JP2000316587A - 核酸プローブ - Google Patents
核酸プローブInfo
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡの増幅及びＲＮＡの増幅等、標的核酸を
鋳型とする相補核酸の合成反応を伴う核酸増幅反応時に
共存しても、その３’末端からの核酸伸長反応を生じな
い核酸プローブを提供すること。 【解決手段】特定核酸配列に相補的な塩基配列を有し、
該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するように標識された一本鎖核酸であって、その
３’末端が該プローブの伸長反応を生じないように修飾
されていることを特徴とする核酸プローブ。
鋳型とする相補核酸の合成反応を伴う核酸増幅反応時に
共存しても、その３’末端からの核酸伸長反応を生じな
い核酸プローブを提供すること。 【解決手段】特定核酸配列に相補的な塩基配列を有し、
該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するように標識された一本鎖核酸であって、その
３’末端が該プローブの伸長反応を生じないように修飾
されていることを特徴とする核酸プローブ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子診断等の臨
床診断分野での利用並びに未知遺伝子の探索等の分野で
の利用に有用な核酸プローブと、該核酸プローブを用い
る、特定の核酸配列を有するＤＮＡやＲＮＡ等の標的核
酸の存在又は存在量を分析するための分析方法に関する
ものである。
床診断分野での利用並びに未知遺伝子の探索等の分野で
の利用に有用な核酸プローブと、該核酸プローブを用い
る、特定の核酸配列を有するＤＮＡやＲＮＡ等の標的核
酸の存在又は存在量を分析するための分析方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】生体成分の分析には、高い特異性が求め
られる。試料中に含まれる（と予想される）特定の核酸
配列を含む標的核酸の存在を検出したり存在量を測定す
るといった標的核酸の分析においても、同様に高い特異
性が求められるが、標的核酸を特異的に分析するために
は標的核酸中の特定核酸配列に相補的な配列を有し、こ
れにより標的核酸中の特定核酸配列部分と配列特異的に
複合体を形成し得る一本鎖オリゴヌクレオチド（核酸プ
ローブ）が用いられる。
られる。試料中に含まれる（と予想される）特定の核酸
配列を含む標的核酸の存在を検出したり存在量を測定す
るといった標的核酸の分析においても、同様に高い特異
性が求められるが、標的核酸を特異的に分析するために
は標的核酸中の特定核酸配列に相補的な配列を有し、こ
れにより標的核酸中の特定核酸配列部分と配列特異的に
複合体を形成し得る一本鎖オリゴヌクレオチド（核酸プ
ローブ）が用いられる。
【０００３】核酸プローブを用いる標的核酸の分析で
は、標的核酸と配列特異的に複合体を形成した核酸プロ
ーブを検出するために、例えば核酸プローブを光学的に
検出可能な標識物質と結合して使用することが−般的で
ある。ここで、核酸プローブを用いる標的核酸の分析で
は、検出感度が高感度であることも求められる。特に、
例えばＨＣＶやＨＩＶ等のウイルス核酸を標的核酸とす
る感染症の診断では、血液等の臨床試料中の標的核酸
（ウイルス核酸）は極微量であることが多い。このた
め、核酸プローブの標識物質として酵素等を用いると共
にその基質として化学発光物質を用いたり、また、二本
鎖核酸の各塩基対の間にインターカレートするインター
カレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させた核
酸プローブも提案されている（特願平７−１８５５９９
号、ＥＰ第７１４９８６号公報）。
は、標的核酸と配列特異的に複合体を形成した核酸プロ
ーブを検出するために、例えば核酸プローブを光学的に
検出可能な標識物質と結合して使用することが−般的で
ある。ここで、核酸プローブを用いる標的核酸の分析で
は、検出感度が高感度であることも求められる。特に、
例えばＨＣＶやＨＩＶ等のウイルス核酸を標的核酸とす
る感染症の診断では、血液等の臨床試料中の標的核酸
（ウイルス核酸）は極微量であることが多い。このた
め、核酸プローブの標識物質として酵素等を用いると共
にその基質として化学発光物質を用いたり、また、二本
鎖核酸の各塩基対の間にインターカレートするインター
カレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させた核
酸プローブも提案されている（特願平７−１８５５９９
号、ＥＰ第７１４９８６号公報）。
【０００４】近年では、例えばＰＣＲ（ポリメレースチ
ェインリアクション）法等によって標的核酸を予め増幅
しておき、増幅された標的核酸に核酸プローブを結合さ
せる等して高感度化を図ることも盛んに行われている。
特に前記したインターカレーター性蛍光色素を標識物質
として用いた核酸プローブでは、標的核酸と核酸プロー
ブを混合した後に標的核酸と結合していないものを分離
することなく、従って従来からかかる分離のために使用
されてきた担体を用いることなく、標的核酸の分析を行
うことができるという特徴を有している。従って、例え
ばＰＣＲ等の増幅反応を該核酸プローブ共存下で行え
ば、増幅中又は増幅後に標的核酸の分析が可能となるう
え、増幅から分析までの操作過程でいかなる試薬も添加
する必要がないため、かかる−連の操作を密閉した容器
中で実施し、操作対象試料からエアロゾルが発生して他
の試料を汚染する可能性をも排除できる（特開平８−２
１１０５０号公報、特願平１０−１８６４３４号、ＥＰ
第７１４９８６号公報）。
ェインリアクション）法等によって標的核酸を予め増幅
しておき、増幅された標的核酸に核酸プローブを結合さ
せる等して高感度化を図ることも盛んに行われている。
特に前記したインターカレーター性蛍光色素を標識物質
として用いた核酸プローブでは、標的核酸と核酸プロー
ブを混合した後に標的核酸と結合していないものを分離
することなく、従って従来からかかる分離のために使用
されてきた担体を用いることなく、標的核酸の分析を行
うことができるという特徴を有している。従って、例え
ばＰＣＲ等の増幅反応を該核酸プローブ共存下で行え
ば、増幅中又は増幅後に標的核酸の分析が可能となるう
え、増幅から分析までの操作過程でいかなる試薬も添加
する必要がないため、かかる−連の操作を密閉した容器
中で実施し、操作対象試料からエアロゾルが発生して他
の試料を汚染する可能性をも排除できる（特開平８−２
１１０５０号公報、特願平１０−１８６４３４号、ＥＰ
第７１４９８６号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述の、例えばＰＣＲ
等の増幅反応を核酸プローブ共存下で行う方法では、従
来の方法に比較して密閉容器中で実施可能である等の優
れた効果を達成できる。ところが、単に核酸プローブを
共存させるのみで核酸の増幅を行うと、核酸プローブの
３’末端から核酸伸長反応が生じてしまい、その結果、
標的核酸が存在していない場合にも標識物質からの信号
が観察される場合がある。
等の増幅反応を核酸プローブ共存下で行う方法では、従
来の方法に比較して密閉容器中で実施可能である等の優
れた効果を達成できる。ところが、単に核酸プローブを
共存させるのみで核酸の増幅を行うと、核酸プローブの
３’末端から核酸伸長反応が生じてしまい、その結果、
標的核酸が存在していない場合にも標識物質からの信号
が観察される場合がある。
【０００６】ＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅を行う場合に
は、例えば核酸プローブの３’末端側に１又は２塩基程
度の標的核酸に対して相補的ではない塩基を導入すれば
良いことも知られている（特開平８−２１１０５０号公
報）。しかし、このような核酸プローブを、標的核酸が
ＲＮＡであり、プライマーと逆転写酵素を用い、該ＲＮ
Ａを鋳型として該ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成した
後、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモーター・プ
ライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行い、こうし
て合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作用
させて標的核酸であるＲＮＡを大量に合成するＲＮＡの
増幅方法に用いると、前記逆転写の際に核酸プローブの
３’末端からのＤＮＡ伸長反応が生じ、微弱ながら標識
物質からの信号が観察される場合があることが知見され
た。
は、例えば核酸プローブの３’末端側に１又は２塩基程
度の標的核酸に対して相補的ではない塩基を導入すれば
良いことも知られている（特開平８−２１１０５０号公
報）。しかし、このような核酸プローブを、標的核酸が
ＲＮＡであり、プライマーと逆転写酵素を用い、該ＲＮ
Ａを鋳型として該ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成した
後、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモーター・プ
ライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行い、こうし
て合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作用
させて標的核酸であるＲＮＡを大量に合成するＲＮＡの
増幅方法に用いると、前記逆転写の際に核酸プローブの
３’末端からのＤＮＡ伸長反応が生じ、微弱ながら標識
物質からの信号が観察される場合があることが知見され
た。
【０００７】そこで本願発明の目的は、上記ＤＮＡの増
幅及びＲＮＡの増幅等、標的核酸を鋳型とする相補核酸
の合成反応を伴う核酸増幅反応時に共存しても、その
３’末端からの核酸伸長反応を生じない核酸プローブを
提供することにある。また本願発明の目的は、かかる核
酸プローブを用いることによりその共存下での核酸増幅
反応を実現することにある。
幅及びＲＮＡの増幅等、標的核酸を鋳型とする相補核酸
の合成反応を伴う核酸増幅反応時に共存しても、その
３’末端からの核酸伸長反応を生じない核酸プローブを
提供することにある。また本願発明の目的は、かかる核
酸プローブを用いることによりその共存下での核酸増幅
反応を実現することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成すべくな
された本願請求項１の発明は、特定核酸配列に相補的な
塩基配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に
測定可能な蛍光信号を発するように標識された一本鎖核
酸であって、その３’末端が式１のように修飾されてい
ることを特徴とする核酸プローブである。
された本願請求項１の発明は、特定核酸配列に相補的な
塩基配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に
測定可能な蛍光信号を発するように標識された一本鎖核
酸であって、その３’末端が式１のように修飾されてい
ることを特徴とする核酸プローブである。
【０００９】また前記目的を達成すべくなされた本願請
求項２の発明は、特定核酸配列に相補的な塩基配列を有
し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍
光信号を発するように標識された一本鎖核酸プローブの
共存下で前記特定核酸配列を有する標的核酸を増幅し、
標的核酸の増幅中及び／又は標的核酸の増幅後、増幅さ
れた標的核酸と前記核酸プローブの結合を利用して標的
核酸の存在又は存在量を分析する方法であって、該一本
鎖核酸プローブの３’末端が式２のように修飾されてい
ることを特徴とする標的核酸の分析方法である。以下、
本発明を詳細に説明する。
求項２の発明は、特定核酸配列に相補的な塩基配列を有
し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍
光信号を発するように標識された一本鎖核酸プローブの
共存下で前記特定核酸配列を有する標的核酸を増幅し、
標的核酸の増幅中及び／又は標的核酸の増幅後、増幅さ
れた標的核酸と前記核酸プローブの結合を利用して標的
核酸の存在又は存在量を分析する方法であって、該一本
鎖核酸プローブの３’末端が式２のように修飾されてい
ることを特徴とする標的核酸の分析方法である。以下、
本発明を詳細に説明する。
【００１０】本願発明の核酸プローブは、後述する核酸
増幅操作の際に共存させることが可能な核酸プローブで
ある。本願発明の核酸プローブによる標的核酸の分析
は、標的核酸の増幅後又は増幅中に実施することが可能
である。
増幅操作の際に共存させることが可能な核酸プローブで
ある。本願発明の核酸プローブによる標的核酸の分析
は、標的核酸の増幅後又は増幅中に実施することが可能
である。
【００１１】標的核酸の分析は、標的核酸と複合体を形
成した核酸プローブを検出することにより行われる。こ
のため本発明では核酸プローブを例えば光学的に検出可
能な標識物質で標識するが、標識物質としては例えば、
酵素、発光物質、蛍光物質等を例示することができる。
標的核酸の増幅中又は増幅後に、容器の密閉状態を維持
したまま該検出を行うためには標識物質としてインター
カレーター性蛍光色素を用いることが特に好ましい。
成した核酸プローブを検出することにより行われる。こ
のため本発明では核酸プローブを例えば光学的に検出可
能な標識物質で標識するが、標識物質としては例えば、
酵素、発光物質、蛍光物質等を例示することができる。
標的核酸の増幅中又は増幅後に、容器の密閉状態を維持
したまま該検出を行うためには標識物質としてインター
カレーター性蛍光色素を用いることが特に好ましい。
【００１２】インターカレーター性蛍光色素は、例えば
オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウ
ムブロマイド、アクリジンオレンジ等の二本鎖核酸の塩
基対間にインターカレートすることにより、その蛍光特
性が変化するものであれば特に制限なく使用することが
できるが、検出の容易さの観点からインターカレートす
ることにより蛍光強度の顕著な増加を示すチアゾールオ
レンジやオキサゾールイエローが特に好ましい。インタ
ーカレーター性蛍光色素を標識物質とすることで、複合
体を形成した核酸プローブと複合体を形成していない核
酸プローブを分離することなく、従って分離のための不
溶性担体を必要とせず、前記検出を行うことが可能とな
る。
オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウ
ムブロマイド、アクリジンオレンジ等の二本鎖核酸の塩
基対間にインターカレートすることにより、その蛍光特
性が変化するものであれば特に制限なく使用することが
できるが、検出の容易さの観点からインターカレートす
ることにより蛍光強度の顕著な増加を示すチアゾールオ
レンジやオキサゾールイエローが特に好ましい。インタ
ーカレーター性蛍光色素を標識物質とすることで、複合
体を形成した核酸プローブと複合体を形成していない核
酸プローブを分離することなく、従って分離のための不
溶性担体を必要とせず、前記検出を行うことが可能とな
る。
【００１３】なおインターカレーター性蛍光色素は、適
当なリンカーを介して核酸プローブと結合すれば良い。
当なリンカーを介して核酸プローブと結合すれば良い。
【００１４】本願発明の核酸プローブは、その３’末端
が式１のように修飾されていることを特徴とする。なお
式１中、Ｒは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）n
ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ［（Ｃ
Ｈ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1は、例えば
Ｆｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のアミノ基の保護基、色素又は
Ｈであり、ｎは１以上の整数である。
が式１のように修飾されていることを特徴とする。なお
式１中、Ｒは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）n
ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ［（Ｃ
Ｈ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1は、例えば
Ｆｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のアミノ基の保護基、色素又は
Ｈであり、ｎは１以上の整数である。
【００１５】本願発明の核酸プローブの製造方法を、イ
ンターカレーター性蛍光色素を標識物質として結合した
ものを−例として説明する。まず、ＤＮＡ合成機を用い
て試料中の標的核酸の配列に相補的な配列を含んだＤＮ
Ａオリゴマーを合成する。出発原料となる固相には、下
記式３又は式４で表される化合物を用いる。
ンターカレーター性蛍光色素を標識物質として結合した
ものを−例として説明する。まず、ＤＮＡ合成機を用い
て試料中の標的核酸の配列に相補的な配列を含んだＤＮ
Ａオリゴマーを合成する。出発原料となる固相には、下
記式３又は式４で表される化合物を用いる。
【００１６】
【化３】
【００１７】（式中、Ｒ2はＤＭＴｒ基などの水酸基の
保護基であり、ＣＰＧは、Ｃｏｎｔｒｏ１１ｅｄ ｐｏ
ｒｅ ｇｒａｓｓ、シリカゲル等の担体であり、Ｘは任
意のリンカーである）
保護基であり、ＣＰＧは、Ｃｏｎｔｒｏ１１ｅｄ ｐｏ
ｒｅ ｇｒａｓｓ、シリカゲル等の担体であり、Ｘは任
意のリンカーである）
【００１８】
【化４】
【００１９】（式中、Ｒ3はＤＭＴｒ基などの水酸基の
保護基であり、Ｒ4は−（ＣＨ2）n−、−ＣＨ（ＯＨ）
−ＣＨ2−又は−ＣＨ［（ＣＨ2）n−ＮＨＲ5］−ＣＨ2
−であり、Ｒ5は、例えばＦｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅ
ｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のア
ミノ基の保護基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数
であり、ＣＰＧはＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇ
ｒａｓｓ、シリカゲル等の担体であり、Ｘは任意のリン
カーである） 上記式３又は式４においてＸで表わされる任意のリンカ
ーには、ＤＮＡ合成機上で行われる反応中、安定な化合
物であれば、特に制限はない。
保護基であり、Ｒ4は−（ＣＨ2）n−、−ＣＨ（ＯＨ）
−ＣＨ2−又は−ＣＨ［（ＣＨ2）n−ＮＨＲ5］−ＣＨ2
−であり、Ｒ5は、例えばＦｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅ
ｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のア
ミノ基の保護基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数
であり、ＣＰＧはＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇ
ｒａｓｓ、シリカゲル等の担体であり、Ｘは任意のリン
カーである） 上記式３又は式４においてＸで表わされる任意のリンカ
ーには、ＤＮＡ合成機上で行われる反応中、安定な化合
物であれば、特に制限はない。
【００２０】ＤＮＡ合成の後、定法に従い２８％アンモ
ニア水等で処理することにより、３’末端が下記式５で
表わされる化合物で修飾されているＤＮＡオリゴマーが
切り出され、核酸塩基部及び、リン酸基の保護基が脱保
護される。
ニア水等で処理することにより、３’末端が下記式５で
表わされる化合物で修飾されているＤＮＡオリゴマーが
切り出され、核酸塩基部及び、リン酸基の保護基が脱保
護される。
【００２１】
【化５】
【００２２】（式中、Ｒは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、
−（ＣＨ2）nＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−
ＣＨ［（ＣＨ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1
は、例えばＦｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のアミノ基の保護
基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数である） そして得られたＤＮＡオリゴマーに、特開平８−２１１
０５０号公報又はＥＰ第７１４９８６号公報に記載され
た方法に従って、インターカレーター性蛍光色素を結合
する。
−（ＣＨ2）nＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−
ＣＨ［（ＣＨ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1
は、例えばＦｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）等のアミノ基の保護
基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数である） そして得られたＤＮＡオリゴマーに、特開平８−２１１
０５０号公報又はＥＰ第７１４９８６号公報に記載され
た方法に従って、インターカレーター性蛍光色素を結合
する。
【００２３】本願発明の核酸プローブは、その共存下で
標的核酸を増幅し、標的核酸の増幅中及び／又は標的核
酸の増幅後に増幅された標的核酸を分析するのに適した
ものである。本願発明の核酸プローブがその効果を最大
限発揮し得るのは、プライマーとＤＮＡポリメレースを
用い、標的核酸（ＤＮＡ）を鋳型とするプライマーの伸
長反応を含むＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ法や、標的核酸
がＲＮＡであって、プライマーと逆転写酵素を用い、該
ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成し
た後、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモーター・
プライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行い、こう
して合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作
用させて標的核酸であるＲＮＡを大量に合成するＲＮＡ
の増幅方法等、標的核酸を鋳型とするＤＮＡの合成反応
又はＤＮＡへの逆転写反応を含む増幅反応である。
標的核酸を増幅し、標的核酸の増幅中及び／又は標的核
酸の増幅後に増幅された標的核酸を分析するのに適した
ものである。本願発明の核酸プローブがその効果を最大
限発揮し得るのは、プライマーとＤＮＡポリメレースを
用い、標的核酸（ＤＮＡ）を鋳型とするプライマーの伸
長反応を含むＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ法や、標的核酸
がＲＮＡであって、プライマーと逆転写酵素を用い、該
ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成し
た後、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモーター・
プライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行い、こう
して合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレースを作
用させて標的核酸であるＲＮＡを大量に合成するＲＮＡ
の増幅方法等、標的核酸を鋳型とするＤＮＡの合成反応
又はＤＮＡへの逆転写反応を含む増幅反応である。
【００２４】後者のＲＮＡを増幅する方法としては、例
えばＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、特願平１０−１８６４３
４号に記載された方法等、多種多様の方法があるが、前
記の通り、標的核酸を鋳型とするＤＮＡの合成反応又は
ＤＮＡへの逆転写反応を含む増幅反応であれば特に制限
はない。
えばＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、特願平１０−１８６４３
４号に記載された方法等、多種多様の方法があるが、前
記の通り、標的核酸を鋳型とするＤＮＡの合成反応又は
ＤＮＡへの逆転写反応を含む増幅反応であれば特に制限
はない。
【００２５】前述した通り、標識物質としてインターカ
レーター性蛍光色素を結合した本願発明の核酸プローブ
を前記増幅反応の際に共存しておくことにより、標的核
酸の増幅中又は標識核酸の増幅後に標的核酸の存在を検
出し、存在量を測定することが可能となる。この場合、
標的核酸の増幅から分析に到る−連の操作を外部から試
薬を追加することなく実施することが可能であるため、
反応容器に試料、増幅反応に必要な試薬及び本願発明の
核酸プローブを投入しておけば、密閉状態で全操作を完
了することが可能である。
レーター性蛍光色素を結合した本願発明の核酸プローブ
を前記増幅反応の際に共存しておくことにより、標的核
酸の増幅中又は標識核酸の増幅後に標的核酸の存在を検
出し、存在量を測定することが可能となる。この場合、
標的核酸の増幅から分析に到る−連の操作を外部から試
薬を追加することなく実施することが可能であるため、
反応容器に試料、増幅反応に必要な試薬及び本願発明の
核酸プローブを投入しておけば、密閉状態で全操作を完
了することが可能である。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を実施
例により説明するが、これら実施例は−例であり、本発
明を限定するものではない。なお本実施例において、Ｈ
ＣＶ ＲＮＡの塩基番号は加藤らの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７，
９５２４−９５２８）に記載されたＨＣＶ ｃＤＮＡの
塩基番号に従うものとする。
例により説明するが、これら実施例は−例であり、本発
明を限定するものではない。なお本実施例において、Ｈ
ＣＶ ＲＮＡの塩基番号は加藤らの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７，
９５２４−９５２８）に記載されたＨＣＶ ｃＤＮＡの
塩基番号に従うものとする。
【００２７】実施例１ ３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃ
ｉｄ修飾核酸プローブの調製（図１及び図２参照） （１）ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（図１に
おける１の化合物）の調製 Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（０．０７８ｇ、１．０３
ｍｍｏ１）を出発材料として、ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１
ｉｃ ａｃｉｄを製造した。Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃａｃｉｄ
をＤＭＦ２ｍ１に溶解し、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔ
ｈｙ１ａｍｉｎｅ（０．５５ｍ１、３．１６ｍｍｏ１）
及びＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．３８２ｇ、１．１３ｍｍｏ
１）を加え、室温で−晩撹拌した。反応液を濃縮乾固
し、シリカゲルカラムで精製し、目的のＤＭＴｒ−Ｇ１
ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（化合物１）を得た。収量は
０．２４９ｇで収率は６４％であった。
ｉｄ修飾核酸プローブの調製（図１及び図２参照） （１）ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（図１に
おける１の化合物）の調製 Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（０．０７８ｇ、１．０３
ｍｍｏ１）を出発材料として、ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１
ｉｃ ａｃｉｄを製造した。Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃａｃｉｄ
をＤＭＦ２ｍ１に溶解し、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔ
ｈｙ１ａｍｉｎｅ（０．５５ｍ１、３．１６ｍｍｏ１）
及びＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．３８２ｇ、１．１３ｍｍｏ
１）を加え、室温で−晩撹拌した。反応液を濃縮乾固
し、シリカゲルカラムで精製し、目的のＤＭＴｒ−Ｇ１
ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（化合物１）を得た。収量は
０．２４９ｇで収率は６４％であった。
【００２８】（２）ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｙ１−ＣＰ
Ｇ（図１における２の化合物）の調製 ＤＭＴｒ−ｄＣ ＣＰＧ（１μｍｏ１、Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅ１ｍｅｒ社製）カラムにｔｒｉｃｈ１ｏｒｏａｃｅｔ
ｉｃ ａｃｉｄの塩化メチレン溶液を通じ、ＤＭＴｒ基
を除去した。カラムを無水アセトニトリルで洗浄し、Ｄ
ＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（化合物１、０．
１０４ｇ、０．２７５ｍｍｏ１）及びｃａｒｂｏｎｙ１
ｄｉｉｍｉｄａｚｏ１ｅ（４４ｍｇ、０．２７ｍｍｏ
１）を溶解したＴＨＦ溶液１ｍ１をカラムに注入した
後、カラムを密栓し、−晩静置した。反応カラムをＴＨ
Ｆで洗浄し、無水酢酸、メチルイミダゾール−ＴＨＦで
処理し、未反応水酸基をアセチル化したカラムをＤＭＴ
ｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｙ１−ＣＰＧ（化合物２）とした。
Ｇ（図１における２の化合物）の調製 ＤＭＴｒ−ｄＣ ＣＰＧ（１μｍｏ１、Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅ１ｍｅｒ社製）カラムにｔｒｉｃｈ１ｏｒｏａｃｅｔ
ｉｃ ａｃｉｄの塩化メチレン溶液を通じ、ＤＭＴｒ基
を除去した。カラムを無水アセトニトリルで洗浄し、Ｄ
ＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ（化合物１、０．
１０４ｇ、０．２７５ｍｍｏ１）及びｃａｒｂｏｎｙ１
ｄｉｉｍｉｄａｚｏ１ｅ（４４ｍｇ、０．２７ｍｍｏ
１）を溶解したＴＨＦ溶液１ｍ１をカラムに注入した
後、カラムを密栓し、−晩静置した。反応カラムをＴＨ
Ｆで洗浄し、無水酢酸、メチルイミダゾール−ＴＨＦで
処理し、未反応水酸基をアセチル化したカラムをＤＭＴ
ｒ−Ｇ１ｙｃｏ１ｙ１−ＣＰＧ（化合物２）とした。
【００２９】（３）３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ
修飾核酸プローブ（図１における５の化合物）の調製 上記により合成した化合物２（ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１
ｙ１−ＣＰＧ）を固相として、ＣＧアミダイトダイマー
（化合物３）及びＧ，Ｃ，Ｔアミダイトを原料に用い、
ＤＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ杜製、ＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９１）により
配列番号１の合成オリゴヌクレオチド（化合物４）を合
成した。なお、配列番号１の配列において、５’末端か
ら５塩基目のシトシンと同６番目のグアニンの間にリン
カーが結合する。
修飾核酸プローブ（図１における５の化合物）の調製 上記により合成した化合物２（ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｏ１
ｙ１−ＣＰＧ）を固相として、ＣＧアミダイトダイマー
（化合物３）及びＧ，Ｃ，Ｔアミダイトを原料に用い、
ＤＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ杜製、ＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９１）により
配列番号１の合成オリゴヌクレオチド（化合物４）を合
成した。なお、配列番号１の配列において、５’末端か
ら５塩基目のシトシンと同６番目のグアニンの間にリン
カーが結合する。
【００３０】得られた配列番号１の合成オリゴヌクレオ
チドを２８％ ＮＨ4ＯＨでＣＰＧカラムより切り出し
た後、６０度２時間加熱することにより脱保護を行っ
た。得られた合成オリゴヌクレオチド（化合物５）をＨ
ＰＬＣ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー
（株）製）により精製し、凍結乾燥した。収量は１８．
２ＯＤ、１５９ｎｍｏ１であった。
チドを２８％ ＮＨ4ＯＨでＣＰＧカラムより切り出し
た後、６０度２時間加熱することにより脱保護を行っ
た。得られた合成オリゴヌクレオチド（化合物５）をＨ
ＰＬＣ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー
（株）製）により精製し、凍結乾燥した。収量は１８．
２ＯＤ、１５９ｎｍｏ１であった。
【００３１】図２に示したように、得られた化合物５
（１８．２ ＯＤ）を蒸留水５０μ１に溶解し、０．２
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ５０μ１、５％ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉ
ｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）／ＤＭＳＯ溶液１０
０μｌを添加した。室温で２時間静置した後、反応液を
蒸留水０．５ｍ１で希釈し、クロロホルムで洗浄した。
水層を濃縮後、ゲル濾過により脱塩し、ＨＰＬＣ（ＴＳ
Ｋｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）にて精
製し、化合物６を得た。収量は２．４ ＯＤ、２１ｎｍ
ｏ１であった。
（１８．２ ＯＤ）を蒸留水５０μ１に溶解し、０．２
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ５０μ１、５％ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉ
ｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）／ＤＭＳＯ溶液１０
０μｌを添加した。室温で２時間静置した後、反応液を
蒸留水０．５ｍ１で希釈し、クロロホルムで洗浄した。
水層を濃縮後、ゲル濾過により脱塩し、ＨＰＬＣ（ＴＳ
Ｋｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）にて精
製し、化合物６を得た。収量は２．４ ＯＤ、２１ｎｍ
ｏ１であった。
【００３２】化合物６（２．４ ＯＤ）を凍結乾燥した
残渣を蒸留水２００μ１に溶解し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ５．１）２０μ１、１Ｍ ＤＴＴ２０μ１を
添加し、３０分静置した。化合物７（１ｍｇ）をＤＭＦ
２００μ１、蒸留水６００μ１、０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4（ｐＨ９．５）２００μ１の混合液に溶解した溶液
の２００μ１をＤＴＴ処理反応液に添加し、室温で１時
間静置した。反応液をブタノールで洗浄した後、濃縮
し、エタノール沈殿により粗精製した沈殿をＨＰＬＣ
（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）
により精製し、目的の３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉ
ｄ修飾発蛍光プローブ（化合物８）を得た。収量は０．
４３ ＯＤ、３．７４ｎｍｏｌであった。
残渣を蒸留水２００μ１に溶解し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ５．１）２０μ１、１Ｍ ＤＴＴ２０μ１を
添加し、３０分静置した。化合物７（１ｍｇ）をＤＭＦ
２００μ１、蒸留水６００μ１、０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4（ｐＨ９．５）２００μ１の混合液に溶解した溶液
の２００μ１をＤＴＴ処理反応液に添加し、室温で１時
間静置した。反応液をブタノールで洗浄した後、濃縮
し、エタノール沈殿により粗精製した沈殿をＨＰＬＣ
（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）
により精製し、目的の３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉ
ｄ修飾発蛍光プローブ（化合物８）を得た。収量は０．
４３ ＯＤ、３．７４ｎｍｏｌであった。
【００３３】実施例２ ３’−Ｇ１ｙｃｅｒｏ１修飾核
酸プローブ（化合物１２）の調製（図３及び図４参照） 図３に示したように、ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｅｒｏ１−Ｃ
ＰＧ（０．２μｍｏ１×２、Ｐｅｎｉｎｓｕ１ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を固相として、前記化合物３及
びＧ，Ｃ，Ｔアミダイトを原料に用いて、ＤＮＡ合成機
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ社製、ＤＮＡＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９１）により、配列番号２
の合成オリゴヌクレオチド（化合物９）を合成した。な
お、配列番号１の配列において、５’末端から５塩基目
のシトシンと同６番目のグアニンの間にリンカーが結合
する。
酸プローブ（化合物１２）の調製（図３及び図４参照） 図３に示したように、ＤＭＴｒ−Ｇ１ｙｃｅｒｏ１−Ｃ
ＰＧ（０．２μｍｏ１×２、Ｐｅｎｉｎｓｕ１ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を固相として、前記化合物３及
びＧ，Ｃ，Ｔアミダイトを原料に用いて、ＤＮＡ合成機
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ社製、ＤＮＡＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９１）により、配列番号２
の合成オリゴヌクレオチド（化合物９）を合成した。な
お、配列番号１の配列において、５’末端から５塩基目
のシトシンと同６番目のグアニンの間にリンカーが結合
する。
【００３４】得られた配列番号２の合成オリゴヌクレオ
チド（化合物９）を２８％ＮＨ4ＯＨでＣＰＧカラムよ
り切り出した後、６０℃で２時間加熱することにより脱
保護を行った。得られた合成オリゴヌクレオチド（化合
物１０）をＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ
東ソー（株）製）により精製し、凍結乾燥した。収量は
３．７５０Ｄ、３３ｎｍｏ１であった。なお配列番号２
の合成オリゴヌクレオチドは、全１３塩基のうち５’末
端側から１１塩基が後述する標的核酸に対して相補的で
ある。
チド（化合物９）を２８％ＮＨ4ＯＨでＣＰＧカラムよ
り切り出した後、６０℃で２時間加熱することにより脱
保護を行った。得られた合成オリゴヌクレオチド（化合
物１０）をＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ
東ソー（株）製）により精製し、凍結乾燥した。収量は
３．７５０Ｄ、３３ｎｍｏ１であった。なお配列番号２
の合成オリゴヌクレオチドは、全１３塩基のうち５’末
端側から１１塩基が後述する標的核酸に対して相補的で
ある。
【００３５】図４に示したように、得られた化合物１０
（３．７５ ＯＤ）を蒸留水５０μ１に溶解し、０．２
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ５０μ１、５％ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉ
ｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）／ＤＭＳＯ溶液１０
０μｌを添加した。室温で２時間静置した後、反応液を
蒸留水０．５ｍ１で希釈し、クロロホルムで洗浄した。
水層を濃縮後、ゲル濾過により脱塩し、ＨＰＬＣ（ＴＳ
Ｋｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）にて精
製し、化合物１１を得た。収量はＯ．１０ ＯＤ、０．
８７ｎｍｏ１であった。
（３．７５ ＯＤ）を蒸留水５０μ１に溶解し、０．２
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ５０μ１、５％ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉ
ｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）／ＤＭＳＯ溶液１０
０μｌを添加した。室温で２時間静置した後、反応液を
蒸留水０．５ｍ１で希釈し、クロロホルムで洗浄した。
水層を濃縮後、ゲル濾過により脱塩し、ＨＰＬＣ（ＴＳ
Ｋｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）製）にて精
製し、化合物１１を得た。収量はＯ．１０ ＯＤ、０．
８７ｎｍｏ１であった。
【００３６】化合物１１（０．１１ ＯＤ）を凍結乾燥
した残渣を蒸留水２００μ１に溶解し、１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１（ｐＨ５．１）２０μｌ、１Ｍ ＤＴＴ２０μ
１を添加し、３０分静置した。前記化合物７（１ｍｇ）
をＤＭＦ２００μ１、蒸留水６００μｌ、０．５Ｍ Ｎ
ａ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．５）２００μ１の混合液に溶解し
た溶液の２００μ１をＤＴＴ処理反応液に添加し、室温
で１時間静置した。反応液をブタノールで洗浄した後、
濃縮し、エタノール沈殿により粗精製した沈殿をＨＰＬ
Ｃ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）
製）により精製し、目的の３’−Ｇ１ｙｃｅｒｏ１修飾
核酸プローブ（化合物１２）を得た。収量は０．０１８
ＯＤ、０．１６ｎｍｏｌであった。
した残渣を蒸留水２００μ１に溶解し、１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１（ｐＨ５．１）２０μｌ、１Ｍ ＤＴＴ２０μ
１を添加し、３０分静置した。前記化合物７（１ｍｇ）
をＤＭＦ２００μ１、蒸留水６００μｌ、０．５Ｍ Ｎ
ａ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．５）２００μ１の混合液に溶解し
た溶液の２００μ１をＤＴＴ処理反応液に添加し、室温
で１時間静置した。反応液をブタノールで洗浄した後、
濃縮し、エタノール沈殿により粗精製した沈殿をＨＰＬ
Ｃ（ＴＳＫｇｅ１ ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー（株）
製）により精製し、目的の３’−Ｇ１ｙｃｅｒｏ１修飾
核酸プローブ（化合物１２）を得た。収量は０．０１８
ＯＤ、０．１６ｎｍｏｌであった。
【００３７】実施例３ 以下の操作により、標識物質としてインターカレーター
性蛍光色素結合した核酸プローブ（化合物８）の共存下
で陽性試料（標的核酸であるＨＣＶ ＲＮＡ標準（ＨＣ
Ｖ ＲＮＡの塩基番号１１３番目から２６７番目を含む
ＲＮＡ）を含む試料）又は陰性試料（標的核酸を含まな
い試料）に対して−定温度でのＨＣＶＲＮＡ用の増幅操
作を行い、蛍光信号の変化を測定した。
性蛍光色素結合した核酸プローブ（化合物８）の共存下
で陽性試料（標的核酸であるＨＣＶ ＲＮＡ標準（ＨＣ
Ｖ ＲＮＡの塩基番号１１３番目から２６７番目を含む
ＲＮＡ）を含む試料）又は陰性試料（標的核酸を含まな
い試料）に対して−定温度でのＨＣＶＲＮＡ用の増幅操
作を行い、蛍光信号の変化を測定した。
【００３８】まず、以下の組成の反応液１８．２５μ１
をＰＣＲ用チューブに分注した。
をＰＣＲ用チューブに分注した。
【００３９】１．２０μ１の１Ｍ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ
８．１） ０．４０μ１の１Ｍ酢酸マグネシウム １．８８μ１の２Ｍ酢酸カリウム ８．００μ１の６０％ソルビトール ０．６０μ１のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド） ３．００μ１の１００ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル） １．５０μ１の２０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．３０μ１の２０μＭプロモータ・プライマー（配列
番号３；ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番号１１３番目から１３
７番目の配列と同−の配列を含む） ０．３０μ１の２０μＭアンチセンス・プライマー（配
列番号４；ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番号２４８番目から２
６７番目の配列に相補的な一本鎖オリゴＤＮＡ） １．０７μ１の脱イオン水 ミネラルオイル５０μ１を重層した後、陽性試料として
ＨＣＶ ＲＮＡ標準１０００コピー／４μ１を、陰性試
料としてＴＥバッファーをそれぞれ４μ１添加し、５０
℃で５分間反応させた。反応後、以下の組成の反応液
５．２５μ１を添加した。
８．１） ０．４０μ１の１Ｍ酢酸マグネシウム １．８８μ１の２Ｍ酢酸カリウム ８．００μ１の６０％ソルビトール ０．６０μ１のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド） ３．００μ１の１００ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル） １．５０μ１の２０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．３０μ１の２０μＭプロモータ・プライマー（配列
番号３；ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番号１１３番目から１３
７番目の配列と同−の配列を含む） ０．３０μ１の２０μＭアンチセンス・プライマー（配
列番号４；ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番号２４８番目から２
６７番目の配列に相補的な一本鎖オリゴＤＮＡ） １．０７μ１の脱イオン水 ミネラルオイル５０μ１を重層した後、陽性試料として
ＨＣＶ ＲＮＡ標準１０００コピー／４μ１を、陰性試
料としてＴＥバッファーをそれぞれ４μ１添加し、５０
℃で５分間反応させた。反応後、以下の組成の反応液
５．２５μ１を添加した。
【００４０】３．４０μｌの５０Ｕ／μｌ ＳＰ６ＲＮ
Ａポリメレース １．２４μ１の３４Ｕ／μ１ ＡＭＶ逆転写酵素 ０．１５μ１の２０ｍｇ／ｍ１ ＢＳＡ ０．４６μ１の１３０Ｕ／μ１ ＲＮａｓｅインヒビタ
ー 反応液を添加後、５０℃で５分間反応させ、更に各２０
ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰを１．５０μ
１添加して５０℃で５分間反応させた。そして０．７５
μＭの３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ修飾核酸プロ
ーブ（化合物８）を１．００μ１添加し、ＡＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＴＰ及びＵＴＰを添加した時間を起点として５分
毎に蛍光強度を蛍光検出器にて測定した（励起波長；４
９０ｎｍ、蛍光波長；５１０ｎｍ）。
Ａポリメレース １．２４μ１の３４Ｕ／μ１ ＡＭＶ逆転写酵素 ０．１５μ１の２０ｍｇ／ｍ１ ＢＳＡ ０．４６μ１の１３０Ｕ／μ１ ＲＮａｓｅインヒビタ
ー 反応液を添加後、５０℃で５分間反応させ、更に各２０
ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰを１．５０μ
１添加して５０℃で５分間反応させた。そして０．７５
μＭの３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ修飾核酸プロ
ーブ（化合物８）を１．００μ１添加し、ＡＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＴＰ及びＵＴＰを添加した時間を起点として５分
毎に蛍光強度を蛍光検出器にて測定した（励起波長；４
９０ｎｍ、蛍光波長；５１０ｎｍ）。
【００４１】以上のようにして測定した蛍光強度の経時
的変化を図５（ａ）に示す。陰性試料の蛍光強度は１２
０分の測定の間ほとんど増加しなかった。−方、陽性試
料については約５０分後から蛍光増加が認められ、約１
００分後に−定値に達した。
的変化を図５（ａ）に示す。陰性試料の蛍光強度は１２
０分の測定の間ほとんど増加しなかった。−方、陽性試
料については約５０分後から蛍光増加が認められ、約１
００分後に−定値に達した。
【００４２】比較のため、配列番号５の合成オリゴヌク
レオチドを用いて調製した核酸プローブを用いて同様の
操作を行った。結果を図５（ｂ）に示す。なおこの比較
のためのプローブは、３’末端部分の配列が異なり、か
つ、当該３’末端が修飾されていないことを除き、前記
３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ修飾核酸プローブと
同−である。
レオチドを用いて調製した核酸プローブを用いて同様の
操作を行った。結果を図５（ｂ）に示す。なおこの比較
のためのプローブは、３’末端部分の配列が異なり、か
つ、当該３’末端が修飾されていないことを除き、前記
３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ ａｃｉｄ修飾核酸プローブと
同−である。
【００４３】図５（ｂ）によれば、その３’末端が標的
核酸とは非相補的であっても、未修飾である場合には、
陽性試料で経過時間に応じた蛍光強度の増加が認められ
た。しかし、陰性試料の蛍光強度も１２０分の測定の間
に増加し、バックグランド蛍光強度の上昇が認められ
た。これに対して本発明の核酸プローブでは、３’末端
の修飾によってこの問題を回避することが示された。
核酸とは非相補的であっても、未修飾である場合には、
陽性試料で経過時間に応じた蛍光強度の増加が認められ
た。しかし、陰性試料の蛍光強度も１２０分の測定の間
に増加し、バックグランド蛍光強度の上昇が認められ
た。これに対して本発明の核酸プローブでは、３’末端
の修飾によってこの問題を回避することが示された。
【００４４】以上の結果から、インターカレーター性蛍
光色素を結合したＤＮＡプローブの共存下、核酸の増幅
反応を行う場合に、核酸プローブ自身の増幅を抑制し、
バックグランド信号を減少して分析感度を向上したり、
分析精度を向上する目的では、３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ
ａｃｉｄのようにその３’末端を修飾した核酸プロー
ブが有効であることが確認できた。
光色素を結合したＤＮＡプローブの共存下、核酸の増幅
反応を行う場合に、核酸プローブ自身の増幅を抑制し、
バックグランド信号を減少して分析感度を向上したり、
分析精度を向上する目的では、３’−Ｇ１ｙｃｏ１ｉｃ
ａｃｉｄのようにその３’末端を修飾した核酸プロー
ブが有効であることが確認できた。
【００４５】
【発明の効果】本願発明の核酸プローブは、３’末端を
化学的に修飾した結果、ＤＮＡやＲＮＡの増幅等、標的
核酸を鋳型とする相補核酸の合成反応を伴う核酸増幅反
応時に共存させても、その３’末端からの核酸伸長反応
を生じることがない。そのため反応容器に標的核酸の増
幅反応に必要な試薬及び標的核酸の分析に必要な本願発
明の核酸プローブを投入することにより、該容器を密閉
した状態で全ての操作を実施することが可能となる。こ
の結果、本願発明の核酸プローブを標的核酸の増幅のた
めの種々の方法と組み合わせることにより、特異性が高
く、高感度で、しかもエアロゾルの発生により試料間汚
染を生じさせる恐れのない標的核酸の分析が可能とな
る。
化学的に修飾した結果、ＤＮＡやＲＮＡの増幅等、標的
核酸を鋳型とする相補核酸の合成反応を伴う核酸増幅反
応時に共存させても、その３’末端からの核酸伸長反応
を生じることがない。そのため反応容器に標的核酸の増
幅反応に必要な試薬及び標的核酸の分析に必要な本願発
明の核酸プローブを投入することにより、該容器を密閉
した状態で全ての操作を実施することが可能となる。こ
の結果、本願発明の核酸プローブを標的核酸の増幅のた
めの種々の方法と組み合わせることにより、特異性が高
く、高感度で、しかもエアロゾルの発生により試料間汚
染を生じさせる恐れのない標的核酸の分析が可能とな
る。
【００４６】
【００４７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> 核酸プローブ <130> ２１１−００７３ <160> 4 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 合成オリゴヌクレオチド <400> 1 ctcgcggggg ctg 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 合成オリゴヌクレオチド <400> 2 ctcgcggggg ctg <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>プロモーター・プライマー <400> 3 atttaggtga cactatagaa tacaacctcc cgggagagcc atagtggtct 50 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>アンチセンス・プライマー <400> 4 gcctttcgcg acccaacact 20 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 合成オリゴヌクレオチド <400> 5 ctcgcggggg cttttt
【図１】図１は、実施例１における化合物の製造工程を
示す図である。
示す図である。
【図２】図２は、実施例１における化合物の製造工程を
示す図である。
示す図である。
【図３】図３は、実施例２における化合物の製造工程を
示す図である。
示す図である。
【図４】図４は、実施例２における化合物の製造工程を
示す図である。
示す図である。
【図５】図５は、実施例３における測定の結果を示した
ものである。陽性試料（図中黒丸）は時間の経過ととも
に蛍光強度が増加したのに対し、陰性試料で（図中黒四
角）は蛍光強度はほとんど増加しなかった。
ものである。陽性試料（図中黒丸）は時間の経過ととも
に蛍光強度が増加したのに対し、陰性試料で（図中黒四
角）は蛍光強度はほとんど増加しなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (72)発明者 田谷 敏貴 神奈川県相模原市上鶴間1718−12
Claims (2)
- 【請求項１】特定核酸配列に相補的な塩基配列を有し、
該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するように標識された一本鎖核酸であって、その
３’末端が下記式１のように修飾されていることを特徴
とする核酸プローブ。 【化１】 （式中、Ｒは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）n
ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ［（Ｃ
Ｈ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1はアミノ基
の保護基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数であ
る） - 【請求項２】特定核酸配列に相補的な塩基配列を有し、
該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するように標識された一本鎖核酸プローブの共存
下で前記特定核酸配列を有する標的核酸を増幅し、標的
核酸の増幅中及び／又は標的核酸の増幅後、増幅された
標的核酸と前記核酸プローブの結合を利用して標的核酸
の存在又は存在量を分析する方法であって、該一本鎖核
酸プローブの３’末端が下記式２のように修飾されてい
ることを特徴とする標的核酸の分析方法。 【化２】 （式中、Ｒは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）n
ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ［（Ｃ
Ｈ2）n−ＮＨＲ1］−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ1はアミノ基
の保護基、色素又はＨであり、ｎは１以上の整数であ
る）
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000063374A JP2000316587A (ja) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | 核酸プローブ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5825199 | 1999-03-05 | ||
| JP11-58251 | 1999-03-05 | ||
| JP2000063374A JP2000316587A (ja) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | 核酸プローブ |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000063374A Pending JP2000316587A (ja) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | 核酸プローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000316587A (ja) |
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