JPH08220092A

JPH08220092A - オリゴヌクレオチドの長さの変化の検出方法

Info

Publication number: JPH08220092A
Application number: JP7304307A
Authority: JP
Inventors: Teresa K H Picone; キムハフピコネテレサ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 1996-08-30
Anticipated expiration: 2015-11-22
Also published as: AU3901095A; CN1133888A; CA2163388C; DE69522176T2; CA2163388A1; EP0713921A2; KR960017858A; PT713921E; ES2162630T3; NZ280506A; ATE204333T1; DE69522176D1; KR100431421B1; CN1131320C; AU700885B2; JP3600333B2; US5571673A; EP0713921B1; EP0713921A3; RU2149186C1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、発光標識物質で標識された、オリ
ゴヌクレオチドの長さの変化を、該標識の発光を変化さ
せるように該標識物質と相互作用するDNA 結合化合物の
存在下で、その発光を測定することによって検出する方
法であって、その相互作用の程度が、該オリゴヌクレオ
チドの長さによって左右される方法を提供する。【解決手段】本方法は、一般に、ハイブリッド形成さ
れたオリゴヌクレオチドプローブの選択的切断をもたら
す反応を用いる核酸配列の検出アッセイ、並びに特にハ
イブリッド形成されたプローブが、プライマー伸長法に
付随して切断されるような、増幅／検出アッセイに適用
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発光標識物質で標
識されたオリゴヌクレオチド標識物質の長さの変化を検
出する方法に関する。さらに、本発明は、プローブの機
能を有する相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド
形成による、核酸配列を検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】オリゴヌクレオチドプローブを用いる核
酸の検出は、特定の標的を検出するための標準的手法と
なっている。多くのアッセイ様式が明らかになってい
る。一般に、核酸試料は、標識された標的に特異的なプ
ローブとハイブリッド形成し、結合しないプローブはこ
のハイブリッド・リュプレックスから分離され、かつこ
のハイブリッド・リュプレックスの存在が該標識物質を
用い検出される。このハイブリッド形成したプローブと
形成しなかったプローブとの分離は、多くの方法で達成
することができる。

【０００３】例えば、その試料核酸を保持体上に固定化
し、かつ非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除
去するか、あるいはハイブリッドリュプレックス及び非
結合プローブをゲル電気泳動によって分離するかのいず
れかである。一般に、これらの方法は、ハイブリッド形
成後に生じたシグナルを、非結合非標識プローブによっ
て生じたバックグラウンドシグナルと区別するするため
の、分離工程を必要とする。

【０００４】いくつかの核酸検出法は、プローブ−標的
のハイブリッド・デュプレックスの形成後の、オリゴヌ
クレオチドプローブの選択的切断に関連して、説明され
ている。切断されたプローブの検出は、ハイブリッド形
成の発生、及びこれによる標的配列の存在を示してい
る。例えば、Saiki らの論文(Biotechnology,3:1008-10
12(1985)は、“オリゴマー制限”の方法を記載し、これ
は、標的に特異的なプローブのハイブリッド形成が、そ
の後対応する制限酵素によって切断されるような制限部
位を生じることを明らかにしている。

【０００５】特許公報 WO 89/09284号は、RNA プローブ
を用い、DNA 標的配列を検出する方法を開示している。
DNA 標的とハイブリッド形成されたRNA プローブを、選
択的にRNA-DNA ハイブリッド・デュプレックス中のRNA
を切断するRNaseHを用いて切断する。米国特許第5,210,
015 号は、核酸ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアー
ゼ活性を用い、標的配列とハイブリッド形成されたプロ
ーブを切断し、そしてこれにより検出のための標識され
たオリゴヌクレオチド断片を放出する方法を開示してい
る。

【０００６】ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、核酸の増幅
方法の発明は、感度及び特異性が顕著に増大した核酸の
検出を可能にした。PCR を用い、単コピーゲノムDNA の
セグメントは、検出前に容易に検出可能なレベルにまで
選択的に増幅される。PCR 法は、米国特許第4,683,202
号において開示されている。PCR 、及び増幅された標的
核酸とハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いるPCR 生成物の検出法は、米国特許第4,683,
195 号、並びに欧州特許公報第237,362 号に開示されて
いる。

【０００７】プローブ−標的ハイブリッド・デュプレッ
クスの形成後の、ハイブリッド形成プローブの選択的切
断を含む前記の核酸検出法は、増幅された核酸の検出に
適用されている。Saiki らの Science, 230:1350-1353
(1985）は、PCR 増幅された核酸を検出するために、
“オリゴマー制限”を適用することを記載している。前
記米国特許第5,210,015 号は、標的配列とハイブリッド
形成された標識プローブを切断するために、核酸ポリメ
ラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を用いる、PCR
増幅生成物の解析法を開示している(Hollandらの論文(P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,8 8 :7276-7280(1991)) も参
照) 。

【０００８】米国特許第5,210,015 号の方法において、
増幅プライマーで結合された該標的核酸の領域とハイブ
リッド形成するプローブは、この増幅反応混合物に混合
される。ハイブリッド形成されたプローブは、プライマ
ー伸長の間に、該ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活
性によって切断される。標識された断片の検出は、プラ
イマー伸長及びプローブハイブリッド形成の両方が生
じ、その結果特定の標的配列の増幅が生じたことを示し
ている。

【０００９】多くの試薬が、標的核酸を容易に検出する
ための、プローブ又は標的のいずれかの核酸の標識に関
して記載されている。標識物質類は、蛍光、放射線、比
色、X-線回析又は吸収、磁気及び酵素活性によって検出
可能なシグナルをもたらし、かつ例えば発蛍光団、発色
団、放射性同位元素( 特に³²P 及び¹²⁵I)、高電子試
薬、酵素、及び特異的結合パターンを有するリガンドで
ある。標識は、標識物質を組み込むための、プライマー
又はプローブの化学的修飾、もしくは修飾されたヌクレ
オチド三リン酸を、伸長生成物へと組み込むための重合
剤の使用のような、多くの方法で達成することができ
る。

【００１０】核酸ハイブリッド形成アッセイにおける、
相互作用する蛍光標識物質によって標識されたオリゴヌ
クレオチドプローブの使用は、Morrisonの論文（非同位
体DNA プローブ技術、Kricka編集、Academic Press社、
サンディエゴ、CA、第13章、(1992 )); 並びにHeller及
びMorrisonの論文（汚染剤の迅速な検出及び同定、Acad
emic Press社、サンディエゴ、CA、245-256(1985))に記
載されている。これらの方法は、適した蛍光標識物質が
近傍にもたらされた場合に生じる蛍光の変化によるもの
であり、前記文献中に、蛍光エネルギーの移動(FET) 、
蛍光共鳴エネルギーの移動、無放射エネルギーの移動、
長距離のエネルギーの移動、双極子組エネルギーの移
動、又はフェルスターエネルギー移動として記載されて
いる。

【００１１】前述のMorrisonの論文(1992)は、３種のア
ッセイ様式を記載している。これらのアッセイ様式のう
ちの２種において、相互作用する蛍光標識物質は、プロ
ーブハイブリッド形成によって、一緒に又は別々にされ
る個別のオリゴヌクレオチドを分離するように結合され
る。これらのアッセイ様式は、プローブ−プローブハイ
ブリッド形成が、プローブ−標的ハイブリッド形成と競
合するかどうかによって決まる、非競合的又は競合的な
もののいずれかとして記載されている。

【００１２】両方のアッセイ様式は、２種の配列に特異
的な標識されたプローブを合成する必要がある。第三の
アッセイ様式において、１個の蛍光標識物質はハイブリ
ッド形成プローブと結合し、かつ第二の蛍光標識物質
は、二本鎖ハイブリッド形成二重らせんの中に挿入され
ることによって、近傍にもたらされる。溶液中では、こ
の挿入標識物質及び非ハイブリッド形成プローブ間に
は、重要な相互作用は生じない。該挿入標識物質は、い
ずれの二本鎖核酸の中にも挿入することができるので、
この様式は、一本鎖の標的核酸の検出のためのみ、実用
的である。

【００１３】米国特許第5,210,015 号は、近傍で相互作
用する蛍光標識物質類で標識されたハイブリッド形成プ
ローブの使用を開示している。これらの標識は、増幅期
のプローブの分解が該標識物質を分離し、その結果、蛍
光の検出可能な変化を生じるように結合している。この
ような複合的に標識されたプローブは、合成が困難であ
り、かつ費用がかかる。

【００１４】当該技術分野の範疇である分子生物学及び
核酸化学の通常の技術は、例えばSambrookらの論文( 分
子クローニング−実験操作法、Cold Spring Harbor Lab
oratory 、コールドスプリングハーバー、NY(1985) );
オリゴヌクレオチド合成(M.J. Gait編集(1984));核酸ハ
イブリッド形成(B.D.Hames及びS.J.Higgins 編集(1984
))；並びに酵素的方法(Academic Press 社) のような
文献に十分に説明されている。

【００１５】一般に本発明は、発光標識物質によって標
識されたオリゴヌクレオチドのDNA結合化合物によっ
て、顕著な溶液内の消光(quenching) が生じるような条
件を提供する。この消光は、標識されたオリゴヌクレオ
チドの、その相補的配列へのハイブリッド形成を伴わな
い溶液中で生じる。本発明の方法は、標識されたオリゴ
ヌクレオチドの長さによって左右されるこの消光を用い
る。短い標識オリゴヌクレオチド( ヌクレオチド約６個
以下) の消光は、より長い標識オリゴヌクレオチドの消
光よりも、検出されにくい。発光標識物質によって標識
されたオリゴヌクレオチドのDNA 結合化合物による溶液
内消光の発生、並びに該オリゴヌクレオチドの長さによ
って決まる消光のいずれも、これまでは報告されていな
い。

【００１６】本発明は、DNA 結合化合物の存在下におけ
る蛍光の変化を基にした、標識オリゴヌクレオチドの長
さの変化を検出する方法を提供する。特に本発明は、切
断されていないオリゴヌクレオチドから切断されたオリ
ゴヌクレオチド断片を分離する必要がない、反応混合物
中でのオリゴヌクレオチドの分解（切断) の検出方法を
提供する。該オリゴヌクレオチドは、発光標識物質によ
って標識されている。該標識物質と相互作用し、該標識
物質の発光を消光するような、DNA 結合化合物が、この
反応混合物に添加される。オリゴヌクレオチドの分解
は、この反応後に、該標識物質の消光を測定することに
よって検出される。標識オリゴヌクレオチドの長さによ
って消光が左右されるので、オリゴヌクレオチド分解
は、標識されたオリゴヌクレオチドの発光の検出可能な
変化を生じる。

【００１７】本発明は、オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド形成による、試料中の標的核酸の改善さ
れた検出法を提供する。本方法は、標的核酸とハイブリ
ッド形成されたプローブの選択的切断によってもたらさ
れる。本発明の方法において切断されたプローブが検出
されることは、標的核酸が存在することを示している。

【００１８】本発明のある具体的な実施態様において、
試料中の標的核酸の検出方法が提供され、かつこの方法
は： (a) 該試料及び発光標識物質で標識されたオリゴヌクレ
オチドプローブを含有する反応混合物を用意し、ここで
該プローブは該標的核酸とハイブリッド形成することが
できる配列を含み、そして該DNA 結合化合物が、該標識
物質の発光を変更し； (b) 工程(a) の反応混合物のアリコートに、DNA 結合化
合物を添加し、そしてその標識物質の発光を測定し； (c) 前記混合物を、該オリゴヌクレオチドプローブが該
標的配列にハイブリッド形成しかつ切断されるような条
件下で処理し； (d) 工程(c) の反応混合物のアリコートに、DNA 結合化
合物を添加し、そしてその標識物質の発光を測定し；そ
して (e) 工程(b) 及び工程(e) において測定された発光の差
によって、該標識配列が存在するかどうかを判定する；
工程を含む。

【００１９】標的核酸とハイブリッド形成したプローブ
の選択的切断は、多くの公知の反応のいずれかによって
達成することができる。標的配列とハイブリッド形成し
たプローブを選択的に切断するのに適した反応の例は、
前述のSaiki らの論文(1985);前記特許公報 WO 89/0928
4号; 及び前記米国特許第5,210,015 号に、記載されて
いる。

【００２０】本発明の核酸を検出する方法は、特に増幅
工程と組み合わせて使用することが適している。従っ
て、本発明のある実施態様において、該標的配列は、工
程(c)の以前に、もしくはこれと組み合わせて増幅され
る。好ましい実施態様において、本発明は、米国特許第
5,120,015 号に開示された、プライマー伸長のため、並
びにハイブリッド形成された標識プローブの切断の両方
ために１種の核酸ポリメラーゼを使用するような、均質
PCR 増幅及びPCR 生成物検出アッセイの改善を提供す
る。本発明によってもたらされたこの改善は、切断及び
非切断プローブを分離するための反応後の操作を必要と
せず、１種の発光標識物質で標識されたプローブを使用
することが許される。

【００２１】従って、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR) を用い、試料中の標的核酸配列を検出する方法を
提供し、この方法は： (a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、
5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、該
オリゴヌクレオチドプライマーによって結合された標的
核酸の領域にハイブリッド形成することが可能なオリゴ
ヌクレオチドプローブを含有するPCR 混合物を用意し、
ここで該プローブは発光標識物質で標識され、そして該
DNA 結合化合物が該標識物質の発光を変化させることが
可能であり； (b) DNA 結合化合物の存在下で、前記反応混合物中の標
識物質の発光を測定し； (c) 前記PCR 混合物を、該核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌ
クレアーゼ活性が該標的配列にハイブリッド形成された
プローブを切断するようなPCR 条件下で処理し； (d) DNA 結合化合物存在下で、該標識物質の発光を測定
し；そして (e) 工程(b) 及び工程(d) 間の発光の差によって、該標
識配列が存在するかどうかを判定する；工程を含む。

【００２２】図１は、実施例１に記載された、標識オリ
ゴヌクレオチドの長さ、発光標識物質、及びDNA 結合化
合物の濃度への消光の依存性を示すグラフである。図２
は、実施例２に記載された、使用されたポリエチレンイ
ミン(PEI) の分子量及び濃度に対する消光の依存性を示
すグラフである。図３は、実施例３に記載された、内部
定量標準存在下での標的核酸配列の増幅による、核酸の
定量に関する。

【００２３】本発明の理解を助けるために、幾つかの用
語の定義を下記に示す。用語“核酸”及び“オリゴヌク
レオチド”は、検出されるべきプローブ及びオリゴマー
断片を意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオ
キシ-D- リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（D-
リボースを含有する）、並びにプリンもしくはピリミジ
ン塩基、又は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基
のN グリコシドであるいずれかの型について一般的でな
ければならない。“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”
という用語の間には、長さに関する意図的な相違点は存
在せず、かつこれらの用語は互いに交換して使用される
であろう。これらの用語は該分子の１次構造のみを意味
する。従って、これらの用語は、二本鎖−及び一本鎖−
DNA に加え、二本鎖−及び一本鎖−RNA を含む。

【００２４】用語“標的領域”、“標的配列”及び“標
的核酸配列”は、検出されるべき核酸の領域を意味す
る。用語“プローブ”は、相補的塩基対のために標的核
酸の配列とデュプレックスを形成するオリゴヌクレオチ
ドで、典型的には標識されたオリゴヌクレオチドを意味
する。このプローブは、該標的配列の領域に対応する、
好ましくは10〜50のヌクレオチドから成る、さらに好ま
しくは20〜30のヌクレオチドから成るような“ハイブリ
ッド形成領域”を含むであろう。“対応する”とは、指
示された核酸と同一であるか、又は相補的であることを
意味する。本発明において、プローブオリゴヌクレオチ
ド類は、検出を可能にするために、蛍光標識物質で標識
され、すなわちそれに結合している。

【００２５】用語“ハイブリッド形成”は、相補的塩基
対のために、２個の一本鎖核酸による、デュプレックス
形成を意味する。ハイブリッド形成は、完全に相補的核
酸鎖間で、又は組み合わせが不適合な小領域を含むよう
な核酸鎖間で生じることができる。完全に相補的核酸鎖
のみがハイブリッド形成するような条件は、“緊縮ハイ
ブリッド形成条件”と呼ばれる。不適合な小領域以外は
相補的である２個の一本鎖核酸は、“実質的に相補的”
と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定なデュプレッ
クスは、より緊縮性の少ないハイブリッド形成条件下で
達成することができる。核酸技術分野における当業者
は、例えば該オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃
度、イオン強度及び不適合の塩基対の存在率を含む多く
の変数を経験的に考慮し、デュプレックスの安定性を決
定することができる。

【００２６】用語“配列に特異的なオリゴヌクレオチ
ド”及び“SSO ”は、ハイブリッド形成領域が、検出さ
れるべき配列と完全に相補的であるようなオリゴヌクレ
オチドプローブを意味する。該プローブが完全に相補的
な標的配列のみとハイブリッド形成するような、緊縮ハ
イブリッド形成条件の採用は、その特定の標的配列の検
出をもたらす。緊縮ハイブリッド形成条件は、当該技術
分野において周知であり、例えばSambrookらの論文（分
子クローニング−実験操作法、Cold Spring Harbor Lab
oratory 、コールドスプリングハーバー、NY(1985)）参
照。緊縮条件は、配列によって決まり、かつ別の環境で
は異なるものとなるであろう。一般に、緊縮条件は、所
定のイオン強度及びpHでの、特定の配列の融解温度(Tm)
よりも約５℃低いように選択される。このTmは、（所定
のイオン強度及びpH下での）その塩基対の50％が解離す
る温度である。ハイブリッド形成条件の厳密性の緩和
は、配列の組み合わせの不適合を忍用性があるものと
し；この忍用性がある不適合を、そのハイブリッド形成
条件の適当な調整によって、制御することができる。

【００２７】用語“サブ配列”は、本願明細書中では、
別の配列内に含まれたヌクレオチド配列を意味する。本
願明細書中で使用される用語“標識物質”は、核酸に付
着することができ、かつ検出可能なシグナルを提供す
る、もしくは第二標識物質によってもたらされた検出可
能な信号を変化させるために第二の標識物質と相互作用
するような、いずれかの原子又は分子を意味する。好ま
しい標識物質は、蛍光、化学発光又は生物発光による検
出可能なシグナルを発生する発光化合物を意味する。

【００２８】用語“発蛍光団”は、発蛍光が可能な化合
物、すなわちある周波数の光を吸収し、かつ別の、一般
にはより低い周波数の光を発光する化合物を意味する。
用語“生物発光”は、発光化合物が生体内に見つかるよ
うなものである化学発光の型を意味する。生物発光化合
物の例は、細菌のルシフェラーゼ及びホタルのルシフェ
ラーゼである。

【００２９】用語“消光”は、その機能にかかわらず、
第二の化合物によって引き起こされた第一の化合物の蛍
光の減少を意味する。通常消光は、これらの化合物が近
傍にあることが要求される。本願明細書においては、該
化合物又は該化合物の蛍光のいずれかが、消光されるこ
とを意味し、かつ双方の使用は、同じ現象を意味すると
理解される。

【００３０】用語“反応混合物”は、所定の反応を遂行
するために必要な試薬類を含有する溶液を意味する。増
幅反応を遂行するために必要な試薬類を含有する溶液を
意味する、“増幅反応混合物”は、典型的には、適当な
バッファー中に、オリゴヌクレオチドプライマー及びDN
A ポリメラーゼを含む。特定の反応のための反応混合物
は、前述の文献において周知である。

【００３１】本発明の方法は、オリゴヌクレオチド類の
合成又は切断のいずれかの検出に適用される。切断され
たオリゴヌクレオチドの検出は、該標識物質の発光を減
少するために該標識物質と相互作用することができるよ
うなDNA 結合化合物を含有する溶液中で行われる。合成
又は切断によるこの標識されたオリゴヌクレオチドの長
さの変化は、付着した標識物質の発光の検出可能な変化
をもたらす。適した発光標識物質、及び該標識物質の発
光を変化させるように相互作用することができるDNA 結
合化合物は、下記のものである。

【００３２】本発明の例示された方法において、一本鎖
オリゴヌクレオチドと結合した蛍光標識物質の発光が検
出される。DNA 結合化合物は、該標識物質の蛍光を、付
着したオリゴヌクレオチドの長さに依存する程度で消光
する。一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した蛍光標識物
質のDNA 結合化合物による溶液内消光の発生、及び該オ
リゴヌクレオチドの長さへの消光の依存の双方が、先行
技術の検討においては予期されていない。

【００３３】好ましい実施態様において、前記DNA 結合
剤は、ポリエチレンイミン(PEI) であり、これは様々な
分子量のエチレンイミンの分枝したもしくは分枝してい
ないポリマー類を意味する。ヒドロキシエチル化された
PEI のような、PEI 誘導体が、本発明の方法に適してい
る。本発明の方法における作業に示されている他の化合
物類は、スペルミン及びスペルミジンを含む。

【００３４】分枝したPEI は、粘度から推定される分子
量が600 から少なくとも60,000〜80, 000 までの範囲の
ものが、Polysciences社（ワーリントン、PA）から市販
されている。PEI 分子量が、600 、1200、1800、10,00
0、及び60,000〜80,000であるものを試験し、長さ２の
蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを、長さ33のものか
ら区別する本発明の方法における機能が示されている。
当業者のあるものは、いずれの大きさのPEI が、所定の
適用に最も適しているかということを経験的に決定する
ことができるであろう。

【００３５】前述のDNA 結合化合物の適した濃度は、経
験的に決定される。典型的には、DNA 結合化合物の至適
濃度は、使用される発光標識物質の種類及び反応試薬類
の濃度によって影響を受ける。具体的には、塩濃度が、
PEI の至適濃度に影響することが認められている。いく
つかの反応においては、該反応混合物へのキレート剤の
添加（例えば約1.5mM EDTA) は、PEI の範囲を、それに
対するウインドウ (window) が最大値付近となるように
広げることが認められている。長い及び短い標識オリゴ
ヌクレオチド類の蛍光に最大差をもたらす、DNA 結合化
合物濃度の通常の最適化は、下記の実施例１及び２に本
質的に記載されたように、行うことができる。

【００３６】当該技術分野において記載されている多く
の発光化合物が、本発明の方法において、オリゴヌクレ
オチド標識物質として使用するのに適している。理論
上、発蛍光団は、散乱した励起光による干渉を最少にす
るために、高度のストークスシフト（すなわち、最大吸
収波長及び最大発光波長の間の大きな差）を有さなけれ
ばならない。

【００３７】当該技術分野において周知である適当な化
合物は、フルオレセイン(FAM) 、ヘキサクロロフルオロ
セイン(HEX) 、テトラクロロフルオロセイン(TE T)、及
びジクロロジメチルフルオロセイン(JOE) などのフルオ
レセイン及び誘導体；テキサスレッド(Texas Red) 、ロ
ーダミン(ROX) 、及びテトラメチルローダミン(TAMRA)
のようなローダミン及び誘導体；ルシフェルイエロー、
並びに7-Me₂N- クマリン-4- アセテート、7-OH-4-CH₃-
クマリン-3- アセテート、及び7-NH₂-4-CH₃-クマリン-3
- アセテート(AMCA)のようなクマリン誘導体であるが、
これらに限定されるものではない。FAM 、HEX 、TET 、
JOE 、ROX 及びTAMRA は、Perkin Elmer社の応用生合成
部門（フォスター市、CA）によって販売されている。

【００３８】テキサスレッド及び多くの他の適当な化合
物類は、Molecular Probes社（ユージン、OR）によって
販売されている。エネルギー供給体としての使用に適し
ている化学発光及び生物発光化合物の例は、ルミノール
（アミノフタルヒドラジド）及び誘導体、並びにルシフ
ェラーゼが含まれる。オリゴヌクレオチドは、いずれか
の適した方法によって調製することができ、これは例え
ば制限酵素を用いる適切な配列のクローニング及び単
離、並びにNarangらの論文(Meth Enzymol., 68:90-99(1
979)) のホスホトリエステル法；Brownらの論文(Meth E
nzymol., 68:109-151(1979)) のホスホジエステル法；B
eaucageらの論文(Tetrahedron Lett., 22:1859-1862(19
81)) のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第
4,458,066 号の保持体法などの方法による直接的化学合
成を含む。

【００３９】標識オリゴヌクレオチド類の合成法は、Ag
rawal 及びZamecnikの論文(Nucl.Acids.Res., 18(18):5
419-5423(1990)) ；MacMillan 及びVerdine の論文(J.O
rg.Chem.,55:5931-5933(1990))；Pielesらの論文(Nucl.
Acids.Res., 17(22):8967-8978(1989)) ；Roget らの論
文(Nucl.Acids.Res., 17(19):7643-7651(1989)) ；並び
にTeslerらの論文(J.Am.Chem.Soc.,111:6966-6976(198
9 ))に記載されている。合成方法の論評は、Goodchild
(Bioconjugate Chemistry, 1(3):165-187(1990))によっ
て提供されている。

【００４０】本発明の方法は、DNA 又はRNA のいずれか
の、増幅された核酸の検出に特に適している。増幅に適
した方法は、前述のPCR （米国特許第4,683,195 号、第
4,683,202 号、及び第4,965,188 号）に加え、下記のも
のを含むが、これらに限定されるものではない：リガー
ゼ連鎖反応(LCR)(Wu及びWallace の論文、(Genomics,4:
560-569 (1989)) 及びBaranyの論文(Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,88:189-193(1991)))；ポリメラーゼリガーゼ連鎖
反応(Barany の論文(PCR Method and Applic.,1:5-16
(1991)))；ギャップ-LCR（特許公報 WO 90/01069号）；
修復連鎖反応（欧州特許公報第439,182 号）；3SR(Kowh
らの論文(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8 6:1173-1177(198
9)) ；Guatelliらの論文(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1
874-1878(1990) )；特許公報 WO 92/08800号；並びにNA
SBA （米国特許第5,130,238 号）である。

【００４１】本発明は、いずれかの具体的な増幅システ
ムを限定するものではない。別のシステムが開発された
場合には、これらのシステムは本発明の実施により利益
をもたらすことができる。増幅システムの最新の調査
は、Abramson及びMyers の論文(Current Opinion in Bi
otechnology,4:41-47(1993))に発表された。本発明の好
ましい実施態様は、前述の米国特許第5,210,015 号に開
示された方法、及びHolland らの論文(Proc.Natl.Acad.
Sci.USA, 88:7276-7280(1991))の方法の改善をもたら
す。この方法は、耐熱性のDNA ポリメラーゼの5'→3'エ
キソヌクレアーゼ活性を使用し、ハイブリッド二重らせ
んからアニールされた標識オリゴヌクレオチドプローブ
を切断し、かつ検出用の標識断片を放出する。

【００４２】本発明の標識されたプローブのDNA ポリメ
ラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性による切断は、
この反応混合物へ標識物質を遊離する。DNA 結合化合物
による溶液内シグナルの消光は、該発蛍光団が完全な長
さの非切断オリゴヌクレオチドプローブに結合した場合
のほうが、短く切断された断片に結合した場合よりも、
顕著に大きい。観察された蛍光の結果的増加は、プロー
ブの切断を示し、標的配列の存在及びプローブ／標的ハ
イブリッド形成の発生の両方を必然的に示す。

【００４３】一般に、該試料中の核酸は、DNA 配列であ
り、最も一般的にはゲノムDNA であろう。しかし本発明
は、メッセンジャーRNA 、リボソームRNA 、ウィルスの
RNA、又はクローン化されたDNA などの、その他の核酸
で実施することもできる。本発明での使用に適した核酸
試料は、一本鎖又は二本鎖のDNA 又はRNA を含む。当業
者は、標識オリゴヌクレオチドプローブの切断にいずれ
の反応を用いるかによって、いかなる核酸の性質であっ
ても、単に使用される方法にとって妥当かつ周知の改変
を行うだけで、核酸が検出できることを理解するであろ
う。

【００４４】試料の調製は、その試料の原料、検出され
るべき標的、及び該アッセイにおいて使用されるオリゴ
ヌクレオチド−分解反応によって異なるであろう。各ア
ッセイは、そのアッセイ試薬類に適合したバッファー中
に標的試料を必要とする。標的が、プローブの切断の検
出の以前もしくは同時のいずれかに増幅された場合に
は、この標的核酸は、該標的を増幅するために使用され
た酵素類に適合したバッファー中に存在しなければなら
ない。この標的核酸は、組織、体液、糞便、痰、唾液、
移植細胞、細菌培養などを含む、様々な生物材料から分
離することができる。

【００４５】各アッセイに適している試料調製法は、当
該技術分野において明らかにされていて、例えば前述の
Sambrookらの論文を参照のこと。標的配列のPCR 増幅の
ための簡便かつ迅速な試料調製法は、Higuchi によっ
て、1989年に、PCR 技術(Erlich 編集、Stockton Press
社、NY) 、並びにPCR プロトコール(Innisらの編集、Ac
ademic Press社、1990年）の第18〜20章に、記載されて
いる。一部当業者は、適当なプロトコールを選択し、か
つ経験的に最適化することができる。

【００４６】溶液中での標識物質の発光は、蛍光分光光
度計、例えばHitachi/Perkin Elmerモデル650-40(Perki
n Elmer 社、ノーウォーク、CT) 、もしくはPTILS-100
発光蛍光分光光度計(Photon Technology International
社、ロンドン、オンタリオ州、カナダ）を用いて測定さ
れる。蛍光分光光度計は、使用された特定の機械の性質
によって、バンド幅に加え、励起及び発光波長の調節の
自由度がある。

【００４７】一部の通常の当業者には、特定の標識物質
からの発光の検出にあわせてセットされる波長及びバン
ド幅の決定法は周知であろう。一般的手引きは、例えば
メルクインデックス(Budavari らの編集、Merck 社(198
9)、ローウェイ、NJ) 及びHauglandによる1990年のMole
cular Probe 社カタログ（ユージーン、OR) に見られ
る。各標識物質が個別の発光スペクトルを有する場合で
あっても、広い幅の検出波長が、本発明の実施には適し
ている。

【００４８】プローブ切断の結果生じる発光の変化は、
プローブ切断の前後に測定された発光を比較することに
よって測定されるのが好ましい。代わりに、該DNA 結合
試薬を該反応混合物中に混合し、かつ該プローブの蛍光
を反応が継続している間は、連続的又は断続的にモニタ
リングすることによって、発光の変化を、プローブ−切
断と同時に測定することができる。この場合、さらに発
光測定での使用に適していて、この反応容器を開けずに
直接発光の測定ができるような反応容器の使用が、好ま
しい。

【００４９】しかし、特定のDNA 結合試薬は、特定のプ
ローブ−切断反応を阻害するので、該反応混合物からこ
のDNA 結合試薬を除去することが必要であることがあ
る。この場合、反応前測定は、デュプリケート反応混合
物を用いて行うことができる。通常は、この反応混合物
は反応前に分割され、かつこの反応条件に晒されない該
反応混合物の一部は、反応前発光の測定に使用される。
典型的には、反応前発光、及び該反応が完了後の反応後
発光の両方を測定することが、最も都合がよい。

【００５０】前述の該核酸検出法をPCR 増幅と組み合わ
せるような好ましい方法において、増幅反応は自動化さ
れた工程として実行される。48又は96本の反応管まで収
容可能なヒートブロックを使用する、熱サイクラーが、
Perkin Elmer社( ノーウォーク、CT) から現在入手可能
である。その結果、96種までの増幅反応を、同時に行う
ことができる。PCR 増幅において、すべての試験管から
の発光を測定に適した光学システムは、前述のHiguchi
らの論文(1992)、前述のHiguchi らの論文(1993)、及び
欧州特許公報第512,334 号に記載されている。このよう
な光学システムのひとつは、複数の光ファイバーの線
が、光源から反応管へ励起光を伝達し、かつ各管からそ
の発光を測定するために使用される。これらの反応管か
らの蛍光を読み取る際に、各光ファイバーは同時に迅速
に読み取ることができるので、一台の蛍光分光光度計の
みが必要となる。複数の反応管の蛍光を同時に測定する
ための別の光学システムは、ビデオカメラを使用する。
当業者にとって、この別の検出装置も、本発明に使用で
きることは明らかであろう。

【００５１】別の適当な検出方法は、96- ウェルマイク
ロタイター様式を使用する。この様式型は、臨床検査室
における大量の試料のスクリーニング、例えば血液銀行
のスクリーニングにおける鎌状赤血球貧血又はAIDSウイ
ルスのような遺伝子診断において好まれている。本発明
は、この種の分析に適し、ELISA 型様式又は他の光学密
度を基にした方法のような、公知の“ウェル中”アッセ
イ操作で必要とされる多くの洗浄及び抽出操作の必要性
を除去する（Kolberらの論文(J.Immun.Meth.,10 8 :255
-264(1988)) 、Huschtschaらの論文(In Vitro Cell and
Dev. Biol.,25( 1 ):105-108(1989))、及び1979年のVo
llerらの論文（免疫吸着剤に結合した酵素アッセイ、Dy
natech Labs,アレキサンドリア、VA）を参照。

【００５２】本検出法も、ELISA プレート読み取り装置
に類似しているが、蛍光を励起しかつ測定するように設
計された装置を用い、直接発光を測定することができ
る。例えば、Millipore 社（ベッドフォード、MA) によ
って製造されたCytoFluor （登録商標）2300が、このよ
うな方法に適している。本発明の方法は、具体的な検出
法、熱サイクラー又はシグナル測定機器、もしくは反応
容器の数に限定されないことは、当業者には明らかであ
る。

【００５３】本発明の方法は、複数の標的配列を同時に
検出するために使用することができる。各標的に対し特
異的なプローブ類が、該反応混合物中に存在する。該試
料中に存在する各標的核酸に対応しているプローブは、
ハイブリッド形成され、かつ切断される。これらの切断
されたプローブを検出するために、各種のプローブを、
検出可能な個別の波長で発光する標識物質で標識され
る。その後、各種のプローブは、測定波長を適当に選択
することで、個別に検出される。

【００５４】従って、本発明の方法は、１個の試料中の
複数の標的を検出する、PCR 同時増幅(co-amplificatio
n)方法における増幅生成物の検出に有用である。本発明
は、同一の試料中の２種の異なる核酸標的の定量的比較
に、特に有用である。核酸を定量する方法は、米国特許
第5,219,727 号に開示されている。この開示された定量
法は、それぞれ、標的の相対量、又は増幅前に存在する
標的の量の正確な定量のいずれかを決定するために、内
部基準を使用する、PCR を基にした方法である。

【００５５】短い又は長い標識オリゴヌクレオチドの特
徴的な消光も、同じく合成されたオリゴヌクレオチドへ
のヌクレオチドの取り込みを測定するために使用され
る。例えば、DNA ポリメラーゼ活性アッセイは、ヌクレ
オチドの取り込み速度を測定する。ヌクレオチドの取り
込みを測定するために、反応混合物は、適当なバッファ
ー中に、DNA ポリメラーゼのようなオリゴヌクレオチド
の合成に必要な他の試薬の他に、標識されたdNTP（デオ
キシヌクレオシド三リン酸）類を含むようにする。合成
前のこの反応混合物の蛍光は、DNA 結合化合物の存在下
でタイトレーションされる。

【００５６】合成前に、すべての標識物質は、単ヌクレ
オチドと結合し、かつ消光は最少である。合成後には、
この反応混合物の蛍光は、DNA 結合化合物の存在下で測
定される。オリゴヌクレオチドの合成は、標識ヌクレオ
チドの数の減少をもたらす。より長い、新たに合成され
たオリゴヌクレオチドは、DNA 結合化合物によってより
効果的に消光されるので、オリゴヌクレオチドへのdNTP
の取り込みは、蛍光の減少をもたらす。

【００５７】本発明の実施態様を、詳細に説明すること
のみを目的として下記に示すが、これは、本発明の範囲
を限定するものではない。これらの実施例の後に記され
た発明の範囲内の本発明の多くの実施態様は、通常の当
業者にとっては、前述の本文及び下記の実施例を読むこ
とで明らかになるであろう。実施例１ PEI による長さに依存した消光本実施例は、溶液中の標識オリゴヌクレオチドの長さに
左右される消光について記している。長さ33及び長さ２
のオリゴヌクレオチドを、様々な蛍光標識物質の中の１
種で標識し、かつ各オリゴヌクレオチドの蛍光を、PEI
含有溶液中で測定した。この測定は、長さ33及び２のオ
リゴヌクレオチド間のシグナルの差を最大にするような
至適PEI 濃度を決定するために、様々な濃度のPEI を含
有する溶液を用いて繰り返した。

【００５８】プローブは、ABI 394 DNA 合成装置(Perki
n Elmer ABD 社、フォスター市、CA)で、１μM のスケ
ールで合成した。蛍光標識物質アミダイトを、オリゴヌ
クレオチド合成時に使用し、5'- 標識オリゴヌクレオチ
ドを直接調製した。長さ33のプローブは、3'末端にPO₄
基で合成し、実施例２に記載された方法において使用し
た。各長さ33の標識プローブの核酸配列は、SK535(SEQ
ID NO:1)5'-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAATであっ
た。長さ２のプローブの核酸配列は、5'-AG であり、こ
れは前述の長さ33のプローブの分解生成物に相当した。

【００５９】使用した蛍光標識物質は、それらの各標識
物質の励起及び発光波長とともに下記に示した。下記に
述べるような、各標識物質の検出に使用したフィルター
のスリット幅も記載した。蛍光測定に使用されたフィルター（波長及び幅は、nmで示す）標識最大励起最大発光フルオレセイン(FAM) 485(20) 530(25) ヘキサクロロフルオレセイン(HEX) 530(25) 590(35) ジクロロジメチルフルオレセイン(JOE) 490(40) 580(50) ローダミン(ROX) 590(40) 645(40) テトラメチルローダミン(TAMRA) 560(20) 620(40) 下記に列記した各プローブ類用の、複製アッセイ溶液
は、バッファー50μL (50mM ビシン、100 mM KOAc(pH8.
3)、3.6mM Mn(OAc)₂）中に、プローブ１μM を含有し、
これをマイクロタイタープレートのウェルに加えた。PE
I （分子量1200、Polysciences社（ウェーリントン、P
A）より入手) を、濃度0.016 ％、0.008 ％、0.004
％、0.002 ％、及び0.001 ％含有する一連の溶液を調製
した。水50μLを、１個のウェルに加え、最大シグナル
対照とした。PEI 溶液50μl を、残りのウェルに加え
た。前記表に示した、励起及び発光波長を用い、Millip
ore Cytofluor 2300微量滴定プレート読み取り装置で、
蛍光測定を行った。

【００６０】本発明の方法は、短い及び長い標識オリゴ
ヌクレオチドの消光の差に依存する。“ウインドウ”と
称される、消光のこの差の測定は、下記の個々の蛍光測
定値から算出した。まず、バッファー単独によってもた
らされる消光のバックグラウンドレベルを測定し、各プ
ローブの蛍光測定値から引き算した。次に、残りの蛍光
を、PEI 非存在下の同一プローブの蛍光に対するPEI の
存在下でのプローブの蛍光の比として算出し、未消光の
蛍光のパーセンテージとして表した。最後に、このウイ
ンドウを長さ２の標識オリゴヌクレオチドの残留蛍光及
び長さ33のオリゴヌクレオチドの残留蛍光の間の差とし
て算出した。このウインドウは、長さ33の標識プローブ
の、長さ２の標識プローブへの分解の結果生じたシグナ
ルの変化の測定値である。最大ウインドウを引き起こす
PEI 濃度は、本発明の検出方法で最大の感度をもたらし
た。

【００６１】この結果を、図１に示しているが、これは
様々なプローブ標識物質を用いて得られたウインドウ
を、PEI 濃度に対し作図したものである。標識オリゴヌ
クレオチドを表わす線分の意味は、下記に示す： hexx2: HEX- 標識オリゴヌクレオチドで、標識物質は、
スペーサーを介し、該オリゴヌクレオチドの5'- 末端に
結合している。 fam2: FAM-標識オリゴヌクレオチド。 hex2: HEX-標識プローブで、標識物質は、該オリゴヌク
レオチドの 5' 末端に直接結合している。 joe: JOE- 標識オリゴヌクレオチド。 rox: ROX- 標識オリゴヌクレオチド。 tam: TAMRA- 標識オリゴヌクレオチド。

【００６２】図１に示されたように、いくつかのPEI 濃
度では各標識物質で、顕著なウインドウが認められた。
得られたウインドウの大きさは、標識物質及びPEI 濃度
の両方に依存した。スペーサーを介したオリゴヌクレオ
チドへのHEX 標識物質の結合は、試験された範囲のPEI
濃度で得られたウインドウの大きさを減少した。実施例２ PEI 分子量の効果本実施例において、蛍光標識されたプローブの消光に対
するPEI 分子量及び濃度の影響を記載する。実質的に実
施例１に記載された実験を、FAM-標識オリゴヌクレオチ
ドを用い、様々な大きさかつ実施例１よりも高濃度のPE
I を用いて行った。

【００６３】分子量600 、1200、1800、及び10,000キロ
ダルトンのPEI は、Polysciences社（ウェーリントン、
PA) から入手した。発光測定は、50mM ビシン、115mM
KOAc、酢酸カリウム(pH8.3) 、及び８％グリセロールか
ら成るバッファーを含有するアッセイ溶液中で行った。
各大きさのPEI のために、PEI を、前記アッセイ溶液中
に、濃度0.000013％〜 0.02 ％(w/v) で混合した。各PE
I の大きさ及び濃度について、ウインドウを実施例１の
ように計算した。

【００６４】この結果を図２に示した。異なるPEI の大
きさを用い、ウインドウの大きさにはわずかな差が認め
られたが、本発明の方法において各PEI の大きさが作用
するとみなされた。各PEI の大きさに関し、至適PEI 濃
度は、最大ウインドウをもたらすようなPEI 濃度とし
て、図２から決定することができる。前述の実験は、当
業者が各検出アッセイを行う際の、PEI の大きさ及び濃
度の通常の最適化を例証している。

【００６５】実施例３ PCR 増幅による定量本実施例は、本発明の方法を用いる核酸の定量を記載す
る。本実施例において、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV) RNA か
ら成る標的を、蛍光標識したプローブ存在下で、逆転写
反応-PCR(RT-PCR)によって増幅した。該DNA ポリメラー
ゼのエキソヌクレアーゼ活性は、増幅プライマーの下流
の標的配列とハイブリッド形成された、標識プローブを
切断し、これにより該プローブの小さい標識オリゴヌク
レオチド断片を、該反応混合物中に放出した。

【００６６】増幅後に、PEI を該反応混合物に添加し、
かつ標識プローブの蛍光を測定した。短い標識オリゴヌ
クレオチド分解生成物の産生は、この分解生成物がPEI
によって、完全な長さの非分解プローブが消光される程
度には消光されないので、測定された蛍光の増加をもた
らした。プローブの分解は、標的の増幅と共に生じるの
で、この蛍光の増加は該標的配列の増幅を示している。

【００６７】最初の標的配列のコピー数の定量的概算
は、標的配列の増幅の結果得られる蛍光の増加を、第二
の核酸配列の増幅の結果得られる蛍光の増加と比較する
ことによって得られた。第二の核酸配列を、既知のコピ
ー数で反応に加え、これにより未知の試料の増幅と比較
される、内部定量基準(IQS) が得られた。第二核酸配列
の検出は、固有の波長で発光する第二の蛍光標識物質を
用いて行った。

【００６８】増幅２種の標的RNA 配列を各反応中で増幅した。両方の標的
核酸配列を、単プライマー対、KY78及びKY80を用い、同
時に増幅した。本実施例において、該標的RNA配列は転
写プラスミドから生じた。HCV 配列を含む転写プラスミ
ドの構造及び使用、増幅プライマー、並びにRT-PCR増幅
は、欧州特許公報第529,493 号、及びYoung らの論文
(J.Clin.Microbiol., 31(4):882-886(1993)) に記載さ
れている。第一の標的配列は、HCV の5'- 非 -コード領
域の中の領域から成る。

【００６９】IQS として使用される第二の標的核酸配列
は、別のプローブ結合サイトを含む核酸配列をフランキ
ングする、同じ２種のプライマー結合サイトを含有す
る。その結果、両方の標的配列は、同じプライマー対を
用いて増幅されたが、これらの２種の標的配列は、異な
る配列に特異的なプローブを用い、それぞれ独立に検出
することができた。IQS の構造及び使用は、Mulderらの
論文(J.Clin.Microbiology.,34( 2 ):292-300 (1994))
に記載されている。

【００７０】増幅は、HCV 標的配列に特異的なFAM-標識
プローブ及びIQS に特異的なHEX-標識プローブの両方の
存在する中で行った。FAM 及びHEX の最大発光は、異な
る波長であり、これは、適した測定周波数を選択するこ
とによって、これらのプローブを別々に検出することが
できる。これらのプローブの核酸配列は、5'から3'への
配向を示した。これらのプローブは、前述のように、5'
末端に標識物質を合成した。

【００７１】各プローブは、3'-OH の代わりに3'-PO₄を
有するように合成し、増幅反応時のTaq ポリメラーゼに
よるあらゆる伸長を防止した。HCV 標的配列の検出のた
めのFAM-標識プローブの配列は、KY88として、前述のYo
ung らの論文(1993)に記載されている。IQS 検出のため
のHEX-標識プローブは、前述の実施例１において、提供
された(SEQ ID NO: 1)。

【００７２】増幅は下記の試薬を含む100 μl 反応物中
で行った： HCV 標的配列（下記に記されたコピー数） IQS （1000コピー） 50mM ビシン 100mM KOAc, pH8.3 3.6mM Mn(OAc)₂ 0.4 μM の各プライマー１μM の各プローブ 0.2mM の各dUTP、dATP、dGTP、dCTP 20単位のrTth DNAポリメラーゼ* ２単位のアムペラーゼウラシル-N- グリコソラーゼ* ８％グリセロール * は、Hoffmann-La Roche 社によって開発製造され、か
つPerkin Elmer社（ノーウォーク、CT）によって販売さ
れている。

【００７３】増幅は、HCV 標的の０から10⁷のコピーを
用いて行った。PCR 熱サイクル条件に晒した該反応混合
物の他に、測定対照として使用するために、２種の追加
の反応混合物を生成し、かつ保存した（熱サイクルな
し）。反応混合物は、Gene Amp9600 熱サイクラー（Per
kin Elmer社、ノーウォーク、CT）中で、下記の増幅方
式を行った： 50℃で２分間 60℃で30分間 95℃で１分間２サイクル： 95℃で15秒間 60℃で20秒間 46サイクル： 90℃で15秒間 60℃で20秒間 72℃で短くとも５分〜10分、最長１時間。

【００７４】増幅後は、反応物を、分析時まで４℃で保
存した。解析法 EDTA 0.8mMを含む0.004 ％PEI （分子量1200）50μl
を、増幅後に各反応混合物50μl 、及び同じく増幅条件
に晒さなかった２個の対照反応混合物の一方に添加し
た。蛍光は、CytoFluor （登録商標）2300(Millipore
社、ロケーション）微量滴定プレート読み取り装置を用
いて測定した。FAM-標識プローブの蛍光は、室温で、48
5nm 励起フィルター（通過バンド幅20nm）及び530nm 発
光フィルター（通過バンド幅25nm）を用い測定した。HE
X-標識プローブの蛍光は、室温で、530nm 励起フィルタ
ー（通過バンド幅25nm）及び590nm 発光フィルター（通
過バンド幅35n m ）を用い測定した。

【００７５】各プローブ標識物質の測定された蛍光は、
プローブを含まない非サイクル反応混合物の蛍光を引き
算することによって補正し、これらはいずれも該標識物
質に適した波長で測定した。この結果は、図３に示して
いるが、HCV 標的コピー数の対数に対する、蛍光比(HCV
/IQS) の対数として作図した。“標準曲線”は、データ
の最少二乗法で直線を概挿して作成した。

【００７６】前述の実験から作成された標準曲線で、未
知のHCV 試料を定量することができる。未知のHCV 試料
を定量するために、前述のようにHCV 核酸を、既知量の
IQSで増幅する。蛍光の測定された変化の比の対数を、
計算し、かつ対応するHCV コピー数を、前述の標準曲線
の式から決定する。

【００７７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：33塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：線形分子の型：DNA （ゲノム）配列番号：１ AGAAGGTGAG ATGACCAGAG GACTGAGTCC AAT

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１に記載された、標識オリゴヌ
クレオチドの長さ、発光標識物質、及びDNA 結合化合物
の濃度への消光の依存性を示すグラフである。

【図２】図２は、実施例２に記載された、使用されたポ
リエチレンイミン(PEI) の分子量及び濃度に対する消光
の依存性を示すグラフである。

【図３】図３は、実施例３に記載された、内部定量標準
存在下での標的核酸配列の増幅による、核酸の定量に関
するグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発光標識物質で標識されたオリゴヌクレ
オチドの長さの変化を検出する方法であって、下記の工
程を含む方法： (a) 前記オリゴヌクレオチドの長さの変化をもたらす条
件下で、反応混合物中で反応を行い； (b) 該標識物質の発光を変更するように該標識物質と相
互作用することが可能なDNA 結合化合物の存在下で、前
記反応混合物中の該標識物質の発光を測定し、ここでこ
の相互作用が前記オリゴヌクレオチドの長さに依存し、
そして (c) 工程(b) で測定された発光によって、前記オリゴヌ
クレオチドの長さの変化を検出する；ことを含んでなる方法。
【請求項２】下記の工程を含む方法： (a1) 反応のための反応混合物を用意し、この反応混合
物が、前記試料及び発光標識物質で標識された一本鎖オ
リゴヌクレオチドを含有し、該オリゴヌクレオチドは、
前記標的核酸とハイブリッド形成することが可能な配列
を含み、かつ前記反応は、該オリゴヌクレオチドが該標
的核酸とハイブリッド形成する場合にのみ、該オリゴヌ
クレオチドの切断を触媒し； (a2) 該オリゴヌクレオチドが該標的配列とハイブリッ
ド形成しそして切断される条件下で、前記混合物を処理
し； (b) 該標識物質の発光を変更することが可能なDNA 結合
化合物の存在下で、前記反応混合物中の該標識物質の発
光を測定し、ここでこの相互作用は前記オリゴヌクレオ
チドの長さに依存し；そして (c) 工程(b) で測定された発光によって、該標的配列が
存在するかどうかを決定する；ことを含んで成る、試料
中の標的核酸を検出するための請求の範囲第１項記載の
方法。
【請求項３】前記標的配列が、工程(b) 以前に増幅さ
れる、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】 (a1) 前記試料、オリゴヌクレオチドプ
ライマー対、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリ
メラーゼ、及び該標的核酸の領域とハイブリッド形成す
ることが可能なオリゴヌクレオチドを含有するポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) 混合物を用意し、ここで前記オリゴ
ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドプライマーと
結合した前記標的核酸配列内にハイブリッド形成し、か
つ該オリゴヌクレオチドプローブは発光標識物質で標識
されており； (a2) PCR 条件下で、前記PCR 混合物を処理し、ここで
前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性が前記
標的配列とハイブリッド形成しオリゴヌクレオチドを切
断し； (b) 該標識物質の発光を変更することが可能なDNA 結合
化合物の存在下で、前記反応混合物中の該標識物質の発
光を測定し、ここで前記相互作用は前記オリゴヌクレオ
チドの長さに依存し；そして (c) 工程(b) で測定された発光によって、該標的配列が
存在するかどうかを決定する；ことを含んで成る、請求
項３に記載の方法。
【請求項５】前記DNA 結合化合物が、ポリエチレンイ
ミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲第１〜４項
記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】前記標識物質が、フルオレセイン、ロー
ダミン及びそれらの誘導体から成る群から選択される、
請求の範囲第１〜５項記載のいずれか１項記載の方法。