KR20240023114A - Lida(lesion induced dna amplification)에 의한 sars-cov-2 분석 - Google Patents

Lida(lesion induced dna amplification)에 의한 sars-cov-2 분석 Download PDF

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Abstract

병변 유도 DNA 증폭(lesion induced DNA amplification: LIDA) 기반 RNA 또는 DNA 증폭 방법과 함께 SARS-CoV-2에 대한 분석이 기술된다.

Description

LIDA(LESION INDUCED DNA AMPLIFICATION)에 의한 SARS-COV-2 분석
본 발명은 핵산 분석 및 핵산을 증폭 및 검출하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 핵산을 검출하는 분석에 관한 것이다.
SARS-CoV-2 팬데믹은 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 다양한 분석법의 개발을 가져왔다. 가장 일반적인 방법 중 2가지는 스파이크, 외피, 막 또는 뉴클레오캡시드 단백질에 결합하는 접합 항체(conjugated antibody)를 사용하여, 특정 바이러스 단백질의 존재를 검출하는 항원 기반 LFA(lateral flow assay), 또는 특정 바이러스 게놈 서열을 증폭시켜, 바이러스의 존재를 검출하는 RT-PCR 분석이다. 이들 각각에는 장점과 단점이 있다; 측면 흐름 분석(LFA)은 신속하여 30분 내에 결과를 제공하나, 상대적으로 덜 민감하고 위음성(false negative)이 발생하기 쉽다. RT-PCR 테스트는 더 정확하지만 일반적으로 테스트를 위해 샘플을 실험실로 반환해야 한다는 점을 고려할 때 신속한 옵션으로 보이지 않는다. 대체 테스트 옵션을 이용할 수 있으면 유익할 것이다. 또한, 일반적으로 분석되는 유전자와 단백질의 바이러스 돌연변이 비율을 고려하면, 이러한 분석의 민감도가 감소할 수 있다. 따라서 분석에서 바이러스 게놈의 상이한 영역을 채택하는 것이 유리할 것이다.
SARS-CoV-2에 대한 대안적인 분석에 통합하는 데 적합할 수 있는 핵산 증폭을 위한 다양한 등온 증폭 방법이 알려져 있다. 이들은 NASBA(핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification); LAMP(루프 매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification); HAD(헬리카아제 의존성 증폭(helicase-dependent amplification)); RCA(롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)); MDA(다중 변위 증폭(multiple displacement amplification)); WGA(MALBAC, LIANTI, DOP-PCR을 포함한 전체 게놈 증폭(whole genome amplification)); 및 RPA(재조합 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification))를 포함한다. 등온 증폭의 이점은 표적을 증폭하기 위해 열 순환이 필요하지 않으므로 분석을 수행하는 데 특정 장비가 필요하지 않을 수 있다는 것이다.
추가적인 등온 기술은 RT-LIDA(역전사 병변-유도 DNA 증폭(reverse transcription lesion-induced DNA amplification))이다. LIDA 기술은 일반적으로 미국 특허 9,193,993에 기술되며, 불안정화 DNA 주형을 상보적 뉴클레오티드 단편에 혼성화하여 제1 닉킹된 이중체(nicked duplex)를 형성하는 단계; 상기 제1 닉킹된 이중체를 라이게이션시켜 DNA 서열과 주형을 포함하는 산물 이중체(product duplex)를 형성하는 단계로서, 상기 산물 이중체는 해리되어 DNA 서열과 주형을 방출할 수 있는 것인 단계; 및 상기 주형과 DNA 서열의 복수의 카피를 생성하기 위해 이 단계들을 반복하는 단계를 포함하는, DNA 서열을 등온 증폭시키는 방법이다. 최초 주형(initial template)이 RNA인 경우, RNA로부터 cDNA를 생성하는 초기 단계도 포함된다. RT-LIDA는 또한 Alladin-Mustan et al, "Reverse transcription lesion-induced DNA amplification: An instrument-free isothermal method to detect RNA"; Analytica Chimica Acta, Volume 1149, 2021, 238130, https://doi.org/10.1016/j.aca.2020.12.005에 기술된다.
본원에 기술된 SARS-CoV-2 분석을 개발하면서, 본 발명자는 개선된 증폭 결과를 제공할 수 있는 RT-LIDA의 변형을 추가로 개발했다. 구체적으로, 통상적인 RT-LIDA에서, 프라이머의 자가-라이게이션(self-ligation)이 문제가 되어 위양성(false positive)을 초래할 수 있다. 본원에 제시된 수정된 분석은 무엇보다도 이러한 위양성의 발생을 감소시키는 것으로 여겨진다.
본원에 기술된 특정 분석은 SARS-CoV-2 게놈 일부의 RT-LIDA 증폭이나, a) SARS-CoV-2 게놈의 동일한 부분은 다른 방법, 특히 등온 증폭을 이용하여 검출될 수 있고; b) 본원에 기술된 변형된 RT-LIDA는 이 분석보다 더 일반적으로 적용 가능한 것으로 이해될 것이다. 본원에 기술된 분석의 주요 이점은 단일 반응 용기에서 등온 증폭 및 검출을 가능하게 하고, 원하는 경우, 분석 시약 이외의 특수 장비 없이 수행할 수 있다는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 일 양태에 따르면, ORF9c 단백질의 말단 또는 말단 근처에서 Leu-Thr-Asp(LTD) 서열을 코딩하는 핵산의 부분이 증폭되고 검출되는 것인 SARS-CoV-2 분석(assay)이 제공된다.
또한, 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 샘플에 존재하는 RNA로부터 cDNA를 생성하는 단계; ORF9c를 코딩하는 SARS-CoV-2 게놈에 해당하는 cDNA의 부분에 특이적인 증폭 과정을 이용하여 cDNA의 부분을 증폭시키는 단계; 및 ORF9c 단백질의 말단 또는 그 근처에 있는 Leu-Thr-Asp(LTD) 서열을 코딩하는 증폭된 cDNA의 부분의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
SARS-CoV-2 게놈은 ORF9c(이전에는 ORF14로 알려짐)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 이는 이전에 기능이 알려지지 않았으며 인간 SARS 및 Bat CoV에 존재했던 70개 아미노산 단백질이다. SARS-CoV-2에서, ORF9c 단백질은 길이가 73개 아미노산이고, 전사체의 말단에 3개의 추가 아미노산(LTD)을 코딩하는 9bp 삽입물(insert)을 갖는다. SARS-CoV-2(서열번호 12), 인간 SARS(서열번호 13) 및 Bat CoV(서열번호 14)의 ORF9c 아미노산 서열의 비교가 도 2에 제시된다. 보다 최근에, 이 단백질은 인간의 면역계를 회피하는 바이러스의 능력에 결정적이고 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. LTD 삽입물은 SARS-CoV-2에서 고도로 보존된 것으로 나타나, 검출에 적합한 표적이 된다. 구체적으로, SARS-CoV-2 게놈에는 게놈 전체에 잘 분포된 돌연변이가 기록(record)되어 있으나, ORF9c에서는 최소한의 돌연변이가 발견되고, 이 LTD 삽입에서는 훨씬 더 적은 돌연변이가 기록되었다. 바이러스 감염성에서 ORF9c의 가능한 역할을 고려할 때, 이러한 변동성(variability)의 결여는 바이러스에 대한 선택적인 이점을 암시하고, 따라서, 이 삽입은 진단에 유용한다.
LTD 삽입을 코딩하는 cDNA 서열은 AAC TGT CTA(서열번호 1)이다. 물론 게놈 서열은 상응하는 RNA 서열(UUG ACA GAU, 서열번호 2)일 것이다. 증폭은 이 삽입에 걸쳐 있는 DNA 서열에 대한 것일 수 있고, 검출은 이 삽입을 포함하는 서열에 결합하는 프로브를 통한 것일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 증폭은 RT-LIDA를 통해 이루어진다. LIDA는 리가아제 연쇄 반응(LCR)의 변형을 기반으로 하는 간단하게 구현 가능한 증폭 기술이다. 18℃ 내지 37℃의 실온에서 작동하여 선택된 표적의 신속한(20분 이하) 증폭을 제공한다. 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 단일 효소를 사용하므로, 기타 등온 화학에 비해 훨씬 덜 복잡하다.
또한, 샘플 중 표적 RNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 상기 표적 RNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표적 RNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
c) 상기 P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머(destabilising primer)인 것인 단계;
d) 상기 P2p 및/또는 P2* 프라이머와 중첩되고 상기 표적 RNA 분자에 상보적인 disDNA(displacement DNA strand)를 제공하는 단계;
e) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 RNA에 어닐링되어 RNA-닉킹된 DNA 이중체(RNA-nicked DNA duplex)를 형성하게 하는 단계;
f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜, RNA-DNA 이중체를 형성하는 단계로서, 상기 DNA 가닥은 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 단계;
g) 상기 disDNA가 상기 이중체로부터 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥을 변위시킬 수 있게 하는 단계;
h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링되어 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하게 하는 단계;
i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜, P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥 및 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체(product DNA duplex)를 형성하는 단계;
j) 상기 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리될 수 있게 하는 단계;
k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링될 수 있게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링될 수 있게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성할 수 있게 하는 단계;
l) 상기 프라이머들을 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥, 및 상기 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성하는 단계; 및
m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행(overrhang) 또는 평활 말단 라이게이션 능력(blunt end ligating ability)을 갖지 않는 DNA 리가아제에 의해 수행되는 것인 방법이 제공된다.
본원에서 검토된 바와 같이, 본 발명자는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력이 없는 DNA 리가아제의 사용이 본 방법으로부터 증진된 정확도 및 감소된 배경을 제공한다는 것을 밝혔다. 바람직한 구체예에서, 상기 리가아제는 PBCV-1 DNA 리가아제이나, 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 감소시키거나 제거하기 위해 천연 형태로부터 변형된 조작된 리가아제(engineered ligase)를 포함한 기타 리가아제가 사용될 수 있다. 이러한 리가아제의 사용으로 인한 배경 증폭의 감소는 리가아제 반응을 가속화하는 성분(예를 들어, PEG와 같은 크라우딩제(crowding agent))이 반응 혼합물에 포함될 수 있음을 의미한다. T4 리가아제와 같은 단일 염기 오버행 라이게이션 능력을 갖는 기존 리가아제의 경우, 그들이 이러한 배경의 동시-증폭을 촉진하므로 생략되어야 한다.
불안정화 프라이머는 무염기 부위(abasic site) 또는 상응하는 상보적 서열과의 미스매치(mismatch)의 존재로부터 선택된 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 구체예에서, 하나의 프라이머는 미스매치를 포함하고, 하나의 프라이머는 무염기 부위를 포함한다. 바람직하게는, P1c* 프라이머는 불일치를 포함하고; 이는 A:T 미스매치일 수 있다(즉, 완벽하게 상보적인 서열은 G 또는 C를 포함할 수 있으나, 미스매치는 A 또는 T를 포함함). 바람직하게는, 미스매치는 프라이머 내부에 있고; 즉, 5' 말단 및 3' 말단으로부터 적어도 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오티드가 있다. 구체예에서, P1(csp) 프라이머는 무염기 부위를 포함한다. 무염기 부위는 바람직하게는 프라이머의 말단, 바람직하게는 5' 말단에 있다.
프라이머는 표적의 연속 부분(contiguous portion)에 혼성화되도록 설계된다. 라이게이션을 가능하게 하기 위해, 각 쌍의 상류(upstream) 프라이머(즉, 나머지 프라이머의 5' 방향에 있는 표적의 영역에 혼성화되는 프라이머)는 5' 말단에 포스페이트 기를 포함한다. 예를 들어, P2p 및 P1(csp) 프라이머는 이러한 포스페이트 기를 포함할 수 있다.
본 방법은 cDNA 가닥 중 적어도 하나를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머 중 적어도 하나는 표지(label)를 포함한다. 예를 들어, P2* 프라이머는 표지를 포함할 수 있다. 구체예에서, 각 쌍 중 하나의 프라이머에는 검출 가능한 표지를 포함한다(예를 들면, P2* 프라이머 및 P1c* 프라이머). 이는 두 cDNA 가닥 모두의 검출을 가능하게 한다. 표지는 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인(fluorescein) 기일 수 있다.
검출 단계는 고체 지지체 상에 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드(Ro, 리포터 올리고뉴클레오티드)를 통해 cDNA 가닥 중 적어도 하나를 포획하는 것(capturing)을 포함할 수 있다. cDNA 가닥이 표지된 경우, 이는 표지를 특정 위치에 위치시키기 위해, 예를 들어, 표적 서열의 검출을 보여주는 선 또는 기타 지표를 개발하기 위해 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드 Ro는 초기에 부분 상보성(partially-complementary) 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 하나 이상의 미스매치를 갖는 올리고뉴클레오티드, 또는 고정된 올리고뉴클레오티드보다 짧은 올리고뉴클레오티드)에 혼성화될 수 있고; cDNA 가닥을 포획하는 것은 cDNA 가닥이 부분 상보성 올리고뉴클레오티드를 변위(displace)시킬 수 있게 하는 것을 포함한다. 부분 상보성 올리고뉴클레오티드가 cDNA와 부분적으로 동일하다는 것은 명백할 것이다. 바람직한 구체예에서, 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 고정된 올리고뉴클레오티드보다 짧고 cDNA보다 짧다. 변위된(displaced) 올리고뉴클레오티드가 유리 cDNA 또는 프라이머에 혼성화하는 경우, 리가아제가 활성화될 수 없도록 상대적인 길이를 선택하는 것이 바람직하다. 이는 위양성(false positives)을 줄이고, 또한 증폭 단계와 동일한 환경(즉, 프라이머의 존재 하에)에서 검출 단계를 수행할 수 있게 한다. 구현예에서, 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드 Ro 및 부분 상보성 올리고뉴클레오티드(Qo)는 리포터-퀀처(quencher) 쌍을 포함한다(예를 들어 Ro는 리포터를 포함할 수 있고 Qo는 퀀처를 포함할 수 있다). cDNA 가닥에 의한 Qo 올리고뉴클레오티드의 변위(displacement)는 리포터-퀀처 쌍을 분리하고, 리포터가 검출될 수 있게 한다. 이 접근 방식은 초기 프라이머에 표지를 포함시킬 필요를 회피한다. 임의의 적합한(compatible) 리포터-퀀처 쌍을 사용할 수 있다; 예를 들어, 리포터 염료의 경우, FAM 또는 VIC, 퀀처 염료의 경우 TAMRA이다. 기타 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 Ro 및 Qo는 핵산의 개재(intervening) 섹션을 통해, 또는 비핵산 링커(non-nucleic acid linker)를 통해 단일 분자로서 연결될 수 있다. 리포터-퀀처 쌍이 사용되는 것인 추가 구체예에서, Ro 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체 상에 고정될 필요는 없으나 용액 내에 있을 수 있다. 일 예에서, 용액 중의 Ro 및 Qo 올리고뉴클레오티드는 링커(핵산 또는 비핵산)에 의해 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 프라이머 서열 중 적어도 하나는 증폭될 표적 서열의 일부가 아닌 태그(tag)(예를 들어, 핵산 태그)를 포함한다. 이 태그는 본원에 기술된 바와 같이, 본 방법의 검출 또는 기타 단계에서 사용될 수 있다.
구체예에서, 프라이머 및 기타 서열은 다음과 같다:
3'-GAA CGA AAC GAC GAC GAA CT-5', 서열번호 3 - disDNA 서열
3'-GAC GAA CTGp-5', 서열번호 4 - P2p 서열
3'-TCT AAC TTG-5', 서열번호 5 - P2* 서열
5'-CTG ATT GA-3', 서열번호 6 - P1c* 서열
5'-p(Ab) AGA TTG AAC-3', 서열번호 7 - P1(csp) 서열, (Ab)는 무염기 부위임.
추가 구체예에서, Ro 및 Qo 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
5'-CTG CTT GAC AGA TTG AAC-3' 서열번호 8, 리포터 올리고
3'-GAC GAA CTG TC-5', 서열번호 9, 퀀처 올리고.
초기 이중 가닥 DNA 분자를 풀기 위해 DNA 언폴딩(unfolding) 효소(예를 들면, 재조합효소(recombinase) 또는 헬리카아제(helicase))를 첨가하여 유사한 방법을 이용하여 DNA를 증폭시키는 것도 가능한다. 따라서, 본 발명은 또한 샘플 중 표적 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 상기 표적 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표적 DNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
c) P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머인 것인 단계;
d) 단일가닥 DNA 결합 단백질 (SSB) 및 DNA 언폴딩 효소를 제공하는 단계;
e) 상기 SSB 및 상기 DNA 언폴딩 효소가 상기 표적 DNA 분자의 가닥을 분리하게 하여, 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 DNA에 어닐링할 수 있도록 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체(DNA-nicked DNA duplex)를 형성하는 단계;
f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜서, 하나의 DNA 가닥이 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 DNA-DNA 이중체를 형성하는 단계;
g) 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥이 상기 이중체로부터 분리되도록 하는 단계;
h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하게 하는 단계;
i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜, 상기 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 상기 불안정화 P1c*-P1(csp)에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체(product DNA duplex)를 형성하는 단계;
j) 상기 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리되게 하는 단계;
k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링되게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링되게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하는 단계;
l) 상기 프라이머를 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성하는 단계; 및
m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 cDNA 가닥 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제로 수행되는 것인 방법을 제공한다.
SSB는 박테리아 SSB일 수 있다. DNA 언폴딩 효소는 DNA 헬리카아제일 수 있거나, DNA 재조합효소, 바람직하게는 RecA일 수 있다.
DNA 리가아제는 바람직하게는 PBCV-1 DNA 리가아제이다. 본 발명의 이 양태의 기타 특징은 본원에 기술된 RNA 증폭 방법에 대한 것과 동일할 수 있다. 라이게이션된 DNA가 일단 형성되면 주형에서 자발적으로 분리될 것이므로, 이 방법에서는 변위 DNA가 필요하지 않다는 것이 주목된다. 또한, 본 발명자들은 SSB와 헬리카아제 또는 재조합효소를 사용하는 이 방법이 본원에 기술된 RT-LIDA 방법으로부터 disDNA를 대체하는 역할도 할 수 있다고 믿는다. 따라서, 본 발명의 추가 양태는 샘플 중 표적 RNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 상기 표적 RNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표적 RNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
c) 상기 P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머인 것인 단계;
d) 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB) 및 DNA 언폴딩 효소를 제공하는 단계;
e) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 RNA에 어닐링되어, RNA-닉킹된 DNA 이중체(RNA-nicked DNA duplex)를 형성하게 하는 단계;
f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜 RNA-DNA 이중체를 형성하는 단계로서, 상기 DNA 가닥은 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 단계;
g) 상기 SSB 및 DNA 언폴딩 효소가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥을 상기 이중체로부터 변위시키게 하는 단계;
h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하게 하는 단계;
i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜, P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp)에 상응하는 제2 불안정화 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성하는 단계;
j) 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리되게 하는 단계;
k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링되게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링되게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하하게 하는 단계;
l) 상기 프라이머를 라이게이션시켜, P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성하는 단계; 및
m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 cDNA 가닥 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제로 수행되는 것인 방법을 제공한다.
또한, 서열번호 3-7, 및 선택적으로 서열번호 8 및 9의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 서열번호 8의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 고정되고, 서열번호 9의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 그에 혼성화된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명자는 또한 반응 혼합물(reaction mix)이 액체 마스터 믹스(master mix)로 분리될 수 있고, 동결건조된 시약 성분이 가능하다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명은 표적 RNA 서열 증폭용 키트로서, 상기 키트는
a) PBCV-1 DNA 리가아제, Tris, MgCl2, ATP 및 DTT를 포함하는 액체 마스터 믹스;
b) RT-LIDA 수행에 적합한, 동결건조된 형태의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 변위 DNA를 포함하는 것인 키트를 제공한다.
상기 키트는 리포터 올리고뉴클레오티드가 고정된 고체 지지체(solid support), 및 상기 리포터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 퀀처 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 마스터 믹스는 1.05 μM DNA 리가아제, 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP 및 10 mM DTT를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 마스터 믹스 및/또는 동결건조된 성분은 크라우딩제(crowding agent), 바람직하게는 PEG를 포함할 수 있다.
구체예에서, 상기 고체 지지체는 반응이 일어날 수 있는 반응 용기의 형태이다. 동결건조된 시약은 반응 용기로 제공될 수 있다. 이러한 방식으로, 검출 대상 RNA를 포함하는 샘플과 마스터 믹스를 동결건조된 시약이 포함된 반응 용기에 첨가하고, 전체 증폭 및 검출 과정이 상기 용기에서 일어날 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 대안적인 액체 마스터 믹스에 관한 것이다. 이 구체예에서, 마스터 믹스는 pH 8 이상에서, Tris, 망간 양이온, DTT 및 1 mM 미만 ATP를 포함한다. 특히 바람직한 마스터 믹스는 pH 8.5에서 50 mM Tris-HCl, 5 mM MnCl2, 10 μM ATP, 10 mM DTT를 포함한다. 이는 더 높은 ATP 농도를 포함하고 더 낮은 pH를 가지며 MnCl2보다는 MgCl2를 포함하는 기존 PBCV-1용 마스터 믹스와 다르다. 예를 들어, New England Biolabs에서 구입할 수 있는 SplintR 리가아제에 대한 제품 데이터 시트를 참조한다. 본원에서 더 설명된 바와 같이, 이 변형된 마스터 믹스는 올바른 라이게이션 산물의 생성을 감소시킬 수 있는 부산물인 아데닐화된(adenylylated) DNA의 생성을 감소시킨다. 상기 믹스는 PBCV-1 DNA 리가아제를, 바람직하게는 1.05 μM로 추가로 포함할 수 있고, 및/또는 크라우딩제, 바람직하게는 PEG를 추가로 포함할 수 있다. 이 마스터 믹스는 또한, 기술된 바와 같이 동결건조된 시약과 함께 제공될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2의 게놈 지도를 보여준다.
도 2. SARS-CoV-2 ORF9c. 적색 음영 서열(red shaded sequence)은 단백질 서열 간의 유사성을 나타내며, 3개 아미노산 'LTD' 말단 삽입의 위치는 화살표로 표시된다.
도 3. SARS-CoV-2 ORF9c의 부분의 뉴클레오티드 서열, 및 관련 올리고뉴클레오티드의 위치.
도 4. RT-LIDA 프로세스의 개요.
도 5. SARS-CoV-2 ORF9c RT-LIDA 올리고뉴클레오티드.
도 6. T4 리가아제를 이용한 증폭 산물의 형성
도 7. T4 및 PBCV-1 리가아제에 의한 단일 염기 오버행 라이게이션의 비교.
도 8. 양성 및 음성 대조 샘플에서 PCBV-1 리가아제의 사용.
도 9. RNA 주형에 대한 DNA 라이게이션의 동역학(kinetics).
도 10. 변위 리포팅 전략.
도 11. 리포팅 전략에 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열
도 12. 테스트 결과의 지표.
도 13. 테스트 결과의 예.
도 14. 수정된 변위 리포팅 전략.
발명의 상세한 설명
코로나바이러스(CoV)(니도비랄레스(Nidovirales) 목, 코로나비리대(Coronaviridae) 과, 코로나비리내(Coronavirinae) 아과(subfamily))는 양성 센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 외피 바이러스(enveloped virus)이다. 게놈 크기의 길이는 26 내지 32 킬로베이스(kb)이다. 그들은 인간을 감염시키고 감기와 유사한 상부 호흡기 감염(URTI)부터 기관지염, 폐렴, 심지어 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)과 같은 하부 호흡기 감염(LRTI)에 이르기까지 다양한 정도로 질병을 유발한다. SARS-CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV는 높은 사망률로 이어지는 중증 감염을 유발한다.
코로나바이러스 게놈은 스파이크(S) 단백질, 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 막(M) 단백질, 및 외피(E) 단백질의 4가지 주요 구조 단백질을 코딩하고, 이들 모두가 구조적으로 완전한 바이러스 입자를 생성하기 위해 요구된다. E 단백질은 주요 구조 단백질 중 가장 작다. 복제 주기 동안, E는 감염된 세포 내부에서 풍부하게 발현되지만, 일부분만이 비리온 외피에 포함된다. E는 바이러스 조립, 비리온 방출 및 바이러스의 발병에 참여한다. 이 단백질의 대부분은 세포내 수송(intracellular trafficking)의 부위, ER, Golgi 및 ERGIC에 국재화되고, CoV 조립 및 발아(budding)에 참여한다.
SARS-CoV 게놈 구성 및 전사에 대한 비교 분석과 결합된 SARS-CoV-2 균주의 시퀀싱된 게놈이 유전자 산물의 잠정 목록을 구성하는 데 이용되었다. SARS-CoV-2에는 폴리프로테인(polyprotein) (wORF1ab)을 구성하는 16개의 예측된 비구조 단백질, 및 그에 이어진 (적어도) 13개의 하류 개방 해독 프레임(ORF): 표면 당단백질(또는 스파이크), ORF3a, ORF3b, 외피(Envelope), 막(Membrane), ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, 뉴클레오캡시드, ORF9a, ORF9b 및 ORF10을 갖는다. 단백질이 가장 높은 유사성을 공유하는 3개의 바이러스 종은 일관되게 동일했다: 인간 SARS 코로나바이러스(SARS-CoV), 박쥐 코로나바이러스(BtCoV) 및 또다른 박쥐 베타코로나바이러스(BtRf-BetaCoV). SARS-CoV-2의 게놈 맵이 도 1에 도시된다.
SARS-CoV-2의 임상 샘플에서 증가하는 개수의 돌연변이가 이미 확인되었다. 따라서, 돌연변이의 영향을 가장 적게 받는 영역에 대한 분석을 설계하거나, 임상의나 연구자에게 돌연변이를 다시 리포트할 수 있는 화학을 선택하는 것이 중요한다.
이러한 돌연변이 중 다수는 상업적으로 이용 가능한 분석에 사용되는 부위에 걸쳐 있어 이러한 테스트의 성능을 변경한 것으로 나타났다. 일부에서는, 프라이머, 프로브 또는 프라이머와 프로브 부위에 걸쳐 다중 돌연변이가 관찰되었다.
스파이크 단백질의 가변 영역에 대한 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 대신, 본 발명자들은 다른 SARS나 코로나바이러스에는 존재하지 않고 SARS-CoV-2에서는 상대적으로 보존된 영역을 선택했다. 본 발명자들은 SARS-CoV-2에 고유하여, 이를 매우 특이적이게 하는, 삽입을 포괄하는 테스트를 설계하였다. 이 표적을 선택하는 것의 장점은 단일 표적을 이용하여 SARS-CoV-2 테스트를 수행할 수 있다는 것이다; SARS-CoV-2에 대한 다른 분석은 일반적으로 고유하지 않은 표적으로부터 다른 코로나바이러스와의 교차 반응 가능성으로 인해 최소 2개의 개별 게놈 표적을 사용해야 한다.
특히, 본 발명자들은 ORF9c(이전에는 ORF14로 알려짐)를 표적으로 하는 RT-LIDA 분석을 설계했다. 이것은 이전에 기능이 알려지지 않았으며 인간 SARS 및 Bat CoV에 존재하는 70개 아미노산 단백질이다. SARS-CoV-2에서, ORF9c 단백질은 73개 아미노산 길이이며, 전사체의 말단에 3개의 추가 아미노산을 코딩하는 9bp 삽입물을 갖는다(도 2는 SARS-CoV-2(서열번호 12), 인간 SARS(서열번호 13), 및 Bat CoV(서열번호 14)로부터의 ORF9c 아미노산 서열의 비교를 보여준다). 보다 최근에 이 단백질은 인간의 면역계를 회피하는 바이러스의 능력에 결정적이고 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다; 이 단백질의 중요성과 ORF9c 서열의 가변성의 관찰된 부재를 고려할 때, 이 고도로 보존된 영역은 진단 표적으로 매우 적합한 것으로 보이다.
도 3은 ORF9c 삽입부(서열번호 15)에 걸쳐 있는 SARS-CoV-2 게놈에서 얻은 cDNA의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열(서열번호 16) 및 상보적 DNA 서열(서열번호 17)을 보여준다. disDNA(displacement DNA)와 제1 및 제2 프라이머(P2p, P2*)가 파생되는 위치들이 도면에 표시된다.
RT-LIDA의 전체 프로세스가 도 4에 도시된다. 상단 패널에서, 선형 증폭(linear amplification)으로 RNA 유발 라이게이션(RNA-triggered ligation)이 일어나서, 주형으로부터 cDNA를 생성한다. 하단 패널에서, cDNA는 기하급수적으로 증폭된다. 표적 RNA("표적 RNA-I'")를 함유하는 샘플은 DNA 프라이머 P2p 및 P2*와 조합되고, 이는 표적 RNA-I'의 인접한 부분에 혼성화되어 RNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성한다. 그 후, 반응 믹스 중 리가아제가 닉(nick)을 복구하여, RNA-DNA 이중체가 생성된다. cDNA와 부분적으로 중첩되는 변위 DNA 가닥(disDNA')은 RNA와 우선적으로 혼성화되어, 생성된 cDNA-II 가닥을 변위시킨다.
그 후, 반응은 지수 증식기(exponential phase)로 진행되어, DNA 프라이머 P2p 및 P2*와 불안정화 DNA 프라이머 P1c* 및 P1(csp)가 교대로 c-DNA-II 또는 F-DNA-I 가닥에 혼성화되고, 그 후, 불안정화 프라이머의 무염기 부위 및 내부 이스매치의 불안정화 특징의 존재로 인해, 혼성화된 가닥에서 자발적으로 분리된다. 따라서, 각 주기마다 cDNA 가닥의 개수가 두 배로 증가한다. 이 도면에서, 불안정화 프라이머에는 형광 표지가 포함되어 있어, 형성 후 F-DNA-I 가닥의 검출을 가능하게 한다. 도 5는 SARS-CoV-2에 대한 RT-LIDA 검출 방법에서 사용되는 다양한 올리고뉴클레오티드를 보여준다. RNAcov(서열번호 10)는 분석 테스트에 사용되는 합성 RNA 주형이다.
기존의 RT-LIDA 프로세스는 T4 리가아제를 라이게이션 효소로 사용한다. 그러나, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 이 효소는 일정 시간이 지나면 위양성을 초래한다. 구체적으로, 도 6은 주형 cDNA의 다양한 출발 농도에서 DNA-I 산물의 생산을 보여준다. 음성 샘플에 대해서도, DNA-I은 여전히 생성된다. 이는 반응 믹스 중 올리고뉴클레오티드 프라이머 이중체의 형성으로 인한 것으로 생각된다- T4 리가아제는 단일 염기 오버행이 있는 경우, 이러한 이중체를 자발적으로 라이게이션시키고, 반응이 진행되면서, 이러한 라이게이션된 올리고뉴클레오티드는 증폭을 발생시킬 것이다(seed). 분명히, 이것은 바람직하지 않다.
따라서, 본 발명자들은 단일 염기 오버행 라이게이션 능력이 결여된 대안적인 리가아제의 이용을 조사했다. PBCV-1 리가아제는 Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 17 DOI: 10.1093/nar/gkg665에 기술되고; PBCV-1 리가아제에 의한 RNA-스플린트 DNA(RNA-splinted DNA)의 라이게이션은 G Lohman et al, "Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase"; Nucleic acids research, 42(3), 1831-1844. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1032에 기술된다. 도 7은 T4 리가아제 및 PBCV-1 리가아제에 의한 단일 염기 오버행의 라이게이션을 비교한다. PBCV-1 리가아제에 의한 라이게이션은 없다. 도면의 아래쪽 부분은 산물의 겔 전기영동을 보여준다. 5'-무염기 포스페이트(5'-abasic phosphate)를 갖는 단일 염기 오버행의 낮은 수준 라이게이션은 T4 DNA 리가아제에 의해 일어나는 것으로 확인된다(i). PBCV-1 DNA 리가아제로는 SBO 라이게이션이 검출되지 않았다(ii). 비교 목적을 위해 14 nM 표적으로 개시된 완전한 라이게이션 산물(full ligation product)이 표시된다(iii). PBCV-1 DNA 리가아제에 의한 5'-무염기 포스페이트의 라이게이션의 부재는 T4 DNA 리가아제에서 관찰되는 배경 증폭을 방지한다.
양성 및 음성 대조군 샘플에서 PBCV-1 리가아제를 사용한 결과가 도 8에 도시된다. 퍼센트 수율(perent yield)은 형광 표지된 P1c 올리고뉴클레오티드의 라이게이션에 근거한다. 효소를 증폭 혼합물에 직접 첨가했다. 음성 대조군에서는 300분 후에도 신호가 관찰되지 않았다는 것을 알 수 있다.
권장 조건에서, PBCV-1 반응 완충액은 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT를 포함하며, 반응은 25℃, pH 7.5에서 수행된다. 그러나, 이는 정확한 라이게이션 산물의 수율을 감소시키는 아데닐화된(adenylylated) DNA 프라이머의 생성을 초래할 수 있다. PBCV-1 DNA 리가아제는 반응성 3'-OH 및 5'-PO4 말단을 포함하는 닉킹된 DNA 이중체에 결합한다. PBCV-1 DNA 리가아제는 연속 DNA 이중체, 테일이 있는 이중체(tailed duplex) 또는 라이게이션될 수 없는 3'-OH 및 5'-OH 말단을 포함하는 닉킹된 리간드에 결합하지 않는다.
ATP 의존성 DNA 리가아제는 3개의 연속 뉴클레오티딜 전달 반응을 통해 5'-포스페이트 말단 가닥과 3'-히드록실 말단 가닥의 연결을 촉매한다. 제1 단계에서, DNA 리가아제에 의한 ATP의 α-포스페이트 공격은 피로포스페이트(pyrophosphate)의 변위 및 AMP가 라이신의 ε-아미노기에 연결된 것인 공유결합성 리가아제-아데닐레이트 중간체(covalent ligase-adenylate intermediate)의 형성을 초래한다. 활성 부위 라이신 잔기는 보존된 모티프인 KxDGxR 내에 위치한다. 그 후, AMP가 닉킹된 DNA 이중체의 5'-모노포스페이트 말단으로 전달되어, 역위 (5')-(5') 피로포스페이트 브릿지 구조, AppDNA로 구성된 DNA-아데닐레이트 중간체를 형성한다. DNA-아데닐레이트 상의 닉킹된 이중체의 3'-OH 말단 가닥에 의한 공격은 닉을 채우고, AMP를 방출한다.
유리 리가아제가 ATP와 빠르게 반응하여 효소의 활성 부위를 아데닐화하기 때문에, AppDNA가 용액으로 방출되면, mM ATP 농도의 조건에서 '막힌 말단(dead end)' 산물이 될 수 있다. 효소의 아데닐릴기가 AppDNA 중간체의 아데닐릴기와 동일한 결합 포켓을 차지하기 때문에, 아데닐화된(adenylylated) 효소는 AppDNA에 결합할 수 없다. μM ATP 농도는 AppDNA 기질을 라이게이션된 DNA에 효과적으로 결합하고 반응할 수 있는 탈아데닐화(deadenylylated) 리가아제의 더 높은 정상 상태(steady state) 농도를 초래한다.
μM ATP(예: 10μM)를 사용할 뿐만 아니라, 효소 농도 및 Mg2+ 대신 Mn2+(5mM) 선택은 AppDNA의 형성 및 막힌 말단 기질의 가능성을 크게 감소시킨다. pH 8.5는 AppDNA를 제거하고, 일반적으로 대부분의 리가아제 마스터 믹스에는 7 내지 8읠 pH가 이용된다. 따라서, 본 발명은 망간 양이온, 감소된(1 mM 미만) 양의 ATP 및 8 초과의 pH를 포함하는 리가아제 완충액을 추가로 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 리가아제 완충액은 pH 8.5에서 50 mM Tris-HCl, 5 mM MnCl2, 10 μM ATP, 10 mM DTT를 포함한다.
추가 연구는 PBCV-1 리가아제가 T4 리가아제보다 더 빠르게 RNA 주형의 DNA 프라이머를 추가로 라이게이션시킨다는 것을 보여주었다. 도 9를 참조한다. 여기서, RNA 주형은 5'-CUU GCU UUG CUG CUG CUU GAC AGA UUG AAC CAG CUU GAG A-3'("RNAcov"; 서열번호 10)이었고, P2p 및 P2* 프라이머가 사용되었다. PBCV-1에 의한 보다 빠른 라이게이션은 RNA-주형(RNA-templated) 단계까지 소요되는 시간을 줄이는 데 이점이 있으나, 두 반응의 역학을 최적화하여 RNA 주형 단계 후에 변위 DNA가 LIDA를 개시할 수 있도록 허용하는 데에도 중요할 수 있다. 구체적으로, disDNA의 길이를 줄이면 RT-라이게이션 산물의 변위를 위해 걸리는 시간이 증가될 것이다. 따라서, PBCV-1을 사용하면 변위 전에 라이게이션이 일어나서, 초기 cDNA 산물의 산물을 보장할 수 있다. 이는 민감도를 향상시키고, 위음성의 가능성을 감소시킨다. 반응은 PBCV-1 DNA 리가아제 1.05 μM, 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP 및 DTT를 사용하여 수행하거나; 또는, T4 DNA 리가아제 2000 CEU, 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 10 μM ATP를 사용하여 수행하였다. 또한, 이들 반응 동역학은 반응을 더욱 가속화하기 위해 PBCV-1을 포함하는 반응 믹스에서, PEG와 같은 분자 크라우딩제(crowding agent)의 사용을 허용한다.
리포팅 전략의 예시가 도 10에 도시된다. 라이게이션 및 증폭 단계는 리포터 염료를 포함하는 리포터 올리고뉴클레오티드 Ro가 고정된 고체 지지체와 접촉하여, 액체 상에서 수행된다. 이는 초기에 퀀처 분자를 포함하는 더 짧은 상보성 올리고뉴클레오티드 Qo에 혼성화된다. 중요한 것은, Ro 올리고뉴클레오티드는 cDNA 산물 가닥 중 하나와 길이가 동일하고 완전히 상보적이고; Qo 올리고뉴클레오티드는 cDNA 산물 가닥의 일부와 동일한 서열을 갖지만 전장보다 짧고(여기서는 6nt 더 짧음), 개별 프라이머보다 길다. 따라서, 존재하는 경우, cDNA는 Qo 올리고뉴클레오티드를 변위시켜, 리포터와 퀀처를 분리하고, 리포터의 검출을 가능하게 할 것이다. 더 작은 개별 프라이머는 Qo 올리고뉴클레오티드를 변위시킬 수 없으므로, 이 시스템은 위양성 경향이 없다. 또한, 오버행이 너무 짧아서(예를 들어, 전체 Qo가 cDNA보다 6nt 더 짧은 경우인 3nt) 닉 라이게이션이 일어날 수 없는 경우, 방출된 Qo 올리고뉴클레오티드는 PBCV-1에 의해 수행되는 라이게이션 반응에 참여할 수 없다; 다시, 이는 위양성의 가능성을 감소시킨다. 관련 서열이 도 11에 예시된다(Ro, 서열번호 8; Qo, 서열번호 9; LIDA 라이게이션 산물, 서열번호 11). LIDA 라이게이션 산물은 P1c*(서열번호 6) 및 P1(csp)(서열번호 7)이다.
기타 구체예에서, 프라이머는 또한 증폭될 표적 영역의 일부가 아닌 추가적인 서열 태그(tag)를 포함할 수 있고; 이는 부분적으로 상기 서열 태그에 상보적인 리포터 서열의 사용을 허용하고, 프라이밍 영역(priming region) 자체에 대한 서열 상동성을 요구하지 않는다. 이는 리포터 또는 방출된 서열에 결합하는 서열의 위험을 감소시킨다. 예를 들어, 검출할 서열이 P2p-P2* 라이게이션된 올리고뉴클레오티드인 경우, P2* 프라이머는 추가 서열 태그인 P2p-P2*-T를 포함할 수 있다. 리포터 올리고뉴클레오티드 Ro는 전체적으로 P2p-P2*-T 서열에 상보적이나, 퀀처 올리고뉴클레오티드 Qo는 태그를 생략하므로 P2p-P2* 서열을 갖는다. 이 구체예에서, 방출된 Qo 올리고뉴클레오티드는 P1 프라이머에 대해 주형으로 작용할 수 있고; 그러나, P2p-P2*-T 산물이 축적되면서, 방출이 일어나고, 실제 증폭 및 방출이 있는 경우에만 신호가 검출된다. 발생하므로 신호는 감지된다. 이 수정된 변위 리포팅 전략이 도 14에 예시된다.
위양성 산물 형성의 전술된 제거와 이 조합의 특별한 이점은 투입(input) 표적 RNA 농도에 관계없이, 특정 시간 후에 증폭이 항상 완료(100%)되고, 따라서, 종말점(endpoint) 결정으로서 형광 강도를 평가하는 최소 요건이 있고, 이는 POC 및 OTC 애플리케이션에 특히 적합한 예/아니요(yes/no) 결과를 제공한다는 것이다. 그러나, 시간의 함수로서 형광 신호의 모니터링이 샘플 내 RNA 양을 결정하는 것이 중요한 전문적인 용도의 정량적 측정을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법은 두 가지 방식(modality) 모두에서 사용될 수 있다.
도 13은 본원에 설명된 분석 및 리포팅 전략의 개념 증명(proof of concept)을 보여준다. 세 가지 분석 테스트가 표시된다; 좌측부터 우측으로, 이들은 SARS-CoV-2 라이게이션 산물의 첨가에 의한 리포터로부터 퀀처 올리고뉴클레오티드의 변위 후, 퀀칭되지 않은 리포터 올리고; Ro/Qo 리포터-퀀처 쌍의 퀀칭된(quenched) 신호; 및 양성 신호이다.
마지막으로, 리포팅 전략이 어떻게 나타날 수 있는지에 대한 예시가 도 12에 도시된다. 리포터-퀀처 올리고가 십자형으로 배열될 수 있고, 십자형의 한쪽 암(arm)은 양성 테스트(예: SARS-CoV-2)에 대한 리포터이고 다른 쪽 암은 테스트에 포함된 대조군(예를 들어, 샘플에 존재할 것으로 예상되는 인간 mRNA)에 대한 리포터이다. 따라서, 리포터의 전개(development)는 테스트가 음성인지 양성인지에 대한 간단한 표시를 제공한다.
요약하면, 본 발명자들은 밀접하게 관련된 바이러스와 구별되는 고도로 보존된 영역을 식별하는 SARS-CoV-2에 대한 분석을 개발했다. 또한, 개발 과정에서 본 발명자들은 RT-LIDA 반응에서 PBCV-1 리가아제를 사용하면 다음과 같은 여러 가지 이점이 있음을 확인했다:
T4 DNA 리가아제와 달리, 단일 오버행을 5'-무염기 포스페이트와 라이게이션시키지 않아, T4 DNA 리가아제에서 관찰된 배경 유발 라이게이션을 완전히 제거한다;
PBCV-1 DNA 리가아제는 T4 DNA 리가아제보다 훨씬 빠르게 DNA 단편의 RNA-주형 라이게이션(RNA-templated ligation)을 촉매하고; 이는 이 단계의 시간을 수분으로 단축시킨다; 및
disDNA 올리고뉴클레오티드의 길이를 최적화하면 변위 활성이 RNA로부터 DNA 올리고를 제거하기 전에, RT가 일어날 수 있게 할 수 있으며, 이는 일반적으로 이 중요한 라이게이션 단계의 효율성을 제한한다. 이는 단일 단계 프로세스를 허용한다.
또한, 변위 리포팅 방법의 채택은 LIDA에 특히 유용할 것이며, 실제로 LIDA 분석 내에서 올리고뉴클레오티드 결합 분리 동역학(oligonucleotide association dissociation kinetics)의 동일한 변위 메커니즘을 기반으로 한다. 이것도 단일 단계 프로세스로 수행될 수 있다.
본 발명자들은 개선된 라이게이션 마스터 믹스를 추가로 개발했고, 그의 사용은 라이게이션 동안 AppDNA 생성을 감소시키고, 이는 정확한 라이게이션 산물의 수율을 감소시킬 수 있다.
또한, RecA 또는 헬리카아제와 같은 SSB 및 DNA 풀림(unwinding) 단백질을 사용하면 단일 단계 증폭 절차가 DNA뿐만 아니라 RNA에서도 수행될 수 있다.
이러한 특성은 본원에 기술된 분석이 단일 반응 용기에서 단일 단계로 신속하게 수행될 수 있음을 의미한다.
서열목록
3'-AAC TGT CTA-5', 서열번호 1 -LTD 삽입의 cDNA 서열
5'-UUG ACA GAU-3', 서열번호 2 -LTD 삽입의 게놈 서열
3'-GAA CGA AAC GAC GAC GAA CT-5', 서열번호 3 - disDNA 서열
3'-GAC GAA CTGp-5', 서열번호 4 - P2p seq
3'-TCT AAC TTG*-5', 서열번호 5 - P2* seq, * 는 표지(label) 임
5'-C*TG ATT GA-3', 서열번호 6 - P1c* seq
5'-p(Ab) AGA TTG AAC-3', 서열번호 7 - P1(csp) seq, (Ab)는 무염기 부위임
5'-CTG CTT GAC AGA TTG AAC-3' 서열번호 8, 리포터 올리고
3'-GAC GAA CTG TC-5', 서열번호 9, 퀀처 올리고(quencher oligo)
5'-CUU GCU UUG CUG CUG CUU GAC AGA UUG AAC CAG CUU GAG A-3' 서열번호 10, RNAcov
3'-GAC GAA CTG TCT AAC TTG-5', 서열번호 11, LIDA 라이게이션 산물
서열번호 12 - 도 2의 SARS-CoV-2 서열
서열번호 13 - 도 2의 인간-CoV 서열
서열번호 14 - 도 2의 Bat-CoV (SARS-유사) 서열
서열번호 15 - 도 3의 ORF9c_RT-LIDA 서열
서열번호 16 -도 3의 프레임(frame) 1 서열
서열번호 17 -서열번호 15의 상보체 (complement)
SEQUENCE LISTING <110> Readygo Diagnostics Limited <120> Assay <130> PC931781WO <150> GB2108853.9 <151> 2021-06-21 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> SARS-CoV-2 <400> 1 atctgtcaa 9 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> SARS-CoV-2 <400> 2 uugacagau 9 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> disDNA sequence <400> 3 tcaagcagca gcaaagcaag 20 <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2p primer <400> 4 gtcaagcag 9 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2* primer <400> 5 gttcaatct 9 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1c* primer <400> 6 ctgattga 8 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 (csp) primer <400> 7 agattgaac 9 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reporter oligo <400> 8 ctgcttgaca gattgaac 18 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher oligo <400> 9 ctgtcaagca g 11 <210> 10 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA template <400> 10 cuugcuuugc ugcugcuuga cagauugaac cagcuugaga 40 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIDA ligation product <400> 11 gttcaatctg tcaagcag 18 <210> 12 <211> 73 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 12 Met Leu Gln Ser Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys 1 5 10 15 Ala Ser Thr Gln Lys Gly Ala Glu Ala Ala Val Lys Pro Leu Leu Val 20 25 30 Pro His His Val Val Ala Thr Val Gln Glu Ile Gln Leu Gln Ala Ala 35 40 45 Val Gly Glu Leu Leu Leu Leu Glu Trp Leu Ala Met Ala Val Met Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Cys Cys Cys Leu Thr Asp 65 70 <210> 13 <211> 70 <212> PRT <213> Human-CoV <400> 13 Met Leu Pro Pro Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys 1 5 10 15 Ala Ser Thr Gln Arg Glu Ala Glu Ala Ala Val Lys Pro Leu Leu Ala 20 25 30 Pro His His Val Val Ala Val Ile Gln Glu Ile Gln Leu Leu Ala Ala 35 40 45 Val Gly Glu Ile Leu Leu Leu Ala Trp Leu Ala Glu Val Val Lys Leu 50 55 60 Pro Ser Arg Tyr Cys Cys 65 70 <210> 14 <211> 70 <212> PRT <213> Bat-CoV <400> 14 Met Leu Pro Ser Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys 1 5 10 15 Ala Ser Thr Gln Arg Gly Ala Glu Val Ala Val Asn Leu His Leu Ala 20 25 30 Pro His His Val Val Ala Val Ile Gln Glu Ile Gln Leu Leu Ala Ala 35 40 45 Val Gly Glu Val Leu Leu Leu Asp Trp Leu Ala Glu Val Val Lys Leu 50 55 60 Pro Ser Arg Tyr Cys Cys 65 70 <210> 15 <211> 170 <212> DNA <213> SARS-CoV-2 <400> 15 tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat 60 ggctggcaat ggcggtgatg ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct 120 tgagagcaaa atgtctggta aaggccaaca acaacaaggc caaactgtca 170 <210> 16 <211> 56 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 16 Val Ala Thr Val Gln Glu Ile Gln Leu Gln Ala Ala Val Gly Glu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Glu Trp Leu Ala Met Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Cys 20 25 30 Cys Cys Leu Thr Asp Thr Ser Leu Arg Ala Lys Cys Leu Val Lys Ala 35 40 45 Asn Asn Asn Lys Ala Lys Leu Ser 50 55 <210> 17 <211> 170 <212> DNA <213> SARS-CoV-2 <400> 17 agcgttgtca agttctttaa gttgaggtcc gtcgtcatcc ccttgaagag gacgatctta 60 ccgaccgtta ccgccactac gacgagaacg aaacgacgac gaactgtcta acttggtcga 120 actctcgttt tacagaccat ttccggttgt tgttgttccg gtttgacagt 170

Claims (31)

  1. 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 샘플에 존재하는 RNA로부터 cDNA를 생성하는 단계; ORF9c를 코딩하는 SARS-CoV-2 게놈에 해당하는 cDNA의 부분에 특이적인 증폭 과정을 이용하여 cDNA의 부분을 증폭시키는 단계; 및 ORF9c 단백질의 말단 또는 그 근처에 있는 Leu-Thr-Asp(LTD) 서열을 코딩하는 증폭된 cDNA의 부분의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 증폭은 RT-LIDA를 통해 이루어지는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 RT-LIDA는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제의 사용을 포함하고; 바람직하게는 상기 DNA 리가아제는 PBCV-1 DNA 리가아제인 것인 방법.
  4. 선행하는 항에 있어서, 상기 검출하는 단계는, 선택적으로 고체 지지체에 고정된, 상보성 올리고뉴클레오티드를 통해 cDNA 가닥 중 적어도 하나를 포획하는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드는 초기에 부분 상보성 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고; cDNA 가닥을 포획하는 것은 상기 cDNA 가닥이 상기 부분 상보성 올리고뉴클레오티드를 변위시킬 수 있게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 상기 고정된 올리고뉴클레오티드보다 짧고, 상기 cDNA보다 짧은 것인 방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드 및 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 리포터-퀀처(quencher) 쌍을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변위된 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 추가 증폭을 위한 기질을 형성하지 않는 것인 방법.
  9. 선행하는 항에 있어서, 상기 증폭은 서열번호 4-7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머의 사용을 포함하는 것인 방법.
  10. ORF9c 단백질의 말단 또는 그 근처에 있는 Leu-Thr-Asp(LTD) 서열을 코딩하는 핵산의 부분을 증폭 및 검출하는, SARS-CoV-2에 대한 분석.
  11. 서열번호 3-7, 및 선택적으로 서열번호 8 및 9의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  12. 청구항 11에 있어서, 서열번호 8의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 고정된 것인 키트.
  13. 샘플 중 표적 RNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 표적 RNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 표적 RNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
    c) P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머인 것인 단계;
    d) 상기 P2p 및/또는 P2* 프라이머와 중첩되고 상기 표적 RNA 분자에 상보적인 disDNA(displacement DNA strand)를 제공하는 단계;
    e) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 RNA에 어닐링되어 RNA-닉킹된 DNA 이중체(RNA-nicked DNA duplex)를 형성하게 하는 단계;
    f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜 RNA-DNA 이중체를 형성하는 단계로서, 상기 DNA 가닥은 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 단계;
    g) disDNA가 상기 이중체로부터 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥을 변위시킬 수 있게 하는 단계;
    h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성하게 하는 단계;
    i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜, P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥 및 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체(product DNA duplex)를 형성시키는 단계;
    j) 상기 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리될 수 있게 하는 단계;
    k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링될 수 있게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링될 수 있게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    l) 상기 프라이머들을 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥, 및 상기 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성시키는 단계; 및
    m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
    상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제에 의해 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 불안정화 프라이머는 무염기 부위(abasic site) 또는 상응하는 상보성 서열과의 미스매치(mismatch)의 존재로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 하나의 불안정화 프라이머는 미스매치를 포함하고, 하나의 불안정화 프라이머는 무염기 부위를 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 각 쌍의 상류 프라이머는 5' 말단에 포스페이트 기를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 13 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 cDNA 가닥을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머 중 적어도 하나는 표지(label)를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 검출하는 단계는. 선택적으로 고체 지지체에 고정된, 상보성 올리고뉴클레오티드를 통해 적어도 하나의 cDNA 가닥을 포획하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드는 초기에 부분 상보성 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고; 상기 cDNA 가닥을 포획하는 것은 상기 cDNA 가닥이 상기 부분 상보성 올리고뉴클레오티드를 변위시킬 수 있게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 상기 고정된 올리고뉴클레오티드보다 짧고, 상기 cDNA보다 짧은 것인 방법.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드 및 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 리포터-퀀처 쌍을 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변위된 부분 상보성 올리고뉴클레오티드는 추가 증폭을 위한 기질을 형성하지 않는 것인 방법.
  24. 청구항 13 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 RNA 분자는 바이러스 RNA, 바람직하게는 SARS-CoV-2 RNA인 것인 방법.
  25. 청구항 13 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 4-7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
  26. 청구항 13 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 리가아제는 PBCV-1 DNA 리가아제인 것인 방법.
  27. 표적 RNA 서열의 증폭용 키트로서, 상기 키트는
    a) PBCV-1 DNA 리가아제, Tris, MgCl2, ATP 및 DTT를 포함하는 액체 마스터 믹스(master mix);
    b) RT-LIDA 수행에 적합한, 동결건조된 형태의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 변위 DNA를 포함하는 것인 키트.
  28. 청구항 27에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드, 및 상기 리포터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 퀀처 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 리포터 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 고정된 것인 키트.
  29. 8.0 이상의 pH, 1 mM 이하의 ATP 중 하나 이상의 선택 및 망간 양이온의 사용을 통해 AppDNA 라이게이션 중간 복합체의 생성을 제한하는 라이게이션 완충액.
  30. 샘플 중 표적 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 표적 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 표적 DNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
    c) P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머인 것인 단계;
    d) 단일가닥 DNA 결합 단백질 (SSB) 및 DNA 언폴딩(unfolding) 효소를 제공하는 단계;
    e) 상기 SSB 및 상기 DNA 언폴딩 효소가 상기 표적 DNA 분자의 가닥을 분리하여, 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 DNA에 어닐링할 수 있게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜서, 하나의 DNA 가닥이 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 DNA-DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    g) 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥이 상기 이중체로부터 분리되게 하는 단계;
    h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜, 상기 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 상기 불안정화 P1c*-P1(csp)에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    j) 상기 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리되게 하는 단계;
    k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링되게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링되게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    l) 상기 프라이머를 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성시키는 단계; 및
    m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 cDNA 가닥 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
    상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제로 수행되는 것인 방법.
  31. 샘플 중 표적 RNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 표적 RNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 표적 RNA 분자의 연속 부분에 상보적인 제1 DNA 프라이머 및 제2 DNA 프라이머(P2p, P2*)를 제공하는 단계;
    c) 상기 P2p 및 P2* 프라이머에 상보적인 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머(P1c*, P1(csp))를 제공하는 단계로서, 상기 제3 DNA 프라이머 및 제4 DNA 프라이머는 불안정화 프라이머인 것인 단계;
    d) 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB) 및 DNA 언폴딩 효소를 제공하는 단계;
    e) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 표적 RNA에 어닐링될 수 있게 하여 RNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    f) 상기 P2p 및 P2* 프라이머를 라이게이션시켜 RNA-DNA 이중체를 형성시키는 단계로서, 상기 DNA 가닥은 라이게이션된 P2p-P2*인 것인 단계;
    g) 상기 SSB 및 DNA 언폴딩 효소가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥을 상기 이중체로부터 변위시키게 하는 단계;
    h) 상기 불안정화 프라이머가 상기 라이게이션된 P2p-P2* DNA 가닥에 어닐링될 수 있게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    i) 상기 P1c* 및 P1(csp) 프라이머를 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp)에 상응하는 제2 불안정화 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    j) 불안정화된 cDNA 가닥이 상기 제1 cDNA 가닥으로부터 분리되게 하는 단계;
    k) 상기 P2p 및 P2* 프라이머가 상기 불안정화된 cDNA 가닥에 어닐링되게 하고, 상기 불안정화 프라이머가 상기 제1 cDNA 가닥에 어닐링되게 하여 DNA-닉킹된 DNA 이중체를 형성시키는 단계;
    l) 상기 프라이머를 라이게이션시켜 P2p-P2* 프라이머에 상응하는 제1 cDNA 가닥과 불안정화 P1c*-P1(csp) 프라이머에 상응하는 제2 불안정화된 cDNA 가닥을 갖는 산물 DNA 이중체를 형성하는 단계; 및
    m) 단계 j) 내지 l)을 반복하여 상기 제1 cDNA 가닥 및 제2 cDNA 가닥의 복수 카피를 생성하는 단계;를 포함하고,
    상기 라이게이션시키는 단계는 단일 염기 오버행 또는 평활 말단 라이게이션 능력을 갖지 않는 DNA 리가아제로 수행되는 것인 방법.
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