JP4772055B2 - mRNAの定量により薬剤の投与を選定する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、薬剤の投与を選定する方法に関する。この方法では、患者の全血を薬剤に暴露する。薬剤に暴露後、及び対照ビヒクルのみに暴露後、この薬剤の効果に結び付いたマーカーmRNAのレベルを白血球で測定する。薬剤暴露後のmRNAレベルを、対照ビヒクル暴露後の値、又は薬剤暴露前に測定した値と比較することによって、この薬剤が患者に効果的であるか否かを判定することが可能である。多くの考えられる治療薬剤に対して、患者の血液をスクリーニングすることによって、特定の患者に対して選定された最適化治療プロトコルを開発することが可能である。
本出願は、2004年10月20日に出願された米国仮特許出願第60/620,603号、2005年2月16日に出願された同第60/653,557号及び2005年6月8日に出願された同第60/688,741号に対して優先権を主張する。
本出願は、別個の配列リストを含む。
薬局方は、医者にほとんどの疾病に対する幾つかの考えられる治療剤を提供している。しかし、個々の治療剤の有効性は、患者ごとに大いに異なる。概して、特定の疾病に対してあまり効果的ではないとされる薬剤が、事実、この疾病に冒された特定の患者には非常に効果的であることがある。したがって医者及び患者にとって、どの薬剤又は薬剤の組み合わせがそれぞれの患者に最も適しているか、また副作用を引き起こすことなく最大限の効果を導くために、どのくらいの用量を個人に合わせて投与すべきかを予め決定することができることは非常に有益なことであろう。このような決定をする能力は、一般的に「個別的医療(tailored medicine)」と呼ばれるが、現在では一般に実用的なものではない。
者に効果的な薬剤レジメンを特定することができる。
の患者間でも異なり、これらの2つの薬剤の1つに対してより良好な反応を示す患者もいる。これらの薬剤の一次作用がインターロイキン−2(IL−2)mRNAの転写を阻害することであるので、リンパ球中のIL−2 mRMAのレベルを定量することは理にかなっている。しかし、主にmRNAを取り扱うことが難しいという理由で、用いられている方法は通常の臨床試験としては適切ではない。また、アッセイの多くの変動は患者ごとの変動を特定するのに適切ではない。
本発明は、候補薬剤で患者の全血を刺激した後に白血球で測定されるマーカーmRNAのレベルに基づいて個々の患者の薬剤プロトコルを選定する方法を開示する。
連する第2のmRNAの量を測定し、薬剤の第1の効果は血液細胞のアポトーシスであり、第1のmRNAがPUMA遺伝子産物をコードし、薬剤の第2の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、第2のmRNAがp21遺伝子産物をコードする。
カルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法を含み、この方法は、4時間以内、薬剤に患者の全血を暴露すること;4時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること;これらの暴露後に、血液細胞におけるp21遺伝子産物をコードするmRNA、BAX遺伝子産物をコードするmRNA、及びPUMA遺伝子産物をコードするmRNAからなる群から選択されるmRNAの量を測定すること;対照ビヒクルの暴露後に得られた測定結果を薬剤の暴露後に得られた測定結果と比較すること;及び比較の結果に基づいた薬剤に対する反応性を確認することを含み、mRNAの量の変化が薬剤に対する患者の反応性を表す、方法を含む。
本方法では、医薬の作用による白血球の細胞死がp21 mRNA及びBAX mRNAの転写レベルに関連している。これらの2つのマーカーmRNAの中で、p21は細胞周期停止に関与し、BAXはアポトーシスの初期信号として誘導される。薬剤が癌細胞においてp21を誘導する場合、この薬剤が細胞増殖抑制作用を発揮することを示している。一方、BAXを誘導する場合は、この薬剤が殺細胞作用を有することを示している。アポトーシスの進行中、多くの遺伝子が関与するが、これらの2つの初期遺伝子マーカーの発現は薬剤の細胞毒性作用を表す。
でプライム化されたcDNAが溶液中に存在し、残留したオリゴ(dT)プライム化cDNAはマイクロプレートに固定化された。TaqManPCRでは(図1、図3、図4)、得られたcDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移し、これにTaqMan universal master mix(ABI)5μl、及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMの順方向プライマー及び逆方向プライマー、及び3〜6μMのTaqManプローブ)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、55℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。SYBR Green PCRでは(図6を参照)、cDNAを水で3〜4倍に希釈し、cDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移して、これにmaster mix(BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ)5μl及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMの順方向プライマー及び逆方向プライマー)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。Ctを解析用ソフトウェア(SDS、ABI)で測定した。
l)、VepがVepesidを表し(5μg/ml)、RanがRanda(シスプラチン)を表し(1μg/ml)、RitがRituxanを表し(200μg/ml)、FidがFildesinを表し(10ng/ml)、TerがTherarubicinを表し(50ng/ml)、ParがParaplatinを表し(5μg/ml)、EndがEndoxanを表す(1μg/ml)。静脈内投与後1〜4時間の血液レベルに基づいて、これらの濃度を決定した。黒色のバーはp<0.001を表し、淡灰色のバーはp<0.05を表す。
mRNA発現を測定することによって、感受性のある薬剤を同定した。アッセイの変動が非常に小さく、開始材料が全血の三重アリコートであったので、この結果は統計的に有意であった。興味深いことに、感受性のある薬剤のリストは2人の患者間で異なっていたけれども、患者は両方ともB細胞の特性を伴う非ホジキンリンパ腫を有していた。これらの薬剤の選択は、このmRNA試験なしでは達成することはできない。したがって、この試験は血液癌に対する薬剤を選定するための有力なツールになるだろう。
mRNAの使用
2001年のほとんど同時期に3つの独立したグループによって、PUMA又はBcl−2結合成分3(bbc3)が発見され、それぞれ、GenBank寄託番号HSU82987、AF332558、及びAF354656が与えられた。GenBank情報によれば、これらの配列はそれぞれ、1996年12月、2000年12月、及び2001年3月に提出され、最も古いエントリーであるUniGene(Hs.467020)はこの遺伝子の表記としてbb3を使用した。多くの出版物では、bbcではなく、PUMA(アポトーシスのp53調節因子)が使用されている。これは全ての細胞型において普遍的に発現するものではなく、UniGene(Hs.467020)の発現プロファイルデータによれば、血液、頸部、結腸、眼、腎臓、喉頭、肺、乳腺、卵巣、肌、小腸、胃、及び睾丸で発現する。また、PUMAは、マウスにおける薬剤誘導性のアポトーシスの主要なメディエーターであることが報告されている。PUMAは、各実験系で広く特徴付けられたが、未だにヒト血液の白血球におけるPUMA mRNAと他のプロアポトーシスmRNAとの間に何ら関係性が示されていない。血液における初期アポトーシス信号の検出が、血液の疾病の患者それぞれに対して効果的な抗癌剤の同定のための新たな診断の開発につながることが期待されるので(図8を参照)、血液は特に重要である。さらに、固形癌に対する抗癌剤には、致命的になることもある白血球における幾つかの副作用を誘導するものもある。したがって、血液及び標的薬剤のex vivoでのインキュベーションによって、個々の薬剤毒性を予測することができる。特定の薬剤に対して反応性のある個体又は非反応性の個体の同定は、薬剤の開発の進展に有用であると思われる。
A)150μlで洗浄した。1×RT緩衝液、それぞれ1.25mMのdNTP、4ユニットのrRNasin、及び80ユニットのMMLV逆転写酵素(Promega)(プライマーなし)を含む緩衝液30μlを添加し、37℃で2時間インキュベートすることによって、cDNAを各ウェルで直接合成した。特定のプライマーでプライム化されたcDNAが溶液中に存在し、残留したオリゴ(dT)プライム化cDNAがマイクロプレートに固定化された。TaqManPCRでは(図1、図3、図4)、得られたcDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移し、これにTaqMan universal
master mix(ABI)5μl、及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのファワードプライマー及びリバースプライマー、及び3〜6μMのTaqManプローブ)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、55℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。SYBR Green PCRでは(図6を参照)、cDNAを水で3〜4倍に希釈し、cDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移して、これにmaster mix(BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ)5μl及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのファワードプライマー及びリバースプライマー)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。Ctを解析用ソフトウェア(SDS、ABI)で測定した。1×Rt緩衝液を陰性対照として使用したが、どのプライマー対もこれらの実験条件下で非特異的なプライマー二量体を生成しなかった。図8におけるPUMAに関して、オリゴ(dT)固定化マイクロプレート上で固定化されたcDNAをiCycler(BioRad)で直接増幅した。
ル50μlを各ウェルに加え、直ちに4℃で2分間、120×gで遠心分離して、続いて4℃で5分間、2,000×gで一回遠心分離して各ウェルをPBS300μlで洗浄した。それから、例えば、0.5%N−ラウロイルサルコシン、4×SSC、10mMのトリスHCl(pH7.4)、1mMのEDTA、0.1%IGEPAL CA−630、及び1.791Mのチオシアン酸グアニジンを含み、1%の2−メルカプトエタノール(Bio Rad、米国カルフォルニア州ハーキュリーズ)、0.5mg/mlのプロテイナーゼK(Pierce、米国イリノイ州ロックフォード)、0.1mg/mlのサケ精子DNA(5 Prime Epperndorf/Brinkmann、米国ニューヨーク州ウェストベリー)、0.1mg/mlのE.コリのtRNA(Sigma)、表1で示される特定のリバースプライマーをそれぞれ10mM含有するカクテル、及び標準的なRNA34オリゴヌクレオチドで補充されたストック溶解緩衝液60μlをフィルタープレートに加えて、37℃で10分間インキュベートした。それから、フィルタープレートをオリゴ(dT)固定化マイクロプレート(GenePlate、RNAture)の上に置いて、4℃で5分間、2,000×gで遠心分離した。4℃で一晩保存した後に、マイクロプレートを単純な溶解緩衝液100μlで3回、続いて4℃で洗浄緩衝液(0.5MのNaCl、10mMのトリス(pH7.4)、1mMのEDTA)150μlで3回洗浄した。1×RT緩衝液、それぞれ1.25mMのdNTP、4ユニットのrRNasin、及び80ユニットのMMLV逆転写酵素(Promega)(プライマーなし)を含む緩衝液30μlを添加し、37℃で2時間インキュベートすることによって、cDNAを各ウェルで直接合成した。特定のプライマーでプライム化されたcDNAが溶液中に存在し、残留したオリゴ(dT)プライム化cDNAがマイクロプレートに固定化された。TaqManPCRでは(図1、図3、図4)、得られたcDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移し、これにTaqMan universal master mix(ABI)5μl、及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのファワードプライマー及びリバースプライマー、及び3〜6μMのTaqManプローブ)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、55℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。SYBR Green PCRでは(図2を参照)、cDNAを水で3〜4倍に希釈し、cDNA溶液4μlを384ウェルPCRプレートに直接移して、これにmaster mix(BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ)5μl及びオリゴヌクレオチドカクテル(それぞれ15μMのファワードプライマー及びリバースプライマー)1μlを加えて、95℃で10分を1サイクル、続いて95℃で30秒、及び60℃で1分を45サイクルで、PRISM 7900HT(ABI)によってPCRを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。一定量のPCR産物を生成したPCRサイクルをCtとして、刺激したサンプルのCt値から非刺激サンプル(PBS又はDMSOビヒクル)のCt値を差し引いて、デルタCt(ΔCt)として結果を示した。Ctは対数目盛りであるので、1ΔCtは、一般的に2倍又は1/2量を意味し、負のΔCtは発現の増大を意味する。分析用ソフトウェア(SDS、ABI)でCtを決定した。また、このアッセイを確認するために、スパイクRNAを定量した。1×Rt緩衝液を陰性対照として使用したが、どのプライマー対もこれらの実験条件下で非特異的なプライマー二量体を生成しなかった。図8におけるPUMAに関して、オリゴ(dT)固定化マイクロプレート上で固定化されたcDNAをiCycler(BioRad)で直接増幅した。
であった。このことにより、このアッセイは再現性があり、信頼できるものであったことが確認された。p21はDNA損傷の間、転写因子p53の活性化によって誘導されることが知られているので、実験条件を確認するのに使用した。何の刺激もなくとも、p21
mRNAは増加したが、p21のレベルは全て、これらの3つの刺激後に有意に増大した(図5B)。VP−16が約2〜4時間をピークに一時的な誘導を示したのに対し、血液を放射線又はBLMで刺激したとき、p21のレベルは8時間連続して増大した(図5B)。目的が初期遺伝子マーカーを同定することであったので、インキュベーションを37℃、4時間で固定した。それから、SYBR greenリアルタイムPCRによって様々なプロアポトーシスmRNAをスクリーニングするのに、cDNAを使用した。この様々なプロアポトーシスmRNAのスクリーニングの結果を図6に示す。この図では、30Gyの放射線(A)、20μMのBLM(B)、若しくは100μMのVP−16(C)で、又はそれらなしで、37℃で4時間、ヘパリン処理された全血を刺激し、それから様々なmRNAを定量した。各バーは、それぞれの人の全血の三重アリコートから得られたΔCtの平均±標準偏差であった(放射線に関して5(Bcl−2及びBcl−wに関して3)、BLM及びVP−16に関して3)。図6で示されるように、全ての試験した個体(放射線に関して5(Bcl−2及びBcl−wに関して3)、BLM及びVP−16に関して、それぞれ3)が、2より大きいΔCtで、有意なp21の誘導を示した。また、Baxも誘導されたが、ΔCtはp21のものより小さかった(図6)。さらに、本明細書で記載されている方法でBAXを用いることはできるが、1個体又は2個体で誘導されなかったので、Baxは完全に信頼できるマーカーではなかった。PUMAは、p21のmRNAと同様の結果を伴う最も優性なmRNAであり、全ての個体で反応が確認された(図6)。NOXAもまた全ての個体で誘導されたが、誘導の程度はPUMAのものより小さかった(図6)。その結果、アポトーシスそれによる薬剤効果を表すのに測定されるマーカーの中で、本方法では、PUMA、NOXA、及びBAX全てを用いることができ、最も好ましいmRNAはPUMAである。これらのmRNAを用いたが、本発明はまた、上記のようなBcl−2/Baxファミリー及びBH3−only Bcl−2ファミリーの他のメンバーの使用も意図している。さらにまた、医薬に対する癌細胞の感受性を表す他のmRNAの使用も意図している。例えば、ATP結合カセット(ABS)サブファミリーA〜GのmRNAを使用することができる。これらの遺伝子が膜を通過する生体分子のトラフィッキング及び生態異物に対する宿主防御メカニズムに関与する膜トランスポータータンパク質をコードする。具体的には、この遺伝子としては、ABCA1、ABCA2変異型1、ABCA2変異型2、ABCA3、ABCA4、ABCA5変異型1、ABCA5変異型2、ABCA6変異型1、ABCA6変異型2、ABCA7変異型1、ABCA7変異型2、ABCA8、ABCA9変異型1、ABCA9変異型2、ABCA10、ABCA12変異型1、ABCA12変異型2、ABCA13、ABCB1、TAP1、TAP2変異型1、TAP2変異型2、ABCB4変異型A、ABCB4変異型B、ABCB4変異型C、ABCB5、ABCB6、ABCB7、ABCB8、ABCB9変異型1、ABCB9変異型2、ABCB9変異型3、ABCB9変異型4、ABCB10、ABCB11、ABCC1変異型1、ABCC1変異型2、ABCC1変異型3、ABCC1変異型4、ABCC1変異型5、ABCC1変異型6、ABCC1変異型7、ABCC2、ABCC3変異型MRP3、ABCC3変異型MRP3A、ABCC3変異型MRP3B、ABCC4、ABCC5変異型1、ABCC5変異型2、ABCC6、ABCC8、ABCC9変異型SUR2A、ABCC9変異型SUR2B、ABCC9変異型SUR2A−デルタ−14、ABCC10、ABCC11変異型1、ABCC11変異型2、ABCC11変異型3、ABCC12変異型A、ABCC12変異型B、ABCC12変異型C、ABCC12変異型D、ABCC12変異型E、ABCC13変異型1、ABCC13変異型2、ABCC13変異型3、ABCC13変異型4、ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCD4変異型1、ABCD4変異型2、ABCD4変異型3、ABCD4変異型4、ABCD4変異型5、ABCF1変異型1、ABCF1変異型2、ABCF2変異型1、ABCF2変異型2、ABCF3、ABCE1、ABCG1変
異型1、ABCG1変異型2、ABCG1変異型3、ABCG1変異型4、ABCG1変異型5、ABCG1変異型6、ABCG1変異型7、ABCG2、ABCG4、ABCG5、及びABCG8が挙げられる。これらの中で、特に好ましいmRNAは、ビンブラスチンを基質とするABCC2遺伝子産物、及び癌多剤耐性に関与する候補タンパク質として同定されているABCG2遺伝子産物に関するmRNAである。
健常なボランティア、又は白血病及びリンパ腫の患者から血液サンプルを得た。ヘパリン処理された全血それぞれ50μLの三重アリコートを特定期間、様々な濃度の抗癌剤(BLM、VP−16、及びタキソール)とインキュベートし、それからmRNAを精製して、cDNAを合成し、上記のようにTaqManリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってp21、PUMA、及びBAXのレベルを定量した。簡潔に述べると、それぞれの血液サンプルを96ウェルフィルタープレートに加えて白血球を捕捉した。人工RNA(RNA34)及び特定のプライマーのカクテルを含む溶解緩衝液をフィルタープレートに加えて、ハイブリダイゼーションのために、細胞溶解物をオリゴ(dT)固定化マイクロプレート(GenePlate、RNAture、カルフォルニア州アービン)に移した。それから、さらにプライマーを加えることなく、オリゴ(dT)固定化マイクロプレートでDNAを合成し、384ウェルプレート(Applied Biosystems、カルフォルニア州フォスターシティ)でのTaqManリアルタイムPCRのために使用した。各アッセイ条件を確認するために、スパイクRNAも定量した。プライマー及びプローブの配列をPrimer Express(Applied Biosystems)及びHYBsimulator(RNAture)で設計した。使用した配列を以下の表2に示す。
1及びPUMA両方を誘導した(図10A、図10C)。この図では、ヘパリン処理された全血50μLそれぞれの三重アリコートを37℃で2時間、0.2μMのBLM(△)、2μMのBLM(◇)、又は20μMのBLM(●)とインキュベートした。それから、p21 mRNA(A、B)及びPUMA mRNA(C、D)のレベルを上記のように決定した。A及びCでは、非刺激サンプルのCt値(X軸)と刺激したサンプルのCt値(Y軸)とを比較した。点線及び実線は、図9と同じである。B及びDでは、刺激したサンプルのCt値から非刺激サンプルのCt値を差し引いて、ΔCtを算出した。この図では、○は非反応性のサンプルを表し、●は中程度の反応性のサンプルを表し(Bではn=22、Dではn=20)、▲は高い反応性のサンプルを表す。各データは、各個体の全血の三重アリコートから得られる平均を表す。
Ctを算出した。各データは、各個体の全血の三重アリコートから得られる平均を表す。100μMより大きいと血液レベルを超えるので、タキソールを100μMより大きい濃度では使用しなかった。
voでの全血のアッセイはCVを増加させる多くの因子を伴う。例えば、粘性の全血のピペッティング、RNA単離ステップ、cDNA合成反応及びPCR全てが変動を引き起こす。PCRが標的遺伝子を指数関数的に増幅させるので、任意のステップにおける小さな変動も、最終的には容認できないぐらい広くなる。さらに、ΔCtの変動が2つのアッセイの多重合計であるので、その変動はより大きくなる。全血の三重アリコートを開始材料として使用し、ΔCtを算出するときでさえ、本方法は極めて小さい変動を示している。結果として、これは、p21、PUMA、及びBAXの薬剤誘導性の発現誘導の極めて小さい変化を同定することが可能である。
本発明の薬剤投与を選定する方法が臨床的に有用な結果をもたらしたことを示すために、白血病及びリンパ腫の様々な病態を患う9人の患者の研究において上記の方法を用いた。患者集団を以下の表3に示す。この表では、「FL」は濾胞性リンパ腫を表し、「MCL」はマントル細胞リンパ腫を表し、「AML」は急性骨髄性白血病を表し(M2はこの段階を表す)、「T−」はT細胞系を表し、「ALL」は急性リンパ芽球性白血病を表す。
患者の白血球におけるp21、BAX、及び幾つかの場合、PUMAのレベルを測定した。対照の血液サンプルを対照のビヒクル溶媒(表4で示される、DMSO又はPBS)のみに暴露して、上記のように測定したmRNA値からCt及びΔCtを得た。
による治療中の患者の白血球の増殖停止又はアポトーシスに起因するものであると考えられる。
健常な成人、乾癬患者(4)、再生不良性貧血患者(1)、ネフローゼ症候群患者(1)、及び骨髄移植した患者(2)から血液を得た。白血球数測定のために、採血時に、1つのEDTAチューブを臨床検査室に送り、1つのヘパリンチューブを氷上に保存した。37℃で様々な期間、CsAの存在下、及び非存在下で、血液アリコートをフィトへムアグルチニン−P(PHA−P)で刺激した。血液サンプル50μLをフィルタープレートの3つの異なるウェル(最初から三重)に加えて、800×gで2分間の遠心分離によりこの膜上の白血球を計測した。遠心分離によってリン酸緩衝生理食塩水(PBS)300μLで各ウェルを一回洗浄した後、上記の溶解緩衝液を各ウェルに加え、37℃で10分間インキュベートして、捕捉した白血球からmRNAを取り出した。それから、2,000×gで5分間、遠心分離することによって、オリゴ(dT)固定化マイクロプレート(GenePlate、RNAture、カルフォルニア州アービン)に溶解物を移して、ハイブリダイゼーションのために4℃で一晩インキュベートした。溶解緩衝液100μLで3回、続いて洗浄緩衝液150μL(10mMのトリス(pH7.4)、1mMのEDTA(pH8.0)、及び0.5MのNaCl)で3回、各ウェルを洗浄した後、緩衝液、ヌクレオチド、特定のプライマーを有するカクテル、RNasin、及びMMLV逆転写酵素(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を添加することにより、各ウェルで、37℃で2時間インキュベートし、cDNAを合成した。得られたcDNA(4μL)をサーマルサイクラー(ABI、PRISM 7900)を使用した384ウェルマイクロプレートでの最終量10μLにおけるTaqManリアルタイムPCRに使用した。
Claims (12)
- 薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
7時間以内、ex vivoで患者の全血を薬剤に暴露すること;
暴露後に、Bcl−2/Bax遺伝子ファミリー、BH3−only Bcl−2遺伝子ファミリーおよびp21からなる群より選択される、血液細胞における該薬剤の効果に関連する遺伝子のmRNAの量を測定すること;及び
該測定の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該mRNAの量の変化が該薬剤に対する該患者の反応性を示し、
該薬剤が抗癌剤であり、
該患者が固形癌、白血病、または白血病性リンパ腫の患者であり、
且つ、該血液細胞における該薬剤の効果に関連する遺伝子が、p21および/またはPUMA遺伝子である、方法。 - 暴露前に、血液細胞に存在するmRNAの量を測定し、暴露前に測定したmRNAの量と暴露後に測定したmRNAの量とを比較することにより該mRNAの量の変化を求める、請求項1に記載の方法。
- 7時間以内、ex vivoで患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること;
暴露後に、該対照ビヒクルに暴露した全血における前記薬剤の効果に関連するmRNAの量を測定すること;
該対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を前記薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較して該薬剤に対する反応性を確認すること、
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記対照ビヒクルがリン酸緩衝生理食塩水及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記患者の全血を暴露することがヘパリンの添加を含む、請求項1〜4のいずれか一項
に記載の方法。 - 5時間以内、前記全血を刺激する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 2〜4時間、前記全血を刺激する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤の効果が血液細胞のアポトーシスである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤の効果が血液細胞における細胞周期停止である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 血液細胞における前記薬剤の第二の効果に関連する第二のmRNAの量を測定することをさらに含み、
前記薬剤の第一の効果が血液細胞のアポトーシスであり、第一のmRNAが前記PUMA遺伝子産物をコードし;
前記薬剤の第二の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、第二のmRNAがp21遺伝子産物をコードする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記薬剤がエトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、5−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- エトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、5−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
4時間以内、ex vivoで患者の全血を該薬剤に暴露すること;
4時間以内、ex vivoで患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること;
前記暴露後に、血液細胞におけるp21遺伝子産物をコードするmRNA及びPUMA遺伝子産物をコードするmRNAからなる群から選択されるmRNAの量を測定すること;
対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を該薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較すること;及び
該比較の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該mRNAの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表し、
該患者が固形癌、白血病、または白血病性リンパ腫の患者である、方法。
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