KR100431421B1 - 형광표지된올리고뉴클레오타이드프로브의용액중에서의켄칭방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 올리고뉴클레오타이드 길이에 의존적으로 광 방출 표지와 상호작용하여 당해 표지의 광 방출을 변형시키는 DNA 결합 화합물의 존재하에 광 방출을 측정함으로써, 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 길이 변화를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 선택적 절단을 야기하는 반응을 이용하는 핵산 서열 검출 검정 및, 보다 상세하게는 하이브리드화된 프로브가 프라이머 연장과 동시에 절단되는 증폭/검출 검정에 관한 것이기도 하다.

Description

형광 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 용액중에서의 켄칭 방법
본 발명은 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 길이 변화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 프로브 기능을 지닌 상보성 올리고뉴클레오타이드로 하이브리드화함으로써 핵산 서열을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 핵산 검출법은 특이적 표적 검출을 위한 표준 방법이 되었다. 다수의 검정 방식(format)이 기술되었다. 일반적으로,핵산 샘플을 표지된 표적-특이적 프로브로 하이브리드화 하고, 비결합된 프로브를 하이브리드화 이중체(duplex)로부터 분리시킨 후, 하이브리드화 이중체의 존재를 당해 표지를 사용하여 검출하게 된다. 하이브리드화 및 비하이브리드화 프로브의 분리는 다수의 수단에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면, 샘플 핵산을 고체 지지체 상에 고정시키고 비하이브리드화 프로브를 세척에 의해 제거하거나, 하이브리드화 이중체 및 비결합 프로브를 겔 전기 영동에 의해 분리시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은, 하이브리드화 이후 발생되는 시그날이 비결합된 표지된 프로브에 의해 발생되는 배경 시그날 로부터 구분될 수 있도록 분리 단계를 필요로 한다.
프로브-표적 하이브리드화 이중체 형성 이후의 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 선택적 절단과 관련된 몇몇 핵산 검출 방법이 기술되었다. 절단된 프로브의 검출은 하이브리드화의 발생 및 표적 서열의 존재를 알려준다. 예를 들어, 사이끼 등의 문헌[Saiki et al., 1985, Biotechnology 3: 1008-1012]은, 표적-특이적 프로브의 하이브리드화가 제한 부위를 생성시키고, 이후 상응하는 제한 효소에 의해 절단되는 "올리고머 제한(oligomer restriction)" 검출 방법을 기술하고 있다. 특허 공보 WO 89/09284는 RNA 프로브를 사용하여 DNA 표적 서열을 검출하는 방법을 기술하고 있다. DNA 표적에 하이브리드화된 RNA 프로브를, RNA-DNA 하이브리드 이중체 중의 RNA를 선택적으로 절단하는 RNaseH를 사용하여 절단한다. 미합중국 특허 제5,210,015호는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제를 사용하여 표적 서열과 하이브리드화된 프로브를 절단함으로써, 검출을 위해 표지된 올리고뉴클레오타이드 단편을 유리시키는 방법을 기술하고 있다.
핵산 증폭을 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 발명은 매우 증가된 민감성과 특이성으로 핵산 검출을 가능하게 한다. PCR을 사용하여, 게놈성 DNA의 단일 카피 세그먼트를, 검출 이전에 용이하게 검출될 수 있는 수준까지 선택적으로 증폭시킬 수 있다. PCR 방법은 미합중국 특허 제4,683,202호에 기술되어 있다. PCR, 및 증폭된 표적 핵산 서열과 하이브리드화될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 PCR 생성물을 검출하기 위한 방법은 미합중국 특허 제4,683,195호 및 유럽 특허 공보 제237,362호에 기술되어 있다.
프로브-표적 하이브리드화 이중체 형성 후 하이브리드화 프로브의 선택적 절단을 포함하는 상술한 핵산 검출 방법은 증폭된 핵산의 검출에 적용되었다. 사이끼 등의 문헌[Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1353]은 "올리고머 제한"을 PCR 증폭된 핵산 검출에 이용하는 것을 기술하고 있다. 상기 미합중국 특허 제 5,210,015호는 핵산 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 표적 서열에 하이브리드화된 표지된 프로브를 절단하여 PCR 증폭 생성물을 분석하는 방법을 기술하고 있다[Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88:7276-7280]. 미합중국 특허 제5,210,015호의 방법에서는, 증폭 프라이머에 의해 결합된 표적 핵산의 영역에 하이브리드화하는 프로브를 증폭 반응 혼합물 내로 혼입시킨다. 하이브리드화 프로브는 프라이머 연장 중에 폴리머라제의 5'→3' 뉴클레아제 활성에 의해 절단된다. 표지된 단편의 검출은 프라이머 연장 및 프로브 하이브리드화 모두의 발생, 및 이로 인한 특이적 표적 서열의 증폭을 나타낸다.
프로브이든 표적이든 이러한 표적 핵산의 검출을 용이하게 하는 방안으로서핵산을 표지화하기 위한 다수의 제제가 기술되었다. 형광성, 방사선, 비색법, X-선 회절 또는 흡광, 자성 및 효소 활성에 의해 검출될 수 있는 시그날을 제공하는 표지가 기술 되었으며, 예를 들면, 형광단, 발색단, 방사선 동위 원소(특히32P 및125I), 전자-밀집제, 효소 및 특이적 결합 파트너를 갖는 리간드를 포함한다. 표지화는, 표지를 혼입시키기 위한 프라이머 또는 프로브의 화학적 변형 또는 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 연장 생성물에 도입시키기 위한 중합화 제제의 사용과 같은 다수의 수단에 의해 성취될 수 있다.
핵산 하이브리드화 검정에 있어 상호작용을 하는 형광성 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 용도가 문헌[Morrison, 1992, in Nonisotopic DNA Probe Techniques, Kricka, de., Academic Press, Inc., San Diego, CA, chapter 13; and Heller and Morrison, 1985, in Rapid Detection and Identification of Infections Agents, Academic Press, Inc., San Diego, CA, pages 245-256]중에 기술되어 있다. 이 방법은, 형광 에너지 전이(FET), 형광 공명 에너지 전이, 비방사성 에너지 전이, 광범위(long-range) 에너지 전이, 이극-커플링된 에너지 전이 또는 푀스터(Forster) 에너지 전이와 같이 문헌 중에 기술된 바대로 적합한 형광성 표지를 근접시킨 경우에 발생하는 형광성 변화에 의존한다.
모리슨[Morrison, 1992, 상기]은 3가지 검정 방식을 기술한다. 검정 방식 중 2가지에서는, 상호작용 형광성 표지가 프로브 하이브리드화에 의해 함께 도입되거나 분리된 개개의 올리고뉴클레오타이드에 결합된다. 이들 검정 방식은, 프로브-프로브 하이브리드화가 프로브-표적 하이브리드화와 경쟁하는지 여부에 따라, 비 경쟁적이거나 경쟁적인 것으로서 기술되었다. 양 검정 방식은 2가지 서열-특이적으로 표지된 프로브의 합성을 필요로 한다. 세번째 검정 방식에서, 하나의 형광성 표지는 하이브리드화 프로브에 결합되고, 두번째 형광성 표지는 이본쇄 하이브리드화 이중체 내로 개재되어 근접하게된다. 용액중에서 개재되는 표지와 비하이브리드화 프로브 사이에는 상당한 상호작용은 없다. 개재되는 표지는 어떠한 이본쇄 핵산내로도 개재될 수 있기 때문에, 이러한 방식은 일본쇄 표적 핵산의 검출에서만 실용적이다.
미합중국 특허 제5,210,015호는 근접시 상호작용하는 형광성 표지로 표지된 하이브리드화 프로브의 용도를 기술하고 있다. 표지는 증폭 동안 프로브 분해가 표지를 분리함으로써, 형광성에서 검출가능한 변화가 생성될 수 있도록 부착된다. 이러한 다중-표지된 프로브는 합성하기가 어렵고 비용이 든다.
당해 분야의 기술 영역내에 있는 분자 생물학 및 핵산 화학의 통상적 기술은 문헌중에 충분히 설명되어 있다[Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridiaztion (B.D. Hames and S.J. Higgins. eds., 1984); and a series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)].
일반적으로, 본 발명은, 광방출 표지로 표지된 올리고 뉴클레오타이드의 DNA 결합 화합물에 의해 상당한 용액내 켄칭이 발생하는 조건을 제공한다. 이러한 켄칭은 표지된 올리고뉴클레오타이드가 이의 상보성 서열로 하이브리드화됨 없이 용액 중에서 발생한다. 본 발명의 방법은 표지된 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 이러한 켄칭의 의존성을 이용한다. 표지된 단쇄 올리고뉴클레오타이드(약 6개 이하의 뉴클레오타이드)의 켄칭은 보다 장쇄인 올리고뉴클레오타이드의 켄칭보다 덜 검출된다. 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드의 DNA 결합 화합물에 의한 용액내 켄칭의 발생 및 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 켄칭의 의존성은 선행분야에 기술된 바 없다.
본 발명은, DNA 결합 화합물의 존재하에 형광성 변화에 의거하여 표지된 올리고뉴클레오타이드의 길이 변화를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 비절단된 올리고뉴클레오타이드로부터 절단된 올리고뉴클레오타이드 단편을 분리할 필요 없이 반응 혼합물중에서 올리고뉴클레오타이드의 분해(절단)를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오타이드는 광 방출 표지로 표지시킨다. 표지의 광 방출을 켄칭시키기 위하여 표지와 상호작용할 수 있는 DNA 결합 화합물을 반응 혼합물에 첨가한다. 반응 이후 표지의 광 방출을 측정함으로써 올리고뉴클레오타이드 분해를 검출한다. 표지화된 올리고뉴클레오타이드 길이에 대한 켄칭의 의존성으로 인해, 올리고뉴클레오타이드 분해는 표지된 올리고뉴클레오타이드의 광 방출에 있어 검출가능한 변화를 야기시킨다.
본 발명은, 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드화함으로써 샘플내의 표적 핵산을 검출하는 개선된 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 핵산과 하이브리드화되는 프로브의 선택적 절단에 의존한다. 본 발명의 방법을 사용하여 절단된 프로브를 검출함으로써 표적 핵산의 존재가 나타난다.
본 발명의 특정 양태에 있어,
(a) 샘플과, 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있는 서열을 함유하며 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브(여기서, 광 방출 표지의 광 방출은 DNA 결합 화합물에 의해 변형될 수 있다)를 포함하는, 반응 혼합물을 제공하는 단계;
(b) 단계(a)의 반응 혼합물의 분취량에 DNA 결합 화합물을 가해 표지의 광 방출을 측정하는 단계;
(c) 올리고뉴클레오타이드 프로브가 표적 서열에 하이브리드화되고 절단되는 조건하에서 혼합물을 처리하는 단계;
(d) 단계(c)의 반응 혼합물의 분취량에 DNA 결합 화합물을 가하고 표지의 광 방출을 측정하는 단계; 및
(e) 단계(b) 및 단계(d)에서 측정된 광 방출의 차이에 의해 표적 서열의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 샘플 중에서 표적 핵산을 검출하는 방법이 제공된다.
표적 핵산에 하이브리드화되는 프로브의 선택적 절단은 수 많은 임의의 공지된 반응에 의해서도 성취될 수 있다. 표적 서열에 하이브리드화되는 프로브를 선택적으로 절단하는 적합한 반응의 예가 상기 문헌[Saiki et al., 1985; 특허 공보 W089/09284; 미합중국 특허 제5,210,015호]중에 기술되어 있다.
핵산 검출을 위한 본 발명의 방법은 증폭 방법과 함께 사용하기에 특히 적합하다. 즉, 본 발명의 하나의 양태에 있어, 표적 서열은 단계(c) 이전에 또는 그와 함께 증폭시킨다.
바람직한 양태에 있어, 본 발명은, 프라이머 연장 및 하이브리드화된 표지된 프로브의 절단 모두를 위해 단일 핵산 폴리머라제를 사용하는 미합중국 특허 제 5,210,015호에 기술된 균일한 PCR 증폭 및 PCR 생성물 검출 검정의 개선된 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 개선점은 절단 및 비절단된 프로브를 분리시키기 위해 반응-후 조작을 필요로 하지 않으면서 단일 광-방출 표지로 표지된 프로브의 사용을 허용하는 점이다.
따라서, 본 발명은,
(a) 샘플, 한쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 5'→3' 뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제, 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해 결합된 표적 핵산의 영역내에 하이브리드화할 수 있고 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브(여기서, 광 방출 표지의 광 방출은 DNA 결합 화합물에 의해 변형될 수 있다)를 포함하는, PCR 혼합물을 제공하는 단계;
(b) DNA 결합 화합물의 존재하에 반응 혼합물중의 표지의 광 방출을 측정하는 단계;
(c) 5'→3' 뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제가 표적 서열과 하이브리드화된 프로브를 절단하는 PCR 조건하에서 PCR 혼합물을 처리하는 단계; 및
(d) DNA 결합 화합물의 존재하에 표지의 광 방출을 측정하는 단계; 및
(e) 단계(b) 및 단계(d)에서 측정되는 광 방출의 차이에 의해 표적 서열의존재 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 샘플 중의 표적 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이해를 도모하고자, 하기와 같이 용어를 정의한다.
용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"란 검출할 프로브 및 올리고머 단편으로, 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시- D-리보오스 함유), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보오스 함유) 및, 푸린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 푸린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코사이드인 기타 모든 종류의 폴리뉴클레오타이드를 총칭한다. 용어"핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드" 간에 길이에 대해 구분할 의도는 없고, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다. 이들 용어는 분자의 1차 구조만을 의미한다. 즉, 이들 용어는 일본쇄 및 이본쇄 DNA, 및 일본쇄 및 이본쇄 RNA 를 포함한다.
용어 "표적 영역", "표적 서열" 및 "표적 핵산 서열"은 검출할 핵산 영역을 의미한다.
용어 "프로브"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 일반적으로 표지화되어 상보성 염기쌍으로 인해 표적 핵산의 서열과 이중체 구조를 형성한다. 프로브는 표적 서열의 영역에 상응하는, 바람직하게는 10 내지 50개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20 내지 30개 뉴클레오타이드로 이루어지는 "하이브리드화 영역"을 포함한다. "상응하는"이란 지정된 핵산과 동일하거나 상보성임을 의미한다. 본 발명에 있어서, 프로브 올리고뉴클레오타이드는 검출을 가능하게 하기 위하여 형광성 표지로 표지, 즉 결합된다.
용어 "하이브리드화"는 상보성 염기 쌍으로 인한 2개의 일본쇄 핵산에 의한 이중체 구조의 형성을 의미한다. 하이브리드화는 완전히 상보성인 핵산 쇄 사이에서 또는 소수의 미스매치 영역을 함유하는 핵산 쇄 사이에서 발생할 수 있다. 완전히 상보성인 핵산 쇄만이 하이브리드화되는 조건을 "엄중한 하이브리드화 조건"이라고 칭한다. 소수의 미스매치 영역을 제외하고는 상보성인 2개의 일본쇄 핵산을 "실질적으로 상보성"인 것으로 칭한다. 실질적인 상보성 서열의 안정한 이중체는 덜 엄중한 하이브리드화 조건하에서 성취될 수 있다. 핵산 기술 분야의 숙련가는, 예를 들면 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 염기쌍 농도, 이온 농도 및 미스매치 염기쌍의 발생을 포함한 여러 변수를 경험상 고려하여 이중체 안정성을 결정할 수 있다.
용어 "서열-특이적 올리고뉴클레오타이드" 및 "SSO"는 하이브리드화 영역이 검출할 서열과 정확히 상보성인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 의미한다. 프로브가 정확히 상보성인 표적 서열에만 하이브리드화하는 엄중한 조건을 사용하여 특이적 표적 서열을 검출할 수 있다. 엄중한 하이브리드화 조건은 문헌[Sambrook et al 1985, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.]에 널리 공지되어 있다. 엄중한 조건은 서열 의존적이며 상이한 환경에서 상이할 것이다. 일반적으로, 엄중한 조건은 한정된 이온 농도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융 온도(Tm) 보다 약 5˚C 낮은 상태로 선택된다. Tm은 염기쌍의 50%가 분리되는 온도(한정된 이온 농도 및 pH하에서)이다. 하이브리드화 조건의 엄중성을 완화시켜 관용될 수 있는 서열 미스매치를 허용한다; 관용될만한 미스매치의 정도는 하이브리드화 조건을 적합하게 조정함으로써 제어할 수 있다.
용어 "아서열(subsequence)"은 다른 서열내에 함유된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "표지"는 핵산에 부착할 수 있으며, 검출가능한 시그날을 제공하거나 제2의 표지와 상호작용함으로써 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 시그날을 변경시키는데 사용될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 의미한다. 바람직한 표지로는 형광성, 화학발광성 또는 생물발광성에 의해 검출되는 시그날을 생성시키는 광 방출 화합물이다.
용어 "형광단"은 한 주파수에서 광선을 흡수하고 다른, 일반적으로 보다 낮은 주파수에서 광선을 방출하는 바와 같이 형광화시킬 수 있는 화합물을 의미한다.
용어 "생물발광성"은 광 방출 화합물이 생존 유기체 내에서 발견되는 것으로 화학발광성의 한 형태를 의미한다. 생물발광 화합물의 예로는 세균 루시퍼라제 및 개똥벌레 루시퍼라제가 포함된다.
용어 "켄칭"은 기전과 상관없이, 제2의 화합물에 의해 야기되는 제1 화합물이 형광성 감소를 의미한다. 켄칭을 위해서는 일반적으로 화합물이 매우 근접하게 위치해야 한다. 본원 중 사용된 바와 같이, 화합물 또는 화합물의 형광성이 켄칭되는 것으로 언급되는 경우에는 두가지 용법이 모두 동일한 현상을 언급하는 것으로 이해된다.
용어 "반응 혼합물"은 주어진 반응을 수행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 의미한다. 증폭 반응 수행에 필요한 시약을 함유하는 용액을 의미하는 "증폭 반응 혼합물"은 일반적으로 적합한 완충액중에 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 DNA 폴리머라제를 함유한다. 특이적 반응을 위한 반응 혼합물이 문헌중에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 올리고뉴클레오타이드의 합성 또는 절단의 검출에 이용될 수 있다. 절단된 올리고뉴클레오타이드의 검출은 표지의 광 방출을 감소시키기 위해 표지와 상호작용할 수 있는 DNA 결합 화합물을 함유하는 용액중에서 수행한다. 합성 또는 절단으로 인한 표지된 올리고뉴클레오타이드의 길이 변화는 부착된 표지의 광 방출에 있어 검출가능한 변화를 초래한다. 표지의 광 방출을 변경시키도록 상호작용할 수 있는 적합한 광 방출 표지와 DNA 결합 화합물이 하기 기술되어 있다.
본 발명의 예시된 방법에 있어, 일본쇄 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형광성 표지의 방출을 검출한다. DNA 결합 화합물은, 부착된 올리고뉴클레오타이드의 길이에 의존하는 정도로 표지 형광성을 켄칭시킨다. 일본쇄 올리고뉴클레오 타이드에 결합된 형광성 표지의 DNA 결합 화합물에 의한 용액내 켄칭의 발생 및 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 켄칭의 의존성 모두는 선행 기술 측면에서 예상된 바 없다.
바람직한 양태에 있어, DNA 결합제는 폴리에틸렌이민 (PEI)으로, 이는 다양한 분자량의 에틸렌이민의 측쇄화되거나 비측쇄화된 중합체 계열을 의미한다. 하이드록시에틸화된 PEI와 같은 PEI 유도체가 본 방법에 있어 적합할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 것으로 입증된 기타 화합물에는 스페르민 및 스페르미딘이 포함된다.
측쇄화 PEI는 폴리사이언스사(Polysciences, Inc., Washington, PA)로부터 입수가능한데, 점도에 의해 측정되는 분자량이 600에서 60,000 내지 80,000까지의 범위이다. 분자량 600, 1200, 1800, 10,000 및 60,000 내지 80,000의 PEI를 시험했을때 본 발명의 방법에서 길이 2의 형광-표지된 올리고 뉴클레오타이드가 길이 33의 것과 구별되는 기능을 나타내었다. 당해 분야의 숙련가는 주어진 용도에 있어 어떤 크기의 PEI가 가장 적합한지를 실험적으로 결정할 수 있다.
DNA 결합 화합물의 적합한 농도는 실험적으로 측정한다. 일반적으로, DNA 결합 화합물의 최적 농도는 사용된 광 방출 표지의 종류 및 반응 시약의 농도에 의해 영향받는다. 특히, 염 농도가 PEI의 최적 농도에 영향을 주는지를 관측한다. 몇몇 반응에서, 반응 혼합물에 킬레이트화제(예, 약 1.5mM EDTA)를 첨가하면, 윈도우가 최대치 근처인 PEI의 범위를 확장시키는지 관측한다. 장쇄 및 단쇄 표지된 올리고뉴클레오타이드의 형광성 사이에 최대 차이를 제공하는 DNA 결합 화합물의 농도에 있어 통상적인 최적화는 실질적으로 하기 실시예 1 및 2에 기술한 바대로 수행할 수 있다.
당해 분야에 기술된 다수의 광 방출 화합물은 본 발명의 방법에 있어 올리고뉴클레오타이드 표지로 사용하기에 적합하다. 이상적으로는, 형광단은 산란된 여기(excitation) 광에 의한 간섭을 최소화하기 위해 높은 스토크 시프트(stokes shift) 즉, 최대 흡수를 위한 파장과 최대 여기를 위한 파장간의 차이)를 지녀야한다. 당해 분야에 널리 공지된 적합한 화합물은 플루오레세인 및, 플루오레세인(FAM), 헥사클로로플루오레세인(HEX), 테트라클로로플루오레세인(TET) 및 디클로로디메틸플루오레세인(JOE) 같은 이의 유도체; 로다민, 및 텍사스 레드(Texas Red), 로다민(ROX) 및 테트라메틸로다민(TAMRA)과 같은 이의 유도체; 루시퍼 옐로우, 및 쿠마린 유도체, 예를 들면 7-Me2N-쿠마린 -4-아세테이트, 7-OH-4-CH3-쿠마린-3-아세테이트 및 7-NH2-4-CH3-쿠마린-3-아세테이트(AMCA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. FAM, HEX, TET, JOE, ROX 및 TAMRA는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 어플라이드 바이오시스템 디비존(Applied Biosystems Division, Foster City, CA)에서 시판한다. 텍사스 레드 및 다수의 기타 적합한 화합물은 몰레큘라 프로브(Molecular Probes, Eugene, OR)에서 시판한다. 에너지 공여체로서 사용하기에 적합한 화학발광성 및 생물발광성 화합물의 예로는 루미놀(아미노프탈히드라지드) 및 유도체, 및 루시퍼라제가 포함된다.
올리고뉴클레오타이드는, 제한 효소를 이용한 적절한 서열의 클로닝 및 분리법, 및 포스포트리에스테르 방법[참조 문헌: Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99]의 ; 포스포 디에스테르 방법[참조 문헌: Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151]; 디에틸포스포르아미다이트 방법[참조 문헌: Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862]; 및 미합중국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의한 직접적 화학적 합성 방법을 포함한 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 방법이 문헌[Agrawal andZamecnik, 1990, Nucl. Acids. Res, U18(18):5419-5423; MacMillan and Verdine, 1990, J. Org. Chem. 25:5931-5933; Pieles et al., 1989, Nucl. Acids. Res. 17(22):8967-8978; Roget et al., 1989, Nucl. Acids. Res. 17(19):7643-7651; and Tesler et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:6966-6976]에 기술되어 있다. 합성 방법의 고찰은 문헌[Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187]에 제공된다.
본 발명의 방법은 DNA 또는 RNA의 증폭된 핵산 검출을 위해 특히 적합하다. PCR[미합중국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 및 제4,965,188호] 이외의 적합한 증폭 방법으로는 하기 방법이 포함되나 이에 제한되지는 않는다: 리가제 연쇄 반응 (LCR, Wu and Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 and Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193); 폴리머라제 리가제 연쇄 반응(Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16) ; Gap-LCR(Patent Publication WO 90/01069); 회복 연쇄 반응(European Patent Publication No. 439,182), 3SR(Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:1173-1177; Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; Patent Publication WO 92/08800), 및 NASBA(U.S. Patent No. 5,130,238). 본 발명은 어떠한 특정 증폭 시스템에도 제한되지 않는다. 다른 시스템이 개발됨으로써, 이들 시스템은 본 발명 실행에 있어 이로울 수 있다. 증폭 시스템의 최근 고찰은 문헌[Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47] 중에 공개되어 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 문헌[미합중국 특허 제5,210,015호 및 Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280]에 기술된 방법의 개선책을 제공한다. 본 방법은, 하이브리드화 이중체로부터 어닐링된 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 절단시키고 검출을 위해 표지된 단편을 유리시키는 열안정성 DNA 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. DNA 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 본 발명의 표지된 프로브의 절단은 반응 혼합물 내로 표지를 유리시킨다. DNA 결합 화합물에 의한 용액내 시그날 켄칭은, 형광단이 단쇄화된 절단된 단편에 결합하는 경우보다 완전한 길이의 비절단된 올리고뉴클레오타이드 프로브에 결합하는 경우 훨씬 커진다. 관측된 형광성의 증가는 프로브 절단을 나타내며, 이는 필연적으로 표적 서열의 존재 및 프로브/표적 하이브리드화 발생 모두를 나타내는 것이다.
일반적으로, 샘플중의 핵산은 DNA, 가장 통상적으로는 게놈 DNA의 서열이다. 하지만 본 발명은 또한 mRNA, rRNA, 바이러스 RNA 또는 클론화 DNA 같은 기타 핵산으로 실행될 수 있다. 적합한 핵산 샘플은 본 발명중 사용하기 위한 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는, 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 절단에 사용되는 반응의 유형에 따라 핵산의 특성과 상관없이, 단순히 사용된 방법에 대해 적절하고 널리 인지된 변형을 가해 핵산이 검출될 수 있음을 인지할 것이다.
샘플 제제는 샘플의 공급원, 검출될 표적 및 검정에 사용되는 올리고뉴클레오타이드-분해 반응에 따라 다양해진다. 각각의 검정은 검정 시약과 병존할 수 있는 완충액 중에 표적 샘플을 필요로 한다. 표적이 프로브 절단이 검출되기 이전 또는 이와 동시에 증폭되는 경우, 표적 핵산은 표적을 증폭시키는데 사용된 효소와 병존가능한 완충액중에 존재해야 한다. 표적 핵산은, 조직, 체액, 변, 객담, 타액, 식물 세포, 세균 배양물 등을 포함한 다양한 생물학적 물질로부터 분리할 수 있다.
각각의 검정에 적합한 샘플 제조 방법은 문헌[Sambrook et al., 상기]에 기술되어 있다. 표적 서열의 PCR 증폭을 위한 샘플을 제조하는 단순하고 신속한 방법이 문헌[Higuchi, 1989, in PCR Technology(Erlich ed., Stockton Press, New York), and in PCR Protocols, Chapters 18-20 (Innis et al., ed., Academic Press, 1990)]에 기술되어 있다. 당해 분야의 숙련가는 적합한 프로토콜을 선별하여 실험적으로 최적화할 수 있다.
용액중 표지의 광 방출은 히타치/퍼킨 엘머 모델 650-40(Perkin Elmer, Norwalk, CT) 또는 PTI LS-100 발광 분광계(Photon Technology International, London, Ontario, Canada)와 같은 분광형광계로 측정한다. 분광형광계는 사용되는 특정 기계의 특성에 따라, 밴드 폭 뿐만 아니라 여기 및 방출 파장을 세팅할 기회를 제공한다. 당해 분야의 통상의 숙련가는 특정 표지로부터 광 방출을 검출하는데 적합한 파장 및 밴드 폭 세팅을 결정하는 방법을 인지할 것이다. 일반 지침이 문헌[The Merck Index, (eds. Budavari et al., 1989, Merck Co. Inc. Rahway, NJ) and the Molecular Probes, Inc.(Eugene, Oregon)Catalog, 1990, by Haugland]에 나타나 있다. 각각의 표지는 불연속 광 방출 스펙트럼을 갖지만, 광범위한 검출 파장이 발명을 수행하는데 적합하다.
프로브 절단으로부터 야기되는 광 방출 변화는 바람직하게는 프로브 절단 전후에 측정되는 광 방출을 비교하여 측정한다. 다른 방편으로, 광 방출에서의 변화는 DNA 결합 제제를 반응 혼합물 내로 혼입시키고, 반응이 진행되는 동안 프로브 형광성을 지속적으로 또는 간헐적으로 모니터함으로써 프로브-절단과 동시에 측정할 수 있다. 이 경우, 광 방출 측정에 사용하기에 적합한 반응 용기의 사용은 반응 용기를 열 필요없이 광 방출의 직접적인 측정을 가능하게 하므로 바람직하다. 하지만, 특정 DNA 결합제는 특정 프로브-절단 반응을 억제할 수 있으므로, 반응 혼합물로부터 DNA 결합제를 생략할 필요가 있다. 이러한 경우, 이중 반응 혼합물을 사용하여 반응전 측정을 수행할 수 있다. 일반적으로, 반응 혼합물은 반응 수행 이전에 분할시켜, 반응 조건에 이르지 않은 반응 혼합물 일부를 반응전 방출 측정에 사용한다. 통상적으로, 반응 완결후 반응전 광 방출 및 반응 후 광 방출 둘 다를 측정하는 것이 가장 편리하다.
핵산 검출 방법이 상기한 바와 같이 PCR 증폭과 병행되는 바람직한 방법에 있어서, 증폭 반응은 자동화 공정으로 수행된다. 열 순환계는 퍼킨 엘머(Norwalk, CT)로부터 현재 입수되며, 48 또는 96개 반응 튜브를 유지할 수 있는 가열 블럭을 사용한다. 결과적으로, 96회까지의 증폭 반응을 동시에 수행할 수 있다.
PCR 증폭에 있어 모든 튜브로부터 광 방출을 측정하는데 적합한 광학 시스템이 문헌[Higuchi et al., 1992, supra, Higuchi et al., 1993, supra, and European Patent Publication No. 512,334]에 기술되어 있다. 이러한 광학 시스템 중 하나는, 다중 광섬유 리드(lead)를 사용하여 공급원으로부터 여기 광을 반응 튜브에 전달하고 각각의 튜브로부터 여기 광을 측정한다. 각각의 광섬유는 한번에 하나씩 신속하게 판독될 수 있으므로, 단일 분광형광계만이 반응 튜브로부터 형광성을 판독하는데 필요하다. 대안적인 광학 시스템은 비디오 카메라를 사용하여 다중 반응 용기의 형광성을 동시에 측정한다. 또한, 대안적 검출 장치가 본 방법에 적용될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게는 명백하다.
대안적 적합한 검출 방식은 96-웰 미세역가 포맷을 사용한다. 이러한 타입의 포맷은, 예를 들면 혈액 은행 스크리닝 절차에 있어 겸상세포 빈혈 또는 AIDS 바이러스를 스크리닝하는 바와 같은 유전자 분석을 위한 대규모 샘플 스크리닝을 위한 임상 연구에 있어 종종 바람직하다. 본 발명은 이러한 타입의 분석에 적합하며, ELISA 타입 포맷 또는 기타 광학 밀도에 의한 방법과 같은 널리 공지된 "웰 내" 검정 절차에서 요구되는 다수의 세척 및 추출 공정의 필요를 배제시킨다[Kolber et al., 1988, J. Immun. Meth. 108:255-264, Huschtscha et al 1989, In Vitro Cell and Dev. Biol. 25(1):105-108, and Voller et al., 1979, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA.]. 본 검출 방법은 또한, ELISA 평판 판독기와 유사하지만 형광성을 여기하고 측정하기 위해 고안된 장치를 사용하여 직접적으로 광 방출을 측정할 수 있다. 예를 들면, 밀리포어(Millipore, Bedford, MA)가 제조한 CytoFluorTM2300 기계가 이러한 방법에 있어 적합하다.
본 발명의 방법이 특정 검출 방법, 열 순환계 또는 시그날 측정계 또는 반응 용기의 수에 제한되지 않는다는 것은 당해 분야의 숙련가에게는 명백하다.
본 발명의 방법을 사용하여 다수의 표적 서열을 동시에 검출할 수 있다. 각각의 표적에 특이적인 프로브가 반응 혼합물 중에 존재한다. 샘플중에 존재하는 각각의 표적 핵산에 대해, 상응하는 프로브가 하이브리드화되고 절단될 것이다. 절단된 프로브를 개별적으로 검출하기 위하여, 각각의 프로브 종을 검출가능한 특유한 파장에서 광선을 방출하는 표지로 표지한다. 이후 각각의 프로브 종은, 측정된 파장의 적합한 선택에 의해 별도로 검출된다.
따라서, 본 발명의 방법은 하나의 샘플내 수 개의 표적을 검출하기 위한 PCR 공동-증폭 방법에서의 증폭 생성물을 검출하는데 유용하다. 본 발명은 동일 샘플내 2가지 상이한 핵산 표적의 정량적 비교에 특히 유용하다. 핵산 정량 방법은 미합중국 특허 제5,219,727호에 기술되어 있다. 기술된 정량 방법은, 각각 표적의 상대량을 측정하거나 증폭 전에 존재하는 표적의 양을 정확히 정량하기 위해 내부 표준을 사용하는 PCR-이용 방법이다.
단쇄 및 장쇄의 표지된 올리고뉴클레오타이드의 차별적 켄칭을 또한 이용하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 내로의 뉴클레오타이드의 도입을 측정할 수 있다. 예를 들면, DNA 폴리머라제 활성 검정은 뉴클레오타이드의 도입 속도를 측정한다. 뉴클레오타이드 도입을 측정하기 위하여, 적합한 완충액 중에 올리고뉴클레오타이드 합성에 필요한 기타 시약, 예를 들면 DNA 폴리머라제 이외에 표지된 dNTP를 함유하는 반응 혼합물을 제공한다. 합성 전 반응 혼합물의 형광성은 DNA 결합 화합물의 존재하에 측정한다. 합성전에, 모든 표지는 단일 뉴클레오타이드에 결합되어 켄칭은 최소로 발생한다. 합성 이후, 반응 혼합물의 형광성을 DNA 결합 화합물 존재하에 측정한다. 올리고뉴클레오타이드의 합성으로 표지된 뉴클레오타이드 양이 감소된다. 새롭게 합성되는 보다 장쇄인 올리고뉴클레오타이드가 DNA 결합 화합물에 의해 보다 효과적으로 켄칭되기 때문에, dNTP의 올리고뉴클레오타이드 내로의 도입은 형광성 감소를 초래한다.
하기 본 발명의 실시예는 설명을 위해 제공되었을뿐 본 발명의 영역을 제한하지는 않는다. 실시예 이후의 특허청구의 범위 영역내에서 본 발명의 다양한 양태는 전술한 내용 및 하기 실시예 내용으로부터 당해 분야의 통상의 숙련가에게 명백할 것이다.
실시예 1
PEI에 의한 길이-의존성 켄칭
본 실시예는 용액내에서 표지된 올리고뉴클레오타이드의 길이-의존성 켄칭에 대해 기술한다. 길이 33 및 길이 2의 올리고뉴클레오타이드를 다양한 형광성 표지 중 하나로 표지화하고, 각각의 올리고뉴클레오타이드의 형광성을 PEI를 함유하는 용액중에서 측정한다. 다양한 농도의 PEI를 함유하는 용액을 사용하여 측정을 반복하여, 길이 33과 2의 올리고뉴클레오타이드 사이의 시그날 차이가 최대화되는 PEI 최적 농도를 측정한다.
ABI 394 DNA 합성기(Perkin Elmer ABD, Foster City, CA) 상에서 1μmole 규모로 프로브를 합성시킨다. 형광성 표지의 아미다이트를 올리고뉴클레오타이드 합성 중에 사용하여 5'-표지된 올리고뉴클레오타이드를 직접 제공한다. 길이 33의 프로브를 실시예 2에 기술된 방법에 사용하기 위하여, 3' 말단에서 PO4그룹을 갖도록 합성한다. 길이 33의 표지된 프로브의 각각의 핵산 서열은 SK535(서열 확인 번호: 1) 5'-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT이다. 길이 2의 프로브의 핵산 서열은 5'-AG로 이루어지고, 이는 길이 33의 프로브의 분해 생성물에 상응한다.
사용된 형광성 표지가, 각각의 표지에 대한 여기 및 방출 파장과 함께, 아래에 나타나 있다. 아래에 기술될 각각의 표지 검출에 사용되는 필터의 슬릿 크기 또한 나타나 있다.
형광성 측정에 사용되는 필터
(파장 및 폭은 nm 단위)
아래에 열거한 각각의 표지에 있어, 완충액(50mM 비신(Bicine), 100mM KOAc(pH 8.3), 3.6mM Mn (OAc)2) 50μl 중 1μM의 프로브를 함유하는 복제 검정 용액을 미세역가 플레이트의 웰에 가한다. 0.016%, 0.008%, 0.004%, 0.002% 및 0.001% 농도로 PEI(분자량 1200, Polysciences Inc., Warrington, PA)를 함유하는 일련의 용액을 제조한다. 물 50μl 용적을 하나의 웰에 가해 최대 시그날 대조군으로 사용한다. PEI 용액 50μl를 나머지 웰 각각에 가한다. 형광성 측정을 상기 표에 제시된 여기 및 방출 파장을 사용하여 밀리포어 사이토플루오르(Milipore Cytofluor) 2300 미세역가 플레이트 판독기에서 실시한다.
본 발명의 방법은 단쇄 및 장쇄의 표지된 올리고뉴클레오타이드 켄칭의 차이에 따라 달라진다. "윈도우"로 언급되는 이러한 켄칭 차이의 측정치는 다음과 같이 각각의 형광성 측정으로부터 계산한다. 먼저, 완충액 단독으로 부터 나타나는 켄칭의 배경 수준을 측정하고 각각의 프로브 형광성 측정치로부터 공제한다. 다음, 잔여 형광성을 PEI 존재하의 프로브 형광성 대 PEI 부재하의 동일 프로브 형광성의 비로서 계산하여, 켄칭되지 않은 형광성의 %로서 표현한다. 마지막으로, 윈도우를, 길이 2의 표지된 올리고뉴클레오타이드의 잔여 형광성과 길이 33의 올리고뉴클레오타이드 잔여 형광성 사이의 차이로서 계산한다. 윈도우는, 길이 33의 표지된 프로브가 길이 2의 단편으로 분해되면서 나타나는 시그날 변화의 측정치이다. 최대 윈도우를 제공하는 PEI 농도는 본 발명의 검출 방법에 있어 최대 민감성을 제공한다.
결과는 제1도에 나타나 있는데, 이때 다양한 프로브 표지를 사용하여 수득한 윈도우를 PEI 농도에 대해 플롯팅하였다. 각각의 라인은 하기와 같이 표지된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
hexx 2: HEX-표지된 올리고뉴클레오타이드로서, 이때 표지는 스페이서를 통해 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착된다.
fam 2: FAM-표지된 올리고뉴클레오타이드.
hex 2: HEX-표지된 프로브, 이때 표지는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 직접 부착된다.
joe: JOE-표지된 올리고뉴클레오타이드.
rox: ROX-표지된 올리고뉴클레오타이드.
tam: TAMRA-표지된 올리고뉴클레오타이드.
제1도로부터 알 수 있듯이, 특정 농도의 PEI에서 각각의 표지로 상당한 윈도우가 관측된다. 수득된 윈도우 크기는 PEI의 농도 및 표지 모두에 의존한다. 스페이서를 통해 올리고뉴클레오타이드에 HEX 표지를 부착시키면, 시험된 PEI 농도 범위 내에서 수득된 윈도우 크기가 감소되는 것으로 관측된다.
실시예 2
PEI 분자량의 효과
본 실시예에서, 형광-표지된 프로브의 켄칭에 대한 PEI 농도 및 분자량 효과가 기술된다. 실시예 1에 기술된 바와 같은 실험을, FAM-표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하지만, 실시예 1보다 큰 범위의 농도 및 다양한 크기의 PEI를 사용하여 수행한다.
분자량 600, 1200, 1800 및 10,000 킬로달톤의 PEI를 펜실바니아 워링톤의 폴리사이언스사(Polyscience Inc.)로부터 수득한다. 50mM 비신, 115mM KOAc, 아세트산칼륨(pH 8.3) 및 8% 글리세롤로 이루어진 완충액을 함유하는 검정 용액에서 방출 측정을 수행한다. 각각의 크기의 PEI에 대해, PEI를 0.000013% 내지 0.02%(w/v) 농도의 검정 용액속에 혼입시킨다. 각각의 PEI 크기 및 농도에 대해, 윈도우를 실시예 1에서와 같이 계산한다.
결과는 제2도에 나타나 있다. 각각의 크기의 PEI는, 상이한 크기의 PEI를 사용하여 수득된 윈도우 크기가 약간 차이나더라도, 본 발명의 방법에서 작용하는 것으로 보인다. 각각의 크기의 PEI에 대해, 최대 윈도우를 제공하는 PEI 농도에서와 같이 제2도로부터 최적 PEI 농도가 측정될 수 있다. 상기 실험은 PEI 크기 및 농도의 통상적 최적화를 예시하며, 당해 분야의 숙련가는 각각의 검출 검정을 수행할 수 있다.
실시예 3
PCR 증폭에 의한 정량화
본 실시예는 본 발명의 방법을 사용한 핵산 정량화에 대해 기술한다. 본 실시예에서, C형 간염 바이러스(HCV) RNA로 이루어진 표적을 형광성 표지된 프로브 존재하에 RT-PCR로 증폭시킨다. DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 증폭 프라이머 하류의 표적 서열과 하이브리드화된 표지된 프로브를 절단함으로써, 프로브의 표지된 올리고뉴클레오타이드 소형 단편을 반응 혼합물내로 유리시킨다. 증폭 후, PEI를 반응 혼합물에 가하고 표지된 프로브 형광성을 측정한다. 단쇄 표지된 올리고뉴클레오타이드 분해 생성물이 생성됨에 따라, 분해 생성물이 완전한 길이의 분해되지 않은 프로브 만큼 PEI에 의해 켄칭되지 않기 때문에, 측정된 형광성이 증가된다. 프로브 분해는 표적 증폭과 동시에 발생하기 때문에, 형광성 증가는 표적서열 증폭을 나타낸다.
최초 표적 서열 카피수의 정량적 측정치는, 표적 서열의 증폭으로부터 수득되는 형광성 증가를 제2 핵산 서열 증폭 으로부터 수득되는 형광성 증가와 비교하여 수득한다. 제2 핵산 서열을 공지의 카피수로 반응물로 가하여, 공지되지 않은 샘플의 증폭과 비교될 수 있는 내부 정량 표준(IQS)을 제공한다. 제2 핵산 서열 검출은 별개 파장에서 광선을 방출하는 제2 형광성 표지를 사용하여 이루어진다.
증폭
2개의 표적 RNA 서열을 각 반응중에 증폭시킨다. 두개의 표적 핵산 서열을 단일 프라이머 쌍, KY78 및 KY80을 사용하여 동시에 증폭시킨다. 이 실시예에서, 표적 RNA 서열은 전사 플라스미드로부터 생성된다. HCV 서열을 함유하는 전사 플라스미드의 사용 및 작제, 증폭 프라이머 및 RT-PCR 증폭이 문헌[European Patent Publication No. 529 493 and in Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. ∼U31∼u(4):882-886]에 기술되어 있다. 제1 표적 서열은 HCV 5' 비암호화 영역으로 부터의 영역으로 이루어진다. IQS로서 사용되는 제2 표적 핵산 서열은, 또 다른 프로브 결합 부위를 함유하는 핵산 서열을 플랭킹하는 동일한 2개의 프라이머 결합 부위를 포함한다. 결과적으로, 두개의 표적 서열을 동일한 프라이머쌍을 사용하여 증폭 시키지만, 2개의 표적 서열은 상이한 서열-특이적 프로브를 사용하여 독립적으로 검출할 수 있다. IQS의 작제 및 사용은 문헌[Mulder et al., 1994, J. Clin Microbiology 34(2): 292-300]에 기술되어 있다.
증폭은, HCV 표적 서열에 특이적인 FAM-표지된 프로브 및 IQS에 특이적인HEX-표지된 프로브 존재하에 수행한다. FAM 및 HEX의 방출 최대치는 상이한 파장에서 발견되고, 이는 측정된 주파수의 적합한 선택에 의해 프로브의 독립적 검출을 허용한다. 프로브의 핵산 서열이 5'→3' 배향으로 나타난다. 프로브는 상술한 바와 같이 표지를 사용하여 합성한다. 각각의 프로브는 증폭 반응중에 Taq 폴리머라제에 의한 어떠한 연장도 차단되도록 3'-OH 대신 3'-PO4를 갖게끔 합성시킨다. HCV 표적 서열 검출을 위한 FAM-표지된 프로브의 서열이 문헌[Young et al., 1993, 상기]에 KY88로 기술되어 있다. IQS의 검출을 위한 HEX- 표지된 프로브의 서열이 상기 실시예 1에 제공된다(서열확인 번호: 1).
증폭을 하기 시약을 함유하는 100μl 반응물 중에서 수행한다:
HCV 표적서열(하기와 같은 카피 수)
IQS 1000개 카피
50 mM 비신
100 mM KOAc, pH 8.3
3.6 mM Mn(OAc)2
0.4μM 각각의 프라이머
1μM 각각의 프로브
0.2 mM 각각의 dUTP, dATP, dGTP, dCTP
20단위 rTth DNA 폴리머라제*
2단위 암퍼라제 우라실-N-글리코솔라제*
8% 글리세롤
*호프만-라 로슈 개발 및 제조, 퍼킨 엘머(코넥티컷, 노워크)시판.
증폭은 HCV 표적의 0 내지 107개 카피를 사용하여 수행한다. PCR 열 순환 조건하의 반응 혼합물 외에, 2가지 추가 반응 혼합물을 측정 대조군으로서 사용하기 위해 제조하고 저장한다(열 순환 없음). 반응 혼합물을 열순환계(GeneAmp 9600 열순환계, 퍼킨 엘머, 코넥티컷 노워크)중에서 하기 증폭 방식으로 처리한다.
50˚C, 2분
60˚C, 30분
95˚C, 1분
2주기:
95˚C, 15초
60˚C, 20초
46주기:
90˚C, 15초
60˚C, 20초
72˚C, 5 내지 10분 이상, 1시간 미만
증폭 후, 반응은 분석시까지 4˚C에서 유지한다.
분석
0.8mM EDTA 함유 0.004% PET(분자량 1200) 용액 50μl를 증폭 후 50μl의 각 반응 혼합물에 가하고, 증폭 조건이 아닌 2개의 대조군 반응 혼합물중 하나에 가한다. CytoFluorTM2300 미세역가 플레이트 판독기(밀리포어, 로케이션)에서 형광성을 측정한다. FAM-표지된 프로브의 형광성을 485nm 여기 필터 (20nm 밴드 통과 폭) 및 530nm 방출 필터(25nm 밴드 통과 폭)을 사용하여 실온에서 측정한다. HEX-표지된 프로브의 형광성을 530nm 여기 필터(25nm 밴드 통과 폭) 및 590nm 방출 필터(35nm 밴드 통과 폭)를 사용하여 실온에서 측정한다.
각각의 프로브 표지의 측정된 형광성을, 프로브 없이 비순환된 반응 혼합물의 형광성(둘 다 표지에 적절한 파장에서의 측정)을 공제하여 수정한다. 결과는 HCV 표적 카피수의 로그값에 대한 형광성 비의 로그값(HCV/IQS)으로서 플롯팅한다. "표준 커브"는 데이타의 최소 제곱 선형 방식으로 나타낸다.
상기 실험에서 생성되는 표준 커브를 사용하여 공지되지 않은 HCV 샘플을 정량할 수 있다. 공지되지 않은 HCV 샘플의 정량화를 위해, HCV 핵산을 상술한 공지량의 IQS로 증폭시킨다. 측정된 형광성 변화 비의 로그값을 계산하고, 상응하는HCV 카피 수를 표준 커브의 등식으로부터 측정한다.
제1도는 실시예 1에 기술된 바와 같은, 표지된 올리고뉴클레오타이드 길이, 광 방출 표지 및 DNA 결합 화합물의 농도에 따른 켄칭 의존성을 나타내는 그래프이다.
제2도는 실시예 2에 기술된 바와 같은, 사용된 폴리에틸렌이민(PEI)의 농도 및 분자량에 따른 켄칭 의존성을 나타내는 그래프이다.
제3도는 실시예 3에 기술된 바와 같은, 내부 정량 대조군 표준의 존재하에 표적 핵산 서열 증폭에 의한 핵산의 정량화 그래프이다.

Claims (7)

  1. (a) 올리고뉴클레오타이드의 길이를 변화시키는 조건하에서 반응 혼합물 중에서 반응을 수행하는 단계;
    (b) 올리고뉴클레오타이드 길이에 따라 달라지는 광 방출 표지와의 상호작용을 통해 당해 표지의 광 방출을 변형시킬 수 있는 폴리에틸렌이민, 하이드록시에틸화된 폴리에틸렌이민, 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 결합 화합물의 존재하에, 상기 반응 혼합물 중의 표지의 광 방출을 측정하는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 측정된 광 방출에 의해 올리고뉴클레오타이드의 길이 변화를 검출하는 단계를 포함하여, 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드의 길이 변화를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a1) 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있는 서열을 함유하고 광 방출 표지로 표지된 일본쇄 올리고뉴클레오타이드 및 샘플을 포함하는 반응 혼합물로서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 하이브리드화하는 경우에만 올리고뉴클레오타이드의 절단을 촉매화하는 반응을 하는, 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    (a2) 올리고뉴클레오타이드가 표적 서열과 하이브리드화되고 절단되는 조건하에서 상기 혼합물을 처리하는 단계;
    (b) 올리고뉴클레오타이드 길이에 따라 달라지는 광 방출 표지와의 상호작용을 통해 당해 표지의 광 방출을 변형시킬 수 있는 폴리에틸렌이민, 하이드록시에틸화된 폴리에틸렌이민, 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 결합 화합물의 존재하에, 반응 혼합물 중 표지의 광 방출을 측정하는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 측정된 광 방출에 의해 표적 서열의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 샘플 중의 표적 핵산을 검출하기 위한 방법.
  3. 제2항에 있어서, 표적 서열을 단계(b) 이전에 증폭시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    (a1) 샘플, 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 5'→3' 뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제, 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해 결합된 표적 핵산의 영역내에 하이브리드화할 수 있고 광 방출 표지로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 혼합물을 제공하는 단계;
    (a2) 5'→3' 뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제가 표적 서열과 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드를 절단하는 PCR 조건하에서 PCR 혼합물을 처리하는 단계;
    (b) 올리고 뉴클레오타이드 길이에 따라 달라지는 광 방출 표지와의 상호작용을 통해 당해 표지의 광 방출을 변형시킬 수 있는 폴리에틸렌이민, 하이드록시에틸화된 폴리에틸렌이민, 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된DNA 결합 화합물의 존재하에, 반응 혼합물 중의 표지의 광 방출을 측정하는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 측정되는 광 방출에 의해 표적 서열의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 결합 화합물이 폴리에틸렌이민인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 표지가 플루오레세인, 로다민, 헥사클로로플루오레세인, 테트라클로로플루오레세인, 디클로로디메틸플루오레세인, 텍사스 레드(Texas Red) 및 테트라메틸로다민으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, DNA 결합 화합물이 폴리에틸렌이민이고, 표지가 플루오레세인, 로다민, 헥사클로로플루오레세인, 테트라클로로플루오레세인, 디클로로디메틸플루오레세인, 텍사스 레드 및 테트라메틸로다민으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
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