CN1131320C - 带发光标记的低核苷酸探针的溶液中的淬火方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通过在与标记相互作用以改变标记的发光的DNA结合化合物存在下测量发光提供检测用发光标记标记的低核苷酸长度变化的方法，其中相互作用程度取决于低核苷酸的长度。所述方法一般适用于核酸序列检测验定，所述验定利用一种导致杂交的低核苷酸探针的选择性切开的反应，而且特别是可适用于扩增/检测验定，其中杂交的探针在引物延伸的同时被切开。

Description

带发光标记的低核苷酸探针的溶液中的淬火方法
本发明涉及用于检测用一种发光标记标记的低核苷酸标记的长度改变的方法。另外，本发明涉及通过用有探针功能的互补低核苷酸杂交检测核酸序列的方法。
使用低核苷酸探针进行核酸检测已成为用于特定目标检测的标准方法。已有许多关于测定格式的描述。一般地，使核酸样品杂交到一种被标记的特定目标探针中，将未结合的探针与杂交复体分开，并且用该标记检测杂交复体的存在。杂交的和未杂交的探针的分离可以借助许多手段实现。例如，核酸样品可以被固定在一种固体载体上并通过洗涤除去未杂交的探针，或者可以通过凝胶电泳法分离杂交复体和未结合的探针。一般来说，这些方法需要一个分离步骤，以使杂交后产生的信号可以与由未结合的标记的探针产生的背景信号区分开。
一些已经描述的核酸检测方法涉及在探针-目标杂交复体形成后选择性地切开低核苷酸探针。检测到切开后的探针表明杂交发生，从而表明存在目标序列。例如，Saiki等人在1985年Biotechnology  3：1008-1012中描述了“低聚物限制”检测方法，在该方法中，特定目标探针的杂交产生限制性位点，然后通过相应的限制性内切酶将其分开。在专利公开文件WO 89/09284描述的方法中，使用RNA探针检测DNA目标序列。用RNaseH切开杂交到DNA目标上的RNA探针，RNaseH选择性地切开RNA-DNA杂交复体中的RNA。US 5210015所述的方法利用核酸聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性切开杂交到目标序列上的探针，从而释放用于检测的标记低核苷酸片段。
聚合酶链反应(PCR)的发明，即一种扩增核酸的方法的发明能够使检测核酸大大增加敏感性和专一性。利用PCR，单个复制基因组DNA的片段可以在检测前被选择性地扩增到容易检测到的水平。在US 4,683,202中描述了PCR方法。在US 4,683,195中以及欧洲专利公开EP 237,362中描述了PCR和利用一种能与扩增的目标核酸杂交的低核苷酸探针检测PCR产物的方法。
上述的涉及在形成探针-目标杂交复体后杂交探针的选择性切开的检测核酸的方法已被用于检测扩增的核酸。Saiki等人在1985年Science  230：1350-1353中描述了使用“低聚物限制”检测PCR扩增的核酸。上述US 5,210,015描述了利用一种核酸聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性切开杂交到目标序列中的标记探针分析PCR扩增产物的方法，还可参见Holland等人的1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：7276-7280。在US 5,210,015的方法中，杂交到由扩增引物束缚的目标核酸的一个区上的探针被混入该扩增反应混合物中。杂交的探针在引物延伸过程中被具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶切开。标记的片段的检出表明引物延伸和探针杂交的发生，从而扩增特定的目标序列。
为了标记核酸已经有许多探针或目标制剂，用于促进目标核酸的检测。已经描述的标记提供可通过荧光、放射性、比色法、X射线衍射或吸收、磁性和酶活性检测到的信号，而且包括如荧光团、载色体、放射性同位素(特别是32P和125I)、电子-密集试剂、酶和有特定结合配偶体的配位体。标记可以通过许多手段完成，例如引物或探针的化学变化使与一个标记结合或使用聚合制剂使改性三磷酸核苷结合到一种延伸产物中。
在Morrison，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques，Kricka，ed.，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，Chapter 13；和Heller and Morrison，1985，Rapid Detection andIdentification of Infections Agents，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，Pages 245-256中描述了在核酸杂交测定中使用用相互作用的荧光标记标记的低核苷酸探针。这些方法基于当适当的荧光标记靠近时所出现的荧光的改变，在该文献中描述成荧光能量转移(FET)，荧光共振能量转移，不辐射能量转移，长距离能量转移，偶极子-偶合能量转移，或Frster能量转移。
Morrison在上述1992年的文献中描述了三种测定程式。在这些程式的两个中，相互作用荧光标记被结合以分开低核苷酸，所述低核苷酸被探针杂交弄到一起或分开。根据探针—探针杂交能否与探针-目标杂交竞争而将这些测定程式描述成非竞争性的或竞争性的。两种测定程式都要求合成两种特定序列标记的探针。在第三种测定程式中，一个荧光标记被结合到杂交探针上，第二个荧光标记通过插入到双链的杂交复体而紧密接近。在插入的标记和在溶液中的未杂交的探针之间不发生显著的相互作用。因为插入的标记可以插入到任何双链核酸中，这种程式实际上只用于检测单链目标核酸。
US 5,210,015描述了使用杂交探针，所述探针用紧密接近的相互作用的荧光标记标记。该标记如此附着使得在扩增过程中探针降解使所述标记分开，从而产生荧光中的可测出的变化。这样的多重标记的探针合成困难并且代价高。
在例如Sambrook等人，1985，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and Higgns.eds.，1984)；和a series，Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)这些文献中详细描述了本领域的分子生物学和核酸化学的常规技术。
一般来说本发明提供了通过用发光标记标记的低核苷酸的DNA结合的化合物进行重要的溶液中淬火的条件。这种淬火在标记的低核苷酸没有杂交到它的互补序列的溶液中发生。本发明的这些方法利用了这种淬火对标记的低核苷酸的长度的依赖。短的标记的低核苷酸(约6个核苷酸或更少)的淬火比较长的标记的核苷酸的淬火更难测出。在此之前一直没有关于通过用发光标记标记的一种低核苷酸的DNA结合的化合物发生在溶液中的淬火和这种淬火对低核苷酸的长度的依赖的描述。
本发明提供用于检测标记的低核苷酸的长度变化的方法，所述变化基于在一种DNA结合的化合物存在下荧光的改变。特别是，本发明提供用于检测低核苷酸在一种反应混合物中的降解的方法，所述检测不需要将切开的低核苷酸片段与未切开的低核苷酸分开。所述低核苷酸用一种发光的标记标记。一种可以与该标记相互作用以抑制该标记的发光的DNA结合的化合物被加入到该反应混合物中。通过测定反应后该标记的发光检测低核苷酸的降解。由于淬火依赖于标记的低核苷酸的长度，低核苷酸的降解引起标记的核苷酸的发光的可检出的变化。
本发明提供通过杂交到一种低核苷酸探针上来检测样品中的一种目标核酸的改进的方法。这些方法依赖于选择性的切开杂交到目标核酸上的探针。利用本发明的方法切开的探针的检测表明存在目标核酸。
在本发明的一个具体的实施方案中，提供一种用于检测样品中的目标核酸的方法，其中所述方法包括：
(a)提供一种反应混合物，该混合物包括该样品和一种用一种发光标记标记的低核苷酸探针，其中所述探针含有一种能够杂交到目标核酸上的序列，而且其中DNA结合的化合物能够改变该标记的发光；
(b)将一种DNA结合的化合物加到步骤(a)的反应混合物的一份等分试样中，并测定标记的发光；
(c)在所述低核苷酸探针杂交到所述目标序列上和被切开的条件下处理所述混合物；
(d)将一种DNA结合化合物加到步骤(c)的反应混合物一份等分试样中，并测定标记的发光；和
(e)通过在步骤(b)和步骤(d)中测得的发光的差别确定是否存在目标序列。
杂交到目标核酸上的探针的选择性的切开可以通过许多已知反应的任何一种来完成。在Saiki等人的上述1985年的文献；上述的专利公开WO 89/09284；和上述的US 5210015中描述了选择性地切开杂交到一个目标序列的探针的适宜的反应的实例。
本发明的检测核酸的方法特别适合用于与扩增过程结合。这样，在本发明的一个实施方案中，目标序列在步骤(c)之前或与步骤(c)结合被扩增。
在一个优选的实施方案中，本发明提供对在US 5,210,015中描述的均匀的PCR扩增和PCR产物验定法的改进，所述专利使用一种用于引物延伸和杂交的标记探针切开的单一核酸聚合酶。本发明所提供的改进允许使用一种用一种单个发光标记标记的探针而无需为分离切开的和未切开的探针进行的反应后处理。
这样，本发明提供一种在一种样品中检测目标核酸的方法，该方法利用一种聚合酶链反应(PCR)，其中该方法包括：
(a)提供一种PCR混合物，该混合物含有所述样品，一对低核苷酸引物，一种具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶，和一种能够通过低核苷酸引物结合杂交到目标该酸的一个区上的低核苷酸探针，而且其中所述探针用一种发光标记标记，并且其中DNA结合化合物能够改变该标记的发光；
(b)在一种DNA结合化合物存在下测定反应混合物中该标记的发光；
(c)在PCR条件下处理该PCR混合物，其中具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶切开杂交到该目标序列上的探针；
(d)在一种DNA结合化合物存在下测定该标记的发光；
(e)通过在步骤(b)和步骤(d)之间发光的差别确定是否存在目标序列。
图1涉及淬火对标记的低核苷酸长度，发光标记和DNA结合化合物的浓度的依赖，如实施例1所述。
图2涉及淬火对所用的聚乙烯亚胺(PEI)的分子量和浓度的依赖，如实施例2所述。
图3涉及在一种内在量控制标准样品存在下通过扩增目标核酸测定核酸量，如实施例3中所述。
为了帮助理解本发明，下面定义一些术语。
术语“核酸”和“低核苷酸”指的是探针和要被检测的低聚物片段，并且是多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其它类型的是一种有嘌呤碱或嘧啶碱，或改性的嘌呤碱或嘧啶碱的N苷的多核苷酸的通称。并不打算区分术语“核酸”和“低核苷酸”的长度，而且这些术语将被可交换地使用。这些术语仅指该分子的初级结构。这样，这些术语包括双链DNA和单链DNA，以及双链RNA和单链RNA。
术语“目标区”、“目标序列”和“目标核酸序列”指的是一个要被检测的核酸区。
术语“探针”是指一种低核苷酸，典型的是标记的低核苷酸，由于互补碱基配对，所述低核苷酸与目标核酸序列形成复体结构。该探针将包括一个“杂交区”，对应于目标序列的一个区，所述杂交区优选由10至50个核苷酸组成，更优选由20至30个核苷酸组成。“对应”的意思是与所设计的核酸相同或互补。在本发明中，探针低核苷酸用一种荧光标记标记即结合到一种荧光标记上以能够检测。
术语“杂交”指的是由于互补碱基配对由两种单链核酸形成一种复体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间或者在含有较小的失配区的核酸链之间发生。只有完全互补的核酸链进行杂交所需的条件称为“严格的杂交条件”。两种除了较小的失配区外是互补的单链核酸被称为是“基本上互补的”。具有基本上互补的序列的稳定的复体可以在较不严格的杂交条件下得到。核酸技术领域中技术人员可以考虑到包括例如低核苷酸的长度和碱基对浓度、离子强度和失配的碱基对的发生率根据经验确定复体稳定性。
术语“特定序列的低核苷酸”和“SSO”是指低核苷酸探针，其中杂交区与要被检测的序列严格互补。使用严格的杂交条件能够测出特定目标序列，在所述条件下探针将只杂交到严格互补的目标序列上。严格的杂交条件是本领域中公知的，例如可参见Sambrook等人，1985，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork。严格地条件与序列有关，而且将在不同情况下有所不同。一般来说，选择的严格的条件为在限定的离子强度和pH下对于特定的序列比热熔点(Tm)低约5℃。Tm是在限定的离子强度和pH值下，在该温度下50％的碱基对离解。松弛杂交条件的严格性要求将会允许序列失配；所允许的失配程度可以通过适当调整杂交条件来控制。
术语“子序列”在此是指含有另一序列内的核苷酸序列。
术语“标记”正如在此使用的是指任何可以被附着到一种核酸上的原子或分子，而且它可以被用于提供一种可测出的信号或与一种第二标记相互作用以改变由第二标记提供的可测出的信号。优选的标记是发光化合物，这种化合物靠荧光、化学发光或生物发光产生一种可测出的信号。
术语“荧光团”是指一种化合物，该化合物能够发荧光，即吸收一种频率的光并放出另一频率的光，一般是放出较低频率的光。
术语“生物发光”是指一种形式的化学发光，其中发光化合物是一种在生物器官中发现的化合物。生物发光化合物的实例包括细菌荧光素酶和荧火虫荧光素酶。
术语“淬火”是指减弱由第二化合物引起的第一化合物的荧光，而不管其机理。淬火一般要求化合物紧密接近。正如在此所用的，所说的化合物或化合物的荧火要被淬火，应当理解成两种说法指的是相同的现象。
术语“反应混合物”是指一种含有进行给定反应所需的试剂的溶液。“扩增反应混合物”是指一种含有进行扩增反应所需试剂的溶液，它典型地含有在一种适当的缓冲液中的低核苷酸引物和DNA聚合酶。用于特定反应的反应混合物是本领域中公知的。
本发明的方法适用于低核苷酸的合成或切开的检测。切开的低核苷酸的检测在一种溶液中进行，所述溶液含有一种可与标记相互作用以减弱标记的发光的DNA结合的化合物。标记的低核苷酸的长度由合成或切开产生的变化导致附着的标记的发光的可检出的变化。下面描述适合的发光标记和DNA结合化合物，它们可以相互作用而改变标记的发光。
在本发明的举例说明的方法中，检测出结合到单链低核苷酸上的发荧光的标记的发光。DNA结合化合物使标记荧光淬火的程度取决于所附着的低核苷酸的长度。由DNA结合化合物结合到单链低核苷酸上的发荧光标记的DNA结合化合物进行溶液中淬火的发生和淬火对低核苷酸的长度的依赖是现有技术所意想不到的。
在一个优选的实施方案中，DNA结合试剂是聚乙烯亚胺(PEI)，它是指一类具有各种分子量的氮丙啶的支链或无支链聚合物。PEI衍生物如羟乙基化的PEI可以适用于本方法中。其它的已经表明在本发明的方法中有效的化合物包括精胺和亚精胺(Spermadine)。
支链PEI可从Polysciences，Inc.(Warrington，PA)购到，由粘度估计的分子量范围从600高至至少60,000-80,000。分子量为600、1200、1800、10,000和60,000-80,000的PEI已被测试并表明在本发明方法中能够用于区分长度为2的发荧光的标记的低核苷酸和长度为33的那些低核苷酸。本领域中的技术人员能够凭经验确定哪种大小的PEI最适合给定的用途。
根据经验确定DNA结合化合物的适合的浓度。一般来说，DNA结合化合物的最适宜浓度受所述的发光标记的种类和反应试剂的浓度的影响。特别是，已经发现盐浓度影响PEI的最适宜浓度。在某些反应中，已经发现向反应混合物中加入一种螯合剂(例如约1.5mM EDTA)拓宽了PEI的范围，在所述整个范围内，窗口(window)接近最大值。DNA结合的化合物的浓度的常规最优化可以基本上按照下面的实施例1和2所述进行，所述最优化提供在长的和短的标记的低核苷酸的荧光之间的最大差别。
本领域中记载的许多发光化合物适用于作为本发明方法中的低核苷酸标记。理想的是荧光团应当有高的司托克斯频移(即最大吸收波长和最大放出波长之间的大的差值)以使由散射激发的光产生的干扰最小。本领域中已知的适宜的化合物包括但不限于荧光素和衍生物如荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、和二氯二甲基荧光素(JOE)；若丹明和衍生物如Texas Red，若丹明(ROX)、和四甲基若丹明(TAMRA)；莹虾属黄(Lucifer Yellow)，和香豆素衍生物如7-Me2N-香豆素-4-乙酸盐、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸盐、和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸盐(AMCA)。FAM、HEX、TET、JOE、ROX和TAMRA由perkin Elmer，Applied BiosystemsDivision(Foster City，CA)出售。Texas Red和许多其它适宜的化合物由Molecular Probes(Eugene，OR)出售。可以适合用作能量供体的化学发光和生物发光化合物的实例包括鲁米诺(氨基邻苯二酰肼)和衍生物，和荧光素酶。
低核苷酸可以通过任何适当的方法制备，所述方法包括如用限制性内切酶进行适当序列的克隆和分离和通过一种方法如Narang等人，1979，Meth.Enzymol. 68：90-99的磷酸三酯法；Brown等人，1979，Meth.Enzymol. 68：109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人，1981，Tetrahedron lett. 22：1859-1862的二乙基氨基磷酸酯法；和US 4,458,066的固体载体法进行直接的化学合成。Agrawal和Zamecnik，1990，Nucl.Acids.Res. 18(18)：5419-5423；Macmillan和Verdine，1990，J.Org.Chem. 55：5931-5933；Pieles等人，1989，Nucl.Acids.Res. 17(22)：8967-8978；Roget等人，1989，Nucl.Acids.Res.17(19)：7643-7651；和Tesler等人，1989，J.Am.Chem.Soc. 111：6966-6976中描述了用于合成标记的低核苷酸的方法。在Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry  1(3)：165-187中提供了合成方法的回顾。
本发明的方法特别适用于检测扩增的核酸，即DNA或RNA。除了PCR(US 4,683,195；4,683,202，和4,965,188)外适当的扩增方法包括但不限于下述：Ligase Chain Reaction(LCR，Wuand Wallace，1989，Genomics  4：560-569和Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：189-193)；Polymerase Ligase Chain Reaction(Barany，1991，PCR Methods和Applic. 1：5-16)；Gap-LCR(专利公开WO90/01069)；Repair Chain Rdaction(EP公开439,182)，3SR(Kwoh等人；1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177；Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：1874-1878；专利公开WO92/08800A)，和NASBA(US 5,130,238)。本发明不限于任何具体的扩增体系。由于其它体系被开发，那些体系可以通过实施本发明而荻益。在Abramson和Myers，1993，Current Opinion inBiotechnology  4：41-47中公开了扩增体系的最近的综述。
本发明的一个优选的实施例对上述US 5,210,015和Holland等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：7276-7280所述的方法提供改进方案。本方法利用一种热稳定的DNA聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性从杂交复体上切开退火的标记低核苷酸探针并释放标记的片段用于检测。利用DNA聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性切开本发明的标记的探针，使标记游离到反应混合物中。由DNA结合化合物进行淬火的溶液中信号当荧光团结合到全长未切开的低核苷酸探针上时显著地大于结合到变短的切开的片段上时的信号。观测到的荧光表明探针切开增加，这必然表明目标序列的存在和探针/目标杂交的发生。
一般来说样品中的核酸是一种DNA序列，最常见的是基因组DNA。然而本发明还可用其它核酸如信使RNA、核糖体RNA、病毒RNA、或克隆DNA实施。适宜的核酸样品包括用于本发明的单或双链DNA或RNA。本领域的技术人员将会清楚，根据切开标记的低核苷酸探针所用的反应，而不论核酸的种类，只通过对所用的方法进行适当的且公认的改变就可检测核酸。
样品的制备将根据样品的来源、要被检测的目标和在测定中所用的低核苷酸降解反应而改变。每次测定要求目标样品在一种可与测定试剂混溶的缓冲液中。如果在检测探针切开之前或与之同时将目标扩增，目标核酸必须在一种可与扩增目标所用的酶相混溶的缓冲液中。目标核酸可从各种生物物质中分离，所述生物物质包括组织、体液、粪便、痰、唾液、植物细胞、细菌培养物等。
本领域中例如上述Sambrook等人描述了适用于每种测定的样品制备方法。Higuchi，1989，in PCR Technology(Erlich ed.，Stockton Press，New York)，和in PCR Protocols，Chaptersl 8-20(Innis等人，ed.，Academic Press，1990)描述了制备用于目标序列的PCR扩增的样品的简单且快速的方法。本领域的技术人员将能够选择并凭经验优化一种适当的草案。
在一种溶液中的标记的发光用一种光谱荧光计测量，所用光谱荧光计例如一种Hitachi/Perkin Elmer Model 650-40(PerkinElmer，Norwalk，CT)  或者一种PTILS-100 LuminescenceSpectrophotometer(Photon Technology International，London，Ontario，Canada)。根据所用的具体装置的性能，光谱荧光计提供了调整激发和放出的波长以及频带宽度的可能性。本领域的技术人员将知道如何确定适合检测特定标记的发光的波长和频带宽度设定值。在例如The Merck Index，(eds.Budavari等人，1989，Merck Co.Inc.Rahway，NJ)和the Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oregon)Catalog，1990，Haugland中可找到一般性的指导。虽然每种标记有不连续地发光光谱，但宽范围的检测波长适用于实施本发明。
由探针切开引起的发光的改变优选通过比较在探针切开之前和之后测得的发光来计量。可供选择的是，可以在探针切开的同时通过将DNA结合剂混入反应混合物中并在反应进行的同时连续或间歇地监测探针荧光来计量发光的变化。在这种情况下，优选使用的反应容器还适用于测量发光，所述容器允许直接测量发光而不必打开反应容器。然而，由于具体的DNA结合试剂可能抑制具体的探针切开反应，所以可能需要从反应混合物中除去DNA结合试剂。在这种情况下，可以用一种完全一样的反应混合物进行反应前测量。一般地，反应混合物在进行反应前被分开，一部分不在反应条件下的反应混合物用于反应前发光测量。一般地，最方便的是在完成反应后测量反应前发光和反应后发光。
在核酸检测方法与PCR扩增结合的优选方法中，如上所述，扩增反应作为一种自发过程进行。目前可从Perkin Elmer(Norwalk，CT)购得热循环控制装置，这种装置使用一种能够夹持高达48或96个反应管的加热组合单元。从而，高达96个扩增反应可以同时进行。
Higuchi等人在上述1992年的文献，Higuchi等人在上述1993年的文献和欧洲专利公开512,334中描述了用于测量在PCR扩增中从所有管中放出的光的适宜的光学系统。在一种这样的光学系统中，使用多根光导纤维将激发光从光源传导到反应管并测量从每个管发出的光。只需要一个光谱荧光计读出来自反应管的荧光，因为每根光导纤维可以同时快速读出一个数。一种可供选择的光学系统使用一个摄像机同时测量多个反应容器的荧光。对于本领域的技术人员来说，显然还有可供选择的检测设备适合于本方法。
一种可供选择的适合的检测方案使用96室微滴定器程式。这种程式在分析实验室中对于大规模的样品筛选经常是理想的，例如用于遗传分析如用于血库筛选程序中镰状细胞贫血症或AIDS病毒的筛选。本发明适用于这种分析并且避免了许多洗涤和提取步骤，所述步骤对于公知的“管内”测定步骤如ELISA型程式或其它光学的基于密度的方法是需要的，这些方法参见如Kolber等人，1988，J.Immun.Meth. 108：255-264，Huschtscha等人1989，In VitroCelland Dev.Biol. 25(1)：105-108，和Volier等人，1979，TheEnzymeLinked Immunosorbent Assay，Dynatech Labs，Alexandria，VA。本检测法还允许用一种类似于ELISA板式读出器的设备直接进行发光测量，所述设备设计成激发并测量荧光。例如，由Millipore(Bedford，MA)制造的CytoFluorTM2300适合于这种方法。
对本领域技术人员来说显而易见，本发明的方法并不限于具体的检测方法、热循环控制装置或信号测量机、或者反应器的数量。
本发明的方法可被用于同时检测多个目标序列。专门对每个目标的探针存在于反应混合物中。对于存在于样品中的每个目标核酸来说，相应的探针将杂交并被切开。为了单独地检测切开的探针，每种探针用一种标记标记，所述标记以清楚的可测出的波长放出光。然后通过适当选择测量的波长单独检测每种探针。
这样，本发明的方法可用于在检测一个样品中的几个目标的PCR共同扩增法中检测扩增产物。本发明特别是可用于定量比较在相同样品中的两种不同的核酸目标。在US 5,219,727中描述了测定核酸量的方法。所描述的定量方法是基于PCR的方法，这些方法使用一种内部标准分别确定目标的相对量或者精确测量扩增前存在的目标量。
短的和长的标记低核苷酸的有差别的淬火还可以被用于测定核苷酸的并入一种合成的低核苷酸。例如，DNA聚合酶活性验定法测量核苷酸的并入速率。为了测定核苷酸的并入，提供一种反应混合物，该混合物含有标记的dNTPs以及其它的用于低核苷酸合成所需的试剂，如一种在适当的缓冲液中的DNA聚合酶。在一种DNA结合化合物的存在下测量合成前反应混合物的荧光。合成前，所有标记被结合到单个的核苷酸上并且淬火是最小的。合成后，在DNA结合化合物存在下测量反应混合物的荧光。低核苷酸的合成导致标记的核苷酸量的降低。因为较长的、新合成的低核苷酸被DNA结合化合物进行的淬火更有效，所以dNTP并入低核苷酸导致荧光的减弱。
下面提出的本发明的实例只用于说明目的而且不限制本发明的范围。这些实例后面所附的权利要求范围内的本发明的许多实施方案对于阅读了上文和后面的实例的本领域的技术人员是显而易见的。
实施例1
依赖长度的PEI淬火
本实例描述了溶液中的标记的低核苷酸的依赖长度的淬火。长度为33和长度为2的低核苷酸用一种发荧光的标记标记，而且每种低核苷酸的荧光在含有PEI的溶液中测量。用含有各种浓度的PEI的溶液重复测量以确定PEI的最适宜浓度，在该浓度时长度为33和长度为2的低核苷酸之间的信号差别最大。
在一种ABI 394 DNA合成器(Perkin Elmer ABD，Foster City，CA)中以1微摩尔规格合成探针。在低核苷酸合成过程中使用荧光标记的Amidites以直接提供一种5′标记的低核苷酸。由于用于实施例2中所述的方法中，合成长度为33的在3′端有一个PO4基的探针。长度为33的每个标记的探针的核酸序列为SK535(SEQ ID NO：1)5′-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT。长度为2的探针的核酸序列由5′-AG组成，它相应于长度为33的探针的降解产物。
下面列出所用的荧光标记，而且下面表示出每种标记的激发和放出波长。还表明如下所述的用于检测每种标记的滤波器的缝隙宽度
                用于荧光测量的滤波器
              (以毫微米表示的波长和宽度) 标记                      激发最大值                放出最大值荧光素(FAM)                485(20)                    530(25)六氯荧光素(HEX)            530(25)                    590(35)二氯二甲基荧光素(JOE)      490(40)                    580(50)若丹明(ROX)                590(40)                    645(40)四甲基若丹明(TAMRA)        560(20)                    620(40)
对于下列每种探针，同样的测定溶液含有1μM探针和50μl缓冲液(50mM N-二(羟乙基)甘氨酸，100mM KOAc(pH8.3)，3.6mM Mn(OAc)2)，将上述溶液加到微滴定盘的室中。制备一系列浓度为0.016％、0.008％、0.004％、0.002％和0.001％的含PEI(分子量1200，产自Polysciences Inc.，Warrington，PA)的溶液。将50μl体积的水加到一个室中用作最大信号对照。将50μl PEI溶液加到剩余的每个室中。在一个Millipore Cytofluor 2300微滴定器盘式读出器中用上表提供的激发和放出波长进行荧光测量。
本发明的方法依赖于短的和长的标记的低核苷酸的淬火方面的差别。  这种与一种“窗口”有关的淬火差的数值从下述的单独的荧光测量结果计算出。首先，测量只由缓冲液产生的淬火的本底水平，并在每个探针荧光测量值中减去该水平。第二，以在PEI存在时探针的荧光与没有PEI时相同探针的荧光的比值计算剩余荧光，并表示为未淬火的荧光的百分比。最后，以长度为2的标记低核苷酸的剩余荧光和长度为33的低核苷酸的剩余荧光之间的差值计算窗口。窗口是长度为33的标记探针降解成长度为2的片段所导致的信号改变的度量。提供最大窗口的PEI浓度在本发明的检测法中提供最大的灵敏度。
结果示于图1中，其中图示出使用各种探针标记得到的窗口与PEI浓度的关系。标识线指的是如下标记的低核苷酸：
hexx2：HEX标记的低核苷酸其中标记通过一个隔离物附着到低核苷酸的5′端。
fam2：FAM标记的低核苷酸。
hex2：HEX标记的探针，其中标记直接附着到低核苷酸的5′端。
joe：JOE标记的低核苷酸。
rox：ROX标记的低核苷酸。
tam：TAMRA标记的低核苷酸。
由图1可看出，对于每种标记在某些PEI浓度时观察到显著的窗口。窗口的大小取决于标记和PEI浓度。HEX标记通过一个隔离物附着到低核苷酸上被观察到降低了在PEI浓度的测试范围内获得的窗口大小。实施例2
PEI分子量的影响
在本例中，描述PEI的分子量和浓度对带发荧光的标记的探针的淬火的影响。实验基本上如实施例1所述用FAM标记的低核苷酸进行，但是使用各种大小的PEI并且浓度范围比实施例1大。
从Polysciences Inc.，Warrington，PA购得分子量为600、1200、1800和10000千道尔顿的PEI。在含有由50mM N-二(羟乙基)甘氨酸、115mM KOAc乙酸钾(pH8.3)和8％甘油组成的缓冲液的测定溶液中进行发光测量。对于每种大小的PEI，将PEI混入浓度从0.000013％至0.02％(w/v)的测定溶液中。对于每种PEI大小和浓度，如
实施例1计算窗口。
结果示于图2中。可看出每种PEI大小都能用于本发明方法中，尽管用不同大小的PEI得到窗口大小的差别较小。对于每种大小的PEI，最佳的PEI浓度即提供最大的窗口的PEI浓度可由图2确定。上述实验举例说明了PEI大小和浓度的常规最优化法，这种方法可以被本领域技术人员用于进行每种检测验定法。实施例3
由PCR扩增定量
本实例描述用本发明方法的核酸的定量。本例中，在带发荧光标记的探针存在下由RT-PCR扩增由丙肝C病毒(HCV)RNA组成的一个目标。具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶切开杂交到扩增引物下游的目标序列上的标记的探针，从而释放探针的小的标记的低核苷酸片段到反应混合物中。扩增后，将PEI加到反应混合物中并测量标记的探针的荧光。短的标记的低核苷酸降解产物的产生导致测得的荧光的增加，因为降解产物并不象全长的、未降解的探针那样多地被PEI淬火。因为探针降解与目标扩增同时发生，荧光增加表明目标序列的扩增。
通过比较由目标序列的扩增导致的荧光的增加与由第二核酸序列扩增获得的荧光增加能获得初始目标序列复制数的定量估计。按已知的复制数将第二核酸序列加到反应中，从而提供一种内部定量标准(IQS)，未知样品的扩增与该标准比较。用一种放出确切的波长的光的第二荧光标记完成第二核酸序列的检测。扩增
两种目标RNA序列在各自反应中扩增。用一种单个的引物对KY78和KY80同时扩增两种目标核酸序列。本例中，目标RNA序列由转录质粒产生。在EP公开529493和Young等人，1993，J.Clin.Microbiol. 31(4)：882-886中描述了含有HCV序列的转录质粒的结构和用途、扩增引物、和RT-PCR扩增。第一目标序列由一个来自HCV 5′非编码区的区组成。用作IQS的第二目标核酸序列包括相同的两个引物结合位点，与该位点侧面相接的核酸序列含有一个交替的探针结合位点。从而两种目标序列用相同的引物对扩增，但两种目标序列可以独立地使用不同的特定序列的探针被检测。在Mulder等人，1994，J.Clin.Microbiology  34(2)：292-300中描述了IQS的结构和用途。
在FAM标记的专门用于HCV目标序列的探针和HEX标记的专门用于IQS的探针存在下进行扩增。FAM和HEX的最大发光是在不同的波长处，这允许通过适当地选择测得的频率独立地检测探针。探针的核酸序列以5′至3′定向表示。探针用如上所述的在5′端处的标记合成。每种探针合成为有3′-PO4而代替3′-OH以阻断在扩增反应期间由Taq聚合酶进行的任何延伸。在上述Young等人在1993年发表的文献中描述了用于检测HCV目标序列的FAM标记的探针的序列，称为KY88。HEX标记的用于检测IQS的探针的序列提供在上述实施例1中(SEQ ID NO：1)。
在含有下列试剂的100μl反应物中进行扩增：
HCV目标序列(复制数如下所述)
1000个IQS复制
50mM N-二(羟乙基)甘氨酸
100mM KOAc，pH8.3
3.6mM Mn(OAc)2
每种引物0.4μM
每种探针1μM
每种dUTP，dATP，dGTP，dCTP 0.2mM
20单位rTth DNA聚合酶*
2单位Amperase Uracil-N-Glycosolase*
8％甘油*由Hoffmann-La Roche研制和由Perkin Elmer，Norwalk，CT销售。
用0-107个HCV目标复制进行扩增。除了进行PCR热循环的反应混合物外，制备并贮存(无温度循环)另外两种反应混合物用作测量对照。在Gene Amp 9600 Thermal Cycler(Perkin Elmer，Norwalk，CT)中反应混合物进行下列扩增程序：
50℃ 2分钟
60℃ 30分钟
95℃ 1分钟
2个循环：
95℃ 15秒
60℃ 20秒
46个循环：
90℃ 15秒
60℃ 20秒
72℃至少5-10分，高至1小时扩增后，反应物保持在4℃直至分析完毕。分析
将含有0.8mM EDTA的0.004％ PEI(分子量1200)50μl加入到50μl扩增后的每种反应混合物中以及未在扩增条件下的两种对照反应混合物的一种中。用CytoFluorTM2300(Millipore，Location)微量滴定盘读出器测量荧光。在室温下使用485nm激发滤波器(20nm带通宽)和530nm发光滤波器(25nm带通宽)测量FAM标记的探针的荧光。在室温下用530nm激发滤波器(25nm带通宽)和590nm发光滤波器(35nm带通宽)测量HEX标记的探针的荧光。
测得的每种探针标记的荧光通过扣除无探针的未循环反应混合物的荧光来矫正，两者都是在适合标记的波长下测量的。结果示于图3中，以荧光比(HCV/IQS)的对数(Log)与HCV目标复制数的对数(Log)的关系曲线表示。由该数据的最小二乘法线性拟合制出“标准曲线”。
由上述实验产生的标准曲线能使未知HCV样品定量。为了定量一种未知的HCV样品，用上述已知量的IQS扩增HCV核酸。计算测得的荧光变化的比值的对数，从标准曲线方程确定相应的HCV复制数。
序列一览(1)一般性信息
(i)申请人：F.Hoffmann-La Roche AG
(ii)发明名称：用于检测用发光标记标记的低核苷酸标记的长度改变的方法
(iii)序列数：1
(iv)通讯地址：
(A)收件人：F.Hoffmann-La Roche AG
(B)街道：Grenzacherstrasse 124
(C)城市：Basle
(D)州：BS
(E)国家：Switzerland
(F)邮编：CH-4002
(V)电讯信息
(A)电话：061 688 7493
(B)传真：061 688 13 95(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特性：
(A)长度：33个碱基对
(B)种类：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)
(Xi)序列表述：SEQ ID NO：1：AGAAGGTGAG ATGACCAGAG GACTGAGTCC AAT

Claims (7)

1.一种检测用发光标记标记的低核苷酸长度改变的方法，该方法包括：
(a)在导致所述低核苷酸长度改变的条件下在反应混合物中进行反应；
(b)在一种DNA结合化合物存在下在所述反应混合物中测量所述标记的发光，所述化合物能与所述标记相互作用以改变所述标记的发光，其中相互作用取决于所述低核苷酸的长度；和
(c)通过步骤(b)测得的发光检测所述低核苷酸长度改变，
其中所述DNA结合化合物是选自聚乙烯亚胺及聚乙烯亚胺的衍生物、精胺以及亚精胺。
2.权利要求1的方法，用于检测样品中的目标核酸，其中该方法包括：
(a1)提供一种用于反应的反应混合物，其中所述反应混合物包括所述样品和用发光标记标记的单链低核苷酸，其中所述低核苷酸含有能够杂交到所述目标核酸上的序列，而且其中只有当所述低核苷酸被杂交到所述目标核酸上时所述反应才催化所述低核苷酸的切开；
(a2)在所述低核苷酸杂交到所述目标序列上并被切开的条件下处理所述混合物；
(b)在DNA结合化合物存在下测量在所述反应混合物中的所述标记的发光，所述化合物能够改变所述标记的发光，其中相互作用取决于所述低核苷酸的长度；和
(c)通过步骤(b)中测得的发光确定目标序列是否存在。
3.权利要求2的方法，其中所述目标序列在步骤(b)之前扩增。
4.权利要求3的方法，包括：
(a1)提供一种聚合酶链反应(PCR)混合物，该混合物包括所述样品、一对低核苷酸引物、一种有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶和一种能够杂交到所述目标核酸的一个区上的低核苷酸，其中所述低核苷酸在与所述低核苷酸引物结合的所述目标核酸序列内杂交，而且其中所述低核苷酸探针用一种发光标记标记；
(a2)在PCR条件下处理PCR混合物，其中具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶切开杂交到目标序列上的低核苷酸；
(b)在DNA结合化合物存在下测量在所述反应混合物中的所述标记的发光，所述化合物能够改变所述标记的发光，其中相互作用取决于所述低核苷酸的长度；和
(c)通过步骤(b)中测得的发光确定目标序列是否存在。
5.权利要求1至4的任何一项的方法，其中所述DNA结合化合物是聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺的衍生物。
6.权利要求1至4的任何一项的方法，其中所述标记选自由荧光素、若丹明、荧光素衍生物以及若丹明衍生物组成的组。
7.权利要求5的方法，其中所述标记选自由荧光素、若丹明、荧光素衍生物以及若丹明衍生物组成的组。
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