JPH01317400A - 非放射活性標識の目的で５’（ｏｈ）位置で化学的に修飾された末端ヌクレオチドを含む核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非反応性核酸プローブに関し、該プローブの合
成に特に有用な化学的変性ヌクレオチド化合物に関する
。

先天性遺伝子病、腫瘍遺伝子病及びウィルス、細菌又は
寄生虫病を検出及び診断する核酸プローブの用途は広範
囲にわたる傾向があり臨床、動物及び植物分野に応用が
見い出せる。これらのプローブは一般にある実験条件下
で相補配列を見つけることができハイブリッド形成して
安定な二重鎖を生成することができる一重鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡである。ＤＮＡ　／　Ｄ　Ｎ　Ａ又はＤＮＡ／Ｒ
ＮＡハイブリッドの古典的な検出方法は放射性標識を使
用し、一般にＤＮＡは放射性同位元素３２ｐで標識され
る。これらのプローブが放射性である場合には計数又は
オートラジオグラフィーによってハイブリッド形成を検
出することができる。しかしながら放射性同位元素の使
用は多くの欠点を有する。

ａ）同位元素の比較的短い寿命による比活性の喪失 ｂ）放射性に対して保護量を使用しなければならないこ
とやこれらのプローブの使用が熟練でない者に複雑であ
るという適用の実際上の問題点 Ｃ）これらの制約の結果として必然的に非常に高い価格 従って近年放射性元素を包含していないことから゛′低
温″なプローベが開発されている。

これらは主に酵素系例えばアルカリ性ホスファターゼ又
はパーオキシダーゼを用いる検出手法を使用する。これ
らの酵素は、無色の可溶性色素産生基質と反応し、着色
沈降生成物を生成してハイブリッド形成を速かに目で見
ることができる。

他の多くの系を使用することができ特に特許出願欧州特
許筒６３，８７９号及び同第１４３．０５９号が想起さ
れ、引例は本特許出願を最もよく理解するために役立つ
ことができる。例えばハイブリッド形成プローブの検出
はフルオレセインを使用するけい光学性によって行なう
ことができる。

開発されている技術は２つの大きなカテゴリーに分類す
ることができる。

１）　　１つはプローブを直接検出できる成分にカップ
リングすることである。ハイブリッドの直接検出は例え
ば酵素をプローブに共有カップリングすることによって
得られる。

こうした欧州特許筒１２０，３７６号の出願にはグルタ
ルアルデヒドの存在下でパーオキシダーゼをＤＮＡにカ
ップリングするためにポリエチレンイミンが使用されて
いる。他方アルカリ性ホスファターゼがチミンの５炭素
に酵素のカルボキシル基とのアミド結合によるアミン化
官能基アームにより結合されている。

２）　第２のカテゴリーは核酸ハイブリッドの間接検出
である６プローブに結合した単位を認識する中間体物質
の使用からなる。問題の系は主にビオチニル化プローブ
とアビジン間の相互作用に基づき、アビジンは酵素に非
常にしばしば結合する。この系はビオチン及びアビジン
間の最大親和性に基づく。現今ではアビジンの代わりに
ストレプトアビジンが好適に使用される。しかしながら
一般に提案されているストレプトアビジン／ビオチンは
カットディスプレースメントとしても知られる手法ニッ
クトランスレーションによってビオチンに結合した変性
ヌクレオチドを核酸プローブに取込むことを必要とする
。このニックトランスレーションは比較的複雑な手法で
あり、大腸菌ポリメラーゼ■及び希釈デオキシリボヌク
レアーゼエのような酵素が使用される。

また提案された間接検出手法は抗体の使用を包含する。

プローブは最初の抗ハプテン抗体に連結したパブテン基
の担体であることができ、この抗体は、最初の抗体に向
けられた他の抗体によって検出されこれらの他の抗体は
非放射性手法の適用によって標識される。

提案された手法の主な欠点は直接あるいは間接検出いず
れに依存するにせよ包含するプローブのヌクレオチドの
化学変性にある。

種々の試薬とカップリングすることができる化学基を有
するオリゴデオキシリボヌクレオチドは文献に記載され
ている。これらの基の導入は一般にオリゴヌクレオチド
鎖にある１種以上の塩基で行なわれる。

塩基に於ける化学変性は、対応配列を有するオリゴヌク
レオチドのハイブリッド形成反応中対になっている塩基
を干渉する欠点を有する。

更に特に従来提案された直接又は間接検出手法のいずれ
も核酸の特に固体サポートによるマニュアル又は自動合
成の伝統的条件下で完全に合成することができない即ち
直接又は間接検出に対して標識成分の結合を包含するこ
とができない。

従って本発明の目的は、 ・標的相補配列で良好なハイブリッド形成を生成し、 ・非放射性方法によって出来る限り低い検出閾値で直接
又は間・液検出することができ更に ・容易に合成することができる即ち特に固体サポートに
よる自動又はマニュアル核酸合成に適当である核酸プロ
ーブを得ることである。

このために本発明はオリゴヌクレオチド又はオリゴデオ
キシヌクレオチド部分と非放射性方法によって相補核酸
標的を容易に迅速に検出することができる特性を有する
分子基からなる別の部分から成る混合分子を製造するこ
とにある。標的相補断片と対応する特定の核酸配列から
なるヌクレオチド部分は安定化エネルギーを与え検出に
望まれるＤＮＡ又はＲＮＡ分子とハイブリッド形成に供
給する。

゛標識成分”とも呼ばれるハイブリッドを直接又は間接
的に検出することができる反応性と供給する部分は上記
で言及した核酸配列の５′末端で結合される。このカッ
プリングは“アーム″とも呼ばれる共有化学的連鎖によ
り行なわれ、一方ではプローブの標識成分と核酸配列間
の立体障害及び他方ではプローブと標的配列のハイブリ
ッド形成に於いてあり得る干渉を避けるためのものであ
る。

要するに本発明の主題は式Ｓ−Ｌ−Ｍに相当するＤＮＡ
又はＲＮＡ核酸配列（Ｓ）を含む核酸プローブであり、
該配列（Ｓ）はその５′末端に於て標識成分（Ｍ）と二
価の化学アーム（Ｌ）により連結しＭは非同位元素方法
で直接又は間接的に検出できる合成又は天然分子である
。

標識成分に結合するための核酸配列の末端ヌクレオチド
の化学変性はＳがｎ個の核酸の配列を示す場合、式Ｉを
次の方法で分けることができるにように５′位で行なわ
れる。

（式中 −Ｊ＝Ｈ又はＯＨ −〇は１〜ｌ　ＯＯ，０００のヌクレオチドの数である
。

−Ｂはプリン又はピリミジン核酸塩基でありヌクレオチ
ドにより異なる。） 核酸はヌクレオチド重合体ＲＮＡの場合にはりボヌクレ
オチドＤＮＡの場合にはデオキシリボヌクレオチドであ
ることが想起される。

ＲＮＡの場合に想起される単量体、即ちヌクレオチドは
リン酸、５個の炭素原子を含む単糖であるリボース（Ｊ
＝ＯＨ）及び４つの基本塩基、アデニン、グアニン、シ
トシン、ウリジンの１つからなる。メチル化又はヒドロ
キシル化塩基、ジヒドロウラシル及びプソイドウリジン
のようないわゆる２次的塩基又はヌクレオチドはほとん
どめったに見い出されない、ＤＮＡの場合には、デオキ
シリボヌクレオチド単糖は、Ｄ−２−デオキシリボース
（Ｊ＝Ｈ）であり４つの主な塩基はアデニン、グアニン
、シトシン及びチミンである。まれには、シトシンがメ
チルシトシン又はヒドロキシメチルシトシンに置き換え
られる。ポリヌクレオチドの本質的な特徴の１つは　３
Ｉ：５Ｉホスホジ工ステルヌクレオチド間結合である。

従って式■の合成は末端ヌクレオチドの５′末端に於い
て伸長する伝統的なヌクレオチド間合成によって行なわ
れる。このため５Ｉ位に於けるアームと核酸配列間の共
有化学的連鎖は特に適当な場合に固体サポートからオリ
ゴヌクレオチド又はオリゴデオキシヌクレオチドを切断
する条件更にヌクレオチド間合成に包含される塩基とリ
ン酸塩の脱保護の条件下で安定でなければならない。

従って本発明による好ましい実施態様では化学アームは
特に式■ ■ −Ｌ’−Ｃ−（−Ｌ’−はその両末端でアミン化した残
基である） を有する化学残基である核酸配列の５′−ヒドロキシル
基とのカルバメート鎖を作製することができる二官能性
二価の化学残基からなる。

更に詳細には、ＬはＡＱｋが２〜２０個の炭素原子を有
する直鎖又は分枝鎖アルキル鎖○ を示す残基−ＮＨ−ＡＭ　ｋ−ＮＨ−Ｃ−を示す。式■
のアームＬは核酸配列の５″（ＯＨ）末端と上記で言及
した切断及び脱保護条件下で安定なカルバメート鎖を生
成する。

Ｌが弐ｍ＝　−ＮＨ−ＡＩ２に−ＮＨ−Ｃ−を有する場
合、ＡＱｋは２〜１２個の炭素原子を有する直鎖を示す
ことが好ましい。

更１こ好ましくはＡ１１ｋは−（ＣＨ２）、−基を示す
。

標識成分Ｍは伝統的な直接検出できる分子を示すことが
できる。特にＭは色素産生基質による目で見るのに適し
た酵素から選択され、特にミクロパーオキシダーゼ及び
アルカリ性ホスファターゼを挙げることができる。

しかしながら本発明によればＭは酵素又はフルオレセイ
ンのようなけい光分子のようないくつかの直接検出でき
る基を結合している巨大分子を示すことが有利であるこ
とができる。この場合、Ｍは、例えば酵素又はけい光分
子のような基が結合しているポリエチレンイミンのよう
な合成重合体を示すことができる。

更に詳細には本発明によればポリフルオレセインポリエ
チレンイミンを言及することができる。この種の化合物
は、標識の増幅が生じ検出閾値が低くなる。

またＭはＬどの連鎖を生成し、オリゴヌクレオチドある
いは他方抗体のような巨大分子からの距離の拡大に寄与
する炭化水素鎖を有するビオチン又はその誘導体の１つ
のような伝統的な間接的に検出できる分子を示すことが
できる。本発明によればＭはいくつかの間接的に検出で
きる基を結合している巨大分子、例えばポリビオチニル
ポリエチレンイミンのようなポリビオチニル化合成重合
体を示すことができることが有利である。

従って本発明の主題は、またいくつかの直接検出できる
基、例えばけい光分子が結合している合成重合体特にポ
リエチレンイミンのようなポリアミン特に直接検出の手
段としてポリフルオレセインポリエチレンイミン、又は
間接検出の手段としてポリビオチニルポリエチレンイミ
ンである核酸プローブを標識するための成分として有用
な中間体生成物を用いることである。

同様に本発明の主題は ａ）　式Ｉａ で表わされる核酸配列を特にヌクレオチド間アッセンブ
リング合成のあらゆる既知のマニュアル又は自動方法に
よって好ましくは固体サポートにより合成し、 ｂ）該配列は好ましくは全く同一の特に固体サポートに
よる合成方法によって式ＩＶＯＲ，Ｊ　　　　　　　　
ＩＶ （式中、 −Ｊ、Ｂ、Ｌ及びＲ□は上記で示した意味を有し、Ｂは
任意に保護される。

−Ｒ，は一定のタイプのヌクレオチド間アッセンブリン
グ合成に対して別のヌクレオチドの５′末端に於て式■
の化合物を導入するのに適した任意に保護されたあらゆ
るホスホリル基である） で表わされるヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドシ
ントン（Ｓｙｎｔｈｏｎ）の３’（ＯＨ）末端に遊離５
’（ＯＨ）末端に於て延長され後者は３′位に於て使用
されるタイプの合成に適したホスホリル基によって保護
され　５′位に於てＲ０基によって遊離末端に於て保護
された化学アームＬを有し、式Ｉｂ で表わされる化合物が得られ。

Ｃ）　保護基Ｒ□は特にジエボキシドのような二官能基
による活性化後゛標識成分ＩＩ　Ｍである分子とのカッ
プリングを確立することを特徴とする式Ｉのプローベの
製造方法である。

“標識成分”Ｍがビオチニル又はフルオレセイニル化学
重合体からなる場合、該化学重合体は非飽和条件下で標
識され結果として求核基を維持するので標識された重合
体は化学″アーム”を有するオリゴヌクレオチドに結合
する。

式１のプローブの合成が固体サポート全体で行なわれる
場合、段階Ｃ）のカップリング反応は段階ａ）及びｂ）
の生成物である基質がなお固体基質に結合されている時
にあるいは他方分子Ｍとの結合の安定性が切断条件下で
不十分である場合切断後に行なうことができる。

Ｍが１種以上の直接又は間接的に検出できる基が結合し
ている巨大分子である場合、該基の巨大分子への結合は
、段階ａ）及びｂ）の生成物である基質に巨大分子が結
合する前に又は後に行なうことができる。

段階Ｃ）のカップリングのための活性化は言及した通り
ジエボキシドを用いてジイソシアナトヘキサン又はスペ
リン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを用い
て行なうことができる。

上記の方法による特に式Ｉのプローブの合成に有用な中
間体生成物によって本発明の主題はまた弐■ ＯＲ，Ｊ　　　　　　　　ＩＶ （式中、 Ｊ＝Ｈ又はＯＨ Ｂ　は任意に保護された核酸塩基である。

Ｌは二価の二官能性化学アームである。

Ｒ１はＬの遊離末端基に対する保護基である。

Ｒ２はＨ又は一定タイブのヌクレオチド間アッセンブリ
ング合成に対して別のヌクレオチドの５′末端に於てシ
ントンの導入に適した任意に保護されたあらゆるホスホ
リル基である。） によって表わされるシントンとも呼ばれる合成ヌクレオ
チド化合物である。

Ｒ２は固体サポートによるホスホルアミド合成の場合に
例示されるように弐Ｖ で表わされるシアノエチルジイソプロピルホスホルアミ
ダイト（−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）基を示す
ことができる。

３’（ＯＨ）位におけるこのホスホリル化は限定してい
ないことは明白であり特にホスホトリ又はジエステル合
成の場合にホスフェートトリエステルスはジエステルの
合成を予想することができる。

好適には二官能性化学アーム　Ｌ　は式Ｌ’−Ｃ−（Ｌ
’はジアミン残基である）の残基で表わされることがで
きる。

Ｌが残基Ｌ’−Ｃ−（Ｌ’はジアミン残基である）であ
る場合、例えばＬが式 −ＨＮ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−Ｃ−を有する場合。

末端アミノ基に対する適当な保護基Ｒ０として式■ ＣＨ，ＶＩ で表わされる酸条件下で不安定なジフェニルイソプロピ
ルオキシカルボニル基が更に例示よって言及することが
できる。

本発明による生成物は式■ ■ （式中Ｂ及びＪは上記で示した意味を有する）に相当す
る。

式■の化合物が核酸プローブの標識に例示により適用さ
れ、従って他の適用を行なうことができることを強調す
ることは適当である。

例えばかかる化合物を使用して核酸配列を固体サポート
に結合することを予想することができる。

更に本発明の主題は以下の段階 （式中Ｂｐは保護核酸塩基であり、Ｊ＝Ｈ又はＯＨ，） で表わされるヌクレオシドの３′位に於けるヒドロキシ
ル基の選択保護、 ２）５′位に於けるヒドロキシル基の選択活性化 ３）式ＲニーＬ　（Ｌは上記で示した意味を有する）の
１個に保護された化学パアーム″を得るための５′位に
於けるカップリング反応 ４）３′位に於けるヒドロキシル基の脱保護及び任意に
よる ５）一定タイブのヌクレオチド間アッセンブリング合成
によって別のヌクレオチドの５′末端にカップリングす
るヌクレオチドを固体相カップリングさせる従って３′
位に於て変性される試薬を用いたホスホリル化 を包含している式■の化合物の製造方法である。

アームＬは式Ｌ’−Ｃ−（Ｌ’はジアミン残α 基である）で表わされることができる場合、５′−ＯＨ
の選択活性化はカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）基
で行なわれるのが好ましい。上記のカップリング３）は
Ｒ１が好ましくはジフェニルイソプロピルオキシカルボ
ニル基を示す式ＲニーＬの末端アミンの１つに保護され
たジアミン残基で行なわれる。

３′位に於けるヒドロキシル基の選択保護はジメチル−
ｔｅｒｔ−ブチルシリル基で行なわれるのが好ましく、
このシリル基は、ＣＤＩでの活性化反応２中安定である
。更にその上この基は通常合成経路の次の段階に十分適
当である。

３’−ＯＨ基の段階１）に於ける選択保護が上述したシ
リル基で行なわれる場合、段階４）での脱保護はフッ化
テトラブチルアンモニウムを用いて行なうことができる
。

段階５）に於けるホスホルアミダイト合成の場合のホス
ホリル化は式■ ■ を用いて行なうことができる。

また上記方法の段Ｖ１１は以下の方法に分けることがで
きる。

１ａ）−式■のヌクレオチドの５′−ＯＨの選択、この
保護は酸ＰＨで不安定なジメ トキシトリチル（ＤＭＴ）を用いて行 なわれるのが好ましい。

１ｂ）−式■の化合物の３’−ＯＨの緩和及び中性条件
下で不安定な基での保護、こ の保護はジメチル−ｔｅｒｔ−ブチル シリル基で行なわれるのが好ましく。

この基は脱保護反応１ｃ）及び活性化 反応３）中安定である。

１ｃ）−５’−ＯＨを遊離するためのＤＭＴの選択脱保
護。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例を考慮すれ
ば明白である。実施例■ではＨＰ　Ｖ１ＧウィルスのＤ
ＮＡに対する本発明によるプローブのハイブリッド形成
が目で見えることを示す、第１図参照。

実施例Ｉ 誘導体５’−［２−（４−ビフェニリル）プロピル−２
−オキシカルボニルアミド−６−ヘキジルアミドカルボ
キシ］チミジン　３′−〇−（２−シアノエチル−Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）は式 （式中ＢＰは保護チミン塩基である）に相当する。

以下の方法は目的として一方では自動合成の通例の条件
下で最終伸張サイクル中オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドに導入することができる化学基、他方ではＤＮＡ分子
を“標識成分ＩＩ　Ｍでカップリングするのに必要とさ
れるカルボキシアルキルアミノ鎖を有するヌクレオチド
シントンの製造方法である。このシントンは自動又はマ
ニュアル合成の手順から逸脱することなく結合すること
ができるＤＮＡ分子を合成させる手段をユーザに提供す
る利点がある。

シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト基はホ
スホルアミド合成に適切である。

カルバメート鎖はヌクレオチドの　５′−ＯＨ基をヘキ
サンジアミンに結合し、このアミノ末端は酸条件下で不
安定なジフェニルイソプロピルオキシカルボニルによっ
て保護される。

このヌクレオチドシントンは保護され、カルバメート鎖
が １）塩基及びリン酸塩に存在する保護基の除去の条件下
で及び ２）オリゴデオキシヌクレオチドを固体サポートから切
断する条件下で 安定であるため、あらゆる合成オリゴデオキシヌクレオ
チドの５″末端で固体相に於て導入することができる適
当な反応性基を提供する。

第１の反応経路は以下の図式１に示され以下の段階を包
含する。

Ｉ）５’−ＯＨを酸ｐＨで不安定なジメトキシトリチル
（ＤＭＴ）で選択保護する ■）３’−ＯＨを　ヒドラジンの存在下で不安定なレブ
リン基で保護する ＩＩＩ）　ＤＭＴを選択脱保護して５’−ＯＨを遊離す
る ＩＶ）５’−ＯＨをカルボニルジイミダゾールで活性化
する ■）へキシレンジアミンと反応させ安定なカルバメート
鎖及び一端がアミノ基を生成する ■）アミンを酸の存在下で不安定なジフェニルイソプロ
ピルオキシカルボニルで保護する ■）レブリン基をヒドラジンで選択脱保護して３’−Ｏ
Ｈを遊離する ■）３’　−ＯＨ位でホスホリル化する。図式に示され
るホスホルアミダイトの具体例は限定されずまたホスフ
ェートトリエステル又はジエステル又はホスホネートの
合成を予想することができる。

図式１に示した反応経路はカルボニルジイミダゾールＣ
ＣＤＩ）を用いる５′位に於けるヒドロキシル基の活性
化中にレブリン基に生じる問題点の結果として以下の図
式２に変更するのが有利である。使用される反応条件下
で完全に安定であるが、誘導体４（図式１）は少なくと
も２倍過剰量のＣＤＩを必要とする。活性化生成物５（
図式１）を分離することができないことから、過剰のＣ
ＤＩは１モル当量のアミノ誘導体を無意味に消費し、精
製を複雑にする。

以下の図式２で示される反応経路に於て、レブリン基は
、ジメチル−ｔａｒｔ−ブチルシリル基に置き換えられ
ており、これは、緩和な中性条件下で除去することもで
き、誘導体１１（図式２）から５’−ＯＨ基とカルボニ
ルジイミダゾールとの反応によって製造される３′−〇
−ジメチルーｊ６ｒｔ−ブチルシリル−５’−０−（イ
ミダゾリルカルボニル）チミジン（１２９図式２）での
置換の反応条件を効果的に再現できる。

シリル基はＣＤＩとの活性化反応を干渉せず、図式２に
記載される次の合成経路の段階に極めて適当である。

１．６−シアミツヘキサンとの置換反応は求核誘導体の
二官能性のために比較的複雑である。対照的に同一条件
での１−アミノヘキサンは簡単な反応を生じる。この置
換反応を簡単にするために我々は１個のアミノ基の保護
を得るための２−（４−ビフェニル）プロプ−２−イル
４−メトキシカルボニルフェニルカーボネート（１０２
図式２）′についてヘキサンジアミンの反応性を研究し
た。１個に保護された誘導体１３（図式２）は９０％以
上の収率で分離することができる。このモノ官能性試薬
は　３′−〇−シリル化５’−０−（イミダゾリルカル
ボニル）チミジンと有効に反応する。

従って十分に保護された誘導体１４（図式２）は　１個
に保護されたヘキサンジアミン１３（図式２）をカルボ
ニルイミダゾール基によって　５′位に於て活性化され
た化合物（図式２）と反応させることによって得られた
。１４のフッ化テトラブチルアンモニウムでの脱保護は
３′位に於けるヒドロキシル基を遊離し、誘導体８に近
づけることができる（図式２）。８のジイソプロピルア
ミノシアノエトキシクロロホスフィンでのホスホリル化
はホスホルアミダイト９を生成する。すへての段階が優
れた収率で行なわれた。誘導体（９）は１Ｈ及び３１Ｐ
　　ＮＭＲによって特徴付けられた。

図式２ 合成のための出発誘導体チミジンは以下に記載される通
り実質的に３段階で　３’−０−ｔｅｒ　ｔ−ブチルジ
メチルシリルチミジン１１に転化された。

第１段階 チミジン（１，２５ｇ　、　５　ｘｌＯ−’モル）を無
水ピリジン（２５ｍ１２）に溶解する。塩化４．４′−
ジメトキシトリチル（，１，９９ｇ。

６Ｘ１０−３モル）を加えた後反応混合液を２０℃で２
時間撹拌する。メタノール（１０ｍＱ）を加え１０分撹
拌した後、この溶液をジクロロメタン５０ｍＱで希釈し
、５％ＮａＨＣＯ、水溶液５０ｍＱずつで３回洗浄する
。

この溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、を濾過し、溶媒を
蒸発させる。残渣をメルク９８３５シリカ（６０ｇ）カ
ラムにより、最初にジクロロメタン（３００ｍ１２）／
ピリジン（０，０１％）次にジクロロメタン（１５０ｍ
Ｍ）／ＭｅＯＨ（１％）／ピリジン（０，０１％）、最
後にジクロロメタン／ＭｅＯＨ（２％）／ピリジン（０
，０１％）４５０＋ｍＱで溶離して精製する。５’　−
０−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを含む
両分を濃縮する。残渣をジクロロメタン（４０ｍＡ）に
溶解し、ヘキサン（３５０ｍＭ）中に滴下撹拌しながら
沈殿する。白色沈殿を真空下で乾燥する。

２．１８ｇの重量、収率＝９０％を得た。

第２段階 ５’−〇−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン
（４，３５ｇ、８Ｘ１０−’モル）及びイミダゾール（
２，２５ｇ、３．３５Ｘ１０−”モル）をアルゴン下で
　２ツロ丸底フラスコに入れ、ジメチルホルムアミド（
４０ｍＱ）中ジメチルーｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン
（２，４ｇ　、　１．６　Ｘ　１０−”モ＃）の溶液で
処理する０反応混合液を２０℃で５時間撹拌した後、水
／水混合液（４５０ｍＭ）に注ぎ入れる。沈殿をミ濾過
により分離し、ジクロロメタン（１００ｍＭ）に溶解す
る。有機相を５％ＮａＨＣＯ，水溶液（１００ｍＭ）で
１回洗浄し、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ，で乾燥し濃縮する。残渣
を真空下で乾燥する。５．１３ｇの重量、収率＝９７％
を得た。

第３段階 ジクロロメタン（３００ｍＭ）中３％トリクロロ酢酸溶
液を５′−〇−（４，４″−ジメトキシトリチル）−３
’−０−ジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリルチミジン　
１５ｇ　（２，２８ｘ１０−２モル）に加える。反応混
合液を２０℃で１／２時間撹拌した後、５％ＮａＨＣＯ
。

水溶液で中性に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、を濾過
し、溶媒を蒸発させて濃縮する。残渣をメルク９８３５
シリカ（３５０ｇ）カラムにより、最初に純粋なジクロ
ロメタン、次にジクロロメタン／酢酸エチル（７０：３
０ｖ　／　ｖ　）最後に酢酸エチル／ジクロロメタン（
５０：　５０　　ｖ／ｖ）で溶離して精製する。

生成物を含む両分を蒸発させる。白色固体残渣を真空下
で乾燥する。８．７ｇの重量を得た。収率＝８９％　生
成物をシリカによるＴＬＣで監視し、”ＨＮＭＲによっ
て特徴付けられた。

１．６−シアミツヘキサン（２，０３４ｇ。

１．７５Ｘ１０−２モル）及び２−（４−ビフェニルイ
ル）プロプ−２−イル４−メトキシカルボニルフェニル
カーボネート（１０）（１，７１ｇ、４．３８　　Ｘ　
　１０−”モル）をジオキサン（６０ｍＱ）に溶解する
。反応混合液を２１℃で２６時間撹拌する。５％Ｎａ２
Ｇｏ、水溶液を混合液に加える。水相をジクロロメタン
１００ｍＱで抽出する。有機相を５％　Ｎａ。

Ｃ○３水溶液で　１回、水で２回洗浄した後。

硫酸ナトリウムで乾燥し、ミ濾過する。溶媒を蒸発させ
る。残渣をメルク９８３５シリカカラムによるクロマト
グラフィで最初にジクロロメタン（６００ｍｌｌｌ）次
にジクロロメタン／メタノール（９８：　２）（２００
ｍＱ）最後にジクロロメタン／メタノール／Ｅｔ、Ｎ（
９３：５　：　２）（１００ｍ１２）で溶離して精製す
る。

生成物を含む両分を蒸発させ、残渣を真空下で乾燥する
。収量１．０８ｇの重量を得た。収率＝９０％生成物を
シリカによるＴＬＣで監視し、’ＨＮＭＲで特徴付けら
れた。

この種の誘導体は、２つの完全に等価の求核基を有し、
１つは選択的に一時的に保護されることから非常に有用
である。遊離のアミノ基は、求電子核を有する分子と反
応して共有連鎖を生成することができる。次いで第２７
ミノ基の保護基は極めて緩和な酸条件下で除去され更に
求核性中心を再生することができる。

坊貸に アルゴン下ニッロフラスコ中に入ったジオキサン（１２
ｍＱ）中３′−〇−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチ
ミジン（１，０６８ｇ、３Ｘ１０−３モル）の溶液にジ
オキサン（４，８ｍＱ）中カルボニルジイミダゾール（
０，５３４ｍｇ。

３．３Ｘ１０−’モル）の溶液を加える。反応混合液を
５０℃で５時間撹拌した後、ジメチルホルムアミド（７
，２ｍＱ）中　２−（４−ビフェニルイル）プロピル−
２−オキシカルボニルアミド−６−ヘキシルアミン１３
（１，４１１＜、４Ｘ１０−３モル）の溶液で処理する
。反応混合液を２０℃で２０時間撹拌した後、５％Ｎａ
ＨＣＯ３水溶液（１００ｍＱ）で加水分解する。水相を
ジクロロメタン（１００ｍＱ）で抽出し有機相を　５％
　ＮａＨＣＯ，水溶液で２回洗浄し、を濾過し、Ｎａ、
ＳＯ２で乾燥する。溶媒を蒸発させ、残渣をメルク９８
３５シリカカラムによりジクロロメタンで溶離して精製
する。生成物を含む画分を蒸発させる。

２．０６　ｇの重量を得た。収率：９３％、生成物をシ
リカによるＴＬＣで監視し、”ＨＮＭＲによって特徴付
けられた。

九人 フッ化テトラブチルアンモニウム（３，６ｇ。

１１．２Ｘ１０−３モル）をテトラヒドロフラン中５１
−　［２−（４−ビフェニルイル）プロピル−２−オキ
シカルボニルアミド−６−ヘキジルアミドカルボキシ］
−３’−０−ｔｅｒ　ｔ−ブチルジメチルシリルチミジ
ン１４　（２，８ＸＩＯ−”モル）の溶液に加える。反
応混合液を２０℃で１７２時間撹拌した後溶媒を蒸発さ
せる。残渣をメルク９８３５シリカカラムによるクロマ
トグラフィで最初にジクロロメタン次にＣＨ２ＣＱ、／
ＭｅＯＨ（９５：　５ｖ／　ｖ　）で溶離して精製する
。生成物を含む両分を蒸発させる。収量３．９９　ｇの
重量を得た。収率＝９３％、この生成物をシリカによる
ＴＬＣで監視し、　１ＨＮＭＲによって特徴付けられた
。

ジイソプロピルアミン（０，６８ｍＱ）及びシアノエト
キシジイソプロピルアミノクロロホスフィン（０，３９
ｍＱ、１．９Ｘ１０−３モル）を無水テトラヒドロフラ
ン（８μ）中５′−［２−（４−ビフェニルイル）プロ
ピル−２−オキシカルボニルアミド−６−ヘキシルアミ
ドカルボキシ］チミジン　８（０，６２２ｇ、１０−’
モル）の溶液に連続して加え、アルゴン下二ッロフラス
コで撹拌する。反応混合液を２０℃で１／２時間撹拌し
、勺濾過する。

酢酸エチル（ｌｏｍＱ）をも炉液に加え、得られた溶液
を５％Ｎ　ａ　ＨＣＯ３水溶液１０ｍＱで３回洗浄し、
Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ミ濾過した後濃縮乾固する。残
渣をメルク９８３５シリカカラムによるクロマトグラフ
ィで酢酸エチル／ヘキサン（７０：３０ｖ／ｖ）で溶離
して精製する。生成物を含む両分を蒸発させ、残渣をジ
クロロメタン４ｍ１ｌｌに溶解した後、アルゴン下で撹
拌しながら一９０℃でヘキサン５０ｍＡに沈殿させる。

白色固形物をも戸別し、真空下で乾燥する。０．６８　
ｇの重量を得た。収率＝８２％　生成物をシリカによる
ＴＬＣで監視し、１Ｈ及び”ＰＮＭＲによって特徴付け
られた。

失凰叢ｌ　　導体９の　、性の この種のヌクレオチド誘導体は合成りＮＡ分子を酵素の
ような天然の巨大分子１合成重合体又はけい光分子又は
例えばビオチンのような巨大分子と極めて安定な複合体
を形成することができる分子に共有的に連結させるため
に使用することができる。生物学及び生体医学の研究、
特に診断分野での応用が見い出せる。この誘導体は、固
体相自動合成の標準化条件下でオリゴデオキシリボヌク
レオチドの末端に於て１段階で導入することができ１つ
の伸張サイクルに於てオリゴヌクレオチド骨格とは別の
反応性化学基を生成する。

ホスホルアミダイト９をテトラゾールの存在下アセトニ
トリルの溶液中で３′−〇−レブリニルチミジンと反応
させ、カップリング反応の速度を薄層クロマトグラフィ
（Ｔ　Ｌ　Ｃ）及び”ＰＮＭＲにより誘導体３’−０−
［（Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィノ
］−５’−〇−（ジメトキシトリチル）チミジンに対し
て既知の速度と同時に行なった。

結果はインターヌクレオチド連鎖の生成速度が両誘導体
と同等であることを示した。−般式９の誘導体の固体相
カップリングは、オリゴヌクレオチド合成で通例使用さ
れる誘導体と一致した又は類似の条件下で行なわれる。

また末端アミンの保護基の不安定性はチミジンのＤ　Ｍ
　Ｔ誘導体のそれと同時に溶液中で研究した９通例使用
される条件下（ＣＨ。

ＣＱ２中２中トリクロロ酢酸）で周基の脱保護の速度は
同等である。これらの結果は固体相に於て確認された。

誘導体９　（Ｂｐ＝Ｔ）はオリゴヌクレオチド自動合成
装置に於て固体サポートに結合したチミジンと縮合し、
アミンの保護基を自動的に除去した。オリゴヌクレオチ
ド伸張サイクル中通例使用した条件（時間、濃度、溶媒
）は全てＡＢ３　３８０Ａ　シンセサイザーで再現した
。アンモニア溶液で固体サポートから切断した後、粗生
成物をＨＰＬＣで分析し、結果を誘導体３’　−０−［
（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホス
フィノ］−５″−〇−（ジメトキシトリチル）チミジン
と平行して行なった縮合後に得られたものと比較した。

各々の場合に、実質的に純粋な生成物が得られる。２つ
の二量体はＨＰＬＣでの保持時間によって明白に区別さ
れる。これらの結果は固体相縮合、酸化及び脱保護反応
が有効であり新規な二量体の質が落ちていないことを示
す。更に新規なカルバメート結合の安定性について行な
った研究は、塩基の脱保護に対する条件下でアンモニア
処理に耐性があることを確認する。

アセトニトリルに可溶化した０、１Ｍ　の濃度の誘導体
９を同一溶媒中　０．５Ｍテトラゾールで活性化し、Ａ
Ｂ８　３８０Ａ　シンセサイザーによるオリゴデオキシ
リボヌクレオチド合成で通例使用される不溶性重合体に
結合したチミジンの５位に於けるヒドロキシル基と縮合
する。全ての条件は、末端アミノ基の酸脱保護を包含す
るオリゴヌクレオチド伸張サイクルエヌ、デイ−、シン
ハ、ジェー、パーナツト、ジェー、マクマナス及びエッ
チ。

カスチル、核配りサーチ（Ｎ、Ｄ、５ｉｎｈａ、　Ｊ　
＊Ｂｉｅｒｎａｔ＋　　Ｊ　、ＭｃＭａｎｕｓ　　＆　
　Ｈ，に６ｓｔｅｒ　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）第１２巻（１１）４５３９頁（１９８
４年）で使用されるものと一致する。生成物の固体サポ
ートからの切断は通例の条件で行なわれ、最終生成物は
オリゴヌクレオチド合成で一般に得られたものに匹敵す
る収量で得られる。

実施例■ オリゴデオキシヌクレオチド部分及び非放射性方法によ
ってデオキシリボ核酸標的が簡単に迅速に検出すること
ができる特性を有する別の部分から構成される混合分子
の合成と用途である。標的ＤＮＡ断片と類似の特定配列
を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド部分は検出が
望まれるＤＮＡ部子とハイブリッド形成するために供給
する安定化のエネルギーを与える。ハイブリッドを検出
することができる放射活性を供給する部分は共有化学結
合によりオリゴデオキシリボヌクレオチドと結合される
。検出に必要とされる特性を有する異なる分子には、ポ
リビオチニルポリエチレンイミン、ポリフルオレセイニ
ルポリエチレンイミン、ミクロパーオキシダーゼ及びア
ルカリ性ホスファターゼが好ましく使用される。

以下の図式３に示されるかかる混合化合物の製造方法は
″標識成分ｕ　Ｍと呼ばれる分子の検出部分の種類に依
存して４段階あるいは３主要段階を包含する。

１）　種々の既知方法の１つによるオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの固体和合成２）　二官能性試薬での活性
化検分子ＩＩ　Ｍ　Ｉ＋と共有結合を確立する官能基（
Ｒよ）を末端に有する連鎖（″アーム″′と呼ばれる）
を有する化学的に変性されたヌクレオチドによる固体相
のオリゴヌクレオチドの５′位に於ける伸張 ３）　適当な場合Ｍを製造するために検出できる分子基
を重合体にグラフする ４）　変性オリゴデオキシリボヌクレオチドを分子″Ｍ
′″とカップリングする カップリング反応４）は固体合成サポートになお結合さ
れているかあるいは分子１（Ｍ　１１の安定性が切断条
件で適合しない場合切断後のオリゴヌクレオチド分子で
達成される。

オリゴヌクレオチド合成は、その分野の専門的な科学文
献に記載される通り、マニュアルで又は自動合成装置で
亜リン酸塩又はリン酸塩法により行なうことができる。

分子“Ｍ　”とカップリングするために必要とされる化
学アームの導入は、特に塩基で化学的に保護されたチミ
ジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキ
シグアノシン又はデオキシイノシンであることができる
実施例■に従って変性されたヌクレオチドにより行なわ
れ“アーム″は５′末端に於て溶液中で行なわれる一連
の制御された化学反応によって結合されている。これら
の反応は３′位に於けるヒドロキシル基の選択保護５′
位に於けるヒドロキシル基の活性化及び安定なカルバメ
ート連鎖を作製する１個に保護された二求核基との反応
を包含する。二求核基は合成の要件に対して新しく製造
された１個に保護されたジアミンである。

ヌクレオチドの３′位に於けるヒドロキシル基は保護基
から遊離され、固体相が変性ヌクレオチドを化学的に保
護されたオリゴデオキシリボヌクレオチドとリン酸塩ト
リエステル法あるいは亜リン酸塩法によりカップリング
することができる試薬でホスホリル化される。

図式３ ％式％ ３）　ロ＝ニー＝コーー÷固形形狂釜羽羽Ｒエ　　　　
　活性基 →−−−−　アーム ニー二＝ニーコ　標識成分の重合体成分口ｌ滋形口　標
識成分Ｍ Ｒ２保護基 ２　　　　　活性基 ■−不溶性合成サポート 化学重合体の標識は、求核基によりビオチンの場合は活
性化エステルとあるいはフルオレセインインチオシアネ
ートの場合はイソチオシアネート基との反応によって行
なわれる。

不飽和条件下で求核基は、標識重合体が求核基１′アー
ム″を有するオリゴヌクレオチドにカップリングしたま
まである。従ってこのカップリングは、ジエボキシド、
ジイソシアナトヘキサン又はスペリン！ＩＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドジエステルのような二官能性試薬によ
り行なわれる。

１）ポリエチレンイミンＰＧ３５のビオチニル化 ビオチンのポリエチレンイミンの結合をモデルとしてト
リチェートＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使
用して研究した。反応物を０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ２を含
む媒質中で数時間攪拌した後、重合体分子と遊離ビオチ
ン分子間の分離を２段階、リン酸塩緩衝液中の透析し次
に分子を濾過で行なわれる。取込みの程度は放射活性に
よって測定する。このモデルで展開された条件はビオチ
ンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルのような更に複雑な試薬で再生することができ、
ビオチニル環と解体される重合体間の立体障害を増幅及
び検出に使用されるアビジン複合体の研究を促進するこ
とができる。

これらのビオチニル基は、アビジン（又はストレプトア
ビジン）に対して及びその結合類似体（パーオキシダー
ゼ又はアルカリ性ホスファターゼに結合）に対して極め
て高い親和性を示す。次いでビオチン−アビジン結合複
合体は、結合酵素を５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェート及びニトロテトラゾリウムブルーの
ような色素産生基質に作用することによって検出するこ
とができる。

ポリエチレンイミンはＰＧ３５（ＢＡＳＦ）（５０μモ
ル）の１０％溶液７００μＱをＮ−ヒドロキシスクシン
イミドビオチン１９８ｍｇ（５８０μモル）と２４時間
撹拌することによってビオチニル化され分子の両分は８
〜９位でトリチェートされる（Ａ［Ｉｌｅｒｓｈａｍ）
。

次いで反応混合液を５ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ４溶液（ｐＨ
８，２）に対して透析する。リン酸塩緩衝液４０ｃｃに
対して　０．５時間３時間透析する。次いで透析サック
の内容物を凍結乾燥し残渣をセファデックスＧ−２５カ
ラムによるクロマトグラフィでＨ２Ｏで溶離して精製さ
れる。

放射活性で洞室される取込みの程度は、重合体（Ｍｗ１
４００）１分当すビオチン９．３分子の取込みを示す。

ＤＮＡプローブを２４個のヌクレオチドを包含するヒト
乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）種のＤＮＡの特定部と対応す
るオリゴデオキシヌクレオチド配列をもって合成した。

自動装置の固体相に於て配列５　’　ＴＧＧ　ＧＣＴＣ
ＴＧ　ＴＣＣＧＧＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＴＧＴ　３　’
のプローブが製造され２４番目のヌクレオチドのＴは実
施例１に記載される通り変性される。このために０．２
μモルに相当する３４μモル／ｇの範囲までジメトキシ
トリチルチミジンで機能化したＣＰＧサポート６ｍｇを
使用した。２４量体（２４＝ｍａｒ）の自動アッセンブ
リーの後、オリゴデオキシリボヌクレオチド鎖のビオチ
ニル化重合体での機能化は３種の異なった方法で行なっ
た。

Ａ、　ビオチニル化重合体を用いる固体サポートによる
機能化 Ｂ、　非ビオチニル化重合体を用いる固体サポートによ
る機能化後結合重合体のビオチニル化 Ｃ６連鎖をサポートから切断した後の溶液中ビオチニル
化重合体の結合 方法Ａ：ビオチニル化重重合体用いる固体サポートによ
る機能化 ２４番目のヌクレオチドＴが変性されている（アルキル
アミノ［）２４−ｍａｒはシンセサイザーで上述の通り
製造される。連鎖を終結するアミンはトリクロロ酢酸で
処理することによって自動的に脱保護され次いでシリカ
に結合したオリゴマーを含むカラムを装置から取りはず
し、次の方法で処理される。カラムを乾燥アセトニトリ
ル２ｃｃで注射器により洗浄した後アルゴンで乾燥し、
乾燥ＤＭＦ中スペリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル）の０．１Ｍ溶液２５０μＱで２時間３
０分間処理した。次いでカラムを乾燥ＤＭＦ２ｃｃ次に
乾燥アセトニトリル２艶で注射器を使用して洗浄し、ア
ルゴンで乾燥した。次いでカラムを　５０　：　５０の
０．ＩＭＮ　ａ　ＨＣＯ３／　Ｄ　Ｍ　Ｆ混合液中ＰＧ
３５．４ビオチンの０．０３２Ｍ溶液２５０μＱで１４
時間処理する。次いでカラムを水４ｃｃ次にアセトニト
リル２ｃｃで注射器を使用して洗浄しアルゴンで乾燥す
る。こうして機能化されたデオキシリボヌクレオチド鎖
は　２５％ＮＨ４０Ｈ５００μＱで　０．５時間を４回
連続して処理することによってＣＰＧサポートから切断
する。合わせたアンモニア性溶液を凍結乾燥し、残渣を
２５％ＮＨ４０Ｈ３ｃｃに溶解しこの溶液を５０℃で５
時間維持する。この２番目のアンモニア処理の目的は、
オリゴヌクレオチド鎖の塩基及びリン酸塩を脱保護する
ためである。次いでこの溶液を凍結乾燥し、残渣を分子
チ過（セファデックスＧ−５０ゲル）によるクロマトグ
ラフィ次にポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。

他方、最後の精製は排除クロマトグラフィカラム（ＰＨ
７，９リン酸塩緩衝液、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒ
ａｔｉｃ　）溶離）によるＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって行な
われる。

方法Ｂ：非ビオチニル化重合体を用いる固体サポートに
よる機能化後、結合重合体のビオチニル化 ２４番目のヌクレオチドＴが変性されてぃる（アルキル
アミノ鎖）２４−ｍａｒはシンセサイザーで上述の通り
製造される。連鎖を終結するアミンはトリクロロ酢酸で
処理して自動的に脱保護した後、シリカに結合したオリ
ゴマーを含むカラムを装置から取りはずし、次の方法で
処理する。カラムを乾燥アセトニトリル２ｃｃで注封器
を用いて洗浄した後アルゴンで乾燥し、乾燥ＤＭＦ中ス
ペリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
）の０．１Ｍ溶液２５０μＱで２時間３０分処理する。

次いでカラムを乾燥ＤＭＦ２ｃｃ次に乾燥アセトニトリ
ルで洗浄し、アルゴンで乾燥する。次いでポリエチレン
イミンＰＧ３５（５０：５０の０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ，
／ＤＭＦ　溶液１６０μＱで希釈した１０％溶液１４０
μＱ）１０μモルで１９時間処理する。次いでカラムを
クエン酸ナトリウム飽和水溶液４ｃｃ次に水４ｃｃ及び
アセトニトリル２ｃｃで洗浄し、アルゴンで乾燥する。

次いでカラムをトリチェート化Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドビオチン０．０５Ｍ溶液２５０μＱで１５時間処
理する。次にカラムを水４ｃｃ及びアセトニトリル２ｃ
ｃで洗浄し、アルゴンで乾燥する。こうして機能化した
オリゴデオキシリボヌクレオチドを２５％ＮＨ，○Ｈ３
Ｏ０μＱで１／２時間連続して４回処理してサポートか
ら切断する。アンモニア性溶液を合わせ凍結乾燥し次い
で残渣を２５％ＮＨ４０Ｈ３ｃｃに溶解し、得られた溶
液を５０℃で５時間維持する。この２番目のアンモニア
処理の目的はオリゴヌクレオチド鎖の塩基及びリン酸塩
を脱保護するためである。次いでこの溶液を凍結乾燥し
、残渣を分子ミ濾過クロマトグラフィ（セファデックス
Ｇ−５０ゲル）次にポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かける。

他方、最後の精製は排除クロマトグラフィカラム（ｐＨ
７，９リン酸塩緩衝液イソクラチツク溶離）によるＨＰ
ＬＣによって行なわれる。

左迭旦：連鎖をサポートから切断後、溶液中でのビオチ
ニル化重合体の結合 ２４番目のヌクレオチドＴが変性されている２　４　ｍ
　ｅ　ｒはシンセサイザーで上述の通り製造される。オ
リゴヌクレオチド鎖を終結するアミンのトリクロロ酢酸
での脱保護及びその連鎖を２５％アンモニア溶液でサポ
ートから切断することは装置で自動的に行なわれる。

ヌクレオチド鎖を含む得られたアンモニア性溶液は２５
％ＮＨ４ＯＨ溶液で３ｃｃにし　５０℃で５時間処理し
た後凍結乾燥する。残渣を分子ミ濾過クロマトグラフィ
　（セファデックスＧ−５０ゲル）次にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかける。こうして合成精製されたオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをビオチニル化ＰＧ３５
重合体を結合するために溶液中で一連の処理にかける。

１．２０．Ｄ、のオリゴマーをＮａＨＣＯ，について０
．１ＭＥＤＴＡについて２ｍＭである水溶液１２μＱに
溶解する。乾燥ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＱ）中スペリン
酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の溶
液２５μΩを加える。

反応混合液を室温で１０分間放置した後セファデックス
Ｇ−２５カラムでＨ２Ｃで７容離して精製する。オリゴ
マーを含む最初の両分がカラムから現われるように冷却
し凍結乾燥する。凍結乾燥後、ＰＧ３５．４ビオチン　
８０ノナモルを０　、１　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ、を含む
水溶液Ｌｏｏμ（！に溶解し、残渣に３ＭＮａＣＱを加
える。反応混合液を室温で２０時間維持した後置子ミ濾
過クロマトグラフィにかける。

カップリングのために５′末端に於けるアミン化化学ア
ームを含むオリゴヌクレオチドを二官能性試薬としてス
ペリン酸とは別にビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル）、１．２，７．８−ジェポキシオクタン又は
１゜６−ジイツシアナトヘキサンで活性化することがで
きる。

ニル化ポリエチレンイミンに結合したオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドプローブの使用上述したオリゴデオキシ
リボヌクレオチド／巨大分子ビオチン標識混合分子の価
値を標的ＤＮＡ分子がヒト乳頭腫ウィルス１６のゲノム
であるハイブリッドの形成及び検出実験で例示した。上
述した方法の１つに従って製造した混合分子は他のＨＰ
ＶウィルスのＤＮＡ配列を排除するためにＨＰＶ１６Ｄ
ＮＡで特異的にハイブリッド形成させた。ハイブリッド
分子の検出は結合ビオチン−ストレプトアビジン複合体
によって結合酵素パーオキシダーゼ又はアルカリ性ホス
ファターゼを色素産生基質ジアミノベンジジン又は５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及び
ニトロテトラゾリウムブルー各々に作用させることによ
って達成した。

プラスミドベクターにクローンしたＨＰＶ１６及びＨＰ
Ｖ１８のＤＮＡをナイロンフィルター又はニトロセルロ
ースフィルターに同時に沈着させた。これらのフィルタ
ーを４５°Ｃあるいは６０℃に於て５ＸＳＳＰＥ５Ｘデ
ンハート、０．５％ＳＤＳ、０．２μｇ／ｍｇ鮭の精子
のＤＮＡで予めハイブリッド形成させた。フィルターを
鮭精子ＤＮＡ　　０．１Ｍｇ／　ｍ　ｎ及びビオチニル
化ＨＰＶ１６プローベ２００ｎｇを含むこのハイブリッ
ド形成混合液中で４５℃あるいは６０℃に於てハイブリ
ッド形成させた。フィルターを２ｘＳＳＰＥ、０．１％
ＳＤＳ中で室温に於て１０分間２回、５ｘＳＳＰＥ、０
．１％ＳＤＳ中で６０℃又、は４５℃に於て１０分間洗
浄したあいくつかの異なった工程を順次使用した。

工寧人　Ｂ５Ａ３％を含む緩衝液Ａ（０，１Ｍトリス−
ＨＣＱ　　ｐＨ７，５，１，ＭＮａＣＱ２　ｍ　Ｍ　Ｍ
　ｇ　ＣＱ　２．０．５％トウィーン２０．０．０５％
トリトンＸ１００Ｏ）中で　３７℃で１時間非特異部位
を遮断した。フィルターをこの緩衝液Ａ中で２回洗浄し
た後ビオチニル化パーオキシダーゼ−ストレプトアビジ
ン複合体の存在下緩衝液Ｂ（０，１Ｍトリス、１Ｍ　Ｎ
ａＣＱ　　２１１１Ｍ　ＭｇＣＱ、、０．０５％トリト
ン×１００及び０．０５％トウィーン２０）中で室温で
１時間温置した。次いでフィルターを１％ＢＳＡを含む
緩衝液Ａ中で５回１次に緩衝液Ｃ（２０ｍＭトリスｐＨ
７，５，０，５ＭＮａＣＱ）中で２回洗浄し、ジアミノ
ベンジジン及びＨ２Ｏ２の存在下緩衝液Ｃ中で少なくと
も３０分間温装した。

工程２　フィルターを緩衛液１　（０，１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ　　ｐＨ７，５，０，１ＭＮａＣＱ、２　ｍ　Ｍ　
ＭｇＣＱ　、、３％ＢＳＡを含む０．０５％トリトンｘ
−１００）中で４２℃で２０分間遮断した。次いでフィ
ルターを真空下８０℃で２０分間乾燥し、ＢＳＡの存在
下緩衝液１中で再水素化した。次いでフィルターをビオ
チニル化仔つシアルカリ性ホスファターゼ１μｇ／ｍＱ
を含む緩衝液１中で１０分間温装した。緩衝液１次に緩
衝液３（０，１Ｍトリス−ＨＣＱｐＨ９，５，０，１Ｍ
ＮａＣＲ２５０ｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ、）　　中で洗浄
した後フィルターをニトロテトラゾリウムブルー及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを
含む緩衝液３中で遮光して４時間以内で装置した。

ナイロンフィルターは高いバックグラウンドを示すが両
種のフィルターで両方法によって１フ工ントモルのＨＰ
Ｖ１６ＤＮＡを特異的に容易に検出することができる。

否定の対照として平行して使用したＨＰＶ１８ＤＮＡに
は全く染色していない。

第１図は、ＨＰＶ１６に対して上述した通りＨＰＶ１６
ＤＮＡのポリビオチニル化ＤＮＡプローブとのハイブリ
ッド形成が目で見えることを示す。

ＤＮＡはニトロセルロースフィルターに沈着させた。

１列は、ｐＢＲ３２２にクローンしたＨＰＶ　１６　Ｄ
ＮＡを含有する。

２列は、ｐＢＲ３２２にクローンしたＨＰＶ１８ＤＮＡ
を含有する。

異なったフィルターは、 ＡはＤＮＡ　５μｇ ＢはＤＮＡ　１μｇ ＣはＤＮＡ　０．１μｇ ＤはＤＮＡ　Ｌｏｎｇ ＥはＤＮＡ　ｌｏｇ ＦはＤＮＡ０．１ｎｇに対応する。

ハイブリッド形成反応は工程２に従って培地１ｍＭ当り
ビオチニル化ＨＰＶ１６プローブ２００ｎｇの存在下前
ハイブリッド形成混合液中で行なわれた。ハイブリッド
形成が目で見られるのはＨＰＶ１６ＤＮＡ１０ｎｇ４こ
対して観察される。

合成されたＨＰＶ１６に特異的な　２９−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドは次の通りである。

５’ＴＡＣＧＣＡ　ＣＡＡ　ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　
ＡＧＡ　ＧＴＣＡＣＡＣＴ３’アルキルアミノ これはアプライドバイオシステムズ（Ａｐ−ｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０　Ａシンセサイザー
によるホスホルアミダイド法（マクブリドエル、ジェー
、及びカルセルズエム、エッチ。

（ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｌ、Ｊ、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、
Ｍ、Ｈ，）テトラヘドロンレターズ第２４巻（１９８３
年）２４５〜２４８頁）によって製造した。合成は２−
シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダ
イドを使用して　０．２μモルのスケールで行なった。

オリゴヌクレオチドに導入される最後のホスホルアミダ
イトはシントンでありその合成は上述されている。

大 オリゴヌクレオチド鎖の末端に於ける保護基（ジフェニ
ルイソプロピルオキシカルボニル）をジクロロメタン９
３％トリクロロ酢酸で（自動）除去した後、５′−アル
キルアミノオリゴヌクレオチドを有する″′制御有孔ガ
ラス”　（ＣＰＧ）サポートをビオチンで標識する目的
で上述した通り処理する。

このビオチン誘導体の使用はオリゴヌクレオチドからの
距離を延長する効果がある。こうしてビオチンおよびオ
リゴヌクレオチド間に生成した新しい連鎖はＣ工２炭化
水素基である。スルホスクシンイミジル基はオリゴヌク
レオチドに結合したＣＧアームの末端アミンで置換され
た残基である。

ａ）固体相に於て ５′−アルキルアミノオリゴヌクレオチド鎖を有するＣ
ＰＧサポートの半量（０，１μモル）（上記の製造方法
を参照）を乾燥ジメチルホルムアミド中スルホスクシン
イミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ピア
ス２１３３５）の２５０μ℃（ジメチルホルムアミドを
酸化バリウムで一晩処理した後ミ濾過し、水酸化カリウ
ムで蒸留した、圧カニ１５ｍ　ｍ　Ｈｇ　）で１６時間
処理する。

次いでサポートを水で洗浄（２閃ずつで４回）シ、その
後サポートからオリゴヌクレオチド鎖を切断するために
２５％アンモニア性溶液で処理（２５０μΩずつで４回
、１７４時間）する。合わせたアンモニア性溶液をオリ
ゴヌクレオチド鎖の塩基の第１アミンを脱保護するため
に５５℃に５時間加熱した後凍結乾燥する。得られた残
渣を　５ＥＰ−ＰＡＫＣ１８カラム（１次溶離水５ｃｃ
、２次溶離２０％ＣＨ，ＣＮ／８０％水５ｃｃ）により
脱塩する。

粗生成物９　、３０　Ｄ、、、を得る（試料１はハイブ
リッド形成で試験する。以下参照）。

粗生成物（試料１）６０Ｄ、Ｓ７を電気泳動（２０％ポ
リアクリルアミドゲル１．５ｍｍ）テ精製した。次いで
ビオチニル化生成物を電気溶離（１５ｍＭトリスｐＨ８
，３）によってゲルから除去する。得られた溶液を凍結
乾燥し、試料２　（０，３７５０Ｄ２ＳＳ）とし、以下
のハイブリッド形成で試験する。

ビオチニル化生成物と別に更に出発５″アルキルアミノ
オリゴマー１　、０２０　Ｄｚｓｖを回収し、これを試
料３とし、以下のハイブリッド形成で試験する。

ｂ）液体相に於て ５′アルキルアミノオリゴヌクレオチド鎖を有するＣＰ
Ｇサポートの半量（０，１μモル）（上記の製造方法参
照）をオリゴヌクレオチド鎖サポートを切断するために
２５％アンモニア溶液で処理（２５０μΩずつで４回、
１７４時間）する。合わせたアンモニア性溶液をオリゴ
ヌクレオチド鎖の塩基の第１級アミンを脱保護するため
に５５℃に５時間加熱した後凍結乾燥する６得られた残
渣をセファデックスＧ−５０カラム（１０ｍ１２）（溶
離剤、１０ｍＭＴＥＡＢ）で溶離した後、ポリアクリル
アミドゲル（２０％厚さ１．５ｍｍ）で精製する。オリ
ゴヌクレオチドを電気溶離（１５ｍＭトリスｐＨ８，３
）で回収する。得られたオリゴヌクレオチド溶液（５，
４０Ｄ、５７）を凍結乾燥する。

２つの５′−アルキルアミノオリゴヌクレオチドＯＤ２
．、を　０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩ｉ液（ｐＨ７，６）２
０μＱに溶解する。この溶液にジメチルホルムアミド中
スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサ
ノエート０．１Ｍ溶液１００μＱを加える。反応混合液
を室温で１６時間放置した後、セファデックスＧ−５０
カラム（１０ｍｌｌｌ、溶離剤１００　ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｅ
　Ａ　Ｂ　）で溶離する。粗生成物１．９６０Ｄ２ｓ、
を回収し、ハイブリッド形成試験は選択性及び感受性の
両方の観点から試料１　（固体相ビオチニル化の粗生成
物）と同様の結果を得た。

ａ）ウテリン頚部生検から細胞の単離 腫瘍生検を最初に約３ｍｍ３片に小力で切り刻む。次に
これらの小片をＰＢＳ食塩水緩衡液（ｌＸ１５ｍＭ　Ｎ
ａＣＱ、２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４）に懸濁した後ＰＢＳ中
０．２５％トリプシンで消化させる。次いで分離した細
胞を計数する。

ｂ）乳頭腫ウイ／Ｌ７ス（ＲＰＶ）ＤＮＡの試験管内酵
素増幅 異なった腫瘍のＤＮＡをサイキ（参考文献１）によって
記載されたのと同じ方法に準じて酵素増幅反応に使用し
た。各々がＲＰＶ種である３対の特異プライマーをこの
実験に使用した（参考文献２）。

ＨＰＶ１６に特異的なプライマー ＨＰＶゲノム 中の位置 ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＣＣＡ　
　　　６９４−７１３ＧＴＧ　ＴＧＣＣＣＡ　ＴＴＡ　
ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＣＴＴ　ＣＣ８２０−７９８これらは
１２７−ｂｐ断片を特定する。

ＨＰＶ１８に特異的なプライマー ＧＣＣＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＣＡＣＡ　　　　　
　　７４０−７５９ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＧτＣ
ＧＴＣＴＧ　　　　　　　８４８−４２８これらは１０
９−ｂｐ断片を特定する。

ＨＰＶ３３に特異的なプライマー ＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧ　　　　　
　　６８１−７００ＧＴＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＣＡＡ　　　　　　　８５８−８３９これらのプラ
イマーは１７８−ｂｐ断片を特定する。

増幅反応は６０００個の腫瘍細胞１６．６ｍ　Ｍ　（Ｎ
　Ｈ４）２Ｓ　Ｏ４，６７ｍＭ　トリス−ＨＣＱｐＨ８
，８，６，７ｍＭ　ＭｇＣＱ、、１０ｍＭＢＭＥ、　　
２００ｕｍ　　ｄＡＴＰ、　　ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰゼラチン２００　μｇ／ｌｎＱ及び
プライマー０．２５％ＤＭ８０．１単位の熱安定性ポリ
メラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、ニューイングランドバ
イオラプス）の各々３０ピコモルを含む混合液容量５０
μＱで行なわれる。鉱油を１滴加え混合液を９２℃で１
０分間温温置る。次に　９２℃で１分間、６６°Ｃで３
分間連続して温置し、このサイクルを３０回繰り返した
。

一方でＨＰＶ６ｂ、１１，１６．１８及び３３のｐＢＲ
３２２にクローンしたＤＮＡを０．５Ｎ　ＮａＯＨ中４
５℃で１５分間変性した。各クローンを担体ＤＮＡ鮭精
子ＤＮＡ０．１μｇの存在下ナイロン膜で勺濾過した。

フィルターを０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣｎ
で含浸したパッドに１０分間０．５Ｍ）−リスＨＣＱ　
ｐＨ７，５，１，５Ｍ　ＮａＣＱで含浸したパッドに１
０分間置き　２ｘＳＳＣ（ｌｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　
ＮａＣＱ、１５ｍＭクエン酸トリナトリウムｐＨ７，５
）で　５分間すすぐ。次にフィルターを風乾した後、Ｄ
ＮＡをＵＶ照射（１分１ＩＪｌｌ　３１２ｎｍ）で固定
する。

他方各酵素増幅の生成物の１１５を４％ヌシーブアガロ
ースゲルによる電気泳動で分析する。次いでゲルを０．
５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５ＭＮａＣＱ溶液中で３０分間温
温置ＤＮＡの変性）した後、トリス−ＨＣＱ　　ｐＨ７
，５゜１．５ＭＮａｃＱ中で　３０分間温温置て中和す
る。ＤＮＡをナイロン膜にサウザン手法（参考文献３）
により移入し、ＵＶ照射で固定する。

ｄ）フィルターのハイブリッド形成 フィルターを次の混合液、５　　×　５ＳＰＥ（１ｘＳ
ＳＰＥ＝０．１８Ｍ　　ＮａＣＱ、１０ｍＭＮａＨ２Ｐ
Ｏ，、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　ｐＨ８）、５×デンハー
ト（ＬＸデンハート＝０．０２％Ｆｉｃｏ１１．０．０
２％ＢＳＡ、０．０２％ポリビニルピロリドン）及び４
５℃で少なくとも２時間変性した鮭精子ＤＮＡ　０．１
ｍｇ／ｍＱ中で前ハイブリッド形成させる。

前ハイブリッド形成混合液で希釈した試料１．２又は３
（ｌμｇ／ｍＱ）を加えハイブリッド形成を４５℃で１
６時間行なう６次いで　フィルターをａｘｓｓｃ、ｏ、
ｉ％ＳＤＳで１５分間２回室温’ｔ’　６ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳで１０分間４５℃で洗浄する。

ｅ）ビオチニル化ハイブリッドの検出 フィルターを４２℃の遮断溶液（０，１Ｍトリス−ＨＣ
Ｑ　ｐＨ７，５，０，１Ｍ　ＮａＣＱ。

２ｍＭ　ＭｇＣＱ、、０．０５％　トリトン×−１００
＝緩衝液１＋３％　ＢＳＡ＝緩衝液２）中で２０分間温
温置る。次いでフィルターを乾燥した後、緩衝液２で再
び水和し、その後ストレプトアビジン（２μｇ　／　ｍ
　Ｑ緩衝液１）の存在下１０分間温温置る。フィルター
を緩衝液１で３回すすいだ後、アルカリ性ホスファター
ゼに結合したビオチン（１μｇ　／　ｍ　Ｑ緩衝液１）
の存在下　１０分間温温置る。フィルターを緩衝液１で
２回次に緩衝液３（０，１Ｍトリス−ＨＣＱ　　ｐＨ９
，５＋　Ｏ，１ＭＮ　ａ　ＣＱ　、　５０　ｍ　Ｍ　Ｍ
　ｇ　ＣＱ　２）で２回すすぐ。

次にフィルターをアルカリ性ホスファターゼに対する基
質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェー
ト（ＢＣＩＰ）及びニトロテトラゾリウムブルー（Ｎ　
Ｂ　Ｔ）の存在下緩衝液３に温置する。２０ｍＭトリス
−ＨＣＱ　　ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液中で洗
浄することにより染色反応を停止する。

ｆ）結果 我々はＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶＩＩ、ＨＰＶ１６゜ＨＶＰ１
８及びＨＰＶ３３クローンＤＮＡ（７）漸減量（ｔｏ−
”　〜１０−”モルｌｏｏ、１０．１及び０．１フ工ン
トモル）について試料１の検出の感受性を最初に試験し
た。

我々は試料１がＨＰＶ１６に排他的に特異的であり、検
出閾値が１フ工ントモル（１０−１５）の範囲にあるこ
とに注目することができた。

次に我々は酵素で増幅した腫瘍ＤＮＡについてこの試料
を試験した。目に見えて３０分後に我々ＲＰＶ１６に特
異的なバンドを簡単に検出することができた。

次いで我々はクローンＤＮＡについて試料２及び３を試
験した。試料２は係数が少なくとも１０（１０−”モル
）低下した検出閾値を有し、ＨＰＶ１６に対する特異性
は維持する。

試料３とのハイブリッド形成はビオチニル化されないた
め、予期した通り目に見えるシグナルは生じない。

参考文献 １、　サイキ、Ｒ，に、等　（１９８８年）。

サイエンス第２３９巻、４３７〜４９１２　、　　５ｏ
ｎｄａｓ　　ｄ　’　ａｃｉｄｅｓ　　ｎｕｃｌ＆１ｑ
ｕｅｓ　ｄ　ｅ　５ｖｉｒｕｓ　　ｎｕｃ１６ｉｑ　ｕ
　ａｓ　　ｄ　ｅ　ｓ　　ｖｉｒｕｓ　　ｄ　ｅｐａｐ
ｉｌｌｏｍｅ　ｈｕｍａｉｎ　（ヒト乳頭腫ウィルスの
核酸に対する核酸プローベ）ヘルゾグ等、８７１０９１
７゜ ３、　サウザン、Ｅ、Ｍ、（１９７７年）。

Ｊ、ＭｏＱ、ＢｉｏＱ、第９８巻、５０３頁

【図面の簡単な説明】

図面は、ＨＰ　Ｖ　１６　ニ対してＨＰＶ１６ＤＮＡの
ポリビオチニル化ＤＮＡプローブとのハイブリッド形成
を示す写真である。 手続７市正書（方式） ％式％［ １、事件の表示　平成１年特許願第４１９３１号２、発
明の名称 ３、補正をする者 氏　名　　（６４４４）弁理士　　岡　　部　　正　　
夫　；′ｉ、、’、　　°。 ５、補正命令の日付

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸配列が式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中 Ｊ＝Ｈ又はＯＨ ｎは１〜１００，０００のヌクレオチドの数である。 Ｂはプリン又はピリミジン核酸塩基であり適宜ヌクレオ
   チドにより異なる。） に従い５’末端に於て二価の二官能性化学“アーム”Ｌ
   により、Ｍが非同位元素的方法で直接又は間接的に検出
   できる合成又は天然分子である“標識成分”Ｍに連結し
   ていることを特徴とする核酸配列を含む核酸プローブ。 ２、Ｌが核酸配列の５’−ヒドロキシル基とカルバメー
   ト鎖を作製することができる化学残基である請求項１記
   載のプローブ。 ３、Ｌが式III ▲数式、化学式、表等があります▼III （式中Ａｌｋは２〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は
   分枝鎖アルキル鎖である。） で表わされる残基である請求項２記載のプローブ。 ４、Ｌが式III（式中Ａｌｋは２〜１２個の炭素原子を
   有する直鎖である）の残基である請求項３記載のプロー
   ブ。 ５、Ａｌｋが−（ＣＨ＿２）＿６−基である請求項４記
   載のプローブ。 ６、Ｍが 直接的に検出できる分子、例えばミクロパーオキシダー
   ゼ及びアルカリ性ホスファターゼのような色素産生基質
   による目で見るのに適した酵素、 フルオレセインのようないくつかの直接に検出できる分
   子が結合している合成又は天然分子であり間接的に検出
   できる分子、例えば炭化水素鎖を有する抗体、ビオチン
   又はその誘導体の１つ、 ビオチンのようないくつかの間接的に検出できる分子が
   結合している合成又は天然分子から選択される前述の請
   求項の１つに記載のプローブ。 ７、ポリビオチニルポリエチレンイミン及びポリフルオ
   レセイニルポリエチレンイミンのような いくつかの直接又は間接的に検出できる分子が結合して
   いる合成重合体から選択される請求項６記載の特に“標
   識成分”Ｍとして有用な化合物。 ８、ａ）好ましくはヌクレオチド間−アッセンブリング
   合成更に好ましくは固体サポートによるあらゆる既知の
   マニュアル又は自動方法によって核酸配列を合成し、 ｂ）該配列が全く同一の好ましくは固体サポートによる
   合成によって遊離５’（ＯＨ）末端に於てヌクレオチド
   又はデオキシヌクレオチドシントンの３’（ＯＨ）末端
   に延長され、後者は３’位に於て使用される合成の種類
   に適したホスホリル基によって保護され５’位に於て保
   護基Ｒ’によって遊離末端で保護された化学“アーム”
   Ｌを有し、 ｃ）保護基Ｒ’は活性化の後“標識成分”Ｍ分子とのカ
   ップリングを確立することを特徴とする前述の請求項の
   １つに記載のプローブの製造方法。 ９、合成が固体サポート上で行なわれ、 段階ｃ）のカップリングが段階ａ）とｂ）の生成物であ
   る基質がまだ固体サポートに結合している時にあるいは
   また該基質と固体サポートの切断後に行なわれる請求項
   ８記載の方法。 １０、Ｍが直接又は間接的に検出できる１個以上の基を
   結合している巨大分子である場合該基の巨大分子への結
   合は、後者が基質にカップリングする前に又は後に行な
   われる請求項８及び９の１つに記載の方法。 １１、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼IV （式中、 Ｊ、Ｂ、Ｌ及びＲ＿１は上記で示した意味を有し、Ｂは
   任意に保護され、Ｒ＿２はＨ又は一定タイプのヌクレオ
   チド間アッセンブリング合成に対して別のヌクレオチド
   の５’末端で式IVの化合物を導入するのに適した任意に
   保護されたあらゆるホスホリル基である。）に相当する
   特に請求項８〜１０の１つに記載の方法に有用な中間体
   化合物。 １２、Ｒ＿２が式Ｖ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｖ で表わされるシアノエチルジイソプロピルホスホルアミ
   ダイト基である特に固体サポートによるホスホルアミダ
   イト合成の場合の請求項８記載の方法に有用な請求項１
   １記載の化合物。 １３、Ｌが式▲数式、化学式、表等があります▼（Ｌ’
   はジアミン 残基である）でありＬ’の末端アミン基に対する保護基
   Ｒ＿１は式VI ▲数式、化学式、表等があります▼VI で表わされる酸条件下で不安定なジフェニルイソプロピ
   ルオキシカルボニル基である請求項１１及び１２の１つ
   に記載の化合物。 １４、式VII ▲数式、化学式、表等があります▼VII （式中Ｂ及びＪは上記で示した意味を有する。）に相当
   する請求項１３記載の化合物。 １５、以下の段階 １）式VIII ▲数式、化学式、表等があります▼VIII で表わされるヌクレオシドの３’位に於けるヒドロキシ
   ル基の選択保護、 ２）５’位に於けるヒドロキシル基の選択活性化、 ３）式Ｒ＿１−Ｌ（Ｒ＿１及びＬは上記で示した意味を
   有する）で表わされる１個に保護された化学“アーム”
   を生成するための５’位に於けるカップリング反応、 ４）３’位に於けるヒドロキシル基の脱保護及び任意に
   より、 ５）一定タイプのヌクレオチド間アッセンブリング合成
   によって別のヌクレオチドの５’末端にカップリングす
   るヌクレオチドを固体相カップリングさせる従って３’
   位に於て変性される試薬を用いたホスホリル化、 を包含している請求項１１〜１４の１つに記載の生成物
   の製造方法。 １６、アームＬが式▲数式、化学式、表等があります▼
   （Ｌ’はジアミン残基である）で表わされることができ
   る場合、５’−ＯＨの選択活性化はカルボニルジイミダ
   ゾール（ＣＤＩ）基を用いて行なわれるのが好ましく段
   階３）のカップリング反応は式Ｒ＿１−Ｌ’（Ｒ＿１は
   好ましくはジフェニルイソプロピルオキシカルボニル基
   である）で表わされる末端アミンで１個に保護されたジ
   アミン残基を用いて行なわれる請求項１５記載の方法。 １７、３’位に於けるヒドロキシル基の選択保護１）が
   ジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル基を用いて行なわれ
   るのが好ましい請求項１５及び１６の１つに記載の方法
   。 １８、段階４）の脱保護がフッ化テトラブチルアンモニ
   ウムを用いて行なわれる請求項１７記載の方法。 １９、段階５）に於てホスホルアミダイト合成の場合の
   任意のホスホリル化がジイソプロピルアミノシアノエト
   キシクロロホスフィンを用いて行なわれる請求項１７及
   び１８の１つに記載の方法。 ２０、段階１）が以下の方法 １ａ）酸ｐＨで不安定な基を用いる式VIIIのヌクレオシ
   ドの５’−ＯＨの選択保護、 この保護はジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を用いて行な
   われるのが好ましい、 １ｂ）緩和な中性条件下で不安定な基を用いる式VIIIの
   化合物の３’−ＯＨの保護、 この保護はジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル基を用い
   て行なわれるのが好ましい、 １ｃ）５’−ＯＨを遊離するＤＭＴの選択脱保護 で分けられる請求項１５〜１９の１つに記載の方法。