに役立たなかった（ジエアー
マン,1981）。
【０１１８】
本発明を補助するために行われた実験は、長さ３ない
し５サブユニットのポリマーが、高いターゲット−結合
親和性を生じる塩基の組合せを用いることによって標準
微生物中でのたん白合成を止めるのに有効であることを
示す。更に特異的に、次のオリゴマー及びオリゴマー組
合せは、標準無傷の微生物中でたん白合成をかき乱すこ
とができる（そこでＤは2,6−ジアミノプリン又はアデ
ニンである;Gはグアニンである;Bは５−ブロモウラシ
ル、他の５−ハロウラシル又はウラシルである；及び配
列は左にその５′末端を有して示される）:DGG,BDDG,DD
GG;DGGD;GGDG;GDGG;DGGB;GGBG;GGAGG;GGDGG;及び組合せ
BDD＋GGDG;DDG＋GDGG;DGG＋DGGB;GGD＋GGBG;BDDG＋GDG;
DDGG＋DGG;DGGD＋GGB;GGDG＋GBG;BDD＋GGDG＋GBG. 短い結合−増加させるオリゴマーの使用は、RNA配列
の生物学的活性を崩壊し、その配列は生物のターゲット
クラスの物質代謝に主要な役割を果すが、より多くの生
物中での同様に重要な役割は、より長いポリマーの入口
を排除する細胞壁を有する種々の病原性生物（たとえば
微生物及びカビ）に幅広く適応させてはならない。
し５サブユニットのポリマーが、高いターゲット−結合
親和性を生じる塩基の組合せを用いることによって標準
微生物中でのたん白合成を止めるのに有効であることを
示す。更に特異的に、次のオリゴマー及びオリゴマー組
合せは、標準無傷の微生物中でたん白合成をかき乱すこ
とができる（そこでＤは2,6−ジアミノプリン又はアデ
ニンである;Gはグアニンである;Bは５−ブロモウラシ
ル、他の５−ハロウラシル又はウラシルである；及び配
列は左にその５′末端を有して示される）:DGG,BDDG,DD
GG;DGGD;GGDG;GDGG;DGGB;GGBG;GGAGG;GGDGG;及び組合せ
BDD＋GGDG;DDG＋GDGG;DGG＋DGGB;GGD＋GGBG;BDDG＋GDG;
DDGG＋DGG;DGGD＋GGB;GGDG＋GBG;BDD＋GGDG＋GBG. 短い結合−増加させるオリゴマーの使用は、RNA配列
の生物学的活性を崩壊し、その配列は生物のターゲット
クラスの物質代謝に主要な役割を果すが、より多くの生
物中での同様に重要な役割は、より長いポリマーの入口
を排除する細胞壁を有する種々の病原性生物（たとえば
微生物及びカビ）に幅広く適応させてはならない。
【０１１９】
次の例は、サブユニット及びポリマー合成の方法、及
び本発明のポリマー組成物の使用を示す。本発明は例に
よって限定されない。
び本発明のポリマー組成物の使用を示す。本発明は例に
よって限定されない。
【０１２０】
例１
リボヌクレオシドの塩基保護
次にリボヌクレオシドを、シグマケミカル社、（セン
トルイス、ミズリー）から得る：ウリジン、グアノシ
ン、５−メチルウリジン、アデノシン、シチジン、５−
ブロモウリジン、及びイソシン。
トルイス、ミズリー）から得る：ウリジン、グアノシ
ン、５−メチルウリジン、アデノシン、シチジン、５−
ブロモウリジン、及びイソシン。
【０１２１】
2,6−ジアミノ−９−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）−9
H−プリン（2,6−ジアミノプリンリボシド）を、フアル
ツ及びバウアー（Pfoltz and Bauer）社、アセトケミカ
ル社の支社（ウオーターバリー、コネチカット）から得
る。次のヌクレオシドを提示した文献の方法で製造す
る： １−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジン（２
−ヒドロキシ−ピリミジンリボシド）を、ニードバラ
（Niedballa）の処理によって製造する。
H−プリン（2,6−ジアミノプリンリボシド）を、フアル
ツ及びバウアー（Pfoltz and Bauer）社、アセトケミカ
ル社の支社（ウオーターバリー、コネチカット）から得
る。次のヌクレオシドを提示した文献の方法で製造す
る： １−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジン（２
−ヒドロキシ−ピリミジンリボシド）を、ニードバラ
（Niedballa）の処理によって製造する。
【０１２２】
２−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル）−1,6−
ジヒドロ−6h プリン−６−チオン（チオグアノシン）
を、フオックス（Fox）の処理によって製造する。ジメ
トキシトリメチルクロライド、N6−ベンゾイルアデノシ
ン、N4−ベンゾイルシチジン、及びN2−ベンゾイルグア
ノシンが、シグマケミカルから得られる。９−フルオレ
ニルメトキシカルボニルクロライド（FMOC クロライ
ド）、トリメチルクロロシラン、無水イソ酪酸、４−ニ
トロベンゾイルクロライド、無水ナフタリン酸、及び反
応及びクロマトグラフィーに対するすべての有機溶剤が
アルドリッチケミカル社（ミルウォキー、ウイスコンシ
ン）から得られる。シリカゲルがEMサイエンス（チエリ
ーヒル、ニュージヤージー）から得られる。
ジヒドロ−6h プリン−６−チオン（チオグアノシン）
を、フオックス（Fox）の処理によって製造する。ジメ
トキシトリメチルクロライド、N6−ベンゾイルアデノシ
ン、N4−ベンゾイルシチジン、及びN2−ベンゾイルグア
ノシンが、シグマケミカルから得られる。９−フルオレ
ニルメトキシカルボニルクロライド（FMOC クロライ
ド）、トリメチルクロロシラン、無水イソ酪酸、４−ニ
トロベンゾイルクロライド、無水ナフタリン酸、及び反
応及びクロマトグラフィーに対するすべての有機溶剤が
アルドリッチケミカル社（ミルウォキー、ウイスコンシ
ン）から得られる。シリカゲルがEMサイエンス（チエリ
ーヒル、ニュージヤージー）から得られる。
【０１２３】
サブユニットの活性化を、ジハロゲン化された求電子
試薬（たとえばＰ（Ｏ）Cl2N（CH3）２又はＰ（Ｓ）Cl2
N（CH3）２）を用いて行った場合、活性化されたサブユ
ニットのより良い収量を、プリン及びピリミジンエキソ
環状アミン上に全く酸性プロトンを遊離しない保護基を
使用することによってしばしば得られる。この様なエキ
ソ環状アミン部分の例は、次の通りである：アデノシン
のN6、チトシンのN4、グアニンのN2、及びジアミノプリ
ンのN2及びN6。この目的に適する保護基は、ナフタロイ
ル基（デクスヒト）及びマクブライド（McBride）等（1
986）によって開発されたアミジン基を有する。更に、
サブユニット活性化にジハロゲン化された求電子試薬を
使用することは、一般により良い結果が得られる。その
際グアニン部分の06を保護する；この保護を、ｐ−ニト
ロフエネチル基を用いて行う（トリヒチンガー）。
試薬（たとえばＰ（Ｏ）Cl2N（CH3）２又はＰ（Ｓ）Cl2
N（CH3）２）を用いて行った場合、活性化されたサブユ
ニットのより良い収量を、プリン及びピリミジンエキソ
環状アミン上に全く酸性プロトンを遊離しない保護基を
使用することによってしばしば得られる。この様なエキ
ソ環状アミン部分の例は、次の通りである：アデノシン
のN6、チトシンのN4、グアニンのN2、及びジアミノプリ
ンのN2及びN6。この目的に適する保護基は、ナフタロイ
ル基（デクスヒト）及びマクブライド（McBride）等（1
986）によって開発されたアミジン基を有する。更に、
サブユニット活性化にジハロゲン化された求電子試薬を
使用することは、一般により良い結果が得られる。その
際グアニン部分の06を保護する；この保護を、ｐ−ニト
ロフエネチル基を用いて行う（トリヒチンガー）。
【０１２４】
グアノシン
サブユニット活性化の間副反応を最小化するために、
トリヒチンガー等（1983）の処理を用いてN2及び06両方
でグアニン部分を保護することがしばしば望まれるから
である。
トリヒチンガー等（1983）の処理を用いてN2及び06両方
でグアニン部分を保護することがしばしば望まれるから
である。
【０１２５】
グアノシンのN2 ９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル誘導体を、ヌクレオシドアミノ基の保護に一般的であ
る以下の操作によって製造する：グアノシン（１モル）
をピリジン（5ml）中に懸濁し、トリメチル−クロロシ
ラン（5mmol）で処理する。溶液を15分間撹拌後、９−
フルオレニルメトキシ−カルボニルクロライド（5mmo
l）を加え、溶液を室温で３時間維持する。反応を氷浴
中で冷却し、水（1ml）を加える。５分間の撹拌後、濃
アンモニア（1ml）を加え、反応を15分間撹拌する。溶
液をほぼ蒸発乾固し、残渣をクロロホルム（10ml）中に
溶解する。この溶液を重炭酸ナトリウム溶液（5ml,10
％）で洗滌し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発する。残
渣を数回トルエンで蒸発し、生成物を、メチレンクロラ
イド（０−50％）中のメタノールの勾配を用いてシリカ
ゲル上でクロマトグラフィー分離する。
ル誘導体を、ヌクレオシドアミノ基の保護に一般的であ
る以下の操作によって製造する：グアノシン（１モル）
をピリジン（5ml）中に懸濁し、トリメチル−クロロシ
ラン（5mmol）で処理する。溶液を15分間撹拌後、９−
フルオレニルメトキシ−カルボニルクロライド（5mmo
l）を加え、溶液を室温で３時間維持する。反応を氷浴
中で冷却し、水（1ml）を加える。５分間の撹拌後、濃
アンモニア（1ml）を加え、反応を15分間撹拌する。溶
液をほぼ蒸発乾固し、残渣をクロロホルム（10ml）中に
溶解する。この溶液を重炭酸ナトリウム溶液（5ml,10
％）で洗滌し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発する。残
渣を数回トルエンで蒸発し、生成物を、メチレンクロラ
イド（０−50％）中のメタノールの勾配を用いてシリカ
ゲル上でクロマトグラフィー分離する。
【０１２６】
Ｎ−２−イソブチルグアノシンをレトシンガーの方法
によって製造する。更にニトロフエネチル部分を有する
06の保護はしばしば望まれ、いくつかの方法によって実
施することができる（ガイト、1984）。
によって製造する。更にニトロフエネチル部分を有する
06の保護はしばしば望まれ、いくつかの方法によって実
施することができる（ガイト、1984）。
【０１２７】
Ｎ−２−アセチルグアノシンを、リーゼの方法でよっ
て得る。Ｎ−２−ナフタロイルグアノシンを、デクスヒ
ットの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオシ
ドアミン基の保護に関する一般的方法を提供する。 アデノシン Ｎ−６−２−（４−ニトロフエニル）−エトキシカル
ボニル誘導体を、ヒンメルスバッハの方法によって製造
する。
て得る。Ｎ−２−ナフタロイルグアノシンを、デクスヒ
ットの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオシ
ドアミン基の保護に関する一般的方法を提供する。 アデノシン Ｎ−６−２−（４−ニトロフエニル）−エトキシカル
ボニル誘導体を、ヒンメルスバッハの方法によって製造
する。
【０１２８】
Ｎ−6 84−ニトロベンゾイル）アデノシンを、４−ニ
トロ−ベンゾイルクロライドをFMOCクロライドに置き代
えた他は、FMOC−グアノシンに対する上記操作によって
製造する。
トロ−ベンゾイルクロライドをFMOCクロライドに置き代
えた他は、FMOC−グアノシンに対する上記操作によって
製造する。
【０１２９】
Ｎ−6 2−（フエニルスルホニル）−エトキシカルボ
ニル誘導体を、２−（フエニルスルホニル）−エチルク
ロロホルマート（バルビゴン）をアシル化剤として使用
し、Ｎ−メチルイミダゾール又はピリミジン及びＮ−メ
チルイミダゾール又はピリジンを溶剤として使用する他
は、FMOCグアノシンに対する操作によって製造する。
ニル誘導体を、２−（フエニルスルホニル）−エチルク
ロロホルマート（バルビゴン）をアシル化剤として使用
し、Ｎ−メチルイミダゾール又はピリミジン及びＮ−メ
チルイミダゾール又はピリジンを溶剤として使用する他
は、FMOCグアノシンに対する操作によって製造する。
【０１３０】
Ｎ−6 ナフトイルアデノシンを、デクスヒットの方法
によって製造する；この文献は、ヌクレオシドアミン基
の保護に関する一般的方法を提供する。
によって製造する；この文献は、ヌクレオシドアミン基
の保護に関する一般的方法を提供する。
【０１３１】
2,6−ジアミノプリン リボシド
2,6−ジアミノプリン リボシドのＮ−2,N−６−ビス
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体を、グ
アノシンに関して記載された一般的操作によって製造す
る。
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体を、グ
アノシンに関して記載された一般的操作によって製造す
る。
【０１３２】
Ｎ−2,N−６−ビス（イソブチリル）誘導体をグアノ
シンに関して記載された一般的操作によって製造する。
シンに関して記載された一般的操作によって製造する。
【０１３３】
チオグアノシン
チオグアノシンのＮ−２（９−フルオレニルメトキシ
カルボニル）誘導体を、グアノシンに関して記載された
一般的操作によって製造する。
カルボニル）誘導体を、グアノシンに関して記載された
一般的操作によって製造する。
【０１３４】
ウリジン
サブユニット活性化工程の間、所望されない副生成物
を最小化するために、時々ウラシル部分のN3を保護する
ことが時々望まれる。５′Ｏ−トリチレート化されたウ
リジン−２′,3′−アセトニドをカミムラ等（1983）の
操作によってN3アニソイル誘導体に変える。次いで生成
物をTHF中で熱い80％酢酸又は0.1N HClで処理して、リ
ボース部分上の保護基を切断する。
を最小化するために、時々ウラシル部分のN3を保護する
ことが時々望まれる。５′Ｏ−トリチレート化されたウ
リジン−２′,3′−アセトニドをカミムラ等（1983）の
操作によってN3アニソイル誘導体に変える。次いで生成
物をTHF中で熱い80％酢酸又は0.1N HClで処理して、リ
ボース部分上の保護基を切断する。
【０１３５】
例２
５′−OH−モルホリノサブユニットの合成
処理中の工程を、第５図中に示された構造に関連し
て、第５図中に表示す。
て、第５図中に表示す。
【０１３６】
塩基−保護されたリボヌクレオシドをペリオダートで
酸化し、２′−３′ジアルデヒドとなす（構造１）。ジ
アルデヒドをアンモニア又は第一アミン上で閉環し（構
造２）、２′及び３′ヒドロキシル（親リボース中に於
けるとして番号をつける）を、シアノボロヒドリドで還
元して除く（構造３）。
酸化し、２′−３′ジアルデヒドとなす（構造１）。ジ
アルデヒドをアンモニア又は第一アミン上で閉環し（構
造２）、２′及び３′ヒドロキシル（親リボース中に於
けるとして番号をつける）を、シアノボロヒドリドで還
元して除く（構造３）。
【０１３７】
この一般的合成式の例は、塩基−保護されたチトシン
（Pi＊）モルホリノサブユニットの合成に関連して以下
に記載する。メタノール1.6lに、撹拌しながら水100ml
中に溶解されたN4−ベンゾイルシチジン0.1モル及びナ
トリウムペリオダート0.105モルを加える。５分後、ア
ンモニウムビボラート0.12モルを加え、混合物を１時間
室温で撹拌し、冷やし、濾過する。濾液に、ナトリウム
シアノボロヒドリド0.12モルを加える。10分後、トリエ
ンスルホン酸0.20モルを加える。更に30分後、更にトル
エンスルホン酸0.20モルを加え、混合物を冷やし、濾過
する。固形の沈殿物を水500mlづつで２回洗滌し、減圧
下に乾燥して、構造３中に示される遊離アミンのトシル
レート塩を生じる。
（Pi＊）モルホリノサブユニットの合成に関連して以下
に記載する。メタノール1.6lに、撹拌しながら水100ml
中に溶解されたN4−ベンゾイルシチジン0.1モル及びナ
トリウムペリオダート0.105モルを加える。５分後、ア
ンモニウムビボラート0.12モルを加え、混合物を１時間
室温で撹拌し、冷やし、濾過する。濾液に、ナトリウム
シアノボロヒドリド0.12モルを加える。10分後、トリエ
ンスルホン酸0.20モルを加える。更に30分後、更にトル
エンスルホン酸0.20モルを加え、混合物を冷やし、濾過
する。固形の沈殿物を水500mlづつで２回洗滌し、減圧
下に乾燥して、構造３中に示される遊離アミンのトシル
レート塩を生じる。
【０１３８】
中位に強い（pKa＜３）芳香族酸、たとえばトルエン
スルホン酸又は２−ナフタレンスルホン酸の使用は、容
易な処理、著しく改良された収量、及び生成物純度の高
いレベルを提供する。
スルホン酸又は２−ナフタレンスルホン酸の使用は、容
易な処理、著しく改良された収量、及び生成物純度の高
いレベルを提供する。
【０１３９】
次いで塩基−保護されたモルホリノサブユニットを、
トリチルクロライド又はベンジヒドラールニトロフエニ
ルカルボナートを用いてモルホリノ環の輪状窒素で保護
する（構造４）。その代りに、５′ヒドロキシルを、ト
リアルキルシリル基で保護することができる。
トリチルクロライド又はベンジヒドラールニトロフエニ
ルカルボナートを用いてモルホリノ環の輪状窒素で保護
する（構造４）。その代りに、５′ヒドロキシルを、ト
リアルキルシリル基で保護することができる。
【０１４０】
保護工程の例としては、アセトニトリル２リットル
に、撹拌しながらトシラート塩0.1モル、次いでトリエ
チルアミン0.26モル及びトリチルクロライド0.15モルを
加える混合物をおおい、１時間室温で撹拌し、その後メ
タノール100mlmを加え、次いで15分間撹拌する。回転蒸
発器によって乾燥後、メタノール400mlmを加える。固体
を十分にスラリーとして懸濁した後に、水5lを加え、混
合物を30分間撹拌し、濾過する。固体を水1lで洗滌し、
濾過し、減圧で乾燥する。固体をジクロロメタン500ml
中に懸濁し、沈殿がまさに開始するまで回転蒸発し、そ
の後ヘキサン1lを加え、15分間撹拌する。固体を濾過に
よって除去し、減圧で乾燥する。
に、撹拌しながらトシラート塩0.1モル、次いでトリエ
チルアミン0.26モル及びトリチルクロライド0.15モルを
加える混合物をおおい、１時間室温で撹拌し、その後メ
タノール100mlmを加え、次いで15分間撹拌する。回転蒸
発器によって乾燥後、メタノール400mlmを加える。固体
を十分にスラリーとして懸濁した後に、水5lを加え、混
合物を30分間撹拌し、濾過する。固体を水1lで洗滌し、
濾過し、減圧で乾燥する。固体をジクロロメタン500ml
中に懸濁し、沈殿がまさに開始するまで回転蒸発し、そ
の後ヘキサン1lを加え、15分間撹拌する。固体を濾過に
よって除去し、減圧で乾燥する。
【０１４１】
上記操作は、モルホリノ窒素上でトリチレート化され
た及び遊離５′ヒドロキシルを有する塩基−保護された
モルホリノサブユニットを生じる（構造４）。
た及び遊離５′ヒドロキシルを有する塩基−保護された
モルホリノサブユニットを生じる（構造４）。
【０１４２】
例３
モルノリノサブユニットの他の合成
この例に、モルホリノ環窒素に結合した酸−不安定部
分を含有するモルホリノサブユニットの他の製造を示
す。
分を含有するモルホリノサブユニットの他の製造を示
す。
【０１４３】
サブユニットを、例２に於ける様に、リボヌクレオシ
ドをペリオダートで酸化し、生じるジアルデヒド（構造
１）を、ベンゾトリアゾール、又はｐ−ニトロフエノー
ルで緩衝された第１アミン4,4′−ジメトキシベンズヒ
ドリルアミン（これはグリーンリーの方法によって製造
することができる1984）上で閉環して製造する。例２に
於ける様に行われる、ナトリウムシアノボロヒドリドで
の還元は、モルホリノ窒素上に4,4′−ジメトキシベン
ズヒドリル基を有するモルホリノサブユニット（構造
２）を生じる。
ドをペリオダートで酸化し、生じるジアルデヒド（構造
１）を、ベンゾトリアゾール、又はｐ−ニトロフエノー
ルで緩衝された第１アミン4,4′−ジメトキシベンズヒ
ドリルアミン（これはグリーンリーの方法によって製造
することができる1984）上で閉環して製造する。例２に
於ける様に行われる、ナトリウムシアノボロヒドリドで
の還元は、モルホリノ窒素上に4,4′−ジメトキシベン
ズヒドリル基を有するモルホリノサブユニット（構造
２）を生じる。
【０１４４】
この操作の１つの特徴は、塩基（たとえばウリジン）
上に保護基を有しないリボヌクレオシドからモルホリノ
サブユニットを製造するのに特に有用であることであ
る。
上に保護基を有しないリボヌクレオシドからモルホリノ
サブユニットを製造するのに特に有用であることであ
る。
【０１４５】
例４
５′−ホスホナートサブユニットの合成
この方法の工程を、第５図中の構造に関連して示す。
【０１４６】
二重−保護されたモルホリノサブユニットの５′−ヒ
ドロキシル（構造４）を、次の様にホスホナートに変え
る。N4−ベンゾイルシチジン−２′,3′−アセトニド
（1mmol）を、20時間室温でアルゴン下でDMF（20ml）中
メチルトリフエノキシホスホニウムヨーダイドと反応さ
せて、５′−ヨード誘導体に変える。メタノール（5m
l）を、反応混合物に加え、30分後混合物を減圧で蒸発
する。残渣を酢酸エチル中で溶解し、溶液を先ず水性チ
オ硫酸ナトリウムで、次いでブラインで洗滌する。硫酸
ナトリウムで乾燥し、溶剤の蒸発後、生成物をイソプロ
パノール／クロロホルム溶剤を用いてシリカ上でクロマ
トグラフィーによって精製する。
ドロキシル（構造４）を、次の様にホスホナートに変え
る。N4−ベンゾイルシチジン−２′,3′−アセトニド
（1mmol）を、20時間室温でアルゴン下でDMF（20ml）中
メチルトリフエノキシホスホニウムヨーダイドと反応さ
せて、５′−ヨード誘導体に変える。メタノール（5m
l）を、反応混合物に加え、30分後混合物を減圧で蒸発
する。残渣を酢酸エチル中で溶解し、溶液を先ず水性チ
オ硫酸ナトリウムで、次いでブラインで洗滌する。硫酸
ナトリウムで乾燥し、溶剤の蒸発後、生成物をイソプロ
パノール／クロロホルム溶剤を用いてシリカ上でクロマ
トグラフィーによって精製する。
【０１４７】
上記製造されたヨーダイド誘導体を、十分に密封され
た容器中で２日間50℃でエタノール中で大過剰の無水ホ
スフインで処理する。この期間の終了時に、容器を冷却
し、放出し、そして過剰ホスフィンを徐々に蒸発させ
る。排出された蒸気を、次亜塩素酸ナトリウムを含有す
る溶液中であわ立て、毒性ガスを分解する。第一ホスフ
ィンのアルコール性溶液を溶液を冷却しながら固形炭酸
ナトリウム及び冷えた過剰の30％過酸化水素で処理す
る。精製物ホスホン酸を、アニオン交換カラム上でイオ
ン交換クロマトグラフィーによって精製する。
た容器中で２日間50℃でエタノール中で大過剰の無水ホ
スフインで処理する。この期間の終了時に、容器を冷却
し、放出し、そして過剰ホスフィンを徐々に蒸発させ
る。排出された蒸気を、次亜塩素酸ナトリウムを含有す
る溶液中であわ立て、毒性ガスを分解する。第一ホスフ
ィンのアルコール性溶液を溶液を冷却しながら固形炭酸
ナトリウム及び冷えた過剰の30％過酸化水素で処理す
る。精製物ホスホン酸を、アニオン交換カラム上でイオ
ン交換クロマトグラフィーによって精製する。
【０１４８】
対イオンはトリエチルアンモニウムであるこのジアニ
オンホスフアート精製物を、所望のペンダントＸ部分の
カルボジイミド−媒介付加を生じる（第3a図）過剰の試
剤と混合する。適する試剤の例は、次の通りである；メ
タノールの添加は、Ｘ−メトキシを生じる；そしてジメ
チルアミンの付加は、Ｘ＝Ｎ（CH3）２を生じる。この
混合物に、カルボジイミド、たとえばDCC,を加える。生
じるサブユニットは、第3a図中に示される形である。実
質上より小さい塩基性対イオン（たとえばピリジン）を
使用してはならない。というのは２個のＸ部分をホスホ
ナート部分に加えねばならないからである。
オンホスフアート精製物を、所望のペンダントＸ部分の
カルボジイミド−媒介付加を生じる（第3a図）過剰の試
剤と混合する。適する試剤の例は、次の通りである；メ
タノールの添加は、Ｘ−メトキシを生じる；そしてジメ
チルアミンの付加は、Ｘ＝Ｎ（CH3）２を生じる。この
混合物に、カルボジイミド、たとえばDCC,を加える。生
じるサブユニットは、第3a図中に示される形である。実
質上より小さい塩基性対イオン（たとえばピリジン）を
使用してはならない。というのは２個のＸ部分をホスホ
ナート部分に加えねばならないからである。
【０１４９】
例５
Ｎ−メタンホスホナートモルホリノサブユニットの合成
この例に、７−原子単位−長さの骨格を有するポリマ
ー（第3d図）を製造するのに適するモルホリノ環窒素に
結合するメチルホスホナート部分を有するサブユニット
の製造を示す。この工程を、第７図中に示される構造に
関して示す。
ー（第3d図）を製造するのに適するモルホリノ環窒素に
結合するメチルホスホナート部分を有するサブユニット
の製造を示す。この工程を、第７図中に示される構造に
関して示す。
【０１５０】
塩基−保護されたリボヌクレオシドとジ（ｐ−メトキ
シ）トリチルクロライドとを反応させて、構造１を生じ
る。次いでリボース部分を、アミノメタンホスホン酸
（AMPA）及びＮ−エチルモルホリンの存在下にパーリオ
ダートで酸化する。酸化をナトリウムシアノボロヒドリ
ドでベンゾトリアゾールの存在下に還元して、モルホリ
ノ窒素上にメタンホスホン酸基を有するモルホリノサブ
ユニットを生じる（構造２）。その後精製物を、トリエ
チルアミン中にクロロホルム／メタノール混合物１％で
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
する。
シ）トリチルクロライドとを反応させて、構造１を生じ
る。次いでリボース部分を、アミノメタンホスホン酸
（AMPA）及びＮ−エチルモルホリンの存在下にパーリオ
ダートで酸化する。酸化をナトリウムシアノボロヒドリ
ドでベンゾトリアゾールの存在下に還元して、モルホリ
ノ窒素上にメタンホスホン酸基を有するモルホリノサブ
ユニットを生じる（構造２）。その後精製物を、トリエ
チルアミン中にクロロホルム／メタノール混合物１％で
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
する。
【０１５１】
対イオンはトリエチルアンモニウムであるこのジアニ
オンホスホナート精製物を、所望のペンダントＸ部分
（構造3d）の付加を生じる過剰の試剤と混合する。適す
る試剤の例は次の通りである：メタノールの付加はＸ＝
メトキシを生じる；そしてジメチルアミンの付加は、Ｘ
＝Ｎ（CH3）２を生じる。この混合物に、カルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）
を加えて、第７図の構造３を生じる。実質上より小さい
塩基性対イオン（たとえばピリジン）を使用した場合、
２個のＸ部分はホスホナート部分に加わる。
オンホスホナート精製物を、所望のペンダントＸ部分
（構造3d）の付加を生じる過剰の試剤と混合する。適す
る試剤の例は次の通りである：メタノールの付加はＸ＝
メトキシを生じる；そしてジメチルアミンの付加は、Ｘ
＝Ｎ（CH3）２を生じる。この混合物に、カルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）
を加えて、第７図の構造３を生じる。実質上より小さい
塩基性対イオン（たとえばピリジン）を使用した場合、
２個のＸ部分はホスホナート部分に加わる。
【０１５２】
例６
５′ヒドロキシから５′アミンへ及び５′スルホヒドラ
ールへの変換 A.アミンへの変換 二重−保護されたモルホリノサブユニットの５′ヒド
ロキシル（構造4,第５図）を、次の様にアミンに変える
ことができる。DMSO 500mlに、ピリジン（Pyr）1.0モ
ル、トリフルオロ酢酸（TFA）0.5モル、及びモルホリノ
サブユニット0.1モルを加える。混合物を、すべての成
分が溶解するまで撹拌し、次いで0.5モルのジイソプロ
ピルカルボジイミド（DIC）又はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）のどちらかを加える。２時間後、反
応混合物を、急速に撹拌されたブライン8lに加える。こ
の溶液を30分間撹拌し、次いで濾過する。生じる固体を
簡単に乾燥し、氷冷ヘキサン1lで洗滌し、濾過する。固
体をメタノール1l中でナトリウムシアノボロヒドリド0.
2モルに加え、10分間撹拌する。この混合物に、0.4モル
のベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフエノールを加
え、メチルアミン（H2O中で40％）0.2モルの添加を続け
る。調製物を、室温で４時間撹拌する。〔注：ベンゾト
リアゾール又はｐ−ニトロフエノールは、還元アルキル
化のイミニウム工程でサブユニットの４′炭素でラセミ
化を保護するために反応混合物を緩衝する。〕最後に、
反応混合物を、水5l中に注ぎ入れ、良好な沈殿が形成さ
れるまで撹拌し、固体（構造6,第５図）を集め、次いで
乾燥する。
ールへの変換 A.アミンへの変換 二重−保護されたモルホリノサブユニットの５′ヒド
ロキシル（構造4,第５図）を、次の様にアミンに変える
ことができる。DMSO 500mlに、ピリジン（Pyr）1.0モ
ル、トリフルオロ酢酸（TFA）0.5モル、及びモルホリノ
サブユニット0.1モルを加える。混合物を、すべての成
分が溶解するまで撹拌し、次いで0.5モルのジイソプロ
ピルカルボジイミド（DIC）又はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）のどちらかを加える。２時間後、反
応混合物を、急速に撹拌されたブライン8lに加える。こ
の溶液を30分間撹拌し、次いで濾過する。生じる固体を
簡単に乾燥し、氷冷ヘキサン1lで洗滌し、濾過する。固
体をメタノール1l中でナトリウムシアノボロヒドリド0.
2モルに加え、10分間撹拌する。この混合物に、0.4モル
のベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフエノールを加
え、メチルアミン（H2O中で40％）0.2モルの添加を続け
る。調製物を、室温で４時間撹拌する。〔注：ベンゾト
リアゾール又はｐ−ニトロフエノールは、還元アルキル
化のイミニウム工程でサブユニットの４′炭素でラセミ
化を保護するために反応混合物を緩衝する。〕最後に、
反応混合物を、水5l中に注ぎ入れ、良好な沈殿が形成さ
れるまで撹拌し、固体（構造6,第５図）を集め、次いで
乾燥する。
【０１５３】
B.スルヒドラルへの変換
二重−保護されたモルホリノサブユニットの５′ヒド
ロキシルを、次の様にスルヒドラルへ変換する。1/10モ
ルの５′−ヒドロキシルサブユニット（構造4,第５図）
を、ピリジン1lに加え、次いでトルエンスルホニルクロ
チイド0.12モルを加える。この溶液を、室温で３時間撹
拌し、反応は第５図の構造７として示された生成物を生
じる。ピリジンを回転蒸発によって除き、固体にNa Iを
含有するメタノールDMF 1l中で新鮮なナトリウムヒドロ
スルフイッド0.5モルを加える。この反応混合物を室温
で一晩撹拌する。混合物を水5lに加え、20分撹拌し、乾
燥して、第５図の構造８として示された生成物が得られ
る。
ロキシルを、次の様にスルヒドラルへ変換する。1/10モ
ルの５′−ヒドロキシルサブユニット（構造4,第５図）
を、ピリジン1lに加え、次いでトルエンスルホニルクロ
チイド0.12モルを加える。この溶液を、室温で３時間撹
拌し、反応は第５図の構造７として示された生成物を生
じる。ピリジンを回転蒸発によって除き、固体にNa Iを
含有するメタノールDMF 1l中で新鮮なナトリウムヒドロ
スルフイッド0.5モルを加える。この反応混合物を室温
で一晩撹拌する。混合物を水5lに加え、20分撹拌し、乾
燥して、第５図の構造８として示された生成物が得られ
る。
【０１５４】
例７
５′アミノメチルホスホナートリボシドサブユニットの
合成 この例中に、リボシドに結合されたアミノメチルホス
ホナート部分を含有するリボシドサブユニットの製造を
示す。この例中に関連する構造を、第12図中に示す。
合成 この例中に、リボシドに結合されたアミノメチルホス
ホナート部分を含有するリボシドサブユニットの製造を
示す。この例中に関連する構造を、第12図中に示す。
【０１５５】
アミノメチルホスホン酸（アルドリッチ化学社）とト
リチルクロライドをトリエチルアミンの存在下に反応さ
せる。対イオンがトリエチルアンモニウムであるジアニ
オンホスホナート生成物を、所望のペンダントＸ部分の
付加（たとえばメタノールの付加はＸ＝メトキシを生
じ、ジメチルアミンの付加はＸ＝Ｎ（CH3）２を生じ
る）に適する過剰の試剤と混合し、次いでカルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）、を加える。生じるモノアニオン性生成物を、ピリ
ジニウムヒドロクロチイドを含有する水とクロロホルム
との混合物と共に振とうする。この操作は、ピリジニウ
ム対イオンを有するモノイオンホスホン酸を生じる。こ
の生成物を、N4−ベンゾイルシチジン−２′,3′−フエ
ニルホロナートを含有するクロロホルムに加え、DCCを
加える。生成物を乾燥し、メタノール／クロロホルム混
合物を用いてシリカ上でクロマトグラフィー分離する。
次いで純粋な生成物を、1,3−ジヒドロキシプロパンで
処理し、第12図の構造２を生じ、更に一部をトリフルオ
ロエタノール中で酢酸で処理し、構造１を生じる。
リチルクロライドをトリエチルアミンの存在下に反応さ
せる。対イオンがトリエチルアンモニウムであるジアニ
オンホスホナート生成物を、所望のペンダントＸ部分の
付加（たとえばメタノールの付加はＸ＝メトキシを生
じ、ジメチルアミンの付加はＸ＝Ｎ（CH3）２を生じ
る）に適する過剰の試剤と混合し、次いでカルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）、を加える。生じるモノアニオン性生成物を、ピリ
ジニウムヒドロクロチイドを含有する水とクロロホルム
との混合物と共に振とうする。この操作は、ピリジニウ
ム対イオンを有するモノイオンホスホン酸を生じる。こ
の生成物を、N4−ベンゾイルシチジン−２′,3′−フエ
ニルホロナートを含有するクロロホルムに加え、DCCを
加える。生成物を乾燥し、メタノール／クロロホルム混
合物を用いてシリカ上でクロマトグラフィー分離する。
次いで純粋な生成物を、1,3−ジヒドロキシプロパンで
処理し、第12図の構造２を生じ、更に一部をトリフルオ
ロエタノール中で酢酸で処理し、構造１を生じる。
【０１５６】
例８
ホスホンアミドリンケージを生じるカップリング
この例中、例４に於ける様に製造されたホスホナート
サブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第二サ
ブユニットとカップリングすることを示す。例を、第９
図中の構造に関連して示す。
サブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第二サ
ブユニットとカップリングすることを示す。例を、第９
図中の構造に関連して示す。
【０１５７】
出発材料は、例４で製造された、塩基−保護された、
モルホリノ窒素保護されたホスホナートサブユニットで
ある。このサブユニットのトリエチルアミン塩を、クロ
ロホルム中に懸濁し、ピリジニウムヒドロクロチイドを
含有する水で振とうし、クロロホルム相中にサブユニッ
トのピリジン塩（構造１）を生じる。有機相を分離し、
水洗し、次いで乾燥する。生じる固体の１部を、過剰の
３−ヒドロキシプロピオニトリルと混合する；次いでDC
Cを混合物に加える。生じる反応の生成物をトリフルオ
ロエタノール中で２％酢酸で脱トリチレート化し、構造
２を生じる。次いで構造１及び２を、DCCの存在下に混
合し、構造３として示された結合されたダイマーを生じ
る。このダイマーを、より長いオリゴマーブロック又は
ポリマーに集めるためのどちらかの末端で選択的に脱保
護する。シアノエチル基を、非プロトン性溶剤（たとえ
ばDMF）中でDBUと共に除去するか又はトリチル部分を上
述の様に切断することができる。
モルホリノ窒素保護されたホスホナートサブユニットで
ある。このサブユニットのトリエチルアミン塩を、クロ
ロホルム中に懸濁し、ピリジニウムヒドロクロチイドを
含有する水で振とうし、クロロホルム相中にサブユニッ
トのピリジン塩（構造１）を生じる。有機相を分離し、
水洗し、次いで乾燥する。生じる固体の１部を、過剰の
３−ヒドロキシプロピオニトリルと混合する；次いでDC
Cを混合物に加える。生じる反応の生成物をトリフルオ
ロエタノール中で２％酢酸で脱トリチレート化し、構造
２を生じる。次いで構造１及び２を、DCCの存在下に混
合し、構造３として示された結合されたダイマーを生じ
る。このダイマーを、より長いオリゴマーブロック又は
ポリマーに集めるためのどちらかの末端で選択的に脱保
護する。シアノエチル基を、非プロトン性溶剤（たとえ
ばDMF）中でDBUと共に除去するか又はトリチル部分を上
述の様に切断することができる。
【０１５８】
例９
ホスホルアミドリンケージを生じる活性化及びカップリ
ング A.X＝−CH3 例9Aに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットにカップリングして、ア
ルキルホンホンアミダートインターサブユニットリンケ
ージを生じることを示す。例を、Ｘがアルキル基であ
る、第10図中の構造に関連して示す。
ング A.X＝−CH3 例9Aに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットにカップリングして、ア
ルキルホンホンアミダートインターサブユニットリンケ
ージを生じることを示す。例を、Ｘがアルキル基であ
る、第10図中の構造に関連して示す。
【０１５９】
塩基−保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレート
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解する。この
溶液に、Ｎ−エチルモルホリン4mmol及びメチルホスホ
ンジクロライド1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はメチルチオホス
ホンジクロライド、Ｚ＝Ｓ）を加え、次いでＮ−メチル
イミダゾール1mmolを加える。１時間後、反応溶液を、
水性NaH2PO4で洗滌する。活性化されたサブユニット
を、酢酸エチルで展開されたシリカゲル上でクロマトグ
ラフィー分離して、単離する（Ｘがメチルである第10図
の構造２）。この活性化されたサブユニットは、DMF中
でこれを混合して第二サブユニット（構造３）のモルホ
リノ窒素と直接結合することができる。このカップリン
グ反応は、構造４（Ｘは−CH3である）として示された
ダイマーを生じる。
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解する。この
溶液に、Ｎ−エチルモルホリン4mmol及びメチルホスホ
ンジクロライド1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はメチルチオホス
ホンジクロライド、Ｚ＝Ｓ）を加え、次いでＮ−メチル
イミダゾール1mmolを加える。１時間後、反応溶液を、
水性NaH2PO4で洗滌する。活性化されたサブユニット
を、酢酸エチルで展開されたシリカゲル上でクロマトグ
ラフィー分離して、単離する（Ｘがメチルである第10図
の構造２）。この活性化されたサブユニットは、DMF中
でこれを混合して第二サブユニット（構造３）のモルホ
リノ窒素と直接結合することができる。このカップリン
グ反応は、構造４（Ｘは−CH3である）として示された
ダイマーを生じる。
【０１６０】
別の活性化及びカップリング操作は、ジクロロメタン
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。溶解後、
メチルホスホンジクロライド1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はメ
チルチオホスホンジクロライド、Ｚ＝Ｓ）、を加える。
２時間後、生成物（Ｘはメチルである第10図の構造２）
を、10％アセトン/90％クロロホルムで展開されたシリ
カゲル上でクロマトグラフィー分離によって単離する。
この活性化されたサブユニット1mmolをN,N−ジイソプロ
ピルアミノエチルイソブチラート（DIPAEIB）1.5mmolを
含有するジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユ
ニットのモルホリノ窒素（構造３）と直接結合させ、構
造４（Ｘは−CH3である）として示されるダイマーを生
じる。
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。溶解後、
メチルホスホンジクロライド1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はメ
チルチオホスホンジクロライド、Ｚ＝Ｓ）、を加える。
２時間後、生成物（Ｘはメチルである第10図の構造２）
を、10％アセトン/90％クロロホルムで展開されたシリ
カゲル上でクロマトグラフィー分離によって単離する。
この活性化されたサブユニット1mmolをN,N−ジイソプロ
ピルアミノエチルイソブチラート（DIPAEIB）1.5mmolを
含有するジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユ
ニットのモルホリノ窒素（構造３）と直接結合させ、構
造４（Ｘは−CH3である）として示されるダイマーを生
じる。
【０１６１】
第三アミン／エステル、DIPAEIB、をイソブチリルク
ロライド1.1モル、N,N−ｓジイソプロピルアミノエタノ
ール１モル、及びピリジン1.5モルを混合し、次いで30
分110℃で加熱して製造する。調製物を、H2O 500ml中で
NaOH 0.5モルで洗滌し、蒸発して、115℃、30mmHgで沸
騰する所望のアミン／エステルを生じる。アルキルホス
ホンアミダートインターサブユニットリンケージ（Ｘは
−CH3である構造４）は、塩基脱保護に使用されるアン
モニアに極めて安定である。対照的に、リンケージは比
較的に弱い酸に敏感である。たとえばリンケージは、ク
ロロホルムメタン中の２％シクロロ酢酸中で約３時間の
開裂半減期を有する。しかしリンケージは、トリフルオ
ロエタノール中の２％酢酸中で18時間後検出可能な開裂
を示さず、モルホリノ窒素の脱トリチレート化に適する
状態にする。 B.X＝−Ｏ−CH2CH3 例9Bに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットの活性化及び遊離のモルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットへのカップリングがホス
ホジエステルアミドインタロサブユニットリンケージを
生じることを示す。例を、Ｘがアルコキシド基である第
10図中の構造に関連して示す。
ロライド1.1モル、N,N−ｓジイソプロピルアミノエタノ
ール１モル、及びピリジン1.5モルを混合し、次いで30
分110℃で加熱して製造する。調製物を、H2O 500ml中で
NaOH 0.5モルで洗滌し、蒸発して、115℃、30mmHgで沸
騰する所望のアミン／エステルを生じる。アルキルホス
ホンアミダートインターサブユニットリンケージ（Ｘは
−CH3である構造４）は、塩基脱保護に使用されるアン
モニアに極めて安定である。対照的に、リンケージは比
較的に弱い酸に敏感である。たとえばリンケージは、ク
ロロホルムメタン中の２％シクロロ酢酸中で約３時間の
開裂半減期を有する。しかしリンケージは、トリフルオ
ロエタノール中の２％酢酸中で18時間後検出可能な開裂
を示さず、モルホリノ窒素の脱トリチレート化に適する
状態にする。 B.X＝−Ｏ−CH2CH3 例9Bに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットの活性化及び遊離のモルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットへのカップリングがホス
ホジエステルアミドインタロサブユニットリンケージを
生じることを示す。例を、Ｘがアルコキシド基である第
10図中の構造に関連して示す。
【０１６２】
塩基−保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレート
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ベンゼン80ml及びＮ−メチルイミダゾー
ル2.2mmol中に溶解する。サブユニットの溶解後、エチ
ルジクロロホスフアート1.2mmol、Ｚ＝Ｏ（又はエチル
ジクロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）を加える。１時間
後、反応溶液を、水性NaH2PO4で洗滌する。活性化され
たサブユニットを、酢酸エチルで展開されたシリカゲル
上でクロマトグラフィー分離して単離する（Ｘが−Ｏ−
CH2CH3である第10図の構造２）。この活性化されたサブ
ユニットは、DMF中でこれを混合して第二サブユニット
（構造３）のモルホリノ窒素と直接結合することができ
る。このカップリング反応は、構造４として示されたダ
イマーを生じる。
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ベンゼン80ml及びＮ−メチルイミダゾー
ル2.2mmol中に溶解する。サブユニットの溶解後、エチ
ルジクロロホスフアート1.2mmol、Ｚ＝Ｏ（又はエチル
ジクロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）を加える。１時間
後、反応溶液を、水性NaH2PO4で洗滌する。活性化され
たサブユニットを、酢酸エチルで展開されたシリカゲル
上でクロマトグラフィー分離して単離する（Ｘが−Ｏ−
CH2CH3である第10図の構造２）。この活性化されたサブ
ユニットは、DMF中でこれを混合して第二サブユニット
（構造３）のモルホリノ窒素と直接結合することができ
る。このカップリング反応は、構造４として示されたダ
イマーを生じる。
【０１６３】
エチルジクロロチオホスフアート（Ｚ＝Ｓ）をサブユ
ニットの活性化に使用する場合、改良された収量が次の
変化で得られる。モルホリノ窒素（第５図の構造４）上
で塩基−保護されかつトリチレート化された５′ヒドロ
キシルサブユニット1mmolをクロロホルム20ml中に懸濁
する。この溶液に、Ｎ−メチルイミダゾール1ml、次い
でエチルジクロロチオホスフアート1.6ml（アルドリッ
チ化学社）を加える。１時間後、サブユニット生成物
を、20％アセトン/80％クロロホルムで展開されたシリ
カゲルクロマトグラフィーによって精製する。この活性
化されたサブユニット（Ｘは−Ｏ−CH2−CH3,Zはイオウ
である構造２）を、上述の様に第二サブユニットのモル
ホリノ窒素にカップリングすることができる。
ニットの活性化に使用する場合、改良された収量が次の
変化で得られる。モルホリノ窒素（第５図の構造４）上
で塩基−保護されかつトリチレート化された５′ヒドロ
キシルサブユニット1mmolをクロロホルム20ml中に懸濁
する。この溶液に、Ｎ−メチルイミダゾール1ml、次い
でエチルジクロロチオホスフアート1.6ml（アルドリッ
チ化学社）を加える。１時間後、サブユニット生成物
を、20％アセトン/80％クロロホルムで展開されたシリ
カゲルクロマトグラフィーによって精製する。この活性
化されたサブユニット（Ｘは−Ｏ−CH2−CH3,Zはイオウ
である構造２）を、上述の様に第二サブユニットのモル
ホリノ窒素にカップリングすることができる。
【０１６４】
別の活性化及びカップリング操作は、ジクロロメタン
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。この溶液
に、N,N−ジエチルアニリン4mmol及び４−メトキシピリ
ジン−Ｎ−オキシド0.2mmolを加える。溶解後、エチル
ジクロロホスフアート1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はエチルジ
クロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）、を加える。１時間
後、生成物（Ｘはエトキシである第10図の構造２）を、
10％アセトン/90％クロロホルムで展開されたシリカル
上でクロマトグラフィー分離によって単離する。この活
性化されたサブユニット1mmolをN,N−ジイソプロピルア
ミノエチルイソブチラート（DIPAEIB）1.5mmolを含有す
るジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユニット
のモルホリノ窒素（構造３）と直接結合させ、構造４
（ＸはＯ−CH2−CH3である）として示されるダイマーを
生じる。 C.X＝−Ｆ 例9Cに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットにカップリングして、フ
ルオロホスホルアミダートインターサブユニットリンケ
ージを生じることを示す。例を、Ｘがフッ素である、第
10図中の構造に関連して示す。
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。この溶液
に、N,N−ジエチルアニリン4mmol及び４−メトキシピリ
ジン−Ｎ−オキシド0.2mmolを加える。溶解後、エチル
ジクロロホスフアート1.1mmol、Ｚ＝Ｏ（又はエチルジ
クロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）、を加える。１時間
後、生成物（Ｘはエトキシである第10図の構造２）を、
10％アセトン/90％クロロホルムで展開されたシリカル
上でクロマトグラフィー分離によって単離する。この活
性化されたサブユニット1mmolをN,N−ジイソプロピルア
ミノエチルイソブチラート（DIPAEIB）1.5mmolを含有す
るジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユニット
のモルホリノ窒素（構造３）と直接結合させ、構造４
（ＸはＯ−CH2−CH3である）として示されるダイマーを
生じる。 C.X＝−Ｆ 例9Cに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環
窒素を有する第二サブユニットにカップリングして、フ
ルオロホスホルアミダートインターサブユニットリンケ
ージを生じることを示す。例を、Ｘがフッ素である、第
10図中の構造に関連して示す。
【０１６５】
出発材料はβ脱離メカニズムで除去できる基で塩基−
保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレート化された
（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニット1mmo
lである。サブユニットをＮ−メチルイミダゾール6mmo
l、次いでフルオロリン酸2.5mmolが添加されたジクロロ
メタン20ml中に溶解する。DCC 5mmolを加え、溶液を３
時間撹拌する。反応溶液を水性NaH2PO4で洗滌し、有機
相を減圧下に乾燥し、フルオロホスフアート塩を生じる
（ＸはF,対イオンはＮ−メチルイミダゾールである構造
５）。生成物をピリジン中でメタノール／クロロホルム
混合物１％で展開されたシリカゲルクロマトグラフィー
によって精製し、ピリジニウム塩を生じる。乾燥後、精
製された生成物は、遊離モルホリノ窒素（構造６）を有
する５′−保護されたサブユニットにジクロロメタン中
でDCCを用いてカップリングするのに適する。このカル
ボジイミドカップリング反応は、構造７（ＸはＦであ
る）として示されるダイマーを生じる。
保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレート化された
（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニット1mmo
lである。サブユニットをＮ−メチルイミダゾール6mmo
l、次いでフルオロリン酸2.5mmolが添加されたジクロロ
メタン20ml中に溶解する。DCC 5mmolを加え、溶液を３
時間撹拌する。反応溶液を水性NaH2PO4で洗滌し、有機
相を減圧下に乾燥し、フルオロホスフアート塩を生じる
（ＸはF,対イオンはＮ−メチルイミダゾールである構造
５）。生成物をピリジン中でメタノール／クロロホルム
混合物１％で展開されたシリカゲルクロマトグラフィー
によって精製し、ピリジニウム塩を生じる。乾燥後、精
製された生成物は、遊離モルホリノ窒素（構造６）を有
する５′−保護されたサブユニットにジクロロメタン中
でDCCを用いてカップリングするのに適する。このカル
ボジイミドカップリング反応は、構造７（ＸはＦであ
る）として示されるダイマーを生じる。
【０１６６】
フルオロホスホルアミダートインターサブユニットリ
ンケージを含有するポリマーを、強い求核試薬、たとえ
ばアンモニアにさらしてはならない。したがって、この
様なポリマーを集めるのに使用されるサブユニットの塩
基を、強い求核試薬の使用なしに切断することができる
基で保護しなければならない。例１に記載した様にβ脱
離メカニズムを介して切断できる保護基は、この目的に
適する。 B.X＝Ｎ（CH3）２ 例9Dに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが遊離モルホリノ環窒素を有する
第二サブユニットにカップリングして、ホンホルアミダ
ートインターサブユニットリンケージを生じることを示
す。例を、Ｘが置換された窒素である、第10図中の構造
に関連して示す。
ンケージを含有するポリマーを、強い求核試薬、たとえ
ばアンモニアにさらしてはならない。したがって、この
様なポリマーを集めるのに使用されるサブユニットの塩
基を、強い求核試薬の使用なしに切断することができる
基で保護しなければならない。例１に記載した様にβ脱
離メカニズムを介して切断できる保護基は、この目的に
適する。 B.X＝Ｎ（CH3）２ 例9Dに、例２又は３に於ける様に製造された５′ヒド
ロキシルサブユニットが遊離モルホリノ環窒素を有する
第二サブユニットにカップリングして、ホンホルアミダ
ートインターサブユニットリンケージを生じることを示
す。例を、Ｘが置換された窒素である、第10図中の構造
に関連して示す。
【０１６７】
塩基−保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレート
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解する。この
溶液に、Ｎ−エチルモルホリン6mmol及びジメチルアミ
ノジクロロホスフアート（OP（Cl）2N（CH3）２）2mmo
l、Ｚ＝Ｏ（又はチオホスフアート同族体、Ｚ＝Ｓ）を
加え、次いでＮ−メチルイミダゾール0.5mmolを加え
る。反応の終了後（薄層クロマトグラフィーによって決
定する）、反応溶液を水性NaH2PO4で洗滌する。活性化
されたサブユニットを、アセトン／クロロホルムで展開
されたシリカゲル上でクロマトグラフィー分離して単離
する（ＸがＮ（CH3）２である第10図の構造２）。この
活性化されたサブユニットは、反応で生じるHClを中和
するのに十分なトリエチルアミンを含有するDHF中で第
二サブユニット（構造３）のモルホリノ窒素と直接結合
し、構造４として示されたダイマーを生じる。
化された（第５図の構造４）５′ヒドロキシルサブユニ
ット1mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解する。この
溶液に、Ｎ−エチルモルホリン6mmol及びジメチルアミ
ノジクロロホスフアート（OP（Cl）2N（CH3）２）2mmo
l、Ｚ＝Ｏ（又はチオホスフアート同族体、Ｚ＝Ｓ）を
加え、次いでＮ−メチルイミダゾール0.5mmolを加え
る。反応の終了後（薄層クロマトグラフィーによって決
定する）、反応溶液を水性NaH2PO4で洗滌する。活性化
されたサブユニットを、アセトン／クロロホルムで展開
されたシリカゲル上でクロマトグラフィー分離して単離
する（ＸがＮ（CH3）２である第10図の構造２）。この
活性化されたサブユニットは、反応で生じるHClを中和
するのに十分なトリエチルアミンを含有するDHF中で第
二サブユニット（構造３）のモルホリノ窒素と直接結合
し、構造４として示されたダイマーを生じる。
【０１６８】
蒸気操作で使用されるジメチルアミノジクロロホスフ
アート（Ｘは−Ｎ（CH3）２及びＺは酸素である）を、
次の通り製造する：オキシ塩化リン0.2モル中にジメチ
ルアミンヒドロクロライド0.1モルを含有する懸濁液
を、12時間還流し、次いで蒸留する（沸点は0.5mmHgで3
6℃である）。蒸気使用されるジメチルアミノジクロロ
チオホスフアート（Ｘは−Ｎ（CH3）２、Ｚはイオウで
ある）を、次の様に製造する：チオホスホリルクロライ
ド0.2モル中にジメチルアミンヒドロクロチイド0.1モル
を含有する懸濁液を、18時間還流し、次いで蒸留する
（沸点15mmHgで85℃）。
アート（Ｘは−Ｎ（CH3）２及びＺは酸素である）を、
次の通り製造する：オキシ塩化リン0.2モル中にジメチ
ルアミンヒドロクロライド0.1モルを含有する懸濁液
を、12時間還流し、次いで蒸留する（沸点は0.5mmHgで3
6℃である）。蒸気使用されるジメチルアミノジクロロ
チオホスフアート（Ｘは−Ｎ（CH3）２、Ｚはイオウで
ある）を、次の様に製造する：チオホスホリルクロライ
ド0.2モル中にジメチルアミンヒドロクロチイド0.1モル
を含有する懸濁液を、18時間還流し、次いで蒸留する
（沸点15mmHgで85℃）。
【０１６９】
別の活性化及びカップリング操作は、ジクロロメタン
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。この溶液
に、N,N−ジエチルアニリン4mmol及び４−メトキシピリ
ジン−Ｎ−オキシド1mmolを加える。溶解後、ジメチル
アミノジクロロホスフアート2mmol、Ｚ＝Ｏ（又はジメ
チルアミノジクロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）を加え
る。２時間後、生成物（Ｘはジメチルアミンである第10
図の構造２）を、10％アセトン/90％クロロホルムで展
開されたシリカゲル上でクロマトグラフィー分離によっ
て単離する。この活性化されたサブユニット1mmolをN,N
−ジイソプロピルアミノエチルイソブチラート（DIPAEI
B）1.5mmolを含有するジクロロメタン中でこれを混合し
て第二サブユニットのモルホリノ窒素（構造３）と直接
結合させ、構造４（Ｘは−Ｎ（CH3）２である）として
示されるダイマーを生じる。
20ml中でモルホリノ窒素（第５図の構造４）上で塩基−
保護されかつトリチレート化された５′ヒドロキシルサ
ブユニット1mmolを溶解しなければならない。この溶液
に、N,N−ジエチルアニリン4mmol及び４−メトキシピリ
ジン−Ｎ−オキシド1mmolを加える。溶解後、ジメチル
アミノジクロロホスフアート2mmol、Ｚ＝Ｏ（又はジメ
チルアミノジクロロチオホスフアート、Ｚ＝Ｓ）を加え
る。２時間後、生成物（Ｘはジメチルアミンである第10
図の構造２）を、10％アセトン/90％クロロホルムで展
開されたシリカゲル上でクロマトグラフィー分離によっ
て単離する。この活性化されたサブユニット1mmolをN,N
−ジイソプロピルアミノエチルイソブチラート（DIPAEI
B）1.5mmolを含有するジクロロメタン中でこれを混合し
て第二サブユニットのモルホリノ窒素（構造３）と直接
結合させ、構造４（Ｘは−Ｎ（CH3）２である）として
示されるダイマーを生じる。
【０１７０】
例10
ホスホンエステルリンケージを生じるためのカップリン
グ この例中、例５に於ける様に製造されたメチルホスホ
ナートサブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する
第二サブユニットとカップリングすることを示す。例を
第11図中の構造に関連して示す。
グ この例中、例５に於ける様に製造されたメチルホスホ
ナートサブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する
第二サブユニットとカップリングすることを示す。例を
第11図中の構造に関連して示す。
【０１７１】
出発材料は、例５で製造された、塩基−保護された、
モルホリノ窒素−保護されたメチルホスホナートサブユ
ニットである。このサブユニットのトリエチルアミン塩
を、クロロホルム中に懸濁し、２％ピリジニウムヒドロ
クロライドを含有する水で振とうし、クロロホルム相中
にサブユニットのピリジニウム塩（構造１）を生じる。
有機相を分離し、水洗し、次いで乾燥する。生じる固体
の１部を、過剰の３−ヒドロキシプロピオニトリルと混
合する；次いでDCCを混合物に加える。生じる反応の生
成物をジクロロメタン中で１％ジクロロ酢酸で脱トリチ
レート化し、構造２を生じる。次いで構造１及び２を、
DCCの存在下に混合し、構造３として示された結合され
たダイマーを生じる。このダイマーを、より長いオリゴ
マーブロック又はポリマーに集めるためのどちらかの末
端で選択的に脱保護する；シアノエチル基を、非プロト
ン性溶剤（たとえばDMF）中でDBUと共に除去するか又は
ジメトキシトリチル部分を上述の様に切断することがで
きる。
モルホリノ窒素−保護されたメチルホスホナートサブユ
ニットである。このサブユニットのトリエチルアミン塩
を、クロロホルム中に懸濁し、２％ピリジニウムヒドロ
クロライドを含有する水で振とうし、クロロホルム相中
にサブユニットのピリジニウム塩（構造１）を生じる。
有機相を分離し、水洗し、次いで乾燥する。生じる固体
の１部を、過剰の３−ヒドロキシプロピオニトリルと混
合する；次いでDCCを混合物に加える。生じる反応の生
成物をジクロロメタン中で１％ジクロロ酢酸で脱トリチ
レート化し、構造２を生じる。次いで構造１及び２を、
DCCの存在下に混合し、構造３として示された結合され
たダイマーを生じる。このダイマーを、より長いオリゴ
マーブロック又はポリマーに集めるためのどちらかの末
端で選択的に脱保護する；シアノエチル基を、非プロト
ン性溶剤（たとえばDMF）中でDBUと共に除去するか又は
ジメトキシトリチル部分を上述の様に切断することがで
きる。
【０１７２】
例11
同時のモルホリノ環形成及びサブユニットカップリング
この例中に、たとえば例７で製造された５′メチレン
を介して結合された保護されたアミンを有するリボヌク
レオシドの酸化、及び他のサブユニットの非保護アミン
にカップリングして、同時にモルホリノ環構造の形成及
びサブユニットの結合を行うことを示す。この例中に関
連する構造を、第12図中に示す。
を介して結合された保護されたアミンを有するリボヌク
レオシドの酸化、及び他のサブユニットの非保護アミン
にカップリングして、同時にモルホリノ環構造の形成及
びサブユニットの結合を行うことを示す。この例中に関
連する構造を、第12図中に示す。
【０１７３】
アミン保護
５′メチレンを介して結合された1oアミンを含有するリ
ボヌクレオシド（構造１）10mmolとトリチルクロライド
11mmolとを反応させて、アミン（構造２）を保護する。
ボヌクレオシド（構造１）10mmolとトリチルクロライド
11mmolとを反応させて、アミン（構造２）を保護する。
【０１７４】
酸化
メタノール中で、トリメチレート化されたサブユニッ
ト（構造２）とNaIO411mmolとを反応させて、ジアルデ
ヒド（構造３）を生じる。
ト（構造２）とNaIO411mmolとを反応させて、ジアルデ
ヒド（構造３）を生じる。
【０１７５】
カップリング
カップリング溶液があまりにも酸性である場合、反応
は極めて遅く、溶液があまりにも塩基性である場合、構
造３成分のエピマー化が生じる。弱酸を使用してアミン
成分（構造１）を中和し、反応をこのカップリング工程
で緩衝する。この目的に適すると認められる弱酸は次の
ものである：カルボン、オルト及びパラニトロフエノー
ル、及びベンゾトリアゾール。したがってジアルデヒド
（構造３）を、水／メタノール混合物中に構造１の適す
る塩と一緒にし、結合された生成物（構造４）を生じ
る。
は極めて遅く、溶液があまりにも塩基性である場合、構
造３成分のエピマー化が生じる。弱酸を使用してアミン
成分（構造１）を中和し、反応をこのカップリング工程
で緩衝する。この目的に適すると認められる弱酸は次の
ものである：カルボン、オルト及びパラニトロフエノー
ル、及びベンゾトリアゾール。したがってジアルデヒド
（構造３）を、水／メタノール混合物中に構造１の適す
る塩と一緒にし、結合された生成物（構造４）を生じ
る。
【０１７６】
還元
モルホリノ閉環工程の間又はその後のどちらかにシア
ノボロヒドリドを加え、ジヒドロキシモルホリノ環（構
造４）を還元し、所望のモルホリノ生成物（構造５）と
なす。
ノボロヒドリドを加え、ジヒドロキシモルホリノ環（構
造４）を還元し、所望のモルホリノ生成物（構造５）と
なす。
【０１７７】
例12
構造確認を有する簡単なプロトタイプモルホリノポリマ
ーの溶液−相集合、脱保護、精製、及びターゲットRNA
配列へのその結合の評価 この例に、簡単なホスホルジアミダート−結合された
モルホリノポリマーのターゲット結合親和性の製造、構
造確認及び評価を示す。
ーの溶液−相集合、脱保護、精製、及びターゲットRNA
配列へのその結合の評価 この例に、簡単なホスホルジアミダート−結合された
モルホリノポリマーのターゲット結合親和性の製造、構
造確認及び評価を示す。
【０１７８】
すべてのPi部分がチトシンであるモルホリノヘキサマ
ーを、例9D中に於ける様に製造されたダイマーから集め
る。このダイマー調製物の1/3を、２％酢酸を含有する
トリフルオロエタノール（TFE）で脱トリチレート化す
る；次いでTFEを減圧で除く。残渣をエーテル洗滌し、
すべて残存する酢酸を除く。ダイマー調製物の残存する
2/3を活性化する（例9Dに於ける様に）。活性化された
ダイマーの半分と脱トリチレート化ダイマーとを反応さ
せ、６％メタノール/94％クロロホルムで展開されたシ
リカゲルクロマトグラフィーによって精製されたテトラ
マー生成物を生じる。テトラマーを脱トリチル化し、残
存する活性化ダイマーと反応させ、10％メタノール/90
％クロロホルムで展開されたシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製されたヘキサマー生成物を生じる。
ーを、例9D中に於ける様に製造されたダイマーから集め
る。このダイマー調製物の1/3を、２％酢酸を含有する
トリフルオロエタノール（TFE）で脱トリチレート化す
る；次いでTFEを減圧で除く。残渣をエーテル洗滌し、
すべて残存する酢酸を除く。ダイマー調製物の残存する
2/3を活性化する（例9Dに於ける様に）。活性化された
ダイマーの半分と脱トリチレート化ダイマーとを反応さ
せ、６％メタノール/94％クロロホルムで展開されたシ
リカゲルクロマトグラフィーによって精製されたテトラ
マー生成物を生じる。テトラマーを脱トリチル化し、残
存する活性化ダイマーと反応させ、10％メタノール/90
％クロロホルムで展開されたシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製されたヘキサマー生成物を生じる。
【０１７９】
モルホリノ窒素上にトリチル部分を有するホスホルジ
アミダート−結合５′OH、塩基−保護されたヘキサマー
は、pd（mC）６−トリチルを示す。負イオン高速原子衝
撃質量分析（３−ニトロベンジルアルコールマトリック
ス）は、次の値を示す:M−１＝2667。９（100）。
アミダート−結合５′OH、塩基−保護されたヘキサマー
は、pd（mC）６−トリチルを示す。負イオン高速原子衝
撃質量分析（３−ニトロベンジルアルコールマトリック
ス）は、次の値を示す:M−１＝2667。９（100）。
【０１８０】
次いでこのPd（mC）６−トリチルポリマーを、上述の
様に脱トリチレート化し、次いで塩基脱保護する。
様に脱トリチレート化し、次いで塩基脱保護する。
【０１８１】
可溶化基をモルホリノポリマーに加えることを望む場
合、このことは次の様に好都合に行うことができる。Ｎ
−末端モルホリノ窒素を、トリフルオロエタノール中で
２％酢酸を用いて脱トリチラレート化する。ポリエチレ
ングリコール1000（ポリサイエンス社、ウェリントン、
ペンシルバニア、米国）を、乾燥DMF中に溶解して、次
いで溶剤を減圧下に蒸発して十分に乾燥する。固体を、
純粋な乾燥DMFの最小容量及び0.5モル当量（PEG1000に
対して）のビス（ｐ−ニトロフエニル）カーボナート中
に懸濁し、TEA 1モル当量を加える。調製物を、封入
し、一晩30℃で温置し、ｐ−ニトロフエニルカーボナー
ト−活性化されたPEG 1000を生じる。
合、このことは次の様に好都合に行うことができる。Ｎ
−末端モルホリノ窒素を、トリフルオロエタノール中で
２％酢酸を用いて脱トリチラレート化する。ポリエチレ
ングリコール1000（ポリサイエンス社、ウェリントン、
ペンシルバニア、米国）を、乾燥DMF中に溶解して、次
いで溶剤を減圧下に蒸発して十分に乾燥する。固体を、
純粋な乾燥DMFの最小容量及び0.5モル当量（PEG1000に
対して）のビス（ｐ−ニトロフエニル）カーボナート中
に懸濁し、TEA 1モル当量を加える。調製物を、封入
し、一晩30℃で温置し、ｐ−ニトロフエニルカーボナー
ト−活性化されたPEG 1000を生じる。
【０１８２】
脱トリチレート化された完全−長さモルホリノポリマ
ーを、実質上モル過剰の（一般に10ないし20倍）に加
え、次いで２時間、室温で温置する。次いで全調製物
を、一晩30℃で濃水酸化アンモニウムで処理する。次い
でアンモニアを減圧下に除去する。精製をカチオン交換
クロマトグラフィーによって行い、次いで水洗され、、
次にメタノールで溶離されたポリプロピレンのカラムで
脱塩して行う。
ーを、実質上モル過剰の（一般に10ないし20倍）に加
え、次いで２時間、室温で温置する。次いで全調製物
を、一晩30℃で濃水酸化アンモニウムで処理する。次い
でアンモニアを減圧下に除去する。精製をカチオン交換
クロマトグラフィーによって行い、次いで水洗され、、
次にメタノールで溶離されたポリプロピレンのカラムで
脱塩して行う。
【０１８３】
この精製された、末端につながれたヘキサマー、Pd
（mC）６−PEG 1000は、算出されたモル吸光度42,800を
有する中性水性溶液中で267.1nmで吸収最大を示す。pH1
で水性溶液中、同一材料は、算出されたモル吸光度77,1
00で、吸収最大275.7nmを示す。
（mC）６−PEG 1000は、算出されたモル吸光度42,800を
有する中性水性溶液中で267.1nmで吸収最大を示す。pH1
で水性溶液中、同一材料は、算出されたモル吸光度77,1
00で、吸収最大275.7nmを示す。
【０１８４】
pd（mC）6PEG−1000ポリマーのターゲット−結合親和
性を評価するために、ポリG RMA（シグマ化学社から得
られる）1mgを脱イオン水中に溶解し、DMSO 4容量（ア
ルトリック化学社の分光光度合）を加える（ストック溶
液Ａ）。末端につながれたモルホリノヘキサマー、pd
（mC6）−PEG 1000、を分光光度合DMSO中に溶解する
（ストック溶液Ｂ）。ホスフアート緩衝液を、リン酸を
用いて0.05NaOHのpHを7.4に調整して調製する（緩衝液
Ｃ）。
性を評価するために、ポリG RMA（シグマ化学社から得
られる）1mgを脱イオン水中に溶解し、DMSO 4容量（ア
ルトリック化学社の分光光度合）を加える（ストック溶
液Ａ）。末端につながれたモルホリノヘキサマー、pd
（mC6）−PEG 1000、を分光光度合DMSO中に溶解する
（ストック溶液Ｂ）。ホスフアート緩衝液を、リン酸を
用いて0.05NaOHのpHを7.4に調整して調製する（緩衝液
Ｃ）。
【０１８５】
ストック溶液Ａ及びＢを、UVによってポリマーの実際
濃度に関して検定する；ストック溶液Ａの吸光度を0.1N
NaOH中で測定し、ストック溶液Ｂを0.1N HCl中で測定
する。このpH高度での測定は、成分モノマーに比例する
ことなく吸高度値を生じることができる塩基積み重ね及
び他のポリマーの相互作用を最小化する。ストック溶液
Ａ及びＢを緩衝液Ｃで希釈し、ポリマー中に10マイクロ
モルの最終濃度を有する溶液を生じる。要求された希釈
を溶液Ａ、ポリ（Ｇ）に対して6,500及び溶液Ｂ、pd（m
C）６−PEG 1000に対して77,100のモル吸光度を用いて
算出する。
濃度に関して検定する；ストック溶液Ａの吸光度を0.1N
NaOH中で測定し、ストック溶液Ｂを0.1N HCl中で測定
する。このpH高度での測定は、成分モノマーに比例する
ことなく吸高度値を生じることができる塩基積み重ね及
び他のポリマーの相互作用を最小化する。ストック溶液
Ａ及びＢを緩衝液Ｃで希釈し、ポリマー中に10マイクロ
モルの最終濃度を有する溶液を生じる。要求された希釈
を溶液Ａ、ポリ（Ｇ）に対して6,500及び溶液Ｂ、pd（m
C）６−PEG 1000に対して77,100のモル吸光度を用いて
算出する。
【０１８６】
ターゲット結合親和性の評価を、参考ビーム中に細胞
２個及びサンプルビーム中に２個に適する温度−制御さ
れたセルハウジングを有する複先束走査スペクトロフォ
トメーター中で実施する。
２個及びサンプルビーム中に２個に適する温度−制御さ
れたセルハウジングを有する複先束走査スペクトロフォ
トメーター中で実施する。
【０１８７】
４つの組合せられた石英セルを用いて、１つにＧモノ
マーに対してポリ（Ｇ）0.5ml、60マイクロモル及び緩
衝液C 0.5mlを充填し、第二番目に10マイクロモノマーp
d（mC）６−PEG 1000 0.5ml及び緩衝液C 0.5mlを充填す
る。この２つのセルを、温度−制御されたハウジングの
参考ビーム中に置く。次いで、第三セルに緩衝液C 1ml
を充填し、第四番目にＧモノマーに対するポリ（Ｇ）0.
5ml、60マイクロモル及び10マイクロモルpd（mC）６−P
EG 1000 0.5mlを充填する。この２つのセルをセルハウ
ジングのサンプルビーム中に置く。次いでセルハウジン
グを50℃に加熱し、14℃に徐々に冷やし、第四セル中で
ポリマーとそのターゲットポリヌクレオチドの間に完全
な対を確かめる。次いで走査を320nmから240nmで測定す
るこれはポリマー−ターゲット混合物中で淡色シフトに
基づいて実質上の吸光度差を示し、約273nmを中心にお
く。次いでセルホルダーの温度を２度増加して72℃に上
げ、その際夫々２度上昇後に測定する。
マーに対してポリ（Ｇ）0.5ml、60マイクロモル及び緩
衝液C 0.5mlを充填し、第二番目に10マイクロモノマーp
d（mC）６−PEG 1000 0.5ml及び緩衝液C 0.5mlを充填す
る。この２つのセルを、温度−制御されたハウジングの
参考ビーム中に置く。次いで、第三セルに緩衝液C 1ml
を充填し、第四番目にＧモノマーに対するポリ（Ｇ）0.
5ml、60マイクロモル及び10マイクロモルpd（mC）６−P
EG 1000 0.5mlを充填する。この２つのセルをセルハウ
ジングのサンプルビーム中に置く。次いでセルハウジン
グを50℃に加熱し、14℃に徐々に冷やし、第四セル中で
ポリマーとそのターゲットポリヌクレオチドの間に完全
な対を確かめる。次いで走査を320nmから240nmで測定す
るこれはポリマー−ターゲット混合物中で淡色シフトに
基づいて実質上の吸光度差を示し、約273nmを中心にお
く。次いでセルホルダーの温度を２度増加して72℃に上
げ、その際夫々２度上昇後に測定する。
【０１８８】
モルホリノポリマー/RNA複合体に対する温度の関数と
して吸光度差のプロットを第13図中に示す。複合体を半
分熔融する熔融温度、Tmをこのモルホリノポリマー/RNA
に対して51.5℃であることを示す。
して吸光度差のプロットを第13図中に示す。複合体を半
分熔融する熔融温度、Tmをこのモルホリノポリマー/RNA
に対して51.5℃であることを示す。
【０１８９】
例13
配列５′−CGCCAのホスホルジアミダート−結合オリゴ
マーの溶液−相製造 この例に、ホスホルジアミダート−結合骨格を有する
短いオリゴマーの集合を示す（ＸはＮ（CH3）２、Ｙは
酸素、Ｚは酸素である第４図の構造Ｂ−Ｂ）。この溶液
集合方は、例14及び15に於ける様に、より長いオリゴマ
ーへの次の集合に適する短いオリゴマーの大きい−規模
の合成に有用である。
マーの溶液−相製造 この例に、ホスホルジアミダート−結合骨格を有する
短いオリゴマーの集合を示す（ＸはＮ（CH3）２、Ｙは
酸素、Ｚは酸素である第４図の構造Ｂ−Ｂ）。この溶液
集合方は、例14及び15に於ける様に、より長いオリゴマ
ーへの次の集合に適する短いオリゴマーの大きい−規模
の合成に有用である。
【０１９０】
A.ブロックの５′末端で使用するためのモノマーの製造
モルホリノ環窒素上にトリチル部分を含有しかつ５′
メチレン上にメチルアミンを有するモルホリノＣサブユ
ニット（例６に於ける様に製造）とアルドリッチ化学
社、ミルウォーキー、ウィスコンシン、米国のＮ−（９
−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）サクシンイ
ミド（FMOC）とを反応させ、シリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製する。
メチレン上にメチルアミンを有するモルホリノＣサブユ
ニット（例６に於ける様に製造）とアルドリッチ化学
社、ミルウォーキー、ウィスコンシン、米国のＮ−（９
−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）サクシンイ
ミド（FMOC）とを反応させ、シリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製する。
【０１９１】
B.脱トリチル化
分液漏斗に、上記Ａ欄で製造されたFMOC−誘導された
Ｃサブユニット1mmol、ジクロロメタン、トリフルオロ
エタノール2ml、及びシアノ酢酸0.4gを加える。10分
後、この溶液を水性NaHCO3で分配する。有機相を、回転
−蒸発器で除く。残存する材料にアセトニトリル20mlを
加え、アセトニトリルを回転−蒸発乾固で除去する。残
存する材料を、１時間減圧下に乾燥する。
Ｃサブユニット1mmol、ジクロロメタン、トリフルオロ
エタノール2ml、及びシアノ酢酸0.4gを加える。10分
後、この溶液を水性NaHCO3で分配する。有機相を、回転
−蒸発器で除く。残存する材料にアセトニトリル20mlを
加え、アセトニトリルを回転−蒸発乾固で除去する。残
存する材料を、１時間減圧下に乾燥する。
【０１９２】
C.他のモノマーの活性化
モルホリノ環窒素上でトリチレート化されたＡ、Ｃ、
及びＧの５′OHモルホリノサブユニットを、例２に於け
る様に製造する。Ａ、Ｃ、及びＧサブユニットを、例9D
に於ける様にモノクロロホスホルアミダードに変換して
活性化する。
及びＧの５′OHモルホリノサブユニットを、例２に於け
る様に製造する。Ａ、Ｃ、及びＧサブユニットを、例9D
に於ける様にモノクロロホスホルアミダードに変換して
活性化する。
【０１９３】
D.第一カップリング
上記Ｂ欄からの脱トリチレート化されたFMOC−誘導さ
れたＣサブユニットをカップリング溶液（ジクロロメタ
ン4ml、テトラメチレンスルホン2ml及びDIPAEIB 0.3ml
（例９に於ける様に製造））中に懸濁する。この溶液に
上記Ｃ欄で製造された、活性化されたＧサブユニット1m
molを加える。30分後、室温でジクロロメタンを減圧下
に除き、生成物を水の添加によって沈殿する。５′FMOC
−CG−トリチルダイマーを、５％メタノール/95％クロ
ロホルムで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィ
ーによって精製する。
れたＣサブユニットをカップリング溶液（ジクロロメタ
ン4ml、テトラメチレンスルホン2ml及びDIPAEIB 0.3ml
（例９に於ける様に製造））中に懸濁する。この溶液に
上記Ｃ欄で製造された、活性化されたＧサブユニット1m
molを加える。30分後、室温でジクロロメタンを減圧下
に除き、生成物を水の添加によって沈殿する。５′FMOC
−CG−トリチルダイマーを、５％メタノール/95％クロ
ロホルムで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィ
ーによって精製する。
【０１９４】
E.次のカップリング
FMOC−CG−トリチル生成物を、上記Ｂ欄に於ける様に
脱−トリチレート化し、上記Ｃ欄からの活性化されたＣ
サブユニット1mmolと結合する。このカップリングサイ
クルを、残存するＣ及びＡサブユニットを加えてくり返
して、所望のブロックを生じる:5′FMOC−CGCCA−トリ
チル。ポリマーの長さが増加するので、精製工程は、生
長するブロックのシリカゲルクロマトグラフィー精製中
でメタノールの増加濃度を要求する。
脱−トリチレート化し、上記Ｃ欄からの活性化されたＣ
サブユニット1mmolと結合する。このカップリングサイ
クルを、残存するＣ及びＡサブユニットを加えてくり返
して、所望のブロックを生じる:5′FMOC−CGCCA−トリ
チル。ポリマーの長さが増加するので、精製工程は、生
長するブロックのシリカゲルクロマトグラフィー精製中
でメタノールの増加濃度を要求する。
【０１９５】
F.構造確認
このペンタマーブロックの構造を、NMR及び負イオン
高速原子衝撃質量分析で最も容易に確認する。原則とし
て質量分析中で優性種は分子イオンである。
高速原子衝撃質量分析で最も容易に確認する。原則とし
て質量分析中で優性種は分子イオンである。
【０１９６】
例14
HIV−Ｉの第一結合部位を目標とするモルホリノポリマ
ーの溶液−相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブ
ロックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユ
ニットリンケージを含有するモルホリノポリマーの溶液
−相集合に関して記載する。モノマーの代りに短いオリ
ゴマーブロックの使用は、失敗配列から最終生成物を分
離することを著しく簡易化する。この例中に合成された
モルホリノポリマーは、HIV−Ｉ（マイヤー等）の第一
結合部位に相補的な塩基配列を有する。
ーの溶液−相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブ
ロックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユ
ニットリンケージを含有するモルホリノポリマーの溶液
−相集合に関して記載する。モノマーの代りに短いオリ
ゴマーブロックの使用は、失敗配列から最終生成物を分
離することを著しく簡易化する。この例中に合成された
モルホリノポリマーは、HIV−Ｉ（マイヤー等）の第一
結合部位に相補的な塩基配列を有する。
【０１９７】
A.短いオリゴマーブロックの合成
次のオリゴマーを例13の様に合成する：
５′FMOC−GUU−トリチル（ブロック１）;5′FMOC−CGG
G−トリチル（ブロック２）;5′FMOC−CGCCA−トリチル
（ブロック３）;5′FMOC−CUGC−トリチル（ブロック
４）。
G−トリチル（ブロック２）;5′FMOC−CGCCA−トリチル
（ブロック３）;5′FMOC−CUGC−トリチル（ブロック
４）。
【０１９８】
B.FMOC部分の切断
ブロック４の１ミリモルをDMF 20ml中に懸濁し、DBU
（1,8−ジアザビシク〔5.4.0〕ウンデセ−７−エン）0.
4mlを加える。20分後、エーテル200mlを加え、溶液を十
分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン20ml中に
再懸濁し、４個の30ml遠心分離管に分配し、夫々にエー
テル25mlを加え、振とうして十分に混合し、遠心分離す
る。上澄みを排出し、ペレットを減圧下に乾燥する。
（1,8−ジアザビシク〔5.4.0〕ウンデセ−７−エン）0.
4mlを加える。20分後、エーテル200mlを加え、溶液を十
分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン20ml中に
再懸濁し、４個の30ml遠心分離管に分配し、夫々にエー
テル25mlを加え、振とうして十分に混合し、遠心分離す
る。上澄みを排出し、ペレットを減圧下に乾燥する。
【０１９９】
C.脱トリチル化及び活性化
次いで例13、第Ｂ欄、の様にブロック3 1mmolを脱−
トリチル化する。減圧下に溶剤の除去後、残存する材料
をジクロロメタン20m;中に懸濁し、次いでDIPAEIB（例
９中に於ける様に製造）1.5mlを添加する。急速に撹拌
しながら、エチルジクロロホスフアート0.5mlを加え
る。５分後、この溶液を４−30ml遠心分離管に分配す
る。各管にエーテルを充填し、十分に振とうし、遠心分
離する。ペレットをジクロロメタンの最小容量中に懸濁
し、次いでエーテルを加える。次いで管を振とうして、
遠心分離する。この洗滌操作をもう一度くり返す。ペレ
ットをカップリング溶液（ジクロロメタン10ml、テトラ
メチレンスルホン5ml、及びDIPAEIB 0.3ml（例９に於け
る様に製造））中に懸濁する。
トリチル化する。減圧下に溶剤の除去後、残存する材料
をジクロロメタン20m;中に懸濁し、次いでDIPAEIB（例
９中に於ける様に製造）1.5mlを添加する。急速に撹拌
しながら、エチルジクロロホスフアート0.5mlを加え
る。５分後、この溶液を４−30ml遠心分離管に分配す
る。各管にエーテルを充填し、十分に振とうし、遠心分
離する。ペレットをジクロロメタンの最小容量中に懸濁
し、次いでエーテルを加える。次いで管を振とうして、
遠心分離する。この洗滌操作をもう一度くり返す。ペレ
ットをカップリング溶液（ジクロロメタン10ml、テトラ
メチレンスルホン5ml、及びDIPAEIB 0.3ml（例９に於け
る様に製造））中に懸濁する。
【０２００】
D.カップリング
活性化されたブロック３の溶液を、FMOC基を切断する
ブロック４に加える。１時間後、無水酢酸0.5mlを加
え、溶液を５分間室温で放置する。ジクロロメタンを、
減圧下に除去する。生成物、５′FMOC−CGCCACUGC−ト
リチルを沈殿するために、水を加える。減圧下に固体を
乾燥した後、すべての残存する無水酢酸を十分に除くた
めに、ジクロロメタン中に再懸濁する。次いでエーテル
を加えて、生成物を沈殿させる。生成物をもう一度ジク
ロロメタン中に再懸濁し、エーテルで再沈殿する。
ブロック４に加える。１時間後、無水酢酸0.5mlを加
え、溶液を５分間室温で放置する。ジクロロメタンを、
減圧下に除去する。生成物、５′FMOC−CGCCACUGC−ト
リチルを沈殿するために、水を加える。減圧下に固体を
乾燥した後、すべての残存する無水酢酸を十分に除くた
めに、ジクロロメタン中に再懸濁する。次いでエーテル
を加えて、生成物を沈殿させる。生成物をもう一度ジク
ロロメタン中に再懸濁し、エーテルで再沈殿する。
【０２０１】
FMOC部分を、上記Ｂ欄の様にこの９−mer生成物から
除く。ブロック２を脱トリチレート化し、上記Ｃ欄に於
ける様に活性化する。この２つの成分を、上述の様に結
合し、13−mer:5′FMOC−CGGGCGCCACUGC−トリチルを生
じる。
除く。ブロック２を脱トリチレート化し、上記Ｃ欄に於
ける様に活性化する。この２つの成分を、上述の様に結
合し、13−mer:5′FMOC−CGGGCGCCACUGC−トリチルを生
じる。
【０２０２】
FMOC部分を、上記Ｂ欄に於ける様にこの13−mer生成
物から切断する。ブロック１を脱トリチレート化し、上
記Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成分を上述
の様に結合し、16−mer:5′FMOC−GUOCGGGCGCCACUGC−
トリチルを生じる。
物から切断する。ブロック１を脱トリチレート化し、上
記Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成分を上述
の様に結合し、16−mer:5′FMOC−GUOCGGGCGCCACUGC−
トリチルを生じる。
【０２０３】
E.脱保護
FMOC及びトリチル部分を上述の様に除去し、生成物を
DMF20ml中に懸濁し、水酸化アンモニウム20mlを加え
る。調製物にふたをし、30℃で18時間温置する。その
後、溶剤を回転−蒸発によって除去し16−mer:5′GUUCG
GGCGCCACUGCの粗製調製物を生じる。
DMF20ml中に懸濁し、水酸化アンモニウム20mlを加え
る。調製物にふたをし、30℃で18時間温置する。その
後、溶剤を回転−蒸発によって除去し16−mer:5′GUUCG
GGCGCCACUGCの粗製調製物を生じる。
【０２０４】
F.精製
16mer−調製物を、、HClでpH10.5に調整された0.05N
水性メチルアミン（溶剤Ａ）中に2mg/mlの濃度で懸濁す
る。クロマトグラフィーに使用されうる水を、吸引減圧
下に脱気し、メチルアミンを加え、最終メチルアミン濃
度0.05Nを生じる。この溶液にHClを加え、pHを10.5に調
整する。対応するpH10.5溶液をKCl中で1Nにする（溶剤
Ｂ）。溶剤Ａを、クロマトグラフィー品質のアセトニト
リル又はメタノールと1:1容量で混合し、溶剤Ｃを生じ
る。
水性メチルアミン（溶剤Ａ）中に2mg/mlの濃度で懸濁す
る。クロマトグラフィーに使用されうる水を、吸引減圧
下に脱気し、メチルアミンを加え、最終メチルアミン濃
度0.05Nを生じる。この溶液にHClを加え、pHを10.5に調
整する。対応するpH10.5溶液をKCl中で1Nにする（溶剤
Ｂ）。溶剤Ａを、クロマトグラフィー品質のアセトニト
リル又はメタノールと1:1容量で混合し、溶剤Ｃを生じ
る。
【０２０５】
ポリマー100mgまでを、アニオン−交換体担体Ｑ−セ
フアロースフアーストフロー（フアルマシア）で充填さ
れたクロマトグラフィーカラム（直径5cm及び長さ15c
m）上に溶剤A50ml中に詰める。カラムを溶剤Ａで十分に
洗滌し、約30ml/分の流速を用いて30分かけて100％溶剤
Ａから100％溶剤Ｂの範囲にある線勾配で溶離する。溶
出液を254nmで追跡する。この例の16−merを約0.3N KCl
で溶離して見い出す。所望の結合ポリマーは、一般にカ
ラムから溶離ための最後かつ最も大きいピークである。
ホリマーをブロック集合で製造した場合、ベースライン
分離をしばしば行う。一般にピーク形は非対称であり、
問題はむしろクロマトグラフィー充填剤の容積不足より
も結合ポリマーの不溶性にある。この様な問題を、しば
しば一定の流出で充填された結合ポリマーの量を減少す
ることによって解決することができる。ピークが対称的
であるが、ベース・ライン分離が行われない場合、改良
がより浅い勾配を用いて溶離することによって通常得る
ことができる。
フアロースフアーストフロー（フアルマシア）で充填さ
れたクロマトグラフィーカラム（直径5cm及び長さ15c
m）上に溶剤A50ml中に詰める。カラムを溶剤Ａで十分に
洗滌し、約30ml/分の流速を用いて30分かけて100％溶剤
Ａから100％溶剤Ｂの範囲にある線勾配で溶離する。溶
出液を254nmで追跡する。この例の16−merを約0.3N KCl
で溶離して見い出す。所望の結合ポリマーは、一般にカ
ラムから溶離ための最後かつ最も大きいピークである。
ホリマーをブロック集合で製造した場合、ベースライン
分離をしばしば行う。一般にピーク形は非対称であり、
問題はむしろクロマトグラフィー充填剤の容積不足より
も結合ポリマーの不溶性にある。この様な問題を、しば
しば一定の流出で充填された結合ポリマーの量を減少す
ることによって解決することができる。ピークが対称的
であるが、ベース・ライン分離が行われない場合、改良
がより浅い勾配を用いて溶離することによって通常得る
ことができる。
【０２０６】
更にポリマーを含有する溶出液を精製し、35ミクロン
クロマトグラフィー品質ポリプロピレン（ポリサイエン
ス社からのCat.no.4342）で充填された等価−大きさの
カラムに詰めて脱塩する。カラムを十分に溶剤Ａで洗滌
する。ベースライン分離を、上記カチオン交換体クロマ
トグラフィー中で行い、次いで純粋な精製物が、溶剤Ｃ
で溶離して得られる。しかしもしベースライン分離が行
われない場合、生成物を100％溶剤Ａから100％溶剤Ｃの
範囲にある線状勾配で溶離する。この例中16−merが溶
離されるのが分る。その時アセトニトリルの濃度は、約
25容量％である。
クロマトグラフィー品質ポリプロピレン（ポリサイエン
ス社からのCat.no.4342）で充填された等価−大きさの
カラムに詰めて脱塩する。カラムを十分に溶剤Ａで洗滌
する。ベースライン分離を、上記カチオン交換体クロマ
トグラフィー中で行い、次いで純粋な精製物が、溶剤Ｃ
で溶離して得られる。しかしもしベースライン分離が行
われない場合、生成物を100％溶剤Ａから100％溶剤Ｃの
範囲にある線状勾配で溶離する。この例中16−merが溶
離されるのが分る。その時アセトニトリルの濃度は、約
25容量％である。
【０２０７】
G.配列確認
前述の様に、完全に保護された状態で完全−長さのポ
リマーの質量分析は、ポリマーの長さ及び塩基組成とと
もに確認することに役立つことができる。しかしサブユ
ニット配列については何らの情報を提供しない。配列情
報を得るための１つの方法は、デオキシリボ核酸とカル
バマート−結合されたデオキシリボ核酸−誘導ポリマー
（グラフイン等）からである。しかし、完全に保護され
た状態で、本発明の多くのモルホリノ−基体ポリマーは
ブラグメンテーションに耐え、最小フラグメントしか有
しない分子イオンを主に生じる。
リマーの質量分析は、ポリマーの長さ及び塩基組成とと
もに確認することに役立つことができる。しかしサブユ
ニット配列については何らの情報を提供しない。配列情
報を得るための１つの方法は、デオキシリボ核酸とカル
バマート−結合されたデオキシリボ核酸−誘導ポリマー
（グラフイン等）からである。しかし、完全に保護され
た状態で、本発明の多くのモルホリノ−基体ポリマーは
ブラグメンテーションに耐え、最小フラグメントしか有
しない分子イオンを主に生じる。
【０２０８】
モルホリノ−基体ポリマーの配列を確認するための他
の方法は、核オリゴマーブロックを結合後生長するポリ
マーの小さい部分を取り出し、質量分析を使用して、ポ
リマーの伸長を追跡することができる。この方法は、合
成で使用される２つのブロックが正確に同一質量を偶然
有するまれな場合を除いて適用することができる。
の方法は、核オリゴマーブロックを結合後生長するポリ
マーの小さい部分を取り出し、質量分析を使用して、ポ
リマーの伸長を追跡することができる。この方法は、合
成で使用される２つのブロックが正確に同一質量を偶然
有するまれな場合を除いて適用することができる。
【０２０９】
ポリマーサブユニット配列の修正を確認するのを助け
る、好ましい、しかも間接的な方法は、モルホリノポリ
マーをその相補的DNA（この配列は確立された方法で確
認することができる）とブロックが間違った順序で集め
られた場合生じうるであろうDNA配列で１対にしなけれ
ばならない。ポリマーとDNAとのペアリングを、240ない
し290nm波長域で淡色シフトに関して査定して、評価す
る（例12に於ける様に評価）。この様なシフトは、ポリ
マーとその相補的配列の間しか生じない。ポリマー/DNA
二重体を、徐々に温度を上げることによってすべての部
分的に−くいちがう二重体と区別することもできる。そ
の間240nmないし290nm域中で吸光度を追跡する、完全な
二重体は、一般にすべてのくいちがう二重体の熔融温度
よりも10度又はそれ以上の熔融温度（ハイポクロミシチ
ィー（hypochromicity）で50％減少に相当）を有する。
る、好ましい、しかも間接的な方法は、モルホリノポリ
マーをその相補的DNA（この配列は確立された方法で確
認することができる）とブロックが間違った順序で集め
られた場合生じうるであろうDNA配列で１対にしなけれ
ばならない。ポリマーとDNAとのペアリングを、240ない
し290nm波長域で淡色シフトに関して査定して、評価す
る（例12に於ける様に評価）。この様なシフトは、ポリ
マーとその相補的配列の間しか生じない。ポリマー/DNA
二重体を、徐々に温度を上げることによってすべての部
分的に−くいちがう二重体と区別することもできる。そ
の間240nmないし290nm域中で吸光度を追跡する、完全な
二重体は、一般にすべてのくいちがう二重体の熔融温度
よりも10度又はそれ以上の熔融温度（ハイポクロミシチ
ィー（hypochromicity）で50％減少に相当）を有する。
【０２１０】
H.ターゲット結合親和性の評価
その相補的DNAと１対にされた、この例の16−merは、
鎖が非平行でる時DNAを結合し、鎖が平行である時結合
しないのが分る（下記に示すように）。
鎖が非平行でる時DNAを結合し、鎖が平行である時結合
しないのが分る（下記に示すように）。
【０２１１】
結合：モルホリノポリマー:5′−GUUCGGGCGCCACUGC
ターゲットDNA:3′−CAAGCCCGCGGTGACG−５′
非結合：モルホリノポリマー:5′−GUUCGGGCGCCACUGC
ターゲットDNA:5′−CAAGCCCGCGGTGACG−３′
非−平行結合鎖分子は、３マイクロモルの濃度で各鎖
が存在する場合、63℃のTm（例12中に記載された様に測
定）を有することが分る。
が存在する場合、63℃のTm（例12中に記載された様に測
定）を有することが分る。
【０２１２】
I.生物学的活性の評価
この例の16merを、HIV−Ｉ−−−−AIDSウイルスで感
染されたヒト細胞中でウイルス性P24プロテインの合成
を阻害するその能力についてテストする。予備の結果
は、HIV−Ｉのプライマー結合部位に相補的である、こ
の例の16−merポリマーを６マイクロモルの濃度でHIV−
Ｉ−感染された細胞に加えた場合、ポリマーはウイルス
性P24プロテインの合成で35％減少を生じることを示
す。更にポリマーは非感染の細胞中で全く検出可能な細
胞毒性を16及び19マイクロモルの濃度で生じない。
染されたヒト細胞中でウイルス性P24プロテインの合成
を阻害するその能力についてテストする。予備の結果
は、HIV−Ｉのプライマー結合部位に相補的である、こ
の例の16−merポリマーを６マイクロモルの濃度でHIV−
Ｉ−感染された細胞に加えた場合、ポリマーはウイルス
性P24プロテインの合成で35％減少を生じることを示
す。更にポリマーは非感染の細胞中で全く検出可能な細
胞毒性を16及び19マイクロモルの濃度で生じない。
【０２１３】
例15
HIV−Ｉのプライマー結合部位を目標とするモルホリノ
ポリマーの固−相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブ
ロックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユ
ニットリンケージを含有するモルホリノポリマーの固−
相集合に関して示す。固−相集合は、より長い結合ポリ
マーの急速集合方を提供する。モノマーの代りに短いオ
リゴマーブロックの使用は、失敗配列からの最終生成物
の分離を著しく簡易化する。
ポリマーの固−相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブ
ロックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユ
ニットリンケージを含有するモルホリノポリマーの固−
相集合に関して示す。固−相集合は、より長い結合ポリ
マーの急速集合方を提供する。モノマーの代りに短いオ
リゴマーブロックの使用は、失敗配列からの最終生成物
の分離を著しく簡易化する。
【０２１４】
A.固体担体への切断しうるリンカーの結合
ビス〔２−（サクシンイミドオキシカルボニルオキ
シ）−エチル〕スルホン1mmol（ピアース化学社、ロッ
クホード、イリノイ、米国）を、DMF 10ml中に溶解し、
第一アミン官能基を有する適当な固体担体3gに加える：
たとえばガラス、アミノプロピル、カタログ＃G4643、
シグマ化学社、セントルイス、ミズリー、米国−−500
オングストローム細孔の大きさ、200−400メッシュ、ア
ミン含有量81マイクロモル/g。２時間後、ガラスビーズ
のスラリーをカラム（好ましくは直径約1.5cm）に注ぎ
入れ、カラムを十分にジクロロメタンで洗浄し、減圧で
乾燥する。ガラス担体に結合したこのリンカーは、脱ト
リチレート化に使用された酸性条件に安定であるが、強
い非−求核塩基、たとえば1,8−ジアザビシクロ〔5.4.
0〕ウンデセ−７−エン（DBU）を用いてベータ脱離メカ
ニズムによって速やかに切断することができる。
シ）−エチル〕スルホン1mmol（ピアース化学社、ロッ
クホード、イリノイ、米国）を、DMF 10ml中に溶解し、
第一アミン官能基を有する適当な固体担体3gに加える：
たとえばガラス、アミノプロピル、カタログ＃G4643、
シグマ化学社、セントルイス、ミズリー、米国−−500
オングストローム細孔の大きさ、200−400メッシュ、ア
ミン含有量81マイクロモル/g。２時間後、ガラスビーズ
のスラリーをカラム（好ましくは直径約1.5cm）に注ぎ
入れ、カラムを十分にジクロロメタンで洗浄し、減圧で
乾燥する。ガラス担体に結合したこのリンカーは、脱ト
リチレート化に使用された酸性条件に安定であるが、強
い非−求核塩基、たとえば1,8−ジアザビシクロ〔5.4.
0〕ウンデセ−７−エン（DBU）を用いてベータ脱離メカ
ニズムによって速やかに切断することができる。
【０２１５】
B.短いオリゴマーブロックの合成
次のオリゴマーを、例13の様に合成する：
５′FMOC−GUU−トリチル（ブロック１）;5′FMOC−CGG
G−トリチル（ブロック２）;5′FMOC−CGCCA−トリチル
（ブロック３）;5′FMOC−CUGC−トリチル（ブロック
４）。
G−トリチル（ブロック２）;5′FMOC−CGCCA−トリチル
（ブロック３）;5′FMOC−CUGC−トリチル（ブロック
４）。
【０２１６】
C.担体−結合リンカーに最初のブロックの付加
ブロック一オリゴマー１ミリモルを、DMF 20ml中に懸
濁し、DBU（1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデセ−
７−エン〕0.4mlを加える。５分後、エーテル200mlを加
え、懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロ
メタン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁
する。夫々の管にエーテル25mlを加え、十分に振とう
し、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に
乾燥する。このオリゴマーをDMF 12ml中に再懸濁し、上
記Ａ欄で製造された固体合成担体のカラムに加える。ガ
ラスビーズの床を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内
部表面へのオリゴマーブロックの接近を保証する。室温
で２時間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌す
る。洗滌液中に存在する非結合オリゴマーブロックを回
収し、再び再使用する。
濁し、DBU（1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデセ−
７−エン〕0.4mlを加える。５分後、エーテル200mlを加
え、懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロ
メタン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁
する。夫々の管にエーテル25mlを加え、十分に振とう
し、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に
乾燥する。このオリゴマーをDMF 12ml中に再懸濁し、上
記Ａ欄で製造された固体合成担体のカラムに加える。ガ
ラスビーズの床を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内
部表面へのオリゴマーブロックの接近を保証する。室温
で２時間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌す
る。洗滌液中に存在する非結合オリゴマーブロックを回
収し、再び再使用する。
【０２１７】
D.脱トリチレート化及び活性化
担体−結合オリゴマーブロックを、ジクロロメタン88
ml、トリフルオロメタノール10ml及びシアノ酢酸2gから
成るカラムに溶液を徐々に通して脱トリチレート化す
る。カラムをジクロロメタン40mlで、次いでジクロロメ
タン中の１％Ｎ−エチルモルホリン40mlで洗滌する。次
いでカラムを、ジクロロメタン50mlで洗滌する。接合オ
リゴマーの末端を、DIPAEIB 5ml（例９に於ける様に製
造）及びエチルジクロロホスフアート3mlを含有するジ
クロロメタン100mlをカラムに徐々に通して活性化す
る。次いでカラムをクロロホルム100mlで洗滌する。
ml、トリフルオロメタノール10ml及びシアノ酢酸2gから
成るカラムに溶液を徐々に通して脱トリチレート化す
る。カラムをジクロロメタン40mlで、次いでジクロロメ
タン中の１％Ｎ−エチルモルホリン40mlで洗滌する。次
いでカラムを、ジクロロメタン50mlで洗滌する。接合オ
リゴマーの末端を、DIPAEIB 5ml（例９に於ける様に製
造）及びエチルジクロロホスフアート3mlを含有するジ
クロロメタン100mlをカラムに徐々に通して活性化す
る。次いでカラムをクロロホルム100mlで洗滌する。
【０２１８】
E.担体−結合オリゴマーに次のブロックの付加
オリゴマーブロック2 1ミリモルを、DMF20ml中に懸濁
し、DBU（1,8−アザビシクロ〔5.4.0〕ウンデセ−７−
エン）0.4mlを加える。５分後、エーテル200mlを加え、
懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタ
ン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁す
る。夫々の管にエーテル25mlを加える。管を十分に振と
うし、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下
に乾燥する。このオリゴマーをカップリング溶液（ジク
ロロメタン8ml、テトラメチレンスルホン4ml、及びDIPA
EIB（例９に於ける様に製造）0.5ml）中に再懸濁する。
この溶液を、容量１ないし2mlしかカラム床上に残存し
なくなるまで、合成カラムの床に徐々に導入する。担体
を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面への
カップリング溶液の完全な接近を保証する。室温で２時
間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。
し、DBU（1,8−アザビシクロ〔5.4.0〕ウンデセ−７−
エン）0.4mlを加える。５分後、エーテル200mlを加え、
懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタ
ン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁す
る。夫々の管にエーテル25mlを加える。管を十分に振と
うし、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下
に乾燥する。このオリゴマーをカップリング溶液（ジク
ロロメタン8ml、テトラメチレンスルホン4ml、及びDIPA
EIB（例９に於ける様に製造）0.5ml）中に再懸濁する。
この溶液を、容量１ないし2mlしかカラム床上に残存し
なくなるまで、合成カラムの床に徐々に導入する。担体
を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面への
カップリング溶液の完全な接近を保証する。室温で２時
間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。
【０２１９】
ブロック３及び４を、上述の様に同一方法で加える。
【０２２０】
F.担体から切断
リンカー切断用溶液（容量なかりで:6部ジメチルマロ
ナート:12部DBU;41部テトラメチレンスルホン；及び41
部ジクロロメタン）を徐々にカラムに通し、一方1mm経
路−長さフローセルを介して290nmで溶出液を追跡す
る。溶出液を、ポリマーのすべてが溶離する（一般に約
30分）まで、集める。ジクロロメタンを減圧で除去す
る。残存する材料水性NaH2PO4を十分に中和するため
に、DBUを加え、次いで多量の水を加えて、ポリマーを
沈殿させる。固体生成物を集め、乾燥する。
ナート:12部DBU;41部テトラメチレンスルホン；及び41
部ジクロロメタン）を徐々にカラムに通し、一方1mm経
路−長さフローセルを介して290nmで溶出液を追跡す
る。溶出液を、ポリマーのすべてが溶離する（一般に約
30分）まで、集める。ジクロロメタンを減圧で除去す
る。残存する材料水性NaH2PO4を十分に中和するため
に、DBUを加え、次いで多量の水を加えて、ポリマーを
沈殿させる。固体生成物を集め、乾燥する。
【０２２１】
G.構造特性評価、脱保護、精製、及びテスト
完全に保護された16−mer生成物を脱保護し、精製
し、例14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の
後、この例の16−merポリマーは、主に例14に記載した
様に製造された16−merポリマーとそのターゲットDNAを
有する同一のTm及び主に同一の生物学的活性を示す。
し、例14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の
後、この例の16−merポリマーは、主に例14に記載した
様に製造された16−merポリマーとそのターゲットDNAを
有する同一のTm及び主に同一の生物学的活性を示す。
【０２２２】
例16
ヘルペスシムプレックスＩ中でスプライス部位を目標と
するモルホリノポリマーの段階的固−相合成 この例は、ホスホルジアミダート−結合骨格を含有す
るポリマーの固体担体上での段階的集合を示す（第４図
の構造Ｂ−Ｂ、そこでＸはＮ（CH3）２、Ｙは酸素、Ｚ
は酸素である。）。配列、５′−CGUUCCUCCUGCを有する
このポリマーは、ウイルス、ヘルペスシンプレックスＩ
（アテンシオ等）中でスプライス部位を目標とする。
するモルホリノポリマーの段階的固−相合成 この例は、ホスホルジアミダート−結合骨格を含有す
るポリマーの固体担体上での段階的集合を示す（第４図
の構造Ｂ−Ｂ、そこでＸはＮ（CH3）２、Ｙは酸素、Ｚ
は酸素である。）。配列、５′−CGUUCCUCCUGCを有する
このポリマーは、ウイルス、ヘルペスシンプレックスＩ
（アテンシオ等）中でスプライス部位を目標とする。
【０２２３】
A.固体担体への切断可能なリンカーの結合
切断可能なリンカーを、例15、第Ａ欄で記載された様
に固体担体に結合させる。
に固体担体に結合させる。
【０２２４】
B.担体に第一モノマーの結合
モルホリノ環窒素上にトリメチルメチルを有しかつ
５′メチレン上にメチルアミンを有するモノホリノＣサ
ブユニット1mmol（例６に於ける様に製造）を、DMF 12m
l中に懸濁し、例15、第Ａ欄に記載された様に固体合成
担体のために製造されたカラムに加える。ガラス床の床
を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部表面への第一
サブユニットの接近を保証する。室温で１時間後、カラ
ムを十分にジクロロメタンで洗滌する。洗滌液中に存在
する未結合サブユニットを回収し、再使用する。
５′メチレン上にメチルアミンを有するモノホリノＣサ
ブユニット1mmol（例６に於ける様に製造）を、DMF 12m
l中に懸濁し、例15、第Ａ欄に記載された様に固体合成
担体のために製造されたカラムに加える。ガラス床の床
を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部表面への第一
サブユニットの接近を保証する。室温で１時間後、カラ
ムを十分にジクロロメタンで洗滌する。洗滌液中に存在
する未結合サブユニットを回収し、再使用する。
【０２２５】
C.カップリングサイクル
a.脱トリチル化
担体−結合サブユニットを、ジクロロメタン88ml、ト
リフルオロエタノール10ml、及びシアノ酢酸2gから成る
溶液をカラムに徐々に通して脱トリチレート化する。カ
ラムをジクロロメタン40ml、次いでジクロロメタン中で
１％Ｎ−エチルモルホリン40ml、次いで最後にクロロホ
ルム100mlで洗滌する。
リフルオロエタノール10ml、及びシアノ酢酸2gから成る
溶液をカラムに徐々に通して脱トリチレート化する。カ
ラムをジクロロメタン40ml、次いでジクロロメタン中で
１％Ｎ−エチルモルホリン40ml、次いで最後にクロロホ
ルム100mlで洗滌する。
【０２２６】
b.生長する鎖にサブユニットの付加
サブユニット1mmol（例２に於ける様に製造し、例
９、第Ｄ欄に記載した様にN,N−ジメチルアミノジクロ
ロホスフアートで活性化）を、カップリング溶液（ジク
ロロメタン8ml、テトラメチレンスルホン4ml、及びDIPA
EIB 0.5ml（例９に於ける様に製造））中に懸濁する。
この溶液を、容量の１ないし2mlしか床上に残らなくな
るまで合成カラムの床中に導入する。担体を、周期的に
撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面へのカップリン
グ溶液の完全接近を保証する。室温で１時間後、カラム
をジクロロメタンで十分に洗滌する。この洗滌液中です
べての未結合サブユニットを、回収し、再使用する。
９、第Ｄ欄に記載した様にN,N−ジメチルアミノジクロ
ロホスフアートで活性化）を、カップリング溶液（ジク
ロロメタン8ml、テトラメチレンスルホン4ml、及びDIPA
EIB 0.5ml（例９に於ける様に製造））中に懸濁する。
この溶液を、容量の１ないし2mlしか床上に残らなくな
るまで合成カラムの床中に導入する。担体を、周期的に
撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面へのカップリン
グ溶液の完全接近を保証する。室温で１時間後、カラム
をジクロロメタンで十分に洗滌する。この洗滌液中です
べての未結合サブユニットを、回収し、再使用する。
【０２２７】
c.未反応鎖末端のカップリング
無水酢酸2ml及びDIPAEIB 2ml（例９に於ける様に製
造）を有するジクロロメタン50ミリリットルを、カラム
に加える。カラムを、DIPAEIB 2mlを含有するメタノー
ル100ml、次いでジクロロメタン200mlを用いて洗滌す
る。
造）を有するジクロロメタン50ミリリットルを、カラム
に加える。カラムを、DIPAEIB 2mlを含有するメタノー
ル100ml、次いでジクロロメタン200mlを用いて洗滌す
る。
【０２２８】
このカップリングサイクル（上記a,b,c段階から成
る）を用いて、サブユニットG,U,U,C,C,U,C,C,U,G,及び
Ｃを配列に加える。
る）を用いて、サブユニットG,U,U,C,C,U,C,C,U,G,及び
Ｃを配列に加える。
【０２２９】
D.担体から切断
完成したポリマーを例15に記載した様に担体から切断
する。
する。
【０２３０】
E.構造特性評価、脱保護、精製、およびテスト
完全に保護された12−mer生成物を脱保護し、精製
し、例14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の
後、上述の様に製造されたヘルペス−ターゲット12−me
rポリマーは、その相補的DNAと１対となった時（２本鎖
非平行）、47℃のTm（例12中に記載された様に測定）を
有するのが分る：各鎖は、２マイクロモルの濃度で存在
する。
し、例14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の
後、上述の様に製造されたヘルペス−ターゲット12−me
rポリマーは、その相補的DNAと１対となった時（２本鎖
非平行）、47℃のTm（例12中に記載された様に測定）を
有するのが分る：各鎖は、２マイクロモルの濃度で存在
する。
【０２３１】
F.生物学的活性の予備評価
この例の12−merを、ターゲットウイルス、ヘルペス
シンプレックスウイルスＩ（HSUI）によって感染された
マウスを保護するその能力についてテストする。HSV I
で目に感染を受けたマウスは、感染後５日目で残存率65
％を示す。ヘルペス−感染されたマウスを、この例中に
記載された12−mer0.03mmolを含有する局所軟膏で処置
した場合、残存率を感染後５日目で90％に増加する。
シンプレックスウイルスＩ（HSUI）によって感染された
マウスを保護するその能力についてテストする。HSV I
で目に感染を受けたマウスは、感染後５日目で残存率65
％を示す。ヘルペス−感染されたマウスを、この例中に
記載された12−mer0.03mmolを含有する局所軟膏で処置
した場合、残存率を感染後５日目で90％に増加する。
【０２３２】
本発明の特別な具体例、方法、及び使用を記載した
が、本発明の種々の変化及び変更を、本発明から離れる
ことなく行うことができる。特に好ましいポリマー骨格
構造を記載かつ描写したが、他のモルホリノ−基体ポリ
マーを上述の骨格制限及び要求に従って構成することが
できる。
が、本発明の種々の変化及び変更を、本発明から離れる
ことなく行うことができる。特に好ましいポリマー骨格
構造を記載かつ描写したが、他のモルホリノ−基体ポリ
マーを上述の骨格制限及び要求に従って構成することが
できる。
フロントページの続き
(72)発明者 ウエラー・デワイト・ディー
アメリカ合衆国、オレゴン州 97330
カーバリス、エヌ・ダブリュ・エルムウ
ッド、3323
(56)参考文献 特表 昭62−502357（ＪＰ，Ａ)
特表 平５−504564（ＪＰ，Ａ)
特表 昭62−502338（ＪＰ，Ａ)
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ.
85（1988），ｐ．7079〜7083
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07F 9/6558
C07F 9/6561
Claims (24)
- 【請求項１】次の形： 【化１】 （式中（ｉ）環構造は１つの環構造のモルホリノ窒素
を、隣接環構造の５′エキソ環状炭素に結合させる、長
さ１〜３個の原子の非電荷リン−含有キラルリンケージ
によって連結され、そして（ii）Piは塩基特異性水素結
合によってポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効
なプリン−又はピリミジン残基である。） のモルホリノ環構造から成るポリマー。 - 【請求項２】Piは、 【化２】 （式中ＸはH,CH3,F,Cl,Br,又はＩである。） から成る群より選ばれる、請求項１記載のポリマー。
- 【請求項３】環構造及びリンケージは、 【化３】 から成る群より選ばれた形を有する、請求項１記載のポ
リマー。 - 【請求項４】ポリマーが次の形： 【化４】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である；及びＸはF,CH2R,OCH2−R,S
−CH2R,又はNR1R2;及びＲ、R1及びR2のうちのそれぞれ
はH,CH3,又は上記塩基特異的水素結合を妨害しない他の
部分である。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項５】ポリマーが次の形： 【化５】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である；及びＸはF,CH2R,OCH2−R,S
−CH2R,又はNR1R2;及びＲ、R1及びR2のうちのそれぞれ
はH,CH3,又は上記塩基特異的水素結合を妨害しない他の
部分である。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項６】ポリマーが次の形： 【化６】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である;ZはＯ又はＳである。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項７】ポリマーが次の形： 【化７】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である；及びＺはＯ又はＳであ
る。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項８】ポリマーが次の形： 【化８】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である；及びＸはF,CH2R,OCH2−R,S
−CH2R,又はNR1R2;及びＲ、R1及びR2のうちのそれぞれ
はH,CH3,又は上記塩基特異的水素結合を妨害しない他の
部分である。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項９】ポリマーが次の形： 【化９】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である；及びＸはF,CH2R,OCH2−R,S
−CH2R,又はNR1R2;及びＲ、R1及びR2のうちのそれぞれ
はH,CH3,又は上記塩基特異的水素結合を妨害しない他の
部分である。） である繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求
項１記載のポリマー。 - 【請求項１０】水性媒体中で分子の溶解度を増加させる
のに有利であるポリエチレングリコール部分を、片方又
は両方の末端に更に有する、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１１】少なくとも３個のモルホリノ環構造から
成る、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１２】Piの少なくとも１個が2,6−ジアミノプ
リンである、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１３】Piの少なくとも１個が、５−ハロウラシ
ルである、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１４】Piの少なくとも70％が、２−アミンを含
有するプリンである請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１５】Piの少なくとも１個が、2,6−ジアミノ
プリンである、請求項14記載のポリマー。 - 【請求項１６】ポリマーが固形担体に結合されている、
請求項１ないし15のいずれかに記載のポリマー。 - 【請求項１７】サンプル中で、選択されたターゲット配
列を有するポリヌクレオチドの存在を検出する方法にお
いて、請求項１ないし16のいずれかに記載のポリマーを
上記ポリヌクレオチドと接触させ、その場合上記ポリマ
ーは選択されたターゲット配列に結合することができ
る、一連の塩基残基Pi及びPjを有し、そしてポリマーと
ターゲット配列の間にハイブリット形成複合体を形成さ
せるのに有効な、従来公知の条件下で、ポリマーのポリ
ヌクレオチドへの接触を実施することを特徴とする、上
記検出方法。 - 【請求項１８】ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求
項17記載の方法。 - 【請求項１９】ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1
8記載の方法。 - 【請求項２０】ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1
8記載の方法。 - 【請求項２１】ポリヌクレオチドが二本鎖である、請求
項17記載の方法。 - 【請求項２２】ポリヌクレオチドが二本鎖RNAである、
請求項21記載の方法。 - 【請求項２３】ポリマーが検出可能なリポーター基によ
って標識されている、請求項17ないし22のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項２４】選択されたターゲット配列を有するポリ
ヌクレオチドをサンプルから単離する方法において、請
求項１ないし15のいずれかに記載のポリマーを上記ポリ
ヌクレオチドと接触させ、その際上記ポリマーは（ｉ）
選択されたターゲット配列に結合することができる、一
連の塩基残基Pi及びPjを有し、（ii）固形担体に結合さ
れており、そして（iii）ポリマーとターゲット配列の
間にハイブリット形成複合体を形成させるのに有効な、
従来公知の条件下でポリマーをポリヌクレオチドと接触
させ、ついで上記ポリヌクレオチドを単離することを特
徴とする、上記単離方法。
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