JP3795557B2 - 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法 - Google Patents

発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JP3795557B2
JP3795557B2 JP21902695A JP21902695A JP3795557B2 JP 3795557 B2 JP3795557 B2 JP 3795557B2 JP 21902695 A JP21902695 A JP 21902695A JP 21902695 A JP21902695 A JP 21902695A JP 3795557 B2 JP3795557 B2 JP 3795557B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
oligonucleotide
label
probe
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP21902695A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0870876A (ja
Inventor
エレン フィッシャー メアリー
マルコルム ワトソン ロバート
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPH0870876A publication Critical patent/JPH0870876A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3795557B2 publication Critical patent/JP3795557B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823Release of bound markers

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNA結合化合物を使って溶液中の発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの発光を制御する方法に関する。更に、本発明は、溶液中の発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドの分解を検出する方法に関する。また、本発明は、相補的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより核酸配列を検出する方法にも関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
オリゴヌクレオチドプローブを使った核酸検出は特異的標的検出のための標準法になりつつある。この方法の無数の変形が記載されている。一般的には、DNA試料を固体支持体上に固定化し、次いで標識された標的特異的プローブにハイブリダイズさせる(例えば、Falkow他、米国特許第4,358,535 号)。
【0003】
プローブ−標的ハイブリダイゼーション二重型の形成後にオリゴヌクレオチドプローブの選択的開裂を含む幾つかの核酸検出方法が記載されている。開裂されたプローブの検出はハイブリダイゼーションの発生を示し、よって標的配列の存在を示す。例えば、Saiki 他, 1985, Biotechnology 3:1008-1012 は、標的特異的プローブのハイブリダイゼーションが制限部位を生成させ、次いで対応する制限酵素により該制限部位が開裂されるという「オリゴマー制限」検出方法を記載している。
【0004】
特許公報WO 89/09284 号は、RNAプローブを使ってDNA標的配列を検出する方法を記載している。DNA標的にハイブリダイズしたRNAプローブは、RNA−DNAハイブリッド二重型の中のRNAを選択的に開裂させるRNアーゼHを使って開裂される。米国特許第5,210,015 号は、核酸ポリメラーゼの5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を使って標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂させ、それによって検出用の標識オリゴヌクレオチド断片を遊離させる方法を記載している。これらの方法は、ポリメラーゼ媒介伸長反応用のプライマーとして作用するためにプローブハイブリダイゼーション部位の上流にハイブリダイズする追加のオリゴヌクレオチドを必要とする。
【0005】
核酸を増幅させる方法であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の発明は、感度と特異性が大きく増大された核酸検出を可能にした。PCRを使って、単一コピーゲノムDNAのセグメントを、検出前に容易に検出可能なレベルにまで選択的に増幅させることができる。PCR法は米国特許第4,683,202 号に開示されている。PCRおよび増幅された標的核酸とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを使ったPCR生成物の検出方法は、米国特許第4,683,195 号および欧州特許公報第237,362 号に記載されている。
【0006】
上述した未増幅の核酸を検出する方法と同様、プローブ−標的ハイブリダイゼーション二重型の形成後のハイブリダイゼーションプローブの選択的開裂を含む増幅生成物の検出方法も記載されている。Saiki 他, 1985, Science 230: 1350-1353は、増幅生成物の検出への「オリゴマー制限」の応用を記載している。米国特許第5,210,015 号も、標的配列にハイブリダイズした標識プローブを開裂させるのに核酸ポリメラーゼの5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を使ったPCR増幅生成物の分析を記載している(Holland 他, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280も参照のこと)。
【0007】
増幅反応混合物中に、増幅プライマーにより結合された標的核酸の領域にハイブリダイズするプローブが含まれる。ハイブリダイズしたプローブは、プライマー伸長中にポリメラーゼの5′→3′ヌクレアーゼ活性により開裂される。標識された断片の検出はプライマー伸長とプローブハイブリダイゼーションの両方の発生を示し、従って特定の標的配列の増幅を示す。
【0008】
標的核酸の検出を容易にする目的で、プローブまたは標的のいずれかの核酸を標識するための多数の剤が記載されている。蛍光、放射能、比色、X線回析または吸光、磁性および酵素活性により検出可能なシグナルを提供する標識が記載されており、そのような標識としては、例えば、蛍光団、発色団、放射性同位体(特に32Pと 125I)、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合相手を有するリガンドが挙げられる。標識は、多数の手段、例えば標識を組み込むためのプライマーもしくはプローブの化学的修飾、または伸長生成物中に変更ヌクレオシド三リン酸を組み込むための重合剤の使用によって達成することができる。
【0009】
様々な蛍光性DNA結合化合物が知られている。それらとしては、積み重ねられた核酸塩基に非共有結合的に結合しそして結果として異なる波長へのシフトまたは増大のいずれかの蛍光変化をもたらす挿入剤が挙げられる。米国特許第4,582,789 号は、ソラレンを含む幾つかの挿入成分を記載している。臭化エチジウム(EtBr)は、遊離溶液中に存在する時よりも二本鎖DNAに結合した時の方が増大した蛍光を示す挿入化合物である(Sharp 他, 1973, Biochemistry 12:3055 )。
【0010】
EtBrは一本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を検出するのに用いることができるけれども、一本鎖核酸に対するEtBrの親和性は比較的低い。EtBrはゲル電気泳動後に核酸を非特異的に検出するのに常用されている。適当なゲル母材、例えばアガロースまたはアクリルアミド上でのサイズ分画後、EtBrの希薄溶液中にゲルを浸漬させる。次いでUV光下でゲルを検査することにより、DNAが可視化される(Maniatis他、1982編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory を参照のこと)。
【0011】
二本鎖DNAに結合した時にEtBrまたは他のDNA結合標識が示す蛍光の増加に基づいたPCRおよび同時PCR生成物検出のための均一アッセイは、Higuchi 他, 1992, Bio/Techniques 10:413-417 ; Higuchi他, 1993, Bio/Techniques 11:1026-1030 ;並びに欧州特許公報第487,218 号および512,334 号中に記載されている。この方法は、最も有意には増幅された標的の増加から、増幅反応中の二本鎖DNAの増加の直接検出を可能にする。しかしながら、それらの方法は反応液中の二本鎖DNAの全量のみを検出し、特定の核酸配列を識別しない。アッセイの特異性は増幅反応の特異性に依存する。
【0012】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける相互作用性蛍光標識で標識されたオリゴヌクレオチドの使用は、Morrison, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Kricka編, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 第13章;HellerおよびMorrison, 1985, Rapid Detection and Identification of Infections Agents, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 第245-256 頁中に記載されている。この方法は、蛍光エネルギー転移(FET)、蛍光共鳴エネルギー転移、非放射性エネルギー転移、長域エネルギー転移、双極子共役エネルギー転移、またはフェルスターエネルギー転移として文献中に記載されている、適当な蛍光標識が極めて接近した時に起こる蛍光の変化に頼っている。多数の適当な蛍光標識が当業界において公知であり、そして例えばMolecular Probes社(Eugene, OR)から市販されている。
【0013】
Morrison, 1992, 前掲は、一緒に合わせられるかまたはプローブハイブリダイゼーションまで分けられる別個のオリゴヌクレオチドに挿入性蛍光標識を結合させるFET型アッセイ形式を記載している。2つのプローブを必要とするそれらのアッセイ方式は、プローブ−プローブハイブリダイゼーションがプローブ−標的ハイブリダイゼーションと競合するかどうかによって、非競合または競合アッセイとして記載されている。別のアッセイ形式では、第一の蛍光標識をハイブリダイゼーションプローブに結合させ、そして第二の蛍光標識を二本鎖ハイブリダイゼーション二重型中に挿入することによってごく接近した状態にする。溶液中の挿入標識とハイブリダイズしてないプローブとの間には有意な相互作用は全く起こらない。挿入標識はどんな二本鎖核酸中にも挿入することができるので、この形式は一本鎖標的核酸の検出にのみ実用的である。
【0014】
上述の米国特許第5,210,015 号に記載された核酸検出方法の一態様では、ごく近位において挿入性蛍光標識で標識されているプローブを使用する。増幅中のプローブ分解が標識を分離させ、それによって検出可能な蛍光変化をもたらすように、1または複数のヌクレオチドにより隔てられたプローブに複数の標識が取り付けられる。そのような多重標識プローブは合成が困難であり費用がかかる。
【0015】
当業者の技術の範囲内である分子生物学および核酸化学の従来技術は、文献中に十分に説明されており、例えば、Sambrook他, 1985, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. HamesおよびS.J. Higgins編, 1984) ; 並びにMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)のシリーズを参照のこと。
【0016】
【課題を解決するための手段】
本発明は、標識と相互作用して該標識の発光を変化させることができるDNA結合化合物を使って、溶液中の発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの発光を制御する方法を提供する。
本発明は、溶液中のオリゴヌクレオチドの分解を検出する方法も提供する。オリゴヌクレオチドは発光性標識で標識される。標識と相互作用して該標識の発光を変化させることができるDNA結合化合物の存在下でオリゴヌクレオチド開裂が行われる。生成する標識の発光の変化を測定することにより、オリゴヌクレオチド分解が検出される。
【0017】
本発明は、オリゴヌクレオチドに結合した発光性標識のDNA結合化合物による有意な溶液中消光が起こる条件を提供する。この消光は、相補的配列への標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使わずに起こる。本発明の方法は、標識オリゴヌクレオチドの長さに対するこの消光の依存性を利用する。短鎖オリゴヌクレオチド(約6ヌクレオチド以下)に結合した発光性標識の消光は、長鎖オリゴヌクレオチドに結合した発光性標識の消光よりも検出可能な位少ない。
【0018】
一本鎖オリゴヌクレオチドに結合した発光性標識のDNA結合化合物による溶液中消光の発生と、オリゴヌクレオチドの長さに対する依存性は、共に従来技術から見れば驚くべきことである。プローブに結合した蛍光標識の挿入化合物による消光に基づいた従来のアッセイ(Morrison, 1992, 前掲を参照のこと)は、消光剤と標識を極めて近位状態にする二本鎖ハイブリダイゼーション二重型中への消光剤の挿入を頼みにしている。従来技術は、ハイブリダイズしていない一本鎖プローブに結合した標識の溶液中消光は無視できると教示している。
【0019】
蛍光エネルギー転移による消光は、挿入標識が極めて近位にあり、且つ溶液中の2つの分子が有意な消光を引き起こすのに十分な位近位には維持されないことを必要とする。更に、従来技術に記載された挿入性消光剤は一本鎖DNAには有意に結合しないので、従って溶液中の一本鎖DNAに結合した標識の感知できるほどの消光は予想されなかった。対照的に、本発明は、溶液中で生じるDNA結合化合物による一本鎖核酸に結合した蛍光標識の消光に基づいている。
【0020】
本発明は更に、オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションにより試料中の標的核酸を検出する改良方法を提供する。この方法は、標的核酸にハイブリダイズしたプローブの選択的開裂を当てにしている。本発明の方法を使った開裂プローブの検出は標的核酸の存在を示す。
【0021】
よって、本発明は、試料中の標的核酸を検出する方法であって、
(a) 前記試料、DNA結合化合物および発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る反応混合物を用意し、ここで前記プローブは前記標的核酸にハイブリダイズすることができる配列を含み、そして前記DNA結合化合物は前記標識の発光を変化させることができ;
(b) 前記標識の発光を測定し;
(c) 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的配列にハイブリダイズしそして開裂される条件下で前記混合物を処理し;
(d) 前記標識の発光を測定し;そして
(e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配列が存在するかどうかを決定する
ことを含んで成る方法を提供する。
【0022】
標的核酸にハイブリダイズしたプローブの選択的開裂は多数の既知の方法のいずれによっても達成することができる。標的配列にハイブリダイズしたプローブを選択的に開裂させる適当な反応の例は、Saiki 他, 1985, 前掲;特許公報第WO 89/09284 号および米国特許第5,210,015 号において記載されている。
核酸を検出するための本発明の方法は、増幅工程と共同した利用に特に適する。よって、本発明の一態様では、段階(c) の前に標的配列が増幅される。
【0023】
好ましい態様では、本発明は、プライマー伸長とハイブリダイズした標識プローブの開裂の両方に単一の核酸ポリメラーゼを使用する、米国特許第5,210,015 号に記載の均一PCR増幅/PCR生成物検出アッセイの改良を提供する。本発明により提供される改良は、開裂されたプローブと未開裂のプローブを分離するための反応後操作を必要とせずに単一の発光性標識で標識されたプローブの使用を可能にする。
【0024】
よって、本発明は、PCRを使って試料中の標的核酸配列を検出する方法であって、
(a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、5′→3′ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、DNA結合化合物、および前記標的核酸の一領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含んで成るPCR反応混合物を用意し、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオチドプライマーにより結合された前記標的核酸配列中にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブは発光性標識で標識されており、そして前記DNA結合化合物は前記標識の発光を変化させることができ;
(b) 前記標識の発光を測定し;
(c) PCR条件下でPCR反応混合物を処理し、ここで前記核酸ポリメラーゼの5′→3′ヌクレアーゼ活性が前記標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂し;
(d) 前記標識の発光を測定し;そして
(e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配列が存在するかどうかを決定する
ことを含んで成る方法を提供する。
【0025】
均一PCR増幅/検出アッセイの別の態様によれば、反応混合物中に提供されるDNA結合化合物は二本鎖DNAに結合すると検出可能なシグナルを提供することを特徴とし、ここで該シグナルは前記化合物が未結合の時に提供される前記シグナルの量よりも大きく、そして増幅工程から生じる二本鎖DNAの全増加量を測定するためにDNA結合化合物のシグナルが監視される。この態様では、DNA結合化合物は未結合プローブの発光の消光剤としておよびHiguchi 他, 1992, 前掲に記載の方法で使用されたようなシグナル生成化合物としての両方で働く。本発明のこの態様では、DNA結合化合物により生じるシグナルの変化が特定の標的配列の増幅を表す。よって、該方法は、追加の試薬を必要とせずに均一アッセイにおける増幅の成功の独自の尺度を提供する。
【0026】
本発明の理解を手助けするために、幾つかの用語を下記に定義する。
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、検出しようとするプローブおよびオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含有する)、およびプリンもしくはピリミジン塩基または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のN−グリコシドである他の型のポリヌクレオチドに対する総称であろう。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」の用語の間に長さの区別をする意図は全くなく、それらの用語は相互に交換可能に用いられるだろう。それらの語は分子の一次構造のみに言及する。よって、それらの用語は二本鎖および一本鎖DNA、並びに二本鎖および一本鎖RNAを包含する。
【0027】
「標的領域」、「標的配列」および「標的核酸配列」なる用語は、検出しようとする核酸の領域を指す。
「プローブ」という用語は、相補的塩基対合によって標的核酸の配列と二重型構造を形成する、典型的には標識されたオリゴヌレオチドを意味する。プローブは、標的配列の一領域に対応する、好ましくは10〜50ヌクレオチド、より好ましくは20〜30ヌクレオチドから成る「ハイブリダイズ領域」を含んで成るだろう。「対応する」とは、指摘する核酸と同一であるかまたは相補的であるという意味である。本発明では、プローブオリゴヌクレオチドは、検出を可能にするために蛍光標識で標識され、即ち蛍光標識に結合される。
【0028】
「ハイブリダイゼーション」なる用語は、相補的塩基対合によって起こる2つの一本鎖核酸による二重型構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間でも小範囲のミスマッチを含む核酸鎖の間でも起こり得る。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするであろう条件は「緊縮ハイブリダイゼーション条件」と呼称される。小範囲のミスマッチを除いて相補的である2つの一本鎖核酸は「実質上相補的」と呼ばれる。実質上相補的な配列の安定な二重型は、低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成することができる。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度並びに不適正塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮して、二重型安定性を決定することができる。
【0029】
「配列特異的オリゴヌクレオチド」および「SSO」なる用語は、ハイブリダイズ領域が検出しようとする配列に正確に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを指す。プローブが正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズするであろう緊縮(stringent)ハイブリダイゼーション条件の使用により、特異的標的配列の検出が可能になる。緊縮ハイブリダイゼーション条件は当業界において周知である(例えば、Sambrook他, 1985, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと)。
【0030】
緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境中では異なるだろう。一般的には、緊縮条件は、限定されたイオン強度とpHにおいて特定配列の融解温度(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、塩基対の50%が解離されている温度(限定されたイオン強度とpHの下で)である。ハイブリダイズ条件の緊縮性を緩めると、配列ミスマッチが許容されるようになるだろう。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当な調整により制御することができる。
【0031】
「部分配列」という用語は、別の配列の中に含まれるヌクレオチド配列を指す。
本明細書中で使用する「標識」という用語は、核酸に取り付けることができ、そして検出可能なシグナルを提供するためかまたは第二の標識と相互作用して第二の標識により提供される検出可能なシグナルを変化させるためのいずれかに使うことができる、任意の原子または分子を指す。好ましい標識は、蛍光、化学発光または生物発光により検出可能なシグナルを生じる発光性化合物である。
【0032】
「発色団」なる用語は、光の形でエネルギーを吸収する非放射性化合物を指す。或る発色団は、化学発光をもたらす化学反応により、または蛍光をもたらす光の吸収により、励起して光を放出することができる。
「蛍光団」なる用語は、蛍光を生じることのできる化合物、即ち、或る周波数で光を吸収しそして別の(通常はより低い)周波数で光を放出する化合物を指す。
「生物発光」なる用語は、発光性化合物が生物体中に見つかるものである化学発光の形を言う。生物発光化合物の例としては細菌のルシフェラーゼおよび蛍のルシフェラーゼが挙げられる。
【0033】
「消光」という用語は、機構にかかわらず、第二の化合物により引き起こされる第一の化合物の蛍光の減少を意味する。消光は典型的にはそれらの化合物が極めて近位にあることを必要とする。本明細書中で使用する時、化合物または化合物の蛍光が消光されると言い、両用法とも同じ現象を指すと解釈される。
「挿入剤」という用語は、核酸二重らせん中の重ねられた塩基対の間に非共有結合的に挿入することができる剤または成分を指す。
【0034】
多段階法に適用される「均一」なる用語は、本明細書中で使用する時、段階と段階の間の試料処理または操作の必要性が最小化されるかまたは排除される、該方法の段階を実施する方法を指す。例えば、「均一」増幅/検出アッセイとは、増幅と検出の間の試料処理と操作の必要性が最小化されるかまたは排除される増幅および検出合同アッセイを言う。
【0035】
「反応混合物」なる用語は、反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を指す。増幅反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を意味する「増幅反応混合物」は、典型的には、適当な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライマーとDNAポリメラーゼを含有する。特定反応のための反応混合物は文献から周知である。
【0036】
本発明は、溶液中の発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの発光を制御する方法を提供する。本発明の方法は、単一の発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドの開裂の検出に適用できる。開裂されたオリゴヌクレオチドの検出は、標識と相互作用して該標識の発光を減少させることのできるDNA結合化合物を含有する溶液中で実施される。開裂からくる標識オリゴヌクレオチドの長さの変化が、取り付けられた標識の発光の検出可能な減少をもたらす。適当な発光性標識および標識と相互作用して該標識の発光を変化させることができるDNA結合化合物を下記に記載する。
【0037】
第二の化合物によって或る化合物の発光を消光させることができる機構は、Morrison, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka編, Academic Press, Inc., San Diego, CA), 第13章の中に記載されている。1つの周知の機構は蛍光エネルギー転移(FET)であり、これは文献中、蛍光共鳴エネルギー転移、非放射性エネルギー転移、長域エネルギー転移、双極子共役エネルギー転移およびフェルスターエネルギー転移とも呼ばれる。FETの主な必要条件は、化合物のうちの1つ(エネルギー供与体)の発光スペクトルが別の化合物(エネルギー受容体)の吸収スペクトルと重複しなければならないということである。
【0038】
Styer およびHaugland, 1967, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:719は、その距離が10オングストローム未満である時、幾つかの一般的発光体−消光剤ペアのエネルギー転移効率が100 %に近づき得ることを示している。エネルギー転移率はエネルギー供与体分子とエネルギー受容体分子の間の距離の6乗に比例して減少する。従って、距離のわずかな増加がエネルギー転移率を大きく減少させ、エネルギー供与体の蛍光の増加を引き起こし、そして消光剤発色団が蛍光団でもある場合、エネルギー受容体の蛍光の減少を引き起こす。
【0039】
本発明の代表的方法では、一本鎖オリゴヌクレオチドに結合した蛍光標識の発光が検出される。DNA結合化合物は、結合したオリゴヌクレオチドの長さに依存する程度に標識の蛍光を消光する。FET消光は周知であるけれども、一本鎖オリゴヌクレオチドに結合した蛍光標識のDNA結合化合物による溶液中消光の発生および該オリゴヌクレオチドの長さに対する消光の依存性は、両方とも従来技術からは予想できない。距離を増加させると蛍光標識の相互作用が非常に急速に減少するため、溶液中の標識は有意に相互作用しないと思われていた。
【0040】
一般的な溶液中の相互作用の欠如は、プローブに結合された蛍光標識の挿入化合物による消光を基にしたアッセイ(Morrison, 1992, 前掲)から明らかである。それらの以前に記載されたアッセイは、消光剤と標識を極めて接近した状態にし、それによってバックグラウンドの未消光状態(挿入消光剤を含む溶液中ハイブリダイズしていない標識一本鎖プローブから成る)に対して消光を増大させるための、二本鎖ハイブリダイゼーション二重型中への消光剤の挿入に頼っている。
【0041】
記載の挿入消光剤は一本鎖DNA、即ちハイブリダイズしていないプローブを有意に結合しない。FETの距離依存性から予想される通り、従来技術はハイブリダイズしていないプローブの有意な溶液中消光を報告していない。従来技術の教示とは対照的に、本発明は、一本鎖核酸に結合された蛍光標識のDNA結合化合物による有意な消光が溶液中で起こる条件を提供する。
【0042】
文献中に記載された多数の蛍光団およびDNA結合発色団が、本発明の方法への使用に適当である。蛍光団の発光スペクトルが発色団の吸収スペクトルと重複するような適当な蛍光団とDNA結合発色団のペアが選択される。理論上、散乱された励起光による干渉を最少にするために、蛍光団は高いストークスシフト(最大吸収波長と最大発光波長とが大きな差)を有するべきである。
【0043】
当業界において周知である適当な標識としては、フルオレセインおよびその誘導体、例えば FAMTM、 HEXTM、 TETTMおよび JOETM;ローダミンおよびその誘導体、例えばテキサスレッド、 ROXTMおよび TAMRATM;ルシファーイエロー、並びにクマリン誘導体、例えば7−Me2N−クマリン−4−酢酸、7−OH−4−CH3 −クマリン−3−酢酸および7−NH2 −4−CH3 −クマリン−3−酢酸(AMCA)が挙げられるがそれらに限定されない。
【0044】
FAMTM、 HEXTM、 TETTM、 JOETM、 ROXTMおよび TAMRATMはPerkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) から販売されている。テキサスレッドと多数の他の適当な化合物はMolecular Probes (Eugene, OR) から販売されている。エネルギー供与体としての利用に適当である化学発光化合物および生物発光化合物の例としては、ルミノール(アミノフタルヒドラジド)および誘導体、並びにルシフェラーゼが挙げられる。
【0045】
好ましい態様では、DNA結合剤は挿入剤である。適当な公知の挿入剤としては臭化エチジウムおよびアクリジンオレンジが挙げられる。
非挿入性DNA結合剤も適当である。例えば、一般に「グローブ結合剤」と呼ばれるDNA結合化合物のクラスのメンバーが適当である。それらの化合物は二重鎖DNAの小さなグローブを認識しそして結合する。マラカイトグリーンは本方法において機能することが証明されたこのクラスの化合物の一例である。
【0046】
本発明の一態様によれば、DNA結合化合物は二本鎖DNA中に挿入されると検出可能なほど変更されるシグナルを提供する。臭化エチジウムは、他のDNA結合剤、例えばアクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン、エリチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジタマイシンD、クロロマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジルおよびアントラマイシンと同様、二本鎖DNAに結合すると変更された蛍光発光を示す。好ましくは、増幅反応を阻害しないDNA結合化合物を使って、増幅された配列の蓄積のモニタリングが行われる。
【0047】
オリゴヌクレオチドは、任意の適当な方法、例えば制限酵素を使った適当な配列のクローニングおよび単離、並びにNarang他, 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法;Brown 他, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法;Beaucage他, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホルアミダイト法;および米国特許第4,458,066 号の固体支持体法のような方法による直接化学合成により、調製することができる。
【0048】
標識オリゴヌクレオチドを合成する方法は、Agrawal およびZamecnik, 1990, Nucl. Acids Res. 18(18):5419-5423 ; MacMillanおよび Verdine, 1990, J. Org. Chem. 55:5931-5933 ; Pieles 他, 1989, Nucl. Acids Res. 17(22):8967-8978 ; Roget他, 1989, Nucl. Acids Res. 17(19):7643-7651 ;並びにTesler他, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:6966-6976 中に記載されている。合成方法の概説はGoodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3):165-187 に与えられている。
【0049】
本発明の方法は、特に増幅された核酸(DNAまたはRNAのいずれか)の検出に適当である。適当な増幅方法としては、PCR(米国特許第4,683,195 号;同第4,683,202 号および同第4,965,188 号)に加えて、次のものが挙げられるがそれらに限定されない:リガーゼ連鎖反応(LCR,WuおよびWallace, 1989, Genomics 4:560-569 並びにBarany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193);ポリメラーゼ−リガーゼ連鎖反応(Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16); Gap−LCR(特許公報第WO 90/01069 号);
【0050】
修復連鎖反応( 欧州特許公報第439,182 A2号);3SR(Kwoh他, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177;Guatelli他, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878;特許公報第WO 92/0880A 号)並びにNASBA(米国特許第5,130,238 号)。本発明はいずれかの特定の増幅系に限定されない。別の系が開発されたら、それらの系は本発明の実施により利益を得るかもしれない。増幅系の最近の概観はAbramsonおよびMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 中に発表された。
【0051】
本発明の好ましい態様は、米国特許第5,210,015 号およびHolland 他, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280中に記載の方法の改良法を提供する。該方法は耐熱性DNAポリメラーゼの5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を使ってアニールした標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション二重型から開裂させ、そして検出用の標識断片を遊離させる。
【0052】
該DNAポリメラーゼの5′→3′エキソヌクレアーゼ活性による本発明の標識プローブの開裂は、反応混合物中に標識を遊離させる。DNA結合化合物による溶液中シグナルの消光は、蛍光団が短縮された開裂断片に結合した時よりも未開裂の全長オリゴヌクレオチドプローブに結合した時の方が有意に大きい。結果として観察される蛍光の増加はプローブの開裂を示し、これは必然的に標的配列の存在とプローブ/標的ハイブリダイゼーションの発生の両方を示唆する。
【0053】
本発明の均一PCR/検出アッセイは、Higuchi 他, 1992, 前掲に記載の方法と共同した使用に適する。この態様では、DNA結合化合物の蛍光も測定される。よって、DNA結合剤の蛍光は増幅が起こったという検出を可能にし、そして開裂されたハイブリダイズしたプローブの蛍光は標的特異的増幅を示す。
【0054】
本発明の検出方法は多数のアッセイに適用可能である。各アッセイはアッセイ試薬と適合できる緩衝液中の標的試料を必要とする。プローブ開裂の検出の前または同時のいずれかに標的が増幅されるならば、標的核酸は該標的を増幅させるのに使う酵素と適合できる緩衝液中に存在しなければならない。標的核酸は、組織、体液、便、痰、唾液、植物細胞、細菌培養物等を含む様々な生物学的材料から単離することができる。各アッセイに適する試料調製方法は技術の現状において記載されている。
【0055】
一般に、試料中の核酸はDNAの配列、最も普通にはゲノムDNAの配列であろう。しかしながら、本発明は他の核酸、例えば伝令RNA、リボソームRNA、ウイルスRNAまたはクローン化DNAを使って実施することもできる。本発明における使用に適当な核酸試料としては、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAが挙げられる。当業者は、標識オリゴヌクレオチドプローブを開裂させるのに用いる反応に応じて、どんな核酸の性質でも、使用する方法に適切で且つ十分認識された変更を行うことにより、核酸を検出することができるということを認識するだろう。
【0056】
試料調製は、試料の入手源、検出しようとする標的、および使用する反応に依存して異なるだろう。適当な試料調製プロトコールは当業界において既知であり、上記に引用した文献(例えばSambrook他、前掲を参照のこと)中に記載されている。標的配列のPCR増幅のための単純で且つ迅速な試料調製方法は、Higuchi, 1989, PCR Technology (Erlich 編, Stockton Press, New York) と PCR Protocols, 第18〜20章 (Innis 他編, Academic Press, 1990) の中に記載されている。これらは共に参考として本明細書中に組み込まれる。当業者は、適当なプロトコールを選択しそして経験的に最適化することができるだろう。
【0057】
溶液中の標識の蛍光は、分光蛍光計、例えばHitachi/Perkin Elmer Model 650-40 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) またはPTI LS-100発光分光光度計(Photon Technology International, London, Ontario, Canada)において測定される。分光蛍光計は、使用する特定の機器の特徴に依存して、励起波長と発光波長並びにバンド幅を設定する機会を提供する。特定の蛍光標識からの蛍光を検出するために波長およびバンド幅設定値を決定する方法は当業者にとって明らかであろう。一般的な手引き書は例えばThe Merck Index (Bydavari 他, 1989, Merck Co. Inc. Rahway, NJ)およびHauglandによる1990年版のMolecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon) カタログの中に見つかる。各標識は別々の蛍光スペクトルを有するけれども、本発明を実施するには広域の検出波長が適当である。
【0058】
プローブ開裂をもたらす反応の前と後に蛍光測定を行い、反応前の値に比較した蛍光の変化を算出する。同等に、反応混合物の一部を反応条件にかけないでおく。こうして、反応前の蛍光を反応後の蛍光と一緒に、反応の終了後に測定することができる。蛍光の測定用にも適当である反応容器の使用は、反応容器を開けたりまたは別の反応後処理を行ったりせずに反応前の蛍光と反応後の蛍光の両方の直接測定を可能にする。
【0059】
上述したような核酸検出方法がPCR増幅と組み合わされる好ましい方法では、増幅反応は自動化法として実施される。48または96本までの反応管を入れることができるヒートブロックを使用する熱循環器がPerkin Elmer (Norwalk, CT)から現在入手可能である。従って96までの増幅反応を同時に実施することができる。
【0060】
本発明は、試料を処理したり、管を開けたり、循環反応を中断したりする必要を伴わずに、全ての試料中のPCR生成物の自動検出を可能にする。適当な光学系は、例えば、Higuchi 他, 前掲、Higuchi 他, 1993, 前掲、および欧州特許公開第 512,334号の中に記載されている。1つのそのような光学系では、複数のファイバーオプチクスリードを使って励起光を光源から反応管に伝達させ、そして各管からの発光を測定する。各ファイバーオプチクスは一度で蛍光を迅速に読むことができるため、反応管からの蛍光を読むのにただ1つの蛍光計が必要である。別の光学系は、複数の反応容器の蛍光を同時に測定するのにビデオカメラを使用する。透明な反応容器蓋の使用により、容器を開封しない状態での蛍光測定が可能になる。
【0061】
96ウエルのミクロタイター方式を使用する別の適当な検出方法が記載されている。この型の方式は、例えばゲノム分析のための大規模試料スクリーニング、例えば血液銀行スクリーニング手順におけるAIDSウイルスまたは鎌状赤血球貧血についてのスクリーニングのために、臨床研究室においてしばしば望ましい。本発明の方法はこの型の分析に適し、ELISA 方式のような既知の「ウエル内」アッセイ方法または他の光学密度に基づいた方法に要求される無数の洗浄および抽出操作の必要性を排除する。(Kolber他, 1988, J. Immun. Meth. 108:255-264 、Huschtscha他, 1989, In Vitro Cell and Dev. Biol. 25(1):105-108 、およびVoller他, 1979, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VAを参照のこと)。
【0062】
本発明の検出方法は、ELISA プレートリーダーに類似しているが蛍光を励起・測定するために設計された装置を使った直接蛍光測定も可能にすう。例えば、Millipore (Bedford, MA) により製造された CytoFluorTM 2300 機がそのような方法に適当である。あるいは、増幅反応の間のPCR生成物の増加をモニタリングするのに蛍光の連続測定を提供する装置が有用である。
本発明の方法が特定の検出方法、熱循環器もしくはシグナル測定器または反応容器の数に限定されないことは当業者に明白であろう。
【0063】
本発明の方法は複数の標的配列を同時に検出するためにも利用することができる。各標的に特異的なプローブが反応混合物中に存在する。試料中に存在する各標的核酸について、対応するプローブがハイブリダイズしそして開裂されるだろう。開裂されたプローブを別々に検出するために、別の波長で蛍光を発する標識により各種のプローブが標識される。次いで測定波長の適当な選択により、各種のプローブが別々に検出される。
【0064】
よって、本発明の方法は、増幅反応を一度開始したら反応容器を開けずに一試料の中の数個の標的を検出するためのPCR同時増幅方法において増幅生成物を検出するのに有用である。本発明は、同一試料中の2つの異なる核酸標的の定量的比較に特に有用である。核酸を定量する方法は米国特許第5,219,727 号に記載されている。記載された定量方法は、標的の相対量を決定するかまたは増幅前に存在する標的の量をそれぞれ正確に定量するために内部標準を使用するPCRを基にした方法である。
【0065】
一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、該プローブを標的にハイブリダイズさせるために標的配列に相補的である。オリゴヌクレオチドプローブはヌクレオチド配列に依存して低温で二次構造を形成し、二本鎖DNAの領域を生成することができる。DNA結合化合物は、蛍光標識に対してごく近位状態で二本鎖領域中に挿入することができ、それによってエネルギー転移の効率を増大させることができる。本発明の方法は二次構造によるプローブ内の二本鎖領域の形成を要求しないけれども、そのような領域は標識の消光を向上させることができる。
【0066】
他方の末端に相補的な末端配列を付加することにより、二次構造を形成しない一本鎖プローブ中に二次構造を導入することができる。形成される二次構造は、「ヘアピン」構造を形成する5′末端と3′末端のハイブリダイゼーションを含む。プローブの各末端の相補的配列の長さは、アッセイ温度および条件(典型的には室温)において安定なヘアピン二次構造を形成するのに十分であるが、プローブの自己ハイブリダイゼーションがプローブ−標的ハイブリダイゼーションよりも多く生じるようにヘアピン二次構造を安定化して該プローブを標的配列にハイブリダイズできなくするほどには長くない。
【0067】
プローブの正確な長さは検出しようとする標的配列の長さとアッセイ条件に依存するだろう。好ましくは、安定なヘアピン構造の形成を引き起こすのに長さ約6〜9ヌクレオチドの相補的末端領域が十分であるが、反応条件に応じてそれ以上またはそれ以下の長さが所望されるかもしれない。プローブのヘアピン二次構造の安定性とプローブ−標的ハイブリダイゼーション二重型の安定性は経験的に決定することができる。
【0068】
【実施例】
実施例1:標識オリゴヌクレオチドプローブの合成
一端が蛍光団で標識されたオリゴヌクレオチドプローブをABI 394 DNA合成装置(Perkin Elmer ABD, Foster City, CA )上で1マイクロモルスケールで合成した。5′標識オリゴヌクレオチドを直接提供するためにオリゴヌクレオチド合成の間蛍光標識のアミダイトを使用した。これはオリゴヌクレオチドのいずれの合成後修飾の必要性も除去した。
【0069】
フルオレセインのホスホルアミダイト誘導体(FAM TM, Perkin Elmer ABD, Foster City, CA)の付加によりオリゴヌクレオチドの5′末端を合成した。該ホスホルアミダイトは、ヌクレオチドから標識を分離するリンカーを含有する。制御細孔ガラス(CPG)を水酸化アンモニウムで55℃で4時間処理してCPGから標識オリゴヌクレオチドを分離した後、オリゴヌクレオチドを濾別し、空気流の中で乾燥し、再懸濁し、濾過し、そして逆相HPLCにより精製した。次いで、純粋な5′標識オリゴヌクレオチドを含有する画分を蒸発乾固せしめた。
【0070】
実施例2:蛍光の消光に対するオリゴヌクレオチドの長さの影響
長さ2〜34ヌクレオチドの標識オリゴヌクレオチドの蛍光を、EtBrを含む溶液とEtBrを含まない溶液中で測定した。更に、比較のため遊離標識の蛍光の測定も行った。
5′末端がFAM TMで標識された一連のプローブを実施例1に記載の通りに合成した。それらのプローブの核酸配列を5′→3′方向で下記に与える。
【0071】
【表1】
Figure 0003795557
【0072】
PCR反応緩衝液(50mM KCl, 10mM Tris pH 8.3および 3mM MgCl2)と0,2または4μg/ml(0,5または10μM)の濃度のEtBrを含有する400 μl の溶液中でオリゴヌクレオチドを測定した。オリゴヌクレオチドは1μMの濃度で存在した。FAM標識の蛍光を検出するために、励起光の波長を495 nmになるように選択しそして蛍光を518 nmの波長で測定した。読みは20℃で行った。4μg/mlのEtBr濃度で行った測定を翌日に繰り返し、該測定の再現性を評価した。
【0073】
結果を図1に与える。EtBrの存在下でのプローブ蛍光の測定値を、EtBr無しでの蛍光に比較して示す。EtBrの存在下での遊離標識の蛍光に約6%の減少が観察された。長さ6塩基未満のオリゴヌクレオチドに結合した標識の蛍光の減少は遊離標識のものと感知できるほど異なっていなかった。有意な消光は、長さが少なくとも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに観察された。
【0074】
実施例3:消光の温度依存性
フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドプローブのEtBrによる消光の温度依存性を決定づけるために実験を行った。EtBrを含むプローブ溶液と含まないプローブ溶液の蛍光を、該溶液を加熱および冷却しながら測定した。
【0075】
4μg/mlのEtBrを含むかまたは含まない、上記実施例2に記載の緩衝液中に0.5 μMのBW118 (配列番号4)またはSGW128(配列番号6)のいずれかを含有する溶液を調製した。未結合のフルオレセイン標識を含有する同様な溶液も調製した。すぐに使用しない溶液は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。蛍光を測定しながら溶液の温度を制御するために、水浴に接続されたジャケット付キュベットを使った。溶液温度は、水浴からジャケット付キュベットを通して溶液の周りに水を循環させることにより維持された。ジャケット付キュベットの近くで循環水の温度を測定し、溶液の温度が実際に維持されていることを確かめた。蒸発を防ぐために試料の上に鉱油を重層させた。光漂白を防ぐために、測定を行っている間だけ溶液を励起光に暴露した。励起波長と発光波長は上述の通りに選択した。
【0076】
溶液を加熱および冷却しながら測定を実施した。2つの測定を単一温度で、1つは加熱しながらもう1つは冷却しながら行い、得られた値を平均した。そのデータを図2に与える。各測定値は、未消光(EtBr不含有の)溶液から得られた対応する値に関して標準化されている。
標識オリゴヌクレオチドプローブの有意な消光は全ての温度で観察された。消光の量の有意な増加は40℃以下で観察され、観察した温度範囲全体を通して、温度を下げると消光の量が増加した。室温以下でかなり大きな消光が観察されたけれども、便宜上20℃で蛍光を測定することが望ましいかもしれない。
【0077】
実施例4:PCRプローブ標識の遊離
この実施例は、PCR反応混合物中の未開裂の標識プローブを消光するためのEtBrの使用を記載する。伸長生成物の合成を防ぐために3′末端が修飾されているFAM標識プローブの存在下で、PCR増幅を実施した。DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、プライマーの下流の標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂させ、それによって該プローブの標識オリゴヌクレオチド小断片を遊離させる。開裂された断片に結合した標識の蛍光の増加(これは標的配列の増幅を示す)が検出された。
【0078】
下記に示す2つのFAM標識プローブのうちの1つの存在下で増幅を実施した。該プローブの核酸配列を5′→3′方向で示す。上述した通りに5′末端にFAMが結合されたこれらのプローブを合成した。各プローブは、Taq ポリメラーゼによる伸長を阻止するために3′−OHの代わりに3′−PO4 を有するように合成した。
【0079】
プローブ 配列番号 配列
SGW127 7 CCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG
SGW128 8 GACCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAG
【0080】
増幅
増幅領域は、Hoffmann-La Roche により開発・製造されそしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)により販売されているプライマー SK431とSK145 により指令されたHIV gag 領域からの142 塩基対生成物であった。HIV gag 遺伝子のクローン化断片を含有するプラスミドから増幅を行った。
2つのプローブのそれぞれについて2つの複製増幅を実施した。増幅は次の試薬を含有する150 μl 反応液中で実施した:
【0081】
3×108 コピーの標的配列
50mM KCl
10mM Tris-HCl, pH 8.3
3mM MgCl2
75ピコモルの各プライマー
各々50μMの4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸*
3.75単位のTaq DNAポリメラーゼ(Hoffmann-La Roche により開発・製造されそしてPerkin Elmer, Norwalk, CT により販売されている)
0.5 μMのプローブ
4μg/mlのEtBr(10μM)
【0082】
* 一般に、長い標的領域の増幅には各々200 μMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸が好ましい。
PCR熱循環条件にかけられる各反応混合物について、1つはEtBrを含みもう1つはEtBrを含まない2つの追加の反応混合物を測定対照用として調製し保存した(温度循環なし)。反応混合物をGeneAmp 900 熱循環器(Perkin Elmer, Norwalk, CT )中で次の増幅スキームにかけた:各々変性段階(95℃、15秒)、アニーリング/伸長段階(55℃、30秒)および生成物の完全な伸長を保証するための最終インキュベーション(72℃、10分)から成る35サイクル。増幅後、反応液を分析まで4℃に維持した。
【0083】
分析
増幅が起こったことを確かめるために、増幅生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。プローブ分解を後述の通り分析した。
【0084】
A.ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるプローブ分解の分析
増幅後、5μの増幅反応液を10ピコモル/μl のプローブ濃度になるようにホルムアミド中に希釈した。次いで5μl の希釈増幅反応液(レーンあたり50ピコモルのプローブ)を7M尿素、10%ポリアクリルアミドゲルの厚さ0.4 mmの長方形ウエル上に負荷し、そして1500V,20W,20mAにおいて ABI 373A DNAシーケンサー(Perkin Elmer, Norwalk, CT )上で6時間電気泳動した(フルスキャンシーケンシング)。 373A DNAシーケンサーデータ収集プログラム(Perkin Elmer, Norwalk, CT )を使ってデータを収集した。
【0085】
収集したデータを362 Gene ScannerTMデータ解析プロブラム(v.1.2d1) (Perkin Elmer, Norwalk, CT) を使って解析した。遊離されたプローブに相当するピーク面積の和と完全体レーンのピーク面積の和を比較することにより、開裂されたプローブの比率を推定した。遊離されたプローブの全量は、反応混合物中に含まれるプローブの全量の推定比率として算出した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定されたプローブ分解の量を下記に示す。2つの複製反応の各々について算出された値を示す。
【0086】
【表2】
Figure 0003795557
【0087】
B.分光蛍光計を使って蛍光を測定することによる分析
各PCRとPCR対照(未循環の反応混合物)の50μl を 350μl のTE(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.0 )中に希釈した。各試料の蛍光をHitachi/Perkin Elmer Model 650-40 蛍光分光蛍光計(実施例2参照)の中で494 nmの励起波長と522 nmの発光波長において20℃で測定した。485 nmの励起フィルター(20 nm バンド通過幅)を取り付けた CytoFluorTM 2300 (前掲)を使って読みを行った。
【0088】
分解したプローブの比率は、反応中に起こる蛍光の変化量を蛍光の最大可能変化量、即ちプローブが全部分解された時に起こったであろう蛍光の変化量で割ることにより算出することができる。反応中に起こる蛍光の変化量は、共にEtBrの存在下での循環試料と未循環試料の間の蛍光の差として測定される。これはPCR熱循環の前と後の反応混合物を測定することと同等である。蛍光の最大可能変化量の直接測定は行わなかった。代わりに、EtBrの存在下での完全に分解されたプローブの蛍光の推定値とEtBrを含む未循環試料の蛍光との差として蛍光の最大可能変化量を推定した。EtBrの存在下での完全に分解されたプローブの蛍光の推定値は下記に記載の通り得られた。
【0089】
EtBrを含まない未循環試料の蛍光に0.94を掛けた値を、プローブが全部分解された時のEtBrの存在下での試料の蛍光を概算するのに使った。EtBr無しでは、プローブの蛍光はオリゴヌクレオチドの長さによりほとんど影響を受けない。よって、未分解の(全長)プローブを含有する試料の蛍光は、完全に分解された(短鎖)プローブを含有する試料のものとほぼ同じである。EtBrを含まない未循環試料の蛍光は、EtBrを含まない完全に分解された断片を含有する試料の蛍光とほぼ同じである。
【0090】
EtBrを含む完全に分解された断片を含有する試料の蛍光は、EtBrによる完全に分解されたプローブの残留消光を考慮に入れた後に得られる。図1に示されるように、完全に分解されたプローブ断片のEtBrによる残留消光は約6%である。従って、EtBrを含まない未循環試料の蛍光に0.94の係数を掛けることにより、EtBrの存在下での完全に分解されたプローブを含有する試料の蛍光の推定値が提供される。EtBrを含む未循環試料の蛍光を差し引くことにより、所望の蛍光の最大可能変化量の推定値が提供される。
【0091】
上記近似から、EtBrを含まない溶液中での長鎖プローブと短鎖プローブの間の蛍光の差が無視できると思われる。実際の実施では、EtBrの不在下であっても、標識の蛍光は取り付けられるオリゴヌクレオチドの長さと配列の両方に或る程度依存する。この依存性は予測できないので、蛍光の最大可能変化量を直接測定することが望ましい。これは、追加の反応混合物を調製し、その反応混合物に該プローブを完全に分解するDNAヌクレアーゼを加えることによって達成される。蛍光の最大変化量は、プローブ分解の前後の反応混合物の蛍光の差として算出される。
【0092】
分光光度計を使って測定された蛍光の変化量から算出した時のプローブ分解の量を下記に示す。2つの複製反応の各々について算出された値を示す。その値は、上述の蛍光の最大変化量の近似値を使って算出される。
【0093】
【表3】
Figure 0003795557
CytoFluor TM 2300 マイクロウエルプレートリーダー中で測定された蛍光の変化量から算出されたプローブ分解の量を下記に示す。2つの複製反応の各々について算出された値を示す。その値は、上述の蛍光の最大変化量の近似値を使って算出される。
【0094】
【表4】
Figure 0003795557
これらの結果は、蛍光の変化がプローブ分解の検出を可能にするのに十分であったことを証明する。
【0095】
実施例5:プローブの二次構造による消光の増大
一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの中の二次構造の存在は、消光剤が挿入できる二本鎖DNAの領域を提供することにより、挿入性DNA結合消光剤による消光を増大させることができる。これは、1つのプローブが標的配列にハイブリダイズしなかった時にヘアピン構造を形成すると予想される点で異なっているプローブの消光を比較することにより証明された。
【0096】
実験は本質的には実施例3に記載の通りに実施した。ただし、温度と蛍光を連続的に測定した。2つがヘアピン二次構造を形成する3種のオリゴヌクレオチドを、本質的には上記実施例1に記載の通りに合成した。それらの配列と標識部位を下記に示す。
SGW140(配列番号9)(ヘアピン)
FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTATG
SGW146(配列番号10)(ヘアピン)
FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTANG
ST50FLC (配列番号11)
FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT
ここでNはTAMRA が結合される修飾チミジンを表す。
【0097】
SGW140(配列番号9)とSGW146(配列番号10)は、ハイブリダイズしてヘアピン二次構造を形成することができる自己相補的末端領域を有する。SGW146(配列番号10)はその上3′末端付近に結合した第二の消光性化合物(TAMRA TM)を含有する。ヘアピン構造の形成は FAMTMとTAMRA TMをごく近位状態にし、それによって蛍光を消光する。このオリゴヌクレオチドの場合には、 TAMRATMとEtBrの両方による FAMTMの合同消光が測定された。
【0098】
測定はジャケット付クオーツキュベットを使ってHitachi/Perkin Elmer Model 650-40 蛍光分光蛍光計の中で実施した。励起および発光単色計をそれぞれ495 nmと522 nmに設定した。それらの単色計のスリット幅をそれぞれ3 nmと7 nmに設定した。PCR緩衝液(50mM KCl, 10mM Tris pH 8.3, 3mM MgCl2 )中に4μg/mlのEtBrと共にまたは伴わずに 0.5μM標識オリゴヌクレオチドを含有する400 μl 溶液を使って測定を行った。溶液は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。
【0099】
各試料を分光蛍光計内のジャケット付キュベット中に入れ、そして蒸発を防ぐために試料の上に鉱油を重層させた。溶液の温度を20〜95℃の間で約1℃/分の速度で上昇および低下させた。
EtBrを含まない直鎖状プローブの蛍光に関して標準化した蛍光測定値を図3に与える。温度を上昇および低下させながら記録した測定値が示される。蛍光の最大変化量が観察された温度に相当する融解中点値も示される。
【0100】
EtBrはヘアピンプローブの二本鎖領域を安定化し、それによって融解温度を上昇させることが観察された。これは、EtBrの添加によって生じた融解中点値のシフトを比較する図3から理解することができる。ヘアピン二次構造の存在がEtBrによる蛍光消光を増大させることが観察された。
【0101】
実施例6:多重標識プローブの消光の増大
上記実施例4に記載の方法で使用される別のプローブは、消光剤として作用しそして5′末端蛍光標識の数塩基以内のところでプローブオリゴヌクレオチドに結合されている第二の標識を含有する。未開裂のプローブ上の蛍光標識は、蛍光エネルギー転移によって第二の結合標識により消光される。プライマー伸長中に起こるプローブ分解が標識と消光剤を分離し、それによって検出可能なシグナルを増大させる。そのようなプローブの利用は米国特許第5,210,015 号に記載されている。未開裂のプローブを消光させる本発明の方法は、未開裂のプローブを更に消光させるために二重標識プローブと共に使用し、それによってプローブ分解により生成するシグナルの変化量を増加させることができる。
【0102】
消光剤を組み合わせることにより提供される追加の消光を証明するために、5′末端で FAMTM標識されたプローブのEtBrによる蛍光消光を、 FAMTMとマラカイトクリーン(MG)の両方で標識されたプローブのEtBrによる蛍光消光と比較した。5′末端に単一の FAMTM標識が取り付けられているかまたは FAMTM標識から3塩基離れて追加のMG標識が取り付けられているプローブを合成した。両プローブは下記に示す配列を使って合成した:
【0103】
SGW55 (配列番号12) FAMTM−CCANCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG。
ここでNはマラカイトグリーンを結合させることができる修飾チミジンを表す。
蛍光の測定は、本質的には上記実施例2に記載の通りに行った。結果を下記に示す。
【0104】
【表5】
Figure 0003795557
【0105】
PCR試薬混合物中のEtBrによるかまたは追加の標識による消光は、検出可能なシグナルの変化を生じるのに十分である。消光方法の組合せは消光効率の有意な増加を提供し、開裂されたプローブと未開裂のプローブの一層高感度な識別を可能にする。上記実施例4に記載の方法においてここに記載のような多重標識プローブを使用することは、開裂されたプローブと未開裂のプローブとを識別する能力を更に増大させるだろう。
【0106】
実施例7:他のDNA結合化合物による消光
蛍光標識プローブの溶液中消光に別の適当なDNA結合化合物を選択できることを次のような蛍光性DNA結合化合物を使って証明した:RO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1およびTO-PRO-1。それらの化合物はMolecular Probes (Eugene, OR) から市販されている関連する単量体シアニン核酸染料である。各化合物についてナノメートルで測定された励起および発光極大を下記に与える。フルオレセイン標識の励起および発光極大を比較のため示す。
【0107】
【表6】
Figure 0003795557
フルオレセイン標識とDNA結合化合物との最大相互作用は、フルオレセイン(516 nm)の発光極大がDNA結合化合物の励起極大と最も接近して合致した時に起こると予想される。よって、TO-PRO-1はフルオレセイン標識の最大消光を示すと予想され、PO-PRO-1は最小消光を示すと予想された。
【0108】
長さ33および2のオリゴヌクレオチドを上述と同様に合成した。これら2つのオリゴヌクレオチドの配列を5′→3′方向で下記に示す。長さ2のオリゴヌクレオチドは全長オリゴヌクレオチドの分解形に相当する。
オリゴ 配列番号 配列
ST535FS 13 FAMTM−AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT
ST4F FAMTM−AG
【0109】
上記DNA結合化合物のうちの1つを含有するおよび含有しない溶液中の標識オリゴヌクレオチドの蛍光を、本質的には実施例2と同様に、PTI LS-100発光分光光度計(Photon Technology International, London, Ontario, Canada)を使って測定した。0.5 μMオリゴヌクレオチド、1×PCR緩衝液(50mM KCl, 10mM Tris pH 8.3および 3mM MgCl2)を含みそして5μMのDNA結合化合物の1つを含むかまたは含まない 400μl 溶液中で測定を行った。各オリゴヌクレオチドおよびDNA結合化合物について、未消光シグナルの%として表した消光の量を下記に与える。
【0110】
【表7】
Figure 0003795557
【0111】
本法は長鎖および短鎖オリゴヌクレオチドの示差的消光を当てにしている。発光極大と励起極大の比較から予想された通り、TO-PRO-1によるフルオレセインの蛍光消光が最大であると観察され、そしてPO-PRO-1によるフルオレセインの蛍光消光が最小であると観察された。TO-PRO-1は、標識された2ヌクレオチド断片の大きく減少した消光も示した。本法を使った反応液中のオリゴヌクレオチド開裂の選択的検出を可能にするには、消光の3倍以上の差(〜96%から〜30%へ)が十分である。
【0112】
上記結果は、優勢的な消光機構がFETであり得ることを示唆し、そして標識の発光極大と消光剤の励起極大を比較することにより他の適当な標識/消光剤ペアを予想通りに選択できることを示唆している。選択の後、下記に記載するような常用のスクリーニングにより、長鎖標識オリゴヌクレオチドの消光と短鎖標識オリゴヌクレオチドの消光の差を最大にする最適消光剤濃度を決定することができる。
本発明の方法における使用のためのTO-PRO-1の最適濃度は次の通りに決定された。0〜10μMの濃度でTO-PRO-1を含有する溶液中で上記プローブの各々の蛍光消光を測定した。本質的には上述した通りに測定を実施した。その結果を下記に与える。
【0113】
【表8】
Figure 0003795557
【0114】
示したデータは、フルオレセインの励起および発光波長におけるTO-PRO-1による吸収について補正しなかった。高濃度のTO-PRO-1による短鎖オリゴヌクレオチドの有意な消光は、TO-PRO-1の光学濃度からくるのであって、フルオレセインの消光によるのではない。5.0 μMのTO-PRO-1濃度は全長プローブと分解したプローブの間の消光に最大の差を提供するだろう。
【0115】
【配列表】
Figure 0003795557
【0116】
Figure 0003795557
【0117】
Figure 0003795557
【0118】
Figure 0003795557
【0119】
Figure 0003795557
【0120】
Figure 0003795557
【0121】
Figure 0003795557
【0122】
Figure 0003795557
【0123】
Figure 0003795557
【0124】
Figure 0003795557
【0125】
Figure 0003795557
【0126】
Figure 0003795557
【0127】
Figure 0003795557

【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、蛍光団が結合されるオリゴヌクレオチドの長さに対する溶液中蛍光消光の依存性に関するグラフである。
【図2】図2は、温度に対する溶液中蛍光消光の依存性に関するグラフである。
【図3】図3は、温度に対する溶液中蛍光消光の依存性および標識された一本鎖オリゴヌクレオチド内部のヘアピン二次構造の存在に起因する観察される消光の増大に関するグラフである。

Claims (7)

  1. 溶液中の発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドの発光を消光する方法であって、前記溶液中にDNA結合発色団を含めることを含んで成り、前記DNA結合発色団が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドとその相補鎖とのハイブリダイゼーションなくして、前記発光性標識と相互作用して前記標識の発光を消光し、前記DNA結合発色団は光の形でエネルギーを吸収する非放射性化合物であり、そして前記発光性標識と前記DNA結合発色団とは当該発光性標識の発光スペクトルが当該DNA結合発色団の吸収スペクトルとが重複するように選択される、ことを特徴とする方法。
  2. 発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドの開裂による分解を検出する方法であって、前記開裂が反応により触媒され、そして前記方法が、
    (a) 前記反応を実施するのに適当な反応混合物を用意し、ここで前記反応混合物は前記オリゴヌクレオチドとDNA結合発色団を含んで成り、前記DNA結合発色団は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドとその相補鎖とのハイブリダイゼーションなくして、前記標識と相互作用して前記標識の発光を消光することができ、前記DNA結合発色団は光の形でエネルギーを吸収する非放射性化合物であり、そして前記発光性標識と前記DNA結合発色団とは当該発光性標識の発光スペクトルが当該DNA結合発色団の吸収スペクトルとが重複するように選択され;
    (b) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光を測定し;
    (c) 前記オリゴヌクレオチドの開裂を引き起こす条件下で前記反応を実施し;
    (d) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光を測定し;そして
    (e) 段階(b) と段階(d) で測定した発光の差により、前記オリゴヌクレオチドの開裂を検出する
    ことを含んで成る方法。
  3. 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
    (a) 反応のための反応混合物を用意し、ここで前記反応混合物は前記試料、DNA結合発色団、および発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含んで成り、前記オリゴヌクレオチドプローブは前記標的核酸にハイブリダイズすることができる配列を含み、前記DNA結合発色団は、前記オリゴヌクレオチドプローブとその相補鎖とのハイブリダイゼーションなくして前記発光性標識の発光を消光することができ、前記DNA結合発色団は光の形でエネルギーを吸収する非放射性化合物であり、前記発光性標識とDNA結合発色団とは当該発光性標識の発光スペクトルが当該DNA結合発色団の吸収スペクトルとが重複するように選択され、そして前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸にハイブリダイズした時にのみ前記反応が前記オリゴヌクレオチドの開裂を触媒し;
    (b) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光を測定し;
    (c) 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的配列にハイブリダイズしそして開裂される条件下で前記混合物を処理し;
    (d) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光を測定し;そして
    (e) 段階(b) と段階(d) で測定された発光の差により標的配列が存在するかどうかを決定する
    ことを含んで成る方法。
  4. 前記標的配列が段階(c) の前に増幅される、請求項3に記載の方法。
  5. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使って試料中の標的核酸配列を検出する方法であって、
    (a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、DNA結合発色団、および前記標的核酸の一領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含んで成るPCR反応混合物を用意し、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオチドプライマーにより結合された前記標的核酸配列中にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブは発光性標識で標識されており、そして前記DNA結合発色団は、前記オリゴヌクレオチドプローブとその相補鎖とのハイブリダイゼーションなくして前記発光性標識の発光を消光することができ、前記DNA結合発色団は光の形でエネルギーを吸収する非放射性化合物であり、そして前記発光性標識とDNA結合発色団とは当該発光性標識の発光スペクトルが当該DNA結合発色団の吸収スペクトルとが重複するように選択され;
    (b) 前記反応混合物中の前記標識の発光を測定し;
    (c) PCR条件下でPCR反応混合物を処理し、ここで前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性が前記標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂し;
    (d) 前記反応混合物中の前記標識の発光を測定し;そして
    (e) 段階(b) で測定された発光と段階(d) で測定された発光の差により、前記標的配列が存在するかどうかを決定する
    ことを含んで成る方法。
  6. 前記DNA結合発色団がDNA挿入剤である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記標識がフルオレセイン誘導体であり、そして前記DNA結合発色団が臭化エチジウムである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
JP21902695A 1994-09-01 1995-08-28 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法 Expired - Lifetime JP3795557B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US299682 1994-09-01
US08/299,682 US5491063A (en) 1994-09-01 1994-09-01 Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0870876A JPH0870876A (ja) 1996-03-19
JP3795557B2 true JP3795557B2 (ja) 2006-07-12

Family

ID=23155803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP21902695A Expired - Lifetime JP3795557B2 (ja) 1994-09-01 1995-08-28 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5491063A (ja)
EP (1) EP0699768B1 (ja)
JP (1) JP3795557B2 (ja)
AT (1) ATE243759T1 (ja)
CA (1) CA2157200C (ja)
DE (1) DE69531133T2 (ja)
DK (1) DK0699768T3 (ja)
ES (1) ES2202333T3 (ja)
PT (1) PT699768E (ja)

Families Citing this family (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846717A (en) * 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
US6821727B1 (en) 1993-11-15 2004-11-23 Applera Corporation Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
CA2159044A1 (en) * 1994-09-26 1996-03-27 Falko-Guenter Falkner Method of quantitating nucleic acids
US5571673A (en) * 1994-11-23 1996-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
WO1997015687A1 (en) * 1995-06-07 1997-05-01 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5994063A (en) * 1995-06-23 1999-11-30 Metzker; Michael L. Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3A,4A-diaza-s-indacene compounds for homogenous amplification/detection assays
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US5837442A (en) 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
DE19548680A1 (de) * 1995-12-23 1997-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen
US7527928B2 (en) * 1996-11-29 2009-05-05 Third Wave Technologies, Inc. Reactions on a solid surface
US5763184A (en) 1996-01-30 1998-06-09 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleotide sequence variation in the ABO glycosyltransferase gene
AU713667B2 (en) * 1996-04-12 1999-12-09 Phri Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
EP0910666B1 (en) * 1996-05-02 2006-08-09 Applera Corporation Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor
US7803528B1 (en) 1997-02-28 2010-09-28 Quest Diagnostics Incorporated Fluorescence energy transfer by competitive hybridization
US6503709B1 (en) 1997-07-03 2003-01-07 Id Biomedical Corporation Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci
US6485901B1 (en) * 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
AU1366299A (en) * 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
EP1045925A1 (en) * 1998-01-09 2000-10-25 Minnesota Mining And Manufacturing Company Enzyme-specific cleavable polynucleotide substrate and assay method
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
WO1999049293A2 (en) 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
WO2000001850A2 (en) * 1998-07-02 2000-01-13 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
JP2000316587A (ja) * 1999-03-05 2000-11-21 Tosoh Corp 核酸プローブ
JP2003510017A (ja) * 1999-06-22 2003-03-18 インビトロジェン コーポレイション 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
US6323337B1 (en) * 2000-05-12 2001-11-27 Molecular Probes, Inc. Quenching oligonucleotides
US7846733B2 (en) * 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US7125660B2 (en) * 2000-09-13 2006-10-24 Archemix Corp. Nucleic acid sensor molecules and methods of using same
US6815164B2 (en) 2000-10-06 2004-11-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
IL155450A0 (en) * 2000-10-20 2003-11-23 Expression Diagnostics Inc Leukocyte expression profiling
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
AU2002228974A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Nugen Technologies, Inc Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
EP1366197B1 (en) * 2001-03-09 2007-05-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
GB0110501D0 (en) * 2001-04-30 2001-06-20 Secr Defence Brit Amplification process
US20020177157A1 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Yuling Luo Pairs of nucleic acid probes with interactive signaling moieties and nucleic acid probes with enhanced hybridization efficiency and specificity
GB0112868D0 (en) * 2001-05-25 2001-07-18 Secr Defence Detection system
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7026121B1 (en) * 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
US9777312B2 (en) * 2001-06-30 2017-10-03 Enzo Life Sciences, Inc. Dual polarity analysis of nucleic acids
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
ATE540127T1 (de) * 2001-11-19 2012-01-15 Affymetrix Inc Multiplex pcr
US20110151438A9 (en) 2001-11-19 2011-06-23 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
US7745180B2 (en) 2002-04-24 2010-06-29 Hitachi Chemical Co., Ltd. Device and method for high-throughput quantification of mRNA from whole blood
US7393950B2 (en) * 2002-08-29 2008-07-01 Hong Kong University Of Science & Technology Antisense oligonucleotides targeted to human CDC45
US7659060B2 (en) 2002-09-02 2010-02-09 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for identifying nucleotide polymorphism
GB0223563D0 (en) * 2002-10-10 2002-11-20 Secr Defence Detection system
EP1558762B1 (en) * 2002-10-23 2013-09-11 University of Utah Research Foundation Amplicon melting analysis with saturation dyes
JP4898119B2 (ja) * 2002-11-22 2012-03-14 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 検出できるラベルされたヌクレオシド類似体及びその使用方法
KR20070121853A (ko) 2003-03-31 2007-12-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
WO2004094986A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US7892745B2 (en) * 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
GB2422196B (en) * 2003-05-20 2008-05-07 Investigen Inc System for detecting polynucleotides
WO2005066372A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-21 Applera Corporation Quantitative amplification and detection of small numbers of target polynucleotides
EP1713925B9 (en) * 2004-01-07 2012-09-05 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Primers and probes for the detection of hiv
US9657347B2 (en) 2004-04-20 2017-05-23 University of Utah Research Foundation and BioFire Defense, LLC Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
CN101426930A (zh) * 2004-05-25 2009-05-06 日立化成工业株式会社 检测癌症易感性的方法
WO2006029184A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
WO2006045053A2 (en) * 2004-10-20 2006-04-27 Hitachi Chemical Company, Ltd. Method for tailoring administration of drugs by quantitation of mrna
WO2010048415A1 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using jak3 genetic variants to diagnose and predict crohn's disease
WO2008101133A2 (en) * 2007-02-14 2008-08-21 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using genes and genetic variants to predict or diagnose inflammatory bowel disease
WO2008109782A2 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis of inflammatory bowel disease in children
EP1819827B1 (en) * 2004-12-08 2010-08-11 Cedars-Sinai Medical Center Methods for diagnosis of crohn's disease
CN101166537B (zh) * 2005-04-28 2013-01-23 日立化成研究中心公司 全血中基因的体外表达作为评定对饮食补充物个体差异的模型
WO2006122295A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Expression Diagnostics, Inc. Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels
DE602006019312D1 (de) * 2005-06-08 2011-02-10 Hitachi Chemical Co Ltd Verfahren zur Vorhersage der Immunreaktion auf neoplastische Krankheiten auf der Grundlage des mRNA-Ausdrucksprofil in neoplastischen Zellen und stimulierten Leukozyten
US7919242B2 (en) 2005-06-30 2011-04-05 Roche Molecular Systems, Inc. Light emission modifiers and their uses in nucleic acid detection, amplification and analysis
CA2621267A1 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
GB0603190D0 (en) * 2006-02-16 2006-03-29 Enigma Diagnostics Ltd Detection system
US8021839B2 (en) * 2006-02-24 2011-09-20 Investigen, Inc. Methods and compositions for detecting polynucleotides
US20090311684A1 (en) * 2006-04-07 2009-12-17 Hitachi Chemical Co., Ltd Enhanced fc receptor-mediated tumor necrosis factor superfamily and chemokine mrna expression in peripheral blood leukocytes in patients with rheumatoid arthritis
CN101410714A (zh) * 2006-04-07 2009-04-15 日立化成工业株式会社 在克罗恩病患者的外周血白细胞中T细胞受体介导的肿瘤坏死因子超家族与趋化因子mRNA增强的表达
AU2007309726A1 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
EP2015783A4 (en) * 2006-05-08 2010-07-21 Hitachi Chemical Co Ltd METHOD FOR TESTING THE SENSITIVITY OF A MEDICINAL PRODUCT IN SOLID TUMORS BY QUANTIFYING THE EXPRESSION OF mRNA IN THIN CUTS OF TUMOR TISSUE
WO2007143669A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-13 California Institute Of Technology Real time micro arrays
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US8048626B2 (en) 2006-07-28 2011-11-01 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US7993832B2 (en) * 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008140484A2 (en) * 2006-11-09 2008-11-20 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
JP2008180677A (ja) * 2007-01-26 2008-08-07 Konica Minolta Medical & Graphic Inc マイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラム
WO2008090759A1 (ja) * 2007-01-26 2008-07-31 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. マイクロ総合分析システム
WO2008096562A1 (ja) * 2007-02-06 2008-08-14 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. マイクロチップ検査システム、マイクロチップ、マイクロチップ検査装置及びプログラム
WO2008103702A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Investigen, Inc. Methods and compositions for rapid light-activated isolation and detection of analytes
WO2008106451A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
WO2008137762A2 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosis and treatment of crohn's disease
WO2010039931A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using il17rd and il23-il17 pathway genes to diagnose crohn's disease
US8486640B2 (en) 2007-03-21 2013-07-16 Cedars-Sinai Medical Center Ileal pouch-anal anastomosis (IPAA) factors in the treatment of inflammatory bowel disease
EP3091088B1 (en) 2007-03-28 2019-02-06 Signal Diagnostics System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations
US20100184050A1 (en) * 2007-04-26 2010-07-22 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease in the puerto rican population
CN101970451A (zh) * 2007-07-26 2011-02-09 塞雷公司 高度可见的染色体特异性探针及相关方法
AU2008283902B2 (en) 2007-08-06 2014-03-13 Orion Genomics Llc Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the IGF2 gene
JP2009077712A (ja) 2007-09-11 2009-04-16 F Hoffmann La Roche Ag B−Rafキナーゼ阻害剤に対する感受性についての診断試験
US8034568B2 (en) * 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US20090215064A1 (en) * 2008-02-27 2009-08-27 Hitachi Chemical Co., Ltd. Quantitative assessment of individual cancer susceptibility by measuring dna damage-induced mrna in whole blood
KR101419980B1 (ko) * 2008-03-15 2014-07-15 홀로직, 인크. 증폭 반응 도중에 핵산 분자를 분석하기 위한 조성물 및 방법
GB2470672B (en) 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
US10669574B2 (en) 2008-11-18 2020-06-02 XCR Diagnostics, Inc. DNA amplification technology
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
US9580752B2 (en) 2008-12-24 2017-02-28 Cedars-Sinai Medical Center Methods of predicting medically refractive ulcerative colitis (MR-UC) requiring colectomy
ES2544265T3 (es) 2009-02-11 2015-08-28 Orion Genomics, Llc Combinaciones de polimorfismos para determinar la expresión específica de alelo de IGF2
US20160348158A1 (en) * 2009-08-14 2016-12-01 Roche Molecular System, Inc. Format of Probes to Detect Nucleic Acid Differences
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
BR112014004763A2 (pt) 2011-08-31 2017-03-21 Hoffmann La Roche método de determinação da susceptibilidade de pacientes ao desenvolvimento da hipertensão, composição farmacêutica, kit de condução, método de redução e método de tratamento de pacientes
WO2013030167A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
KR20140064971A (ko) 2011-09-19 2014-05-28 제넨테크, 인크. c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 포함하는 조합 치료
KR20140096073A (ko) 2011-11-23 2014-08-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 혈관신생 억제제에 대한 반응성
US10294529B2 (en) 2012-04-10 2019-05-21 Life Sciences Research Partners Vzw Microsatellite instability markers in detection of cancer
US10633707B2 (en) 2012-04-10 2020-04-28 Vib Vzw Markers for detecting microsatellite instability in cancer and determining synthetic lethality with inhibition of the DNA base excision repair pathway
US9828629B2 (en) 2013-03-15 2017-11-28 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage
CN112870368A (zh) 2013-03-27 2021-06-01 西达-赛奈医疗中心 通过抑制tl1a的功能和相关信号传导途径来减轻并逆转纤维化和炎症
EP4105236A1 (en) 2013-07-19 2022-12-21 Cedars-Sinai Medical Center Anti-tl1a (tnfsf15) antibody for treatment of inflammatory bowel disease
US20160161472A1 (en) 2013-07-30 2016-06-09 President And Fellows Of Harvard College Quantitative dna-based imaging and super-resolution imaging
CN105793435A (zh) 2013-10-09 2016-07-20 弗洛雷森特里克公司 多重探针
US9637791B2 (en) 2013-12-20 2017-05-02 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage
US20150176060A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method For Coding Of Multiple PCR Reactions For Assay Recognition
US9243289B2 (en) 2013-12-23 2016-01-26 Roche Molecular Systems, Inc. Method for screening reagents used in PCR assays
RU2662969C2 (ru) * 2014-03-11 2018-07-31 Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж Высокопроизводительная и высокомультиплексная визуализация при помощи программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот
US20160053302A1 (en) 2014-04-22 2016-02-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method for visual identification of pcr solutions for accurate reaction setup
EP4015649A1 (en) 2014-07-10 2022-06-22 Fluoresentric, Inc. Dna amplification technology
US11708608B2 (en) 2014-11-10 2023-07-25 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for IL-33-mediated disorders
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
JP6630742B2 (ja) 2015-08-17 2020-01-15 クラ オンコロジー, インコーポレイテッド ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を用いて癌患者を治療する方法
DE112016003948T5 (de) 2015-08-31 2018-05-09 City Of Sapporo Molekulare verfahren zum beurteilen einer urothelialen erkrankung
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
US11186872B2 (en) 2016-03-17 2021-11-30 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing inflammatory bowel disease through RNASET2
US20190119758A1 (en) 2016-04-22 2019-04-25 Kura Oncology, Inc. Methods of selecting cancer patients for treatment with farnesyltransferase inhibitors
ES2929367T3 (es) 2016-05-18 2022-11-28 Hoffmann La Roche Amplificación por PCR ultrarrápida cuantitativa usando un dispositivo basado en electrohumectación
KR102468174B1 (ko) 2016-09-15 2022-11-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 멀티플렉스 pcr 수행 방법
MX2019005065A (es) 2016-11-03 2019-08-21 Kura Oncology Inc Metodos de tratamiento de pacientes con cancer con inhibidores de farnesiltransferasa.
US11031099B2 (en) 2016-11-09 2021-06-08 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of sequence variants
EP3432883B1 (en) 2017-02-21 2021-07-28 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US10137121B2 (en) 2017-02-21 2018-11-27 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
CA3176529C (en) 2017-03-24 2024-03-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of viral pathogens in samples
US10806730B2 (en) 2017-08-07 2020-10-20 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
BR112020002591A2 (pt) 2017-08-07 2020-07-28 Kura Oncology, Inc. método para o tratamento de câncer
EP3749362A1 (en) 2018-02-09 2020-12-16 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
WO2020092720A2 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
WO2020180663A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
JP2022525322A (ja) 2019-03-14 2022-05-12 インシリクサ, インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
AU2020254492A1 (en) 2019-03-29 2021-11-11 Kura Oncology, Inc. Methods of treating Squamous Cell Carcinomas with farnesyltransferase inhibitors
WO2020205387A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US20220305001A1 (en) 2019-05-02 2022-09-29 Kura Oncology, Inc. Methods of treating acute myeloid leukemia with farnesyltransferase inhibitors
WO2021180858A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Medimmune Limited Therapeutic methods for the treatment of subjects with risk alelles in il33
WO2022136477A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for performing multiplexed real-time pcr with the use of large stokes shift fluorescent dyes
WO2023104812A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Mass based detection of pcr amplicons

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4257774A (en) * 1979-07-16 1981-03-24 Meloy Laboratories, Inc. Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA
US5102784A (en) * 1990-05-04 1992-04-07 Oncor, Inc. Restriction amplification assay
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP0487218B1 (en) * 1990-10-31 1997-12-29 Tosoh Corporation Method for detecting or quantifying target nucleic acid
US5994056A (en) * 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
JPH06153997A (ja) * 1992-11-27 1994-06-03 Canon Inc 検出信号増幅による標的核酸の検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69531133D1 (de) 2003-07-31
DK0699768T3 (da) 2003-10-20
ATE243759T1 (de) 2003-07-15
US5491063A (en) 1996-02-13
DE69531133T2 (de) 2004-05-06
JPH0870876A (ja) 1996-03-19
CA2157200C (en) 2008-10-14
PT699768E (pt) 2003-10-31
CA2157200A1 (en) 1996-03-02
EP0699768A1 (en) 1996-03-06
EP0699768B1 (en) 2003-06-25
ES2202333T3 (es) 2004-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3795557B2 (ja) 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法
KR100431421B1 (ko) 형광표지된올리고뉴클레오타이드프로브의용액중에서의켄칭방법
US5538848A (en) Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AU665185B2 (en) Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5925517A (en) Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6251600B1 (en) Homogeneous nucleotide amplification and assay
EP0870063B1 (en) Fluorescence detection assay for homogeneous pcr hybridization systems
US6818420B2 (en) Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
JP2004511227A (ja) 核酸の同種内検出用の特異的二本鎖プローブおよびその適用方法
US20060194222A1 (en) Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection
EP1829964A1 (en) Method of examining gene sequence
WO2022264174A1 (en) A method to amplify and detect target nucleic acids with very high specificity and sensitivity
EP1086245B1 (en) Multi-fluorescent hairpin energy transfer oligonucleotides
Beacons The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050621

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20050920

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20050927

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20051221

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060207

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060217

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20060314

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060413

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090421

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100421

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110421

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110421

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120421

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120421

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130421

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130421

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140421

Year of fee payment: 8

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term