PT713921E - Metodos para extinguir numa solucao a fluorescencia de sondas oligonucleotidicasmarcadas com um fluoroforo - Google Patents

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7Sé

Descrição “Métodos para extinguir numa solução a fluorescência de sondas oligonucleotídicas marcadas com um fluoróforo” [0001] A presente invenção diz respeito a métodos para detectar uma mudança no comprimento de uma sonda oligonucleotídica marcada com um identificador emissor de luz. Além disso, a invenção diz.respeito a métodos para a detecção de sequências de ácidos nucleicos , por hibridação com um oligonucleótido complementar que desempenhe a função de uma sonda.

[0002] A detecção de ácidos nucleicos utilizando sondas oligonucleotídicas passou a ser um método convencional para a detecção de alvos específicos. Foram já descritos inúmeros protocolos de ensaio. De um modo geral, deixa-se uma amostra de ácido nucleico hibridar com uma sonda marcada específica para o alvo visado, retira-se das hélices duplas de hibridação a parte da sonda não ligada e efectua-se a detecção da presença das hélices duplas de hibridação, utilizando o marcador de identificação. A separação da sonda hibridada e da sonda não hibridada pode ser feita de várias maneiras. Por exemplo, o ácido nucleico da amostra pode ser imobilizado, sendo a sonda não hibridada removida por meio de uma lavagem, ou então as hélices duplas de hibridação e a sonda não ligada podem ser separadas por electroforese em gel. Em geral, tais métodos implicam um passo de separação para que o sinal gerado a seguir à hibridação possa ser distinguido do sinal natural gerado pela sonda marcada não ligada.

[0003] Foram já descritos vários métodos de detecção de ácidos nucleicos que implicam a clivagem selectiva de sondas oligonucleotídicas a seguir à formação de hélices duplas de hibridação com o alvo visado pela sonda. A detecção das sondas clivadas indica a ocorrência de hibridação e conseauentemente a Dresenca das seauências visadas. Por exemnlo. Saiki et ai, 1985, Biotechnology 3:1008-1012, descrevem métodos de detecção por ‘Restrição de oligómeros” em que α hibridação da sonda específica do alvo gera um local de restrição que é clivado depois pela correspondente enzima de restrição. No texto publicado da patente de invenção WO 89/09284 estão descritos métodos em que são utilizadas sondas de ARN para a detecção das sequências de ADN visadas. As sondas de ARN hibridadas com o alvo de ADN destinatário são clivadas utilizando RNaseH que cliva de uma forma selectiva o ARN nas hélices duplas híbridas de ARN-ADN. A patente de invenção noite-americana n° 5 210 015 descreve métodos em que se recorre à actividade de exonuclease de 5’ para 3’ de uma polimerase de ácido nucleico para efectuar a clivagem de sondas hibridadas com as sequências visadas, libertando assim os fragmentos de oligonucleótidos marcados, para efeitos de detecção.

[0004] A invenção da reacção em cadeia com polimerase (RCP), que é um processo para a amplificação de ácidos nucleicos, veio permitir a detecção de ácidos nucleicos com uma sensibilidade e com uma especificidade cada vez maiores. Utilizando a RCP, é possível amplificar selectivamente segmentos de ADN genómico de uma só cópia, até se atingir um nível facilmente detectável, antes da detecção. Os métodos de RCP estão descritos na patente de invenção norte-americana n° 4 683 202. Na patente de invenção norte-americana n° 4 683 195 e no texto publicado da patente de invenção europeia n° 237 362 estão descritos métodos de RCP e métodos para a detecção dos produtos da RCP utilizando uma sonda oligonucleotídica capaz de hibridar com um ácido nucleico destinatário amplificado.

[0005] Os métodos para a detecção de ácidos nucleicos, descritos supra, que implicam a clivagem selectiva das sondas de hibridação a seguir à formação das hélices duplas de hibridação com o alvo visado pela sonda, foram já aplicados à detecção de ácido nucleico -'“-'ido. Sailci et a!.. 1985. Science 230:1350-1353. descrevem a aDhcacão de “restrição de oligómeros” à detecção de ácido nucleico amplificado por RCP. A patente de invenção norte--americana n° 5 210 015, supra, descreve a análise de produtos de amplificação por RCP, recorrendo à actividade de exonuclease de 5’ para 3’ existente numa polimerase do ácido nucleico, para clivar sondas marcadas hibridadas com as sequências visadas; ver também Holland et ai, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7276-7280. Nos métodos explicitados na patente de invenção norte-americana n° 5 210 015, as sondas que hibridam com uma região do ácido nucleico visado, que está ligado pelos iniciadores de amplificação, são incorporadas na mistura da reacção de amplificação. As sondas hibridadas são clivadas por meio da actividade de nuclease de 5’ para 3’ existente na polimerase, durante o aumento do iniciador. A detecção de fragmentos marcados indica a ocorrência simultânea de um aumento do iniciador e de hibridação da sonda e consequentemente indica a amplificação da sequência específica visada.

[0006] Foram já descritos diversos agentes para se fazer a marcação de ácidos nucleicos, quer sejam uma sonda ou um alvo, para facilitar a detecção do ácido nucleico visado. Foram já descritos marcadores que geram sinais detectáveis por fluorescência, radioactividade, colorimetria, diffaeção ou absorção dos raios X, magnetismo e actividade enzimática, estando incluídos entre eles, por exemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente 32P e 125I), reagentes densos em electrões, enzimas e ligandos que tenham os elementos compares de ligação específicos. A marcação pode ser feita de várias maneiras, tais como a modificação química de um iniciador ou de uma sonda para se lhe incorporar um marcador, ou a utilização de agentes polimerizantes para se incorporar um nucleósido-trifosfato modificado num produto de extensão.

[0007] A utilização de sondas oligonucleotídicas marcadas com marcadores fluorescentes 1992 na obra ‘Nonisotopic DNA Probe Techniques’, Kricka, ed., Academic Press, Inc., San Diego, CA capítulo 13; e por Heller e Morrison em 1985 na obra ‘Rapid Detection and Identification of Infections Agents’, Academic Press, Inc. San Diego, CA páginas 245-256. Tais métodos têm por base a modificação de fluorescência que ocorre quando marcadores fluorescentes adequados assumem posições muito próximas entre si, estando essas modificações descritas na literatura como transferência de energia da fluorescência (TEF), transferência da energia da ressonância da fluorescência, transferência de energia não radioactiva, transferência de energia de longo alcance, transferência de energia acoplado ao dipolo ou transferência da energia de Fõrster [0008] Morrison, 1992, supra, descreve três protocolos de ensaio. Em dois desses protocolos de ensaio, os marcadores fluorescentes interactuantes são ligados ao oligonucleótidos separados que são reunidos entre si ou separados pela hibridação com a sonda. Estes protocolos de ensaio são de tipo competitivo ou não competitivo, dependendo isso da eventualidade de a hibridação sonda-sonda competir ou não com a hibridação sonda-alvo. Qualquer desses dois protocolos de ensaio implica a síntese de duas sondas marcarias específicas das sequências. No terceiro protocolo de ensaio liga-se um marcador fluorescente à sonda de hibridação e leva-se o segundo marcador fluorescente para uma posição muito próxima, mediante intercalação na hélice de hibridação de cadeia dupla. Não ocorre nenhuma interacção significativa entre o marcador de intercalação e a sonda não hibridada em solução. Tendo em conta que o marcador de intercalação pode ficar intercalado em qualquer ácido nucleico de cadeia dupla, este protocolo é prático apenas para a detecção de ácido nucleico relevante de cadeia singular.

[0009] A patente de invenção norte-americana n° 5 210 015 descreve a utilização de uma sonda de hibridação que é marcada com marcadores fluorescentes interactuantes em

posições muito próximas entre si. Os marcadores são acoplados de tal modo que a degradação da sonda durante a amplificação separa os marcadores, produzindo assim uma mudança detectável de fluorescência. É difícil e dispendioso obter tais sondas multiplamente marcadas.

[0010] O documento WO 92/02638 descreve um método de detecção por RCP em que se recorre à capacidade que a polietilenimina tem para se ligar aos oligonucleótidos, de um modo dependente do tamanho, para se fazer precipitar selectivamente os oligonucleótidos de sondas não clivadas, marcados com um marcador emissor de luz. O sinal medido a seguir ao passo de precipitação é um indicador para a amplificação que ocorreu na presença do ácido nucleico visado. O método descrito não permite a detecção durante a amplificação e exige vários passos de manuseamento.

[0011] As técnicas convencionais da biologia molecular e da química dos ácidos nucleicos, que são assuntos da competência dos especialistas na matéria, estão exaustivamente descritas na literatura; ver, por exemplo, Sambrook et al., 1985, ‘Molecular Cloning - A Laboratory Manual’, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Oligonucleotide Synlhesis’ (MJ. Gait, ed., 1984); ‘Nucleic Add Hybridization’ (B.D. Hames e S.J. Higgins, eds., 1984); e ainda a série de publicações ‘Methods in Enzymology’ (Academic Press, Inc.).

[0012] De um modo geral, a presente invenção proporciona condições que permitem que tenha lugar, niuna solução, tuna extinção significativa, por acção de um composto de ligação do ADN, de um oligonucleótido marcado com um marcador emissor dc luz. Esta extinção tem lugar em solução, sem que o oligonucleótido marcado hibride com a sua sequência complementar. Os métodos da presente invenção utilizam a dependência que esta extinção tem em relação ao comprimento do oligonucleótido marcado. A extinção de um oligonucleótido

curto marcado (com cerca de 6 nucleótidos ou menos) é menos detectável do que a extinção de um oligonucleótido marcado mais comprido. A ocorrência de extinção numa solução, por acção de um composto de ligação do ADN, de um oligonucleótido marcado com um marcador emissor de luz e a dependência da extinção em relação ao comprimento do oligonucleótido nunca antes foram descritas.

[0013] A presente invenção proporciona métodos para detectar a variação do comprimento de oligonucleótidos marcados, com base na mudança da fluorescência na presença de um composto de ligação do ADN. Em particular, a presente invenção proporciona métodos para detectar a degradação (clivagem) de oligonucleótidos numa mistura de reacção, sem necessidade de se efectuar a separação dos fiagmentos oligonucleotídicos clivados, para fora do oligonucleótido não clivado. Os oligonucleótidos são marcados com um marcador emissor de luz. Acrescenta-se à mistura de reacção um composto de ligação do ADN que seja capaz de interactuar com o marcador para extinguir a emissão de luz do marcador. A degradação do oligonucleótido é detectada medindo a emissão de luz do marcador a seguir à reacção. Uma vez que a extinção depende do oligonucleótido marcado, a degradação oligonucleotídica vai determinar uma mudança detectável na emissão de luz do oligonucleótido marcado.

[0014] A presente invenção proporciona métodos aperfeiçoados para a detecção de um ácido nucleico relevante numa amostra por hibridação com uma sonda oligonucleotídica. Tais métodos fundamentam-se na clivagem selectiva de sondas hibridadas com o ácido nucleico visado. A detecção das sondas clivadas, utilizando os métodos da presente invenção, indica a presença do ácido nucleico em causa.

[0015] De acordo com uma das suas variantes específicas, a presente invenção proporciona um método para a detecção de um ácido nucleico relevante numa amostra, compreendendo tal método os passos seguintes: (a) preparar uma mistura de reacção que contenha a amostra e uma sonda oligo-nucleotídica marcada com um marcador emissor de luz, em que a referida sonda contém uma sequência que é capaz de hihridar com o ácido nucleico visado, (b) acrescentar a uma aliquota da mistura de reacção do passo (a) um composto de ligação do ADN, que seja capaz de modificar a emissão de luz do marcador, e medir a emissão de luz do marcador; (c) tratar a referida mistura em condições em que a referida sonda oligonucleotídica hibride com a referida sequência relevante e seja cbvada; (d) acrescentar a uma ahquota da mistura de reacção do passo (c) um composto de bgação do ADN e medir a emissão de luz do marcador; e (e) determinar se a sequência visada se encontra presente, recorrendo para isso à diferença das emissões de luz medidas no passo (b) e no passo (d).

[0016] A clivagem selectiva das sondas hibridadas com o ácido nucleico visado pode ser feita por meio de diversas ieacções conhecidas. Como exemplos de reacções convenientes, que permitem chvar selectivamente sondas hibridadas com uma sequência relevante, refere-se os que foram descritos antes na obra de Saiki et al., 1985, supra, no texto pubhcado da patente de invenção WO 89/09284, supra, e na patente de invenção norte-americana n° 5 210 015, supra.

[0017] Os métodos da presente invenção para a detecção de ácidos nucleicos são particularmente apropriados para utilização em conjunto com processos de amplificação. Assim sendo, de acordo com uma variante da invenção, a sequência visada é amplificada antes do passo (c) ou conjuntamente com este passo.

[0018] De acordo com uma variante preferível, a presente invenção proporciona aperfeiçoamentos ao protocolo de amplificação homogénea por RCP e de detecção do produto da

RCP descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 210 015, em que se utiliza uma única polimerase dos ácidos nucleicos tanto para α extensão do iniciador como para a clivagem das sondas marcadas hibridadas. Os aperfeiçoamentos proporcionados pela presente invenção permitem a utilização de uma sonda marcada com um único marcador emissor de luz, sem que sejam necessárias manipulações após a reacção para efectuar a separação entre a sonda clivada e a sonda não clivada.

[0019] Posto isto, a presente invenção proporciona um método para a detecção de uma sequência relevante de ácidos nucleicos numa amostra, utilizando uma reacção em cadeia com polimerase (RCP), compreendendo tal método os passos seguintes: (a) preparar uma mistura de RCP que contenha a referida amostra, um par de iniciadores oligonucleotídicos, uma polimerase de ácidos nucleicos que tenha actividade de nuclease de 5’ para 3’ e uma sonda oligonucleotídica capaz de hibridar com uma região do ácido nucleico visado ligado pelos iniciadores oligonucleotídicos, em que a sonda é marcada com um marcador emissor de luz e em que o composto de ligação do ADN é capaz de modificar a emissão de luz o marcador; (b) medir a emissão de luz do marcador na mistura de reacção na presença de um composto de ligação do ADN; >i > (c) tratar a mistura de RCP em condições para RCP, em que a actividade de nuclease de 5’ para 3’ existente na polimerase de ácidos nucleicos cliva as sondas hibridadas com a sequência relevante; (d) medir a emissão de luz do marcador na presença de um composto de ligação do ADN; (e) determinar se a sequência relevante se encontra presente, recorrendo para isso à diferença nas emissões de luz entre o passo (b) e o passo (d).

[0020] A figura 1 ilustra a dependência que há entre a extinção e o comprimento do oligonucleólido marcado e entre o marcador emissor de luz e a concentração do composto de ligação do ADN, conforme descrito no exemplo 1.

[0021] A figura 2 ilustra a dependência existente entre a extinção e o peso molecular e concentração da polietilenimina (PEI) utilizada, conforme descrito no exemplo 2.

[0022] A figura 3 ilustra a quantificação de ácidos nucleicos por amplificação de uma sequência relevante de ácidos nucleicos na presença de um padrão interno de controlo da qualidade, conforme descrito no exemplo 3.

[0023] Para ajudar a compreender a invenção, apresenta-se a seguir a definição de vários termos.

[0024] Os termos “ácido nucleico” e “oligonucleótido” referem-se a sondas e a fragmentos de oligómeros que se pretende detectar e subentende-se que são genéricos para os polidesoximbo-nucleótidos (contendo 2-desoxi-D-ribose), para os polinibonucleótidos (contendo D-ribose) e para qualquer outro tipo de polinucleótido que seja um N-glicósido de uma base de purina ou pirimidina, ou de uma base modificada de purina ou pirimidina. Não há nenhuma distinção explícita, no que diz respeito ao comprimento, entre os termos “ácido nucleico” e “oligonucleótido”, podendo estes termos ser trocados livremente entre si. Estes termos referem-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim sendo, estes termos designam ADN de cadeia singular e de cadeia dupla e designam também AKN de cadeia singular e de cadeia dupla.

[0025] Os termos “região visada”, “sequência visada” e “sequência visada de ácidos nucleicos” designam uma região de um ácido nucleico que se pretende detectar.

[0026] O termo “sonda” designa um oligonucleótido, tipicamente marcado, que forma tuna estrutura dúplice com uma sequência de um ácido nucleico visado, devido ao empare-

lhamento de bases complementares. An sonda irá compreender uma “região hibridante”, constituída preferencialmente por 10 a 50 nucleótidos e mais preferencialmente por 20 a 30 nucleótidos, correspondente a uma região da sequência relevante. O termo “correspondente” significa idêntico ao ácido nucleico designado ou complementar desse ácido nucleico. Na presente invenção, os oligonucleótidos da sonda são marcados com um marcador fluorescente, isto é, são ligados a esse marcador, para permitir a detecção.

[0027] O termo “hibridação” designa a formação de uma estrutura dúplice por meio de dois ácidos nucleicos de cadeia angular, devido ao emparelhamento de bases complementares. A hibridação pode ocorrer entre cadeias e ácidos nucleicos perfeitamente complementares ou entre cadeias de ácidos nucleicos que contenham regiões menores em que haja desempare-Ihamento. As condições em que apenas as cadeias de ácidos nucleicos perfeitamente complementares vão hibridar são designadas por “condições de hibridação rigorosas”. Dois ácidos nucleicos de cadeia singular que sejam complementares, excepto em regiões menores em que haja desemparelhamento, recebem a designação de “praticamente complementares”. As hélices duplas estáveis de sequências praticamente complementares podem ser obtidas em condições de hibridação menos rigorosas. Os especialistas no domínio da tecnologia dos ácidos nucleicos sabem como determinar empiricamente a estabilidade de hélices duplas, tomando' em consideração diversas variáveis, entre as quais se salienta, por exemplo, o comprimento e a concentração dos pares de bases dos oligonucleótidos, a força iónica e a incidência de pares de bases desemparelhados [0028] Os termos “oligonucleótido específico da sequência” e “OES” designam sondas ohgonucleotídicas em que a região hibridante é exactamente complementar da sequência que se pretende detectar. A utilização de condições de hibridação rigorosas, em que a sonda irá hibridar apenas com essa sequência destmatária exactamente complementar, permite a detecção da sequência visada específica. As condições de hibridação rigorosas são perfeitamente conhecidas na especialidade; ver, v.g., Sambrook et al., 1985, ‘Molecular Cloning - A Laboratoiy Manual’, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. As condições rigorosas dependem da sequência e irão ser diferentes consoante as circunstâncias. De um modo geral, a selecção de condições rigorosas leva-nos a temperaturas cerca de 5°C abaixo do ponto térmico de fusão (Tf) para a sequência específica e para valores definidos de força iónica e pH. O valor Tf é a temperatura (nas condições definidas de força iónica e pH) a que ocorre a dissociação de 50% dos pares de bases. O abrandamento do rigor das condições de hibridação vai permitir que sejam tolerados desemparelhamentos na sequência; o grau de desemparelhamento tolerável pode ser regulado pelo ajustamento adequado das condições de hibridação.

[0029] O termo “subsequência” aqui utilizado designa uma sequência de nucleótidos contida noutra sequência.

[0030] O teimo “marcador*tal como aqui utilizado, designa qualquer átomo ou molécula que possa ser acoplado a um ácido nucleico e que possa ser utilizado quer para gerar um sinal detectável quer para interactuar com um segundo marcador para modificar o sinal detectável gerado pelo segundo marcador. Os marcadores preferidos são os compostos emissores de luz que geram um sinal detectável por fluorescência, quimioluminescência ou bioluminescência.

[0031] O termo “fluoróforo” designa um composto que é capaz de emitir fluorescência, isto é, absorver luz a uma determinada frequência e emitir luz noutra frequência, geralmente mais baixa.

[0032] O termo “bioluminescência” diz respeito a uma forma de quimioluminescência em que o composto emissor de luz é do tipo existente em organismos vivos. Como exemplos de compostos bioluminescentes refere-se a luciferase bacteriana e a luciferase dos pirilampos.

[0093] O teimo “extinção” refere-se a uma diminuição da fluorescência de um primeiro composto, provocada por um segundo composto, independente do mecanismo em causa. Tipicamente, a extinção exige que os compostos referidos estejam numa vizinhança próxima entre sL De acordo com a presente memória descritiva, diz-se que o composto ou a fluorescência do composto são extintos e subentende-se que qualquer destes conceitos diz respeito ao mesmo fenómeno.

[0034] O termo “mistura de reacção” designa uma solução que contém os reagentes necessários para levar a cabo uma dada reacção. Uma “mistura de reacção de amplificação”, que designa uma solução que contém os reagentes necessários para que ocorra uma reacção de amplificação, contém tipicamente os iniciadores oligonucleotídicos e uma polimerase de ADN num tampão adequado. As misturas de reacção para reacções específicas estão perfeitamente descritas na literatura.

[0035] Os métodos da invenção são aplicáveis à detecção da síntese ou da clivagem de oligonucleótidos. A detecção do oligonucleótido clivado tem lugar numa solução que contém um composto de ligação do ADN que pode interactuar com o marcador para fazer diminuir a emissão de luz do marcador. A modificação do comprimento do oligonucleótido marcado, pela síntese ou pela clivagem, tem como consequência uma modificação detectável na emissão de luz do marcador acoplado. Descreve-se adiante os marcadores emissores de luz adequados e os compostos convenientes de ligação do ADN que podem interactuar para modificar a emissão dc luz do marcador.

[0036] Nos métodos exemplificados da presente invenção detecta-se a emissão de um marcador fluorescente ligado ao oligonucleótido de cadeia singular. Um composto de ligação do ADN extingue a fluorescência do marcador segundo um grau que depende do comprimento 7ί4 do oligonucleótido acoplado. Tanto a ocorrência da extinção de um marcador fluorescente ligado â um oligonucleótido de cadeia singular, que tem lugar em solução por acção de um composto de ligação do ADN, como a dependência da extinção em relação ao comprimento do oligonucleótido são propriedades inesperadas à luz da técnica anterior.

[0037] De acordo com uma variante preferencial, o agente de ligação do ADN é poli-etilenimina (PEI), termo este que designa uma classe de polímeros ramificados ou não ramificados de etilenimina de diversos pesos moleculares. Os derivados de PEI, tais como PEI hidroxietilãda, podem ser adequados nos métodos da presente invenção. Entre outros compostos, que demonstraram já que podem ser úteis nos métodos da presente invenção refere-se a espermina e a espermidina.

[0038] As PEI ramificadas encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais e podem ser adquiridas a ‘Polyscience, Inc.’ (Wanington, PA) com pesos moleculares, conforme estimado pela sua viscosidade, variando desde 600 até valores da ordem de 60 000 - 80 000. Foram já testadas PEI com os pesos moleculares de 600,1200,1800,10 000 e 60 000 - 80 000 e comprovou-se que funcionam nos métodos da presente invenção, permitindo diferenciar entre oligonucleótidos marcados com fluoróforos e cujos comprimentos estejam compreendidos entre 2 e 33. Um especialista na matéria sabe como determinar empiricamente qual o támariho da PEI que é mais conveniente para uma dada aplicação.

[0039] As concentrações adequadas do composto de ligação do ADN são determinadas empiricamente De uma forma típica, a concentração óptima do composto de ligação do ADN é afectada pelo tipo de marcador emissor de luz utilizado e pela concentração dos reagentes da reacção. Em particular, verificou-se que a concentração salina afecta a concentração óptima das PEI. Em algumas reacções, a adição de um agente quelador (por exemplo, EDTA na concentração de cerca de 1,5 mM) à mistura de reacção leva a um alargamento do domínio de valores das PEI acima do qual a janela utilizável está próxima do valor máximo. A optimização rotineira da concentração do composto de ligação do ADN, que permite obter a diferença máxima entre as fluorescências dos oligonucleótidos marcados comprido e curto, pode ser feita essencialmente conforme descrito nos exemplos 1 e 2 subsequentes.

[0040] Há muitos compostos emissores de luz, descritos na especialidade, que são adequados para serem utilizados como marcadores de oligonucleótidos nos métodos da presente invenção. De uma forma ideal, um fluoróforo deve ter um desvio de Stokes elevado (isto é, uma diferença grande entre o comprimento de onda para a absorção máxima e o comprimento de onda para a emissão máxima) para minimizar a interferência pela luz dispersada pela excitação. Os compostos adequados, perfeitamente conhecidos na especialidade, compreendem entre outros, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a fluorcsceína e seus derivados, tais como a carboxifluoresceína (FAM), hexaclorofluoresceína (HEX), tetraclorofluoresceína (ΊΈΤ) e diclorodimetilfluoresceína (JOE); a rodamina e seus derivados, tais como vermelho-do-texas (‘Texas Red’), rodamina (ROX) e tetrametilrodamina (TAMRA); amarelo-de-lúcifer e derivados de coumarina, tais como 7-Me2N-coumarina-4-acetato, 7-OH-4-CH3-coumarina-3-acetato e 7-NH2-4-CH3-coumarina-3-acetato (AMGA).-Os produtos FAM, HEX, TET, JOE, ROX e TAMRA são comercializados por “Perkin Elmer, Applied Biosystems Divison” (Foster City, CA). O composto vermelho-do-texas (‘Texas Red’) e muitos outros compostos adequados são comercializados por “Molecular Probes” (Eugene, OR). Como exemplos de compostos quimioluminescentes e bioluminescentes, que podem ser convenientes para utilização como dadores de energia, indica-se o luminol (aminoftal-hidrazida) e seus derivados e ainda [0041] É possível preparar um oligonucleótido por meio de qualquer método conveniente, incluindo, por exemplo, a elonagem c o isolamento de sequências apropriadas utilizando enzimas de restrição e a síntese química diiecta por meio de um método tal como o método do fosfotriéster descrito por Narang et d, 1979, Melh. Enzymol. 68:90-99; o método do fosfodiéster descrito por Brown et d., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; o método da dietilfosforamidite descrito por Beaucage et d., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; e o método em suporte sólido descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 458 066. Os métodos para a síntese de oligonucleótidos marcados encontram-se descritos nas obras de Agrawal e Zamecnik, 1990, Nucl. Add. Res. 18(18):5419-5423; MacMillan e Verdine, 1990, J. Org. Chem. 55:5931--5933; Pieles et d., 1989, Nucl. Acid. Res. 17(22):8967-8978; Roget et d., 1989, Nucl. Acid. Res. 17(19):7643-7651; e Tesler et d., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:6966-6976. Na obra de Goodchild de 1990 ‘Bioconjugate Chemistry’ 1(3):165-187, está descrito um estudo exaustivo dos métodos de síntese.

[0042] Os métodos da presente invenção são particularmente adequados para a detecção de ácidos nucleicos amplificados, quer se trate de ADN ou de ARN. Os métodos de amplificação adequados, para além do método de RCP (patentes de invenção norte-americanas tF 4 683 195, 4 683 202 e 4 965 188) são, mas sem que isso constitua qualquer'limitação, os seguintes: reacção em cadeia com ligase (‘LCR’, Wu e Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 e Barany, 1991, ‘Proc. Natl. Acad. Sd. USA 88:189.193); reacção em cadeia com a ligase polimerase (Barany, 1991, ‘PCR Methods and Applic’ 2:5-16); ‘Gap-LCR’ (publicação da patente de invenção WO 90/01069); reacção de reparação em cadeia (publicação da patente de invenção europeia n° 439 182), ‘3SR’ (Kwoh et d., 1989, ‘Proc. Natl. Acad. Sd. USA’ 86:1173-1177; Guatelli et d., 1990, ‘Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874-1878; publicação da patente de invenção WO 92/08800) e ‘NASBA’ (patente de invenção norte-americana n° 5 130 238). A presente invenção não está limitada a nenhum sistema particular de amplificação. A medida que forem sendo desenvolvido outros sistemas, poderão beneficiar com a prática da presente invenção. Foi publicado um estudo recente, respeitante a sistemas de amplificação, por Abramson e Myers, 1993, ‘Current Opinion in Biotechnology’ 4:41-47.

[0043] Uma variante preferida da invenção proporciona aperfeiçoamentos para o processo descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 210 015, supra, e por Holland et cã., 1991, ‘Proc. Natl. Acad. Sei. USA’ 88:7276-7280. O processo recorre à actividade de exonuclease de 5’ para 3’ de uma polimerase de ADN tennostável para clivar sondas oligo-nucleotídicas marcadas e recombinadas, obtidas por hibridação de hélices duplas e libertação dos fragmentos marcados para detecção. A clivagem das sondas marcadas da presente invenção, pela actividade da exonuclease de 5’ para 3’ existente na polimerase de ADN, liberta os marcadores na mistura de reacção. A extinção do sinal em solução, por acção do composto de ligação do ADN, quando o fluoróforo fica ligado à sonda oligonucleotídica não clivada de comprimento completo, é significativamente maior do que no caso em que a ligação é feita ao fragmento clivado e encurtado. O aumento resultante para a fluorescência observada indica que houve uma clivagem da sonda, o que necessariamente indica simultaneamente a presença de sequências visadas e a ocorrência de hibridação entre a sonda/alvo visado.

[0044] Em geral, o ácido nucleico existente na amostra irá ser uma sequência de ADN, mais vulgarmente irá ser ADN genómico. No entanto, a presente invenção também pode ser praticada com outros ácidos nucleicos, tais como ARN mensageiro, ARN ribossómico, ARN virai ou ADN clonado. As amostras de ácidos nucleicos adequados compreendem ADN ou ARN de cadeia singular ou de cadeia dupla para utilização na presente invenção. Os especialistas na matéria inferem facilmente, consoante a reacção que venha a ser utilizada para clivar as sondas oligonudcotídicas marcadas, qualquer que seja a natureza do ácido nucleico, que o ácido nucleico pode ser detectado simplesmente introduzindo no método que venha a ser utilizado modificações convenientes e perfeitamente conhecidas.

[0045] A preparação das amostras irá variar consoante a fonte da amostra, o alvo visado que se pretenda detectar e ainda a reacção de degradação dos oligonucleótidos que venha a ser utilizada na experiência. Para cada ensaio é necessária uma amostra relevante num tampão que seja compatível com os reagentes do ensaio. Se o alvo visado for amplificado antes ou simultaneamente com a detecção da clivagem da sonda, o ácido nucleico em causa deve estar num tampão compatível com as enzimas utilizadas para amplificar o alvo visado. O ácido nucleico visado pode ser isolado a partir de diversos materiais biológicos, incluindo tecidos, fluídos corporais, fezes, expectoração, saliva, células vegetais, culturas bacterianas e outras que tais.

[0046] Os métodos convenientes para a preparação de amostras para cada ensaio estão descritos na especialidade. Ver, por exemplo, Samhrook et al., supra. Há métodos simples e rápidos para a preparação de amostras para a amplificação das sequências visadas, por RCP, que foram descritos por Higuchi, 1989, rià obra ‘PCR Techonology’ (Erlich ed., Stockton Press, Nova Iorque) e na obra ‘PCR Protocols’, capítulos 18-20 (Trinis et al., ed., Academic Press, 1990). Qualquer especialista na matéria é capaz de escolher e optimizar empiricamente um protocolo conveniente.

[0047] A emissão de luz de um marcador numa solução é medida com um espectro-fluorómetro, tal como um aparelho de modelo 650-40 de “Hitachi/Perkin Elmer” (Perkin Ehner, Norwalk, CT) ou então um espectrofotómetro de luminescência de modelo ‘ΡΉ LS-100’ (Photon Technology International, Londres, Ontário, Canadá). Um espectrofluorómetro, consoante as características do aparelho particular utilizado, proporciona a oportunidade de se poder ajustar os comprimentos de onda de excitação e de emissão e ainda a largura de banda. Qualquer especialista na matéria sabe como determinar os ajustamentos adequados de comprimento de onda e de larguras de banda para a detecção da emissão de luz por um marcador particular. Por exemplo, é possível encontrar orientações gerais sobre esta matéria na publicação ‘The Merck Index’ (eds. Budavari et al., 1989, Merck Co., Inc., Rahway, NJ) e na obra ‘Molecular Probes’, Inc. (Eugene, Oregon) catálogo, 1990 de Haugland. Embora cada marcador tenha um espectro discreto de emissão de luz; há um conjunto bastante amplo de comprimentos de onda de detecção que são adequados para a prática da invenção.

[0048] A modificação que ocorre na emissão de luz, resultante da clivagem da sonda, é medida preferencialmente comparando a emissão de luz medida antes e depois da clivagem da sonda. Em alternativa, a modificação que ocorre na emissão de luz pode ser medida em simultaneidade com a clivagem da sonda, mediante a incorporação do agente de ligação do ADN na mistura de reacção e monitorizando a fluorescência da sonda contínua ou intermitentemente, enquanto a reacção vai decorrendo. Neste caso, e preferível utilizar vasos de reacção que também sejam convenientes para fins de medição das emissões de luz, os quais permitem medições directas da emissão de luz sem que seja necessário abri-los. No entanto, uma vez que há agentes particulares de ligação do ADN que podem inibir reacções particulares de clivagem das sondas, eventualmente pode ser necessário suprimir na mistura de reacção o agente de ligação do ADN. Neste caso, é possível efectuar medições pré-reacção, utilizando uma mistura de reacção em duplicado. De uma forma típica, divide-se a mistura de reacção °Tvtes de se realizar a reacção c utiliza-se uma parte da mistura de íeacção, que não irá ser sujeita às condições de reacção, para as medições de emissão pré-reacção. De uma forma típica, é mais conveniente medir tanto a emissão de luz pré-reacção como a emissão de luz pós-reacção depois de completada a reacção.

[0049] Em métodos preferidos, em que o método de detecção do ácido nucleico é combinado com a amplificação por RCP, conforme descrito supra, a reacção de amplificação é levada a cabo sob a forma de um processo automatizado. Os aparelhos de realização dos ciclos térmicos podem ser fornecidos por ‘Peridn Elmer’ (Norwalk, CT), dispondo tais aparelhos de um bloco térmico capaz de suportar simultaneamente 48 ou 96 tubos de reacção. Em consequência, é possível efectuar simultaneamente até 96 reacções de amplificação.

[0050] Os sistemas ópticos convenientes para a medição da emissão de luz proveniente de todos os tubos numa amplificação por RCP foram descritos por Higushi et al., 1992, supra, Higuchi et al., 1993, supra, e no texto publicado da patente de invenção europeia n° 512 334. Num sistema óptico deste tipo são utilizados múltiplos guias de fibras ópticas para transmitir a luz de excitação da fonte para o tubo de reacção, sendo medida a emissão de luz de cada tubo. Apenas é necessário um único espectrofluorómetro para ler a fluorescência proveniente dos tubos de reacção, uma vez que cada fibra óptica pode ser lida rapidamente, tuna de cada vez. Há um sistema óptico alternativo'èm que se utiliza uma videocâmara para medir simultaneamente a fluorescência de múltiplos vasos de reacção. É evidente para qualquer especialista na matéria que há dispositivos de detecção alternativos que podem ser adaptados aos métodos da presente invenção.

[0051] Há um esquema de detecção alternativo e adequado em que é utilizado um protocolo de microtitulação de 96 cavidades. Este tipo de protocolo é frequentemente preferível nos laboratórios clínicos para a pesquisa de amostras em grande escala, por exemplo, para

análises genéticas, tais como as de despistagem da anemia provocada pelas células falciformes ou do vírus da SIDA, cm procedimentos dc despistagem de bancos de sangue. A presente invenção é adequada para este tipo de análises e elimina a necessidade de execução de inúmeros procedimentos de lavagem e extraeção que são necessários com os procedimentos de ensaio conhecidos de tipo “loculaftais como os protocolos de tipo EISLE ou outros métodos ópticos que se baseiem na densidade; ver, v.g., Kolber etal, 1988, ‘J. fmmun. Meth.’ 108:255-264. Huschtscha et al., 1989, ‘In Vitro Cell and Dev. Biol.’ 25(1); 105-108, e Voller et al., 1979, ‘The Enzyme Linked Immunosorbent Assay’, Dynatech Labs, Alexandria, VA. O método de detecção da presente invenção também permite fazer a medição directa da emissão de luz com um aparelho semelhante ao leitor de placas de EISLE, mas concebido para excitar e medir a fluorescência. Por exemplo, num método deste tipo é possível utilizar o aparelho de modelo ‘CytoFluor™ 2300’ produzido por “Millipore” (Bedford, MA).

[0052] Para um especialista na matéria é evidente que os métodos da presente invenção não ficam limitados a um método particular de detecção, ao aparelho de realização dos ciclos térmicos ou aos dispositivos de medição de sinais, nem ao número de vasos de reacção.

[0053] Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para detectar simultaneamente várias sequências relevantes. As sondas específicas para cadà alvo visado estão presentes na mistura de reacção. Para cada ácido nucleico visado existente na amostra, a sonda correspondente irá hibridar e irá ser clivada. Para se detectar separadamente as sondas clivadas, marca-sc cada cspccic de sonda com um marcador que emita luz com um comprimento de onda detectavelmente distinto. Cada espécie de sonda é depois detectada separadamente por selecção adequada do comprimento de onda medido.

[0054] Assim sendo, os métodos da presente invenção são úteis para a detecção dos produtos dc amplificação cm métodos de co-amplificação por RCP para efeitos de detecção de vários alvos visados numa amostra. A invenção é particularmente útil para comparações quantitativas de dois alvos relevantes diferentes de ácidos nucleicos na mesma amostra. Os métodos para a quantificação dos ácidos nucleicos estão descritos na patente de invenção norte-americana n° 5 219 727. Os métodos de quantificação descritos são os métodos que se baseiam na RCP èm que é utilizado um padrão interno para se determinar quer a quantidade relativa de um alvo relevante quer a quantidade exacta do alvo relevante existente antes da amplificação.

[0055] Também se pode recorrer à extinção diferencial de oligonucleótidos marcados, curtos e compridos, para se medir a incorporação de nucleótidos num oligonucleótido sintetizado. Por exemplo, os ensaios de actividade de polimerase do ADN permitem medir o ritmo de incorporação de nucleótidos. Para se medir a incorporação de nucleótidos prepara-se uma mistura de reacção que contenha os dNTP marcados, para além dos outros reagentes necessários para a síntese de oligonucleótidos, tais como uma polimerase de ADN num tampão conveniente. Mede-se a fluorescência da mistura de reacção antes da síntese, na presença de um composto de ligação do ADN. Antes dá síntese todos os marcadores èstão ligados a nucleótidos singulares e a extinção é mínima A seguir à síntese mede-se a fluorescência da mistura de reacção na presença do composto de ligação do ADN. Da síntese dos oligonucleótidos resulta uma diminuição da quantidade de nucleótidos marcados. Uma vez que os oligonucleótidos mais compridos recentemente sintetizados são extintos de uma forma mais eficaz pelo composto de ligação do ADN, a incorporação de dNTP nos oligonucleótidos tem como consequência uma redução da fluorescência.

[0056] Os exemplos da presente invenção, adiante descritos, têm por objecto apenas fins ilustrativos c com clcs não sc pretende limitar o âmbito da invenção. Há inúmeras variantes da invenção, consideradas abrangidas no âmbito das reivindicações apresentadas a seguir aos exemplos, que são evidentes para os especialistas na matéria após a leitura do texto antecedente e dos exemplos subsequentes.

Exemplo 1

Extinção dependente do comprimento, pela PEI ···..·;* [0057] Este exemplo descreve a extinção, dependente do comprimento, de oligonu-cleótidos marcados em solução. Os oligonucleótidos de comprimento 33 e de comprimento 2 foram marcados com um fluoróforo (marcador fluorescente) seleccionado entre um conjunto deles, tendo a fluorescência de cada oligonucleótido sido medida numa solução que continha PEI. As medições foram repetidas utilizando soluções que continham diversas concentrações de PEI com o intuito de se determinar a concentração óptima de PEI que permite maximizar a diferença de sinais entre os oligonucleótidos de comprimento 33 e de comprimento 2.

[0058] Efectuou-se a síntese de sondas num sintetizador de ADN de modelo ‘ABI 394’ (Peridn Elmer ABD, Foster City, CA), à escala de 1 pmol. Foram utilizadas amidites de.cada marcador fluorescente durante a síntese dos oligonucleótidos para se obter directamente um oligonucleótido marcado em 5’. As sondas de comprimento 33 foram sintetizadas com um grupo P04 na extremidade 3’ para utilização nos métodos descritos no exemplo 2. A sequência de ácidos nucleicos de cada sonda marcada de comprimento 33 era SK535 (SEQ ID NO:l) 5’-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT. A sequência de ácidos nucleicos das sondas de comprimento 2 era 5’-AG, que corresponde a um produto de degradação das sondas de comprimento 33.

[0059] Os marcadores fluorescentes utilizados estão enumerados a seguir, conjuntamente com os comprimentos de onda dc excitação c de emissão para cada um dos marcadores. Também se indica a largura da fenda do filtro utilizado para a detecção de cada marcador fluorescente, conforme adiante se descreve.

Filtros utilizados para as medições de fluorescência (comprimento de onda e largura indicados em nanómetros) Marcador Excitação máxima Emissão máxima fluoresceána (FAM) 485(20) ^ 530(25) hexaclorofluorescdna (HEX) 530(25) 590(35) diclorodimetilfluoresceína (JOE) 490(40) 580(50) rodamina(ROX) 590(40) 645(40) tetrametilrodamina (TAMRA) 560(20) 620(40) [0060] Para cada uma das sondas adiante enumeradas, acrescentou-se às cavidades das placas de microtitulaçao soluções de ensaio replicadas que continham 1 μΜ de sonda em 50 pL de tampão (Bicine 50 mM, KOAc 100 mM (pH 8,3), Mn(OAc)2 3,6 mM). Preparou-se um conjunto de soluções contendo PEI (peso molecular igual a 1200, da ‘Polyscience Inc.’, Warrington, PA) em concentrações de 0,016%, 0,008%, 0,004%, 0,002% e 0,0001%. Acrescentou-se um volume de 50 pL de água a uma cavidade que foi utilizada como uma contraprova de sinal máximo. A cada uma das cavidades restantes acrescentou-se 50 pL de uma solução de PEI. As medições de fluorescência foram efectuadas com um leitor de placas de microtitulação de modelo ‘Millipore Cytofluor 2300’, utilizando os comprimentos de onda de excitação e de emissão que constam do quadro anterior.

[0061] Os métodos da presente invenção têm por base a diferença que há na extinção dos oligonucleótidos marcados ciirtos c compridos. Calculou-sc uma medida desta diferença na extinção, designada por “janela”, a partir das medições individuais de fluorescência, conforme a seguir se descreve. Em primeiro lugar, mediu-se o nível espontâneo de extinção resultante do tampão por si só e subtraiu-se à medição de fluorescência para cada sonda. Em segundo lugar, calculou-se a fluorescência residual como sendo a razão entre a fluorescência de uma sonda na presença de PEI e a fluorescência da mesma sonda sem PEI e exprimiu-se em termos percentuais em relação à fluorescência não extinta. Finalmente, calculou-se a janela como sendo a diferença entre a fluorescência residual do oligonucleótido de comprimento 2 marcado e a fluorescência residual do oligonucleótido de comprimento 33. A janela é uma medida da mudança no sinal que resultaria da degradação das sondas de comprimento 33 marcadas ao passarem a fragmentos de comprimento 2. Uma concentração de PEI que proporcione a janela máxima gera a maior sensibilidade possível nos métodos de detecção da presente invenção.

[0062] Na figura 1 estão apresentados resultados sobre um gráfico que traduz as janelas obtidas, utilizando os diversos marcadores das sondas, em função da concentração de PEI. As legendas das linhas referem-se aos oligonucleótidos marcados, de acordo com o esquema seguinte: hexx2: oligonucleótidos marcados com HEX, em que o marcador é acoplado à extremidade 5’ dos oligonucleótidos através de um separador; fam2: oligonucleótidos marcados com FAM; hex2: sondas marcadas com HEX, em que o marcador é acoplado directamente à extremidade 5’ dos oligonucleótidos; joe: oligonucleótidos marcados com JOE; rox: oligonucleótidos marcados com ROX; tam: oligonucleótidos marcados com TAMRA.

[0063] Conforme se pode ver na figura 1, foi observada uma janela significativa com cada um dos marcadores para uma certa concentração de PEI. O tamanho da janela obtida dependeu simultaneamente do marcador e da concentração de PEI. Verificou-se que o acoplamento de um marcador HEX ao oligonucleótido através de um separador faz diminuir o tamanho da janela obtida no intervalo testado de concentrações de PEI.

Exemplo 2

O efeito do peso molecular da PEI

[0064] Neste exemplo descreve-se o efeito do peso molecular e da concentração da PEI sobre a extinção de sondas marcadas com o fluoróforo. Foram realizadas experiências essencialmente conforme descrito no exemplo 1, utilizando os oligonucleótidos marcados com FAM, mas utilizando PEI de diversos tamanhos e para um intervalo de concentrações maior do que no exemplo 1.

[0065] As PEI com pesos moleculares iguais a 600, 1200, 1800 e 10 000 quilodaltons foram obtidas em ‘Polysciences Inc.’, Wanington, PA. As medições das emissões foram realizadas em soluções de ensaio que continham um tampão constituído por ‘Bicine’ 50 mM, KOAc 115 mM (pH 8,3) e 8% de gliceiol. Para cada tamanho de PEI, incorporou-se essa PEI nas soluções de ensaio em concentrações compreendidas entre 0,000013% c 0,02% (p/v). Para cada tamanho e concentração da PEI, calculou-se a janela tal como no exemplo 1.

[0066] Os resultados estão apresentados na figura 2. Verificou-se que cada tamanho de PEI era prático nos métodos da presente invenção, embora tivessem sido obtidas diferenças de somenos importância no tamanho das janelas utilizando os diferentes tamanhos de PEI. Para cada tamanho de PEI é possível determinar a concentração óptima de PEI, a partir da figura 2 como sendo a concentração de PEI que permite obter a janela máxima. A experiência anterior exemplifica a optimização rotineira do tamanho e da concentração da PEI que um especialista na matéria poderia eíectuar para cada ensaio de detecção.

Exemplo 3

Quantificação por amplificação por RCP

[0067] Este exemplo descreve a quantificação de um ácido nucleico utilizando os métodos da presente invenção. Neste exemplo amplificou-se um alvo, constituído pelo ARN do vírus da hepatite C (VHC), tendo a amplificação sido efectuada por RCP-TR na presença de sondas marcadas com fluoróforos. A actividade de exonucíease das sondas marcadas e clivadas com polimerase de ADN hibridou com a sequência relevante a jusante de um iniciador de amplificação, libertando assim na mistura de reacção os pequenos fragmentos oligonucleotídicos marcados da sonda A seguir à amplificação acrescentou-se PEI à mistura de reacção e mediu-se a fluorescência das sondas marcadas. A geração de produtos curtos de degradação dos oligo-nucleótidos marcados teve como consequência um aumento da fluorescência medida, uma vez que os produtos de degradação não são extintos pela PEI tanto quanto a sonda de comprimento completo não degradada. Uma vez que a degradação da sonda ocorre concomitantemente com a amplificação do alvo, o aumento de fluorescência indica que houve amplificação da sequência em causa.

[0068] Obteve-se uma estimativa quantitativa do número inicial de cópias da sequência visada, comparando o aumento de fluorescência resultante da amplificação da sequência em 7% causa com o aumento de fluorescência obtido na amplificação de uma segunda sequência de ácido nucleico. Acrescenta-se a segunda sequência de ácido nucleico à mistura de reacção com um número de cópias conhecido, o que proporciona assim um padrão interno de quantificação (PIQ) com o qual se compara a amplificação da amostra desconhecida. A detecção da segunda sequência de ácidos nucleicos é conseguida utilizando um segundo marcador fluorescente que emite uma luz com um comprimento de onda distinto.

Amplificação [0069] Amplificou-se em cada reacção duas sequências de ARN relevantes. As duas sequências de ácidos nucleicos relevantes foram amplificadas simultaneamente utilizando um único par de iniciadores, KY78 e KY80. Neste exemplo, as sequências de ARN relevantes foram geradas a partir de plaanídeos de transcrição. A construção e a utilização de um plasmídeo de transcrição contendo uma sequência de VHC, os iniciadores de amplificação e a amplificação por RCP-TR são matérias que estão descritas na publicação da patente de invenção europeia com o n° 529 493 e na obra de Young et cã., 1993, ‘J. Clin. Microbiol.’ 31(4):882-886. A primeira sequência relevante é constituída por uma região proveniente da região não codificadora de 5’ do VHC. A segunda sequência relevante de ácidos nucleicos, que é utilizada como um PIQ, compreende os mesmos dois locais de ligação do iniciador que flanqueiam uma sequência de ácidos nucleicos que contém um local alternativo de ligação da sonda. Em consequência, as duas sequências relevantes são amplificadas utilizando o mesmo par de iniciadores, mas essas duas sequências relevantes podem ser detectadas de forma independente, recorrendo a diferentes sondas específicas das sequências. A construção e a utilização de um PIQ está descrita na obra de Mulder ei cã., 1994, CJ. Clin. Miciobiology’ 34(2):292-300.

[0070] As amplificações foram realizadas na presença de uma sonda marcada com FAM, especifica para a sequência relevante do VHC, e com uma sonda marcada com HEX, específica para o PIQ. As emissões máximas do FAM e do HEX ocorrem para comprimentos de onda diferentes, o que permite efectuar uma detecção autónoma das sondas, mediante a selecção adequada da frequência medida. As sequências dos ácidos nucleicos das sondas estão representadas com a orientação de 5’ para 3’. As sondas foram sintetizadas com os marcadores na extremidade 5’, conforme descrito supra. Cada sonda foi sintetizada de modo a ter um grupo 3’-P04 em vez de um grupo 3’-OH para bloquear qualquer prolongamento por acção da polimerase de Taq durante a reacção de amplificação. A sequência da sonda marcada com FAM, para a detecção da sequência relevante do VHC, foi descrita por Young et cã., 1993, supra, como sendo KY88. A sequência da sonda marcada com HEX, para a detecção do PIQ, está indicada no exemplo 1 anterior (SEQ DD NO: 1).

[0071] As amplificações foram feitas em 100 pL de misturas de reacção que continham os reagentes seguintes: sequência relevante do VHC (número de cópias conforme descrito infra), 1000 cópias do PIQ, ‘Bicine’ 50 mM, KOAc 100 mM a pH 8,3,

Mn(OAc)23,6mM, 0,4 μΜ de cada iniciador, 1 μΜ de cada sonda, 0,2 mM de cada um dos dUTP, dATP, dGTP e dCTP,

20 unidades de polimerase do ADN de rTth*, 2 unidades de ‘Amperase Uracil-N-Glicosolase’ *, 8% de glicerol.

[0072] As amplificações foram feitas utilizando entre 0 e 107 cópias do alvo relevante de VHC. Para além das misturas de reacção sujeitas às condições de consumação dos ciclos térmicos da RCP, foram produzidas mais duas misturas de reacção que foram guardadas (sem nenhum tratamento de ciclos térmicos) para utilização como contraprovas de medição. As misturas de reacção foram sujeitas aò esquema de amplificação a seguir indicado, tendo para tal sido utilizado um aparelho de execução de ciclos térmicos de modelo ‘GeneAmp 9600’ (Perkin Elmer, Norwalk, CT): 50°C durante 2 minutos, 60°C durante 30 minutos, 95°C durante 1 minuto, 2 ciclos: 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 20 segundos, 46 ciclos: 90°C durante 15 segundos, 60°C durante 20 segundos 72°C durante pelo menos 5 a 10 minutos, até 1 hora. A seguir à amplificação manteve-se as misturas de reacção a 4°C até serem analisadas. ‘ Desenvolvido e produzido por ‘Hoffmann-La Roche’ e comercializado por ‘Perkin Elmer’, Norwalk, CT. 30

Análise [0073] Acrescentou-se 50 pL dc uma solução com 0,004% de PEI (peso molecular igual a 1200), contendo EDTA 0,8 mH a 50 pL de cada uma das misturas de reacção a seguir à amplificação e também a uma das duas misturas de reacção utilizadas como contraprovas, que não foram submetidas às condições de amplificação. Mediu-se a fluorescência das sondas marcadas com FAM à temperatura ambiente, utilizando um filtro de excitação de 485 nm (com uma largura de banda passante de 20 nm) e um filtro de emissão de 530 nm (largura da banda passante de 25 nm). Mediu-se a fluorescência das sondas marcadas com HEX à temperatura ambiente, utilizando um filtro de excitação de 530 nm (com uma largura de banda passante de 25 nm) e um filtro de emissão de 590 nm (largura da banda passante de 35 nm). [007] A fluorescência medida para cada marcador da sonda foi corrigida subtraindo a fluorescência de uma mistura de reacção sem sonda, não sujeita aos ciclos, tendo sido medidas as duas fluorescências para um comprimento de onda adequado ao marcador. Os resultados estão apresentados na figura 3 que traduz a evolução do logaritmo (log) do quociente entre fluorescências (VHC/PIQ) em função do logaritmo do número de cópias do alvo relevante de VHC. Gerou-se uma “curva padrão” fazendo o ajustamento linear dos dados aos mínimos quadrados.

[0075] A curva padrão gerada a partir da experiência anterior permite quantificar as amostras desconhecidas de VHC. Para a quantificação de uma amostra desconhecida de VHC, amplifica-se o ácido nucleico do VHC com uma quantidade desconhecida de PIQ, conforme descrito antes. Calcula-se o logaritmo do quociente das modificações medidas na fluorescência e determina-se o número de cópias correspondentes de VHC a partir da equação da curva padrão.

Lisboa, 15 de Novembro de 2001 O Agaete Oficial da Pvojofiedaa^ inausmai

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.l.

Rua do Salitre, í95, r'c-Prt. 1269-063

Claims (3)

1. Reivindicações Método para detectar uma modificação no comprimento de um oligonucleótido marcado com um marcador emissor de luz, o qual compreende os passo seguintes: (a) levar a cabo uma reacção numa mistura de reacção em condições das quais resulte uma modificação do comprimento do referido oligonucleótido; (b) medir a emissão de luz do referido marcador na referida mistura de reacção na presença de um composto de ligação do ADN que seja capaz de interactuar com o referido marcador para modificar a emissão de luz desse marcador, em que a interacção depende do comprimento do referido oligonucleótido; e (c) detectar a modificação no comprimento do referido oligonucleótido pela emissão da luz medida no passo (b), em que o referido composto de ligação do ADN é seleccionado entre o conjunto constituído por polietilenimina, seus derivados, espermina e espermidina. Método da reivindicação 1 para a detecção de um ácido nucleico relevante numa amostra, o qual compreende os passos seguintes: ς (al) preparar uma mistura de reacção para que tenha ligar uma reacção, em que a referida mistura de reacção contém a referida amostra e um oligonucleótido de cadeia singular marcado com um marcador emissor de luz, em que o referido oligonucleótido contém uma sequência que é capaz de hibridar com o referido ácido nucleico relevante e em que a referida reacção catalisa a clivagem do referido oligonucleótido apenas se esse oligonucleótido estiver hibridado com o referido ácido nucleico relevante;

   (a2) tratar a referida mistura em condições nas quais o referido oligonucleótido hibride com a referida sequência relevante e seja clivado; (b) medir a emissão de luz do referido marcador na referida mistura de reacção na presença de um composto de ligação de ADN que seja capaz de modificar a emissão de luz desse marcador, em que a interacção depende do comprimento do referido oligonucleótido; e (c) determinar se a sequência relevante está presente, recorrendo para isso à emissão de luz medida no passo (b). - Método da reivindicação 2, em que a referida sequência relevante é amplificada antes do passo (b). Método da reivindicação 3, o qual compreende os passos seguintes: (al) preparar uma mistura de reacção em cadeia com polimerase (RCP) que contenha a referida amostra, um par de iniciadores oligonucleotídicos, uma polimerase de ácidos nucleicos que tenha actividade de nuclease de 5’ para 3’ e um oligonucleótido capaz de hibridar com uma região do referido ácido nucleico relevante, em que esse oligonucleótido híbrida com a referida sequência de ácido nucleico relevante ligada aos referidos iniciadores oligonucleotídicos e em que a referida sonda oligonucleotídica é marcada com um marcador emissor de luz; (a2) tratar a mistura de RCP em condições próprias para RCP, em que a actividade da nuclease de 5’ para 3’ existente na polimerase de ácidos nucleicos cliva o oligonucleótido hibridado com a sequência relevante; 3 (b) medir a emissão de luz do referido marcador nessa mistura de reacção na presença de um composto de ligação do ADN que seja capaz de modificar a emissão de luz desse marcador, em que a interacção depende do comprimento do referido oligo-nucleótido; e (c) determinar se a sequência relevante se encontra presente, recorrendo para isso à emissão de luz medida no passo (b).
2. 5. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o referido composto de ligação do ADN é a polietilenimina ou um seu derivado.
3. 6. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o referido marcador é seleccxonado entre o conjunto constituído por fluoresceína, rodamina e seus derivados. Lisboa, 15 de Novembro de 2001 O Age* ·--·-

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