CN117677711A - 通过损伤诱导的dna扩增(lida)的sars-cov-2测定 - Google Patents

通过损伤诱导的dna扩增(lida)的sars-cov-2测定 Download PDF

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Abstract

描述了对于SARS‑CoV‑2的测定方法，以及用于扩增RNA或DNA的基于损伤诱导的DNA扩增(LIDA)的方法。

Description

通过损伤诱导的DNA扩增(LIDA)的SARS-COV-2测定
技术领域
本发明涉及核酸测定以及用于扩增或扩增和检测核酸的方法。在具体实施方案中，本发明涉及用于检测SARS-CoV-2核酸的测定方法。
背景技术
SARS-CoV-2流行病导致了许多检测该病毒的测定方法的开发。最常见的两种是基于抗原的侧向流动测定或RT-PCR测定，基于抗原的侧向流动测定使用缀合抗体结合刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白或核衣壳蛋白来检测特定病毒蛋白的存在；RT-PCR测定放大特定的病毒基因组序列以检测该病毒的存在。其中每一个都有优点和缺点；侧向流动测定速度快，仅需30分钟即可得出结果，但灵敏度相对较低，且容易出现假阴性。RT-PCR测定更准确，但考虑到通常需要将样品返回实验室进行测试，因此不被视为快速选择。如果有替代的可用的测试选项，将是有益的。此外，考虑到通常测定的基因和蛋白质的病毒突变率，这些测定的灵敏度可能会降低。因此，在测定中采用病毒基因组的不同区域将是有益的。
已知多种用于核酸扩增的等温扩增方法，这些方法可能适合并入SARS-CoV-2的替代测定中。其中包括NASBA(基于核酸序列的扩增)；LAMP(环介导的等温扩增)；HAD(解旋酶依赖性扩增)；RCA(滚环扩增)；MDA(多重位移扩增)；WGA(全基因组扩增，其包括MALBAC、LIANTI、DOP-PCR)；和RPA(重组酶聚合酶扩增)。等温扩增的好处是它不需要热循环来扩增靶标，因此可能不需要特定的设备来进行测定。
另一种等温技术是RT-LIDA(逆转录损伤诱导的DNA扩增)。LIDA技术大体描述于美国专利9,193,993中，是一种用于等温扩增DNA序列的方法，该方法涉及将不稳定DNA模板与互补核苷酸片段杂交以形成第一带切口的双链体；连接第一带切口的双链体以形成包含DNA序列和模板的产物双链体，其中产物双链体能够解离以释放DNA序列和模板；并重复这些步骤以生成模板和DNA序列的多个拷贝。如果初始模板是RNA，则还包括从RNA中生成cDNA的初始步骤。RT-LIDA也描述于Alladin-Mustan et al,“Reverse transcription lesion-induced DNA amplification:An instrument-free isothermal method to detectRNA”；Analytica Chimica Acta,Volume 1149,2021,238130,https://doi.org/10.1016/ j.aca.2020.12.005。
在开发本文所述的SARS-CoV-2测定法时，本发明人进一步开发了RT-LIDA的修饰，其可以提供改进的扩增结果。特别是，在传统的RT-LIDA中，引物的自连接可能是一个问题，导致假阳性。据信，本文提出的改进测定除其他优点外，还减少了此类假阳性的发生。
尽管本文描述的具体测定是SARS-CoV-2基因组的一部分的RT-LIDA扩增，但是应当理解，a)SARS-CoV-2基因组的相同部分可以使用其他方法来检测，特别是等温扩增；和b)本文描述的改进的RT-LIDA比该测定具有更普遍的适用性。本文描述的测定的一个关键优点是它允许在单个反应容器中进行等温扩增和检测，并且如果期望的话，可以在除了测定试剂之外没有专用设备的情况下进行。
发明概述
根据本发明的方面，提供了针对SARS-CoV-2的测定法，其中编码ORF9c蛋白末端处或末端附近的Leu-Thr-Asp(LTD)序列的核酸的一部分被扩增并检测。
还提供了用于检测样品中的SARS-CoV-2的方法，该方法包括：从样品中存在的RNA生成cDNA；使用对应于编码ORF9c的SARS-CoV-2基因组的cDNA的一部分特异的扩增程序来扩增cDNA的一部分；并检测编码ORF9c蛋白末端处或末端附近的Leu-Thr-Asp(LTD)序列的扩增cDNA的一部分的存在。
SARS-CoV-2基因组包含编码ORF9c(以前称为ORF14)的基因。这是一种70个氨基酸的蛋白质，以前功能未知，存在于人类SARS和蝙蝠CoV中。在SARS-CoV-2中，ORF9c蛋白长73个氨基酸，并在转录物末端有编码3个另外的氨基酸(LTD)的9bp的插入片段。图2给出了来自SARS-CoV-2(SEQ ID NO:12)、人SARS(SEQ ID NO:13)和蝙蝠CoV(SEQ ID NO:14)的ORF9c氨基酸序列的比较。最近这种蛋白质已被证明在病毒逃避人类免疫系统的能力中发挥着至关重要的作用。LTD插入在SARS-CoV-2中似乎高度保守，使其成为合适的检测目标。特别是，尽管SARS-CoV-2基因组在整个基因组中记录了分布良好的突变，但在ORF9c中发现的突变很少，在该LTD插入中记录的突变甚至更少。鉴于ORF9c在病毒感染性中可能发挥的作用，这种变异性的缺乏表明了病毒的选择性优势，因此该插入可用作诊断。
编码LTD插入的cDNA序列是AAC TGT CTA(SEQ ID NO:1)。基因组序列将当然是相应的RNA序列(UUG ACA GAU，SEQ ID NO:2)。扩增可以是跨越该插入的DNA序列，并经由结合包含该插入的序列的探针进行检测。
在优选的实施方案中，扩增是经由RT-LIDA进行的。LIDA是基于连接酶链式反应(LCR)改进的易于实施的扩增技术。它在18℃至37℃之间的室温下运行，以提供选定靶标的快速(≤20分钟)扩增。它使用四个寡核苷酸引物和单个酶，使其与其他等温化学相比复杂性显著降低。
还提供了扩增样品中靶RNA分子的方法，该方法包括：
a)提供含有所述靶RNA分子的样品；
b)提供与所述靶RNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与P2p和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供与P2p和/或P2*引物重叠并与靶RNA分子互补的置换DNA链(disDNA)；
e)允许P2p和P2*引物与靶RNA退火，形成带RNA切口的DNA双链体；
f)连接P2p和P2*引物，形成RNA-DNA双链体，其中DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许disDNA从双链体中置换连接的P2p-P2*DNA链；
h)允许不稳定引物与连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接P1c*和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；
j)允许不稳定cDNA链与第一cDNA链解离；
k)允许P2p和P2*引物与不稳定cDNA链退火，并且允许不稳定引物与第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接引物以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
如本文所讨论的，发明人已经确定，使用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶提供了增强的准确性和降低的方法背景。在优选的实施方案中，连接酶是PBCV-1DNA连接酶，尽管可以使用其他连接酶，包括已从天然形式修饰以减少或去除单碱基突出端或平末端连接能力的工程化连接酶。使用此种连接酶所导致的背景扩增的减少意味着反应混合物中可以包含加速连接酶反应的组分(例如，拥挤剂，如PEG)。对于具有单碱基突出端连接能力的常规连接酶，如T4连接酶，必须省略这些连接酶，因为它们促进该背景的共扩增。
不稳定引物可以包括选自脱碱基位点的存在或与相应互补序列的错配的一种或多种特征。在实施方案中，一个引物包括错配，并且一个引物包括脱碱基位点。优选地，P1c*引物包含错配；这可能是A:T错配(即，完全互补的序列可能包括G或C，而该错配包括A或T)。优选地，错配在引物内部；也就是说，距离5’和3’末端至少有2、3、4或更多个核苷酸。在实施方案中，P1(csp)引物包括脱碱基位点。脱碱基位点优选位于引物的末端，优选5’末端。
引物被设计为与靶标的连续部分杂交。为了进行连接，每对的上游引物(即与另一个引物的靶标5’方向上的区域杂交的引物)在5’末端包含一个磷酸基团。例如，P2p和P1(csp)引物可以包括该磷酸基团。
该方法还可以包括检测至少一条cDNA链的步骤。优选地，至少一个引物包括标记。例如，P2*引物可以包括标记。在实施方案中，每对中的一个引物包括可检测标记(例如，P2*引物和P1c*引物)。这允许检测两条cDNA链。标记可以是荧光标记，例如荧光素基团。
检测步骤可以包括经由固定在固体支持物上的互补寡核苷酸(Ro，报告寡核苷酸)捕获至少一条cDNA链。当cDNA链被标记时，这可用于将标记定位到特定位置；例如，为了显色线条或其他指示剂来显示靶序列的检测。
在实施方案中，固定化互补寡核苷酸Ro最初可以与部分互补寡核苷酸(例如，具有一个或多个错配的寡核苷酸，或者比固定化寡核苷酸短的寡核苷酸)杂交；捕获cDNA链包括允许cDNA链置换部分互补寡核苷酸。将显而易见的是，部分互补寡核苷酸与cDNA部分相同。在优选的实施方案中，部分互补寡核苷酸比固定化寡核苷酸短并且比cDNA短。优选地选择相对长度，使得在置换的寡核苷酸与游离cDNA或引物杂交的情况下，连接酶不能激活。这减少了假阳性，并进一步允许检测步骤在与扩增步骤相同的环境中进行(即，在引物存在的情况下)。在实施方案中，固定化互补寡核苷酸Ro和部分互补寡核苷酸(Qo)包括报告基团-猝灭剂对(例如，Ro可以包括报告基团并且Qo包括猝灭剂)。Qo寡核苷酸被cDNA链置换可分离报告基团-猝灭剂对，并允许检测报告基团。这种方法避免了在初始引物中包含标记的需要。可以使用任何兼容的报告基团-猝灭剂对；例如用于报告基团染料的FAM或VIC以及用于猝灭剂染料的TAMRA。在其他实施方案中，寡核苷酸Ro和Qo可以通过插入的核酸部分或经由非核酸接头连接为单个分子。在进一步的实施方案中，当使用报告基团-猝灭剂对时，Ro寡核苷酸不需要固定在固体支持物上，而是可以在溶液中。在实例中，溶液中的Ro和Qo寡核苷酸可以通过接头(核酸或非核酸)连接。
在一些实施方案中，至少一个引物序列包括不是待扩增的靶序列的一部分的标签(例如，核酸标签)。该标签可用于检测或该方法的其他步骤，如本文所述。
在实施方案中，引物和其他序列如下：
3’-GAACGAAAC GAC GAC GAA CT-5’,SEQ ID NO:3–disDNA序列
3’-GAC GAA CTGp-5’,SEQ ID NO:4–P2p seq
3’-TCT AAC TTG-5’,SEQ ID NO:5–P2*seq,
5’-CTG ATT GA-3’,SEQ ID NO:6–P1c*seq
5’-p(Ab)AGA TTG AAC-3’,SEQ ID NO:7–P1(csp)seq,(Ab)是脱碱基位点。
在进一步的实施方案中，Ro和Qo寡核苷酸序列是：
5’-CTG CTT GAC AGA TTG AAC-3’SEQ ID NO:8,报告oligo
3’-GAC GAACTG TC-5’,SEQ ID NO:9,猝灭剂oligo。
还可以使用类似的方法来扩增DNA，添加DNA解折叠酶(例如重组酶或解旋酶)以解开初始双链DNA分子。因此，本发明还提供了扩增样品中靶DNA分子的方法，该方法包括：
a)提供含有所述靶DNA分子的样品；
b)提供与所述靶DNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与P2p和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA解折叠酶；
e)允许SSB和DNA解折叠酶将靶DNA分子的链分开，从而使P2p和P2*引物与靶DNA退火，以形成带DNA切口的DNA双链体；
f)连接P2p和P2*引物，以形成DNA-DNA双链体，其中一条DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许连接的P2p-P2*DNA链从双链体解离；
h)允许不稳定引物与连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接P1c*和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；
j)允许不稳定cDNA链与第一条cDNA链解离；
k)允许P2p和P2*引物与不稳定cDNA链退火，并且允许不稳定引物与第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接引物以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
SSB可以是细菌SSB。DNA解折叠酶可以是DNA解旋酶，或者可以是DNA重组酶，优选RecA。
DNA连接酶优选为PBCV-1DNA连接酶。本发明的这个方面的其他特征可以与本文描述的RNA扩增方法相同。值得注意的是，该方法不需要置换DNA，因为连接的DNA一旦形成就会自发地从模板上解离。此外，我们相信这种方法(使用SSB和解旋酶或重组酶)也可以置换本文所述的RT-LIDA方法中的disDNA。因此，本发明的另一方面提供了扩增样品中靶RNA分子的方法，该方法包括：
a)提供含有所述靶RNA分子的样品；
b)提供与所述靶RNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与P2p和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA解折叠酶；
e)允许P2p和P2*引物与靶RNA退火，以形成带RNA切口的DNA双链体；
f)连接P2p和P2*引物，以形成RNA-DNA双链体，其中DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许SSB和DNA解折叠酶从双链体中置换连接的P2p-P2*DNA链；
h)允许不稳定引物与连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接P1c*和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；
j)允许不稳定cDNA链从第一cDNA链解离；
k)允许P2p和P2*引物与不稳定cDNA链退火，并且允许不稳定引物与第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接引物以形成产物DNA双链体，其具有对应于P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
还提供了包括具有SEQ ID NO:3-7、以及任选地还具有SEQ ID NO:8和9的序列的寡核苷酸的试剂盒。具有SEQ ID NO:8的寡核苷酸可以固定在固体支持物上提供，并且与SEQ ID NO:9的寡核苷酸杂交。
本发明人还发现，反应混合物可以分离成液体预混液并且冻干试剂组分是可能的。因此，本发明进一步提供了用于扩增靶RNA序列的试剂盒，该试剂盒包括：
a)液体预混液，其包含PBCV-1DNA连接酶、Tris、MgCl2、ATP和DTT；
b)冻干形式的寡核苷酸引物和置换DNA，其适合于进行本文所述的RT-LIDA。
试剂盒还进一步包含其上固定有报告寡核苷酸的固体支持物以及与报告寡核苷酸杂交的猝灭剂寡核苷酸。
预混液可包含1.05μM DNA连接酶、50mM Tris、10mM MgCl2、1mM ATP和10mM DTT。在实施方案中，预混液和/或冻干组分可以包含拥挤剂，优选PEG。
在实施方案中，固体支持物是反应容器的形式，反应可以在其中发生。冻干试剂可以提供在反应容器中。这样，就可以将含有待检测RNA的样品和预混液加入到含有冻干试剂的反应容器中，并且整个扩增和检测过程都在容器中进行。
本发明的又一方面涉及替代的液体预混液。在该实施方案中，预混液包含Tris、锰阳离子、DTT和低于1mM ATP，pH大于8。特别优选的预混液包含50mM Tris-HCl、5mM MnCl2、10μM ATP、10mM DTT、pH值8.5。这与PBCV-1的传统预混液不同，传统预混液含有较高的ATP浓度、较低的pH值、并且含有MgCl2而不是MnCl2。参见例如可从New England Biolabs获得的SplintR连接酶的产品数据表。如本文进一步解释的，这种改进的预混液减少了腺苷酰化DNA的产生，腺苷酰化DNA是可以减少正确连接产物的生产的副产物。该混合物还进一步包含PBCV-1DNA连接酶，优选以1.05μM，和/或可进一步包含拥挤剂，优选PEG。该预混液还可以与所描述的冻干试剂一起提供。
附图说明
图1.显示了SARS-CoV-2的基因组图谱
图2.SARS-CoV-2ORF9c。红色阴影序列代表蛋白质序列之间的相似性，并且箭头标记了3个氨基酸“LTD”末端插入的位置
图3.SARS-CoV-2ORF9c部分的核苷酸序列以及相关寡核苷酸的位置。
图4.RT-LIDA流程概述。
图5.SARS-CoV-2ORF9c RT-LIDA寡核苷酸。
图6.使用T4连接酶形成扩增产物
图7.通过T4和PBCV-1连接酶的单碱基突出端连接的比较。
图8.PCBV-1连接酶在阳性和阴性对照样品中的使用。
图9.RNA模板上DNA连接的动力学。
图10.置换报告策略。
图11.报告策略中使用的寡核苷酸序列
图12.测试结果指标。
图13.测试结果实例。
图14.修改后的置换报告策略。
发明详述
冠状病毒(CoV)(套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒亚科)是具有正向单链RNA基因组的包膜病毒。其中基因组大小范围为长度26至32千碱基(kb)。它们感染人类并引起不同程度的疾病，从类似普通感冒的上呼吸道感染(URTI)到下呼吸道感染(LRTI)如支气管炎、肺炎、甚至严重急性呼吸道综合症(SARS)。SARS-COV-2、SARS-COV和MERS-COV会引起严重感染，导致高死亡率。
冠状病毒基因组编码四种主要结构蛋白：刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，所有这些都是产生结构完整的病毒颗粒所必需的。E蛋白是主要结构蛋白中最小的。在复制周期中，E在受感染细胞内大量表达，但只有一小部分并入病毒体包膜中。E参与病毒组装、病毒体释放和病毒发病机制。大部分蛋白质位于细胞内运输部位、ER、高尔基体和ERGIC，在那里参与CoV的组装和出芽。
SARS-CoV-2毒株的测序基因组结合SARS-CoV基因组组织和转录的比较分析已被用来构建基因产物的暂定清单。有人提出，SARS-CoV-2有16个预测的非结构蛋白构成多蛋白(wORF1ab)，其次是(至少)13个下游开放阅读框(ORF):表面糖蛋白(或刺突)、ORF3a、ORF3b、包膜、膜、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、核衣壳、ORF9a、ORF9b和ORF10。蛋白质相似度最高的三种病毒物种始终相同：人类SARS冠状病毒(SARS-CoV)、蝙蝠冠状病毒(BtCoV)以及另一种蝙蝠β冠状病毒(BtRf-BetaCoV)。SARS-CoV-2的基因组图谱如图1所示。
在SARS-CoV-2临床样品中已经鉴定了越来越多的突变。因此，重要的是设计针对受突变影响最小的区域的测定方法，或者选择可以向临床医生或研究人员报告突变的化学物质。
许多这些突变已被证明跨越了可商业化测定中使用的位点，这改变了这些测试的性能。在一些中，已观察到引物、探针或引物和探针位点上的多个突变。
我们没有针对刺突蛋白中的可变区设计一组引物和探针，而是选择了其他SARS或冠状病毒中不存在且在SARS-CoV-2中相对保守的区域。我们设计了跨越SARS-CoV-2特有的插入的测试，使其具有高度特异性。选择该靶标的优点是针对SARS-CoV-2的测试可以使用单个靶标进行；SARS-CoV-2的其他测定通常需要使用至少两个独立的基因组靶标，因为可能与来自非独特靶标的其他冠状病毒发生交叉反应。
具体来说，我们设计了靶向ORF9c(以前称为ORF14)的RT-LIDA测定。这是70个氨基酸的蛋白质，以前功能未知，存在于人类SARS和蝙蝠冠状病毒中。在SARS-CoV-2中，ORF9c蛋白长73个氨基酸，并在转录物末端有编码3个另外的氨基酸的9bp插入片段(图2显示了来自SARS-CoV-2(SEQ ID NO:12)、人SARS(SEQ ID NO:13)和蝙蝠CoV(SEQ ID NO:14)的ORF9c氨基酸序列的比较)。最近，这种蛋白质已被证明在病毒逃避人类免疫系统的能力中发挥着至关重要的作用。考虑到该蛋白质的重要性，以及观察到的ORF9c序列缺乏变异性，这个高度保守的区域似乎非常适合作为诊断靶点。
图3显示了从跨越ORF9c插入片段的SARS-CoV-2基因组获得的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)，以及氨基酸序列(SEQ ID NO:16)和互补DNA序列(SEQ ID NO:17)。图中标记的是置换DNA(disDNA)以及第一和第二引物(P2p、P2*)的来源位置。
RT-LIDA的整体流程如图4所示。在上图中，RNA触发的连接发生，如线性扩增，从模板生成cDNA。在下图中，cDNA随后呈指数扩增。含有靶标RNA的样品(“靶标RNA-I”)与DNA引物P2p和P2*结合，其与靶标RNA-I’的相邻部分杂交以形成带RNA切口DNA双链体。然后反应混合物中的连接酶修复切口，形成RNA-DNA双链体。与cDNA部分重叠的置换DNA链(disDNA’)优先与RNA杂交，置换生成的cDNA-II链。
然后反应进入指数阶段，其中DNA引物P2p和P2*以及不稳定DNA引物P1c*和P1(csp)交替杂交至c-DNA-II或F-DNA-I链，并连接，然后由于脱碱基位点的不稳定特征的存在以及不稳定引物中的内部错配，自发地从杂交链上解离。因此，每个循环使cDNA链的数量加倍。在此图中，不稳定引物包含荧光标记，允许在形成后检测F-DNA-I链。图5显示了SARS-CoV-2的RT-LIDA检测方法中使用的各种寡核苷酸。RNAcov(SEQ ID NO:10)是用于测定测试的合成RNA模板。
传统的RT-LIDA程序使用T4连接酶作为连接酶。然而，如图6所示，这种酶在一段时间后会导致假阳性。具体而言，图6显示了在不同起始浓度的模板cDNA下DNA-I产物的产生。即使是阴性样品，仍然会产生DNA-I。这被认为是由于反应混合物中寡核苷酸引物双链体的形成–如果存在单碱基突出端，T4连接酶将自发连接此类双链体，并且随着反应的进行，此类连接的寡核苷酸将产生扩增。显然，这是不期望的。
因此，我们研究了缺乏单碱基突出端连接能力的替代连接酶的使用。PBCV-1连接酶描述于Nucleic Acids Research,2003,Vol.31,No.17DOI:10.1093/nar/gkg665；并且PBCV-1连接酶对RNA夹板DNA的连接描述于G Lohman et al,“Efficient DNA ligation inDNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase”；Nucleic acids research,42(3),1831–1844.https://doi.org/10.1093/nar/gkt1032。图7比较了T4和PBCV-1连接酶对单碱基突出端的连接。没有与PBCV-1连接酶的连接。图的下半部分显示了产物的凝胶电泳。单个碱基突出端与5’-碱性磷酸酶的低水平连接显示使用T4DNA连接酶发生(i)。没有检测到使用PBCV-1DNA连接酶的SBO连接(ii)。为了比较目的，显示了使用14nM靶标起始的全连接产物(iii)。5’-脱碱基磷酸酶与PBCV-1DNA连接酶没有连接，避免了使用T4 DNA连接酶观察到的背景扩增。
在阳性和阴性对照样品中使用PBCV-1连接酶的结果如图8所示。产率百分比基于荧光标记的P1c寡核苷酸的连接。将酶直接添加到扩增混合物中。可以看出，即使在300分钟后，阴性对照中也没有观察到信号。
在推荐条件下，PBCV-1反应缓冲液含有50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT，反应在pH 7.5、25℃下进行。然而，这可能导致生成腺苷酸化DNA引物，这会降低正确连接产物的产量。PBCV-1DNA连接酶与含有反应性3’-OH和5’-PO4末端的带切口的DNA双链体结合。它不结合连续的DNA双链体、带尾双链体，甚至不结合含有不可连接的3’-OH和5’-OH末端的带切口的配体。
ATP依赖性DNA连接酶经由三个连续的核苷酸基转移反应催化5’-磷酸末端链与3’-羟基末端链的连接。第一步，DNA连接酶攻击ATP的α-磷酸，导致焦磷酸置换并形成共价连接酶-腺苷酸中间体，其中AMP连接到赖氨酸的ε-氨基。活性位点赖氨酸残基位于保守基序KxDGxR内。然后将AMP转移至带切口的DNA双链体的5’-单磷酸末端，以形成DNA-腺苷酸中间体，该中间体由反向(5’)-(5’)焦磷酸桥结构AppDNA组成。带切口的双链体的3’-OH末端链对DNA腺苷酸的攻击会密封切口并释放AMP。
如果AppDNA在溶液中释放，则在mM ATP浓度条件下，它可能成为“死端”产物，因为游离连接酶快速与ATP反应以使酶的活性位点腺苷酸化。腺苷酰化酶不结合AppDNA，因为酶上的腺苷基与AppDNA中间体上的腺苷基占据相同的结合袋。μM ATP浓度导致去腺苷酸化连接酶的稳态浓度更高，它可以有效地将AppDNA底物与连接的DNA结合并发生反应。
除了使用μM ATP(例如10μM)之外，酶浓度和选择Mn2+(5mM)而不是Mg2+显著减少AppDNA的形成以及死端底物的可能性。pH 8.5也会消除AppDNA，用于大多数连接酶预混液的常用pH在7和8之间。因此，本发明进一步提供了包含锰阳离子、减少量(小于1mM)的ATP且pH高于8的连接酶缓冲液。用于本发明的方法的优选连接酶缓冲液包含50mM Tris-HCl、5mMMnCl2、10μM ATP、10mM DTT，pH 8.5。
进一步的研究表明，PBCV-1连接酶在RNA模板上另外连接DNA引物的速度比T4连接酶更快。参见图9。此处RNA模板是5’-CUU GCU UUG CUG CUG CUU GAC AGA UUG AAC CAGCUU GAG A-3’(“RNAcov”；SEQ ID NO:10)，并使用P2p和P2*引物。与PBCV-1的更快速连接有利于减少RNA模板化步骤花费的时间，但至关重要的是，通过优化两个反应的动力学，允许置换DNA在RNA模板步骤后启动LIDA。具体来说，减少disDNA的长度将增加RT连接产物的置换所花费的时间。因此，PBCV-1的使用允许在置换之前发生连接，以确保生成初始cDNA产物。这提高了灵敏度，并减少了假阴性的机会。使用PBCV-1DNA连接酶1.05μM、50mM Tris、10mM MgCl2、1mM ATP和DTT；或使用T4 DNA连接酶2000CEU、50mM Tris10mM MgCl2、10μM ATP进行反应。此外，这些反应动力学还允许在与PBCV-1的反应混合物中使用分子拥挤剂，例如PEG，以进一步加速反应。
报告策略的说明如图10所示。连接和扩增步骤在液相中进行，与固定有包含报告染料的报告寡核苷酸Ro的固体支持物接触。这最初与包含猝灭剂分子的较短互补寡核苷酸Qo杂交。重要的是，Ro寡核苷酸与cDNA产物链之一长度相同且完全互补；而Qo寡核苷酸与cDNA产物链的一部分具有相同的序列，但比全长短(此处，短6nt)，并且比任一单独引物长。因此，cDNA(如果存在)将置换Qo寡核苷酸，分离报告基团和猝灭剂，并允许检测报告基团。较小的单个引物不能置换Qo寡核苷酸，因此系统不易出现假阳性。此外，如果突出端太短(例如，3nt，其中整个Qo比cDNA短6nt)而无法进行切口连接，则释放的Qo寡核苷酸不能参与PBCV-1实现的连接反应；同样，这减少了假阳性的可能性。相关序列如图11所示(Ro，SEQ IDNO:8；Qo，SEQ ID NO:9；LIDA连接产物，SEQ ID NO:11。LIDA连接产物是P1c*，SEQ ID NO:6，和P1(csp)，SEQ ID NO:7)。
在其他实施方案中，引物还可以包括附加的序列标签，其不是待扩增的靶区域的一部分；这允许使用与序列标签部分互补的报告序列，并且不需要与引发区本身有任何序列同源性。这降低了序列与报告基团或释放序列结合的序列风险。作为实例，如果待检测的序列是P2p-P2*连接的寡核苷酸，则P2*引物可以包括另外的序列标签：P2p-P2*-T。报告寡核苷酸Ro与整个P2p-P2*-T序列互补，而猝灭剂寡核苷酸Qo省略了标签，因此将具有P2p-P2*序列。在该实施方案中，释放的Qo寡核苷酸能够作为P1引物的模板；然而，只有当P2p-P2*-T产物积累时才会发生释放，因此只有在真正的放大和释放时才能检测到信号。这种修饰置换的报告策略如图14所示。
这种与所描述的消除假阳性产物形成的组合的特别优点是，无论输入的靶RNA浓度如何，扩增总是在一定时间后完成(100％)，因此评估荧光强度作为终点确定的要求最低，它提供是/否特别适合POC和OTC应用的结果。然而，作为时间函数的荧光信号监测可用于为专业用途提供定量测量，其中样品中RNA的量的测定很重要。该方法可用于两种模式。
图13显示了本文描述的测定和报告策略的概念证明。显示了三种测定测试；从左到右，这些是未猝灭的Ro报告寡核苷酸；来自Ro/Qo报告基团-猝灭剂对的猝灭信号；和通过添加SARS-CoV-2连接产物从报告基团中置换猝灭剂寡核苷酸后的阳性信号。
最后，图12显示了报告策略如何出现的说明。报告基团-猝灭剂寡核苷酸可以呈十字形排列，其中十字形的一个臂是用于阳性检测(例如，SARS-CoV-2)的报告基团，另一个是用于测试中纳入的对照(例如，预期存在于样品中的人类mRNA)的报告基团。因此，报告基团的开发提供了测试是阴性还是阳性的简单指示。
总而言之，我们开发了针对SARS-CoV-2的测定方法，它可以鉴定出与密切相关的病毒不同的高度保守区域。此外，在开发过程中，我们确定在RT-LIDA反应中使用PBCV-1连接酶具有许多好处：
与T4 DNA连接酶不同，它不会将单个突出端与5’-脱碱基磷酸连接，这完全消除了使用T4 DNA连接酶观察到的背景触发连接；
PBCV-1DNA连接酶催化DNA片段的RNA模板化连接比T4 DNA连接酶快得多；这会将这一步的时间缩短到几分钟；
优化disDNA寡核苷酸的长度可以允许RT在从RNA中去除DNA寡核苷酸在置换活动之前发生，从RNA中去除DNA寡核苷酸通常会限制这一关键连接步骤的效率。这将允许一步反应。
此外，采用置换报告方法对于LIDA特别有用，并且事实上是基于LIDA测定中寡核苷酸缔合解离动力学的相同置换机制。这也可以作为一步反应来进行。
我们还开发了改进的连接预混液，使用它可以在连接过程中减少AppDNA的产生，AppDNA的产生可能会降低正确连接产物的产量。
此外，使用SSB和DNA解旋蛋白(例如RecA或解旋酶)可以允许在DNA以及RNA上进行一步扩增程序。
这些特性意味着本文描述的测定可以在单个反应容器以及单个步骤中快速进行。
序列表
3’-AAC TGT CTA-5’,SEQ ID NO:1–LTD插入的cDNA序列
5’-UUG ACA GAU-3’,SEQ ID NO:2–LTD插入的基因组序列
3’-GAA CGA AAC GAC GAC GAA CT-5’,SEQ ID NO:3–disDNA序列
3’-GAC GAA CTGp-5’,SEQ ID NO:4–P2p seq
3’-TCT AAC TTG*-5’,SEQ ID NO:5–P2*seq,*是标记
5’-C*TG ATT GA-3’,SEQ ID NO:6–P1c*seq
5’-p(Ab)AGA TTG AAC-3’,SEQ ID NO:7–P1(csp)seq,(Ab)是脱碱基位点
5’-CTG CTT GAC AGA TTG AAC-3’SEQ ID NO:8,报告oligo
3’-GAC GAA CTG TC-5’,SEQ ID NO:9,猝灭剂oligo
5’-CUU GCU UUG CUG CUG CUU GAC AGA UUG AAC CAG CUU GAG A-
3’SEQ ID NO:10,RNAcov
3’-GAC GAA CTG TCT AAC TTG-5’,SEQ ID NO:11,LIDA连接产物
SEQ ID NO:12–图2中的SARS-CoV-2序列
SEQ ID NO:13–图2中的人-CoV序列
SEQ ID NO:14–图2中的蝙蝠-CoV(SARS样)序列
SEQ ID NO:15–图3中的ORF9c_RT-LIDA序列
SEQ ID NO:16–图3中的框1序列
SEQ ID NO:17–SEQ ID NO:15的互补序列
序列表
<110> 雷迪戈诊断有限公司
<120> 通过损伤诱导的DNA扩增(LIDA)的SARS-COV-2测定
<130> PC931781WO
<150> GB2108853.9
<151> 2021-06-21
<160> 17
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
atctgtcaa 9
<210> 2
<211> 9
<212> RNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
uugacagau 9
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> disDNA 序列
<400> 3
tcaagcagca gcaaagcaag 20
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2p 引物
<400> 4
gtcaagcag 9
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2* 引物
<400> 5
gttcaatct 9
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1c* 引物
<400> 6
ctgattga 8
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1 (csp) 引物
<400> 7
agattgaac 9
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基团 oligo
<400> 8
ctgcttgaca gattgaac 18
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猝灭剂 oligo
<400> 9
ctgtcaagca g 11
<210> 10
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA 模板
<400> 10
cuugcuuugc ugcugcuuga cagauugaac cagcuugaga 40
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIDA 连接产物
<400> 11
gttcaatctg tcaagcag 18
<210> 12
<211> 73
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
Met Leu Gln Ser Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys
1 5 10 15
Ala Ser Thr Gln Lys Gly Ala Glu Ala Ala Val Lys Pro Leu Leu Val
20 25 30
Pro His His Val Val Ala Thr Val Gln Glu Ile Gln Leu Gln Ala Ala
35 40 45
Val Gly Glu Leu Leu Leu Leu Glu Trp Leu Ala Met Ala Val Met Leu
50 55 60
Leu Leu Leu Cys Cys Cys Leu Thr Asp
65 70
<210> 13
<211> 70
<212> PRT
<213> 人-CoV
<400> 13
Met Leu Pro Pro Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys
1 5 10 15
Ala Ser Thr Gln Arg Glu Ala Glu Ala Ala Val Lys Pro Leu Leu Ala
20 25 30
Pro His His Val Val Ala Val Ile Gln Glu Ile Gln Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Val Gly Glu Ile Leu Leu Leu Ala Trp Leu Ala Glu Val Val Lys Leu
50 55 60
Pro Ser Arg Tyr Cys Cys
65 70
<210> 14
<211> 70
<212> PRT
<213> 蝙蝠-CoV
<400> 14
Met Leu Pro Ser Cys Tyr Asn Phe Leu Lys Glu Gln His Cys Gln Lys
1 5 10 15
Ala Ser Thr Gln Arg Gly Ala Glu Val Ala Val Asn Leu His Leu Ala
20 25 30
Pro His His Val Val Ala Val Ile Gln Glu Ile Gln Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Val Gly Glu Val Leu Leu Leu Asp Trp Leu Ala Glu Val Val Lys Leu
50 55 60
Pro Ser Arg Tyr Cys Cys
65 70
<210> 15
<211> 170
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 15
tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat 60
ggctggcaat ggcggtgatg ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct 120
tgagagcaaa atgtctggta aaggccaaca acaacaaggc caaactgtca 170
<210> 16
<211> 56
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 16
Val Ala Thr Val Gln Glu Ile Gln Leu Gln Ala Ala Val Gly Glu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Glu Trp Leu Ala Met Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Cys
20 25 30
Cys Cys Leu Thr Asp Thr Ser Leu Arg Ala Lys Cys Leu Val Lys Ala
35 40 45
Asn Asn Asn Lys Ala Lys Leu Ser
50 55
<210> 17
<211> 170
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 17
agcgttgtca agttctttaa gttgaggtcc gtcgtcatcc ccttgaagag gacgatctta 60
ccgaccgtta ccgccactac gacgagaacg aaacgacgac gaactgtcta acttggtcga 120
actctcgttt tacagaccat ttccggttgt tgttgttccg gtttgacagt 170

Claims (31)

1.用于检测样品中SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：从所述样品中存在的RNA生成cDNA；使用特定于与编码ORF9c的SARS-CoV-2基因组对应的所述cDNA的一部分的扩增程序来扩增所述cDNA的一部分；并在ORF9c蛋白的末端或末端附近检测编码Leu-Thr-Asp(LTD)序列的扩增的cDNA的一部分的存在。
2.权利要求1所述的方法，其中扩增经由RT-LIDA。
3.权利要求2所述的方法，其中所述RT-LIDA包括不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶的使用；优选地其中所述DNA连接酶是PBCV-1DNA连接酶。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括经由互补的寡核苷酸捕获至少一个cDNA链，所述互补的寡核苷酸任选地固定在固体支持物上。
5.权利要求4所述的方法，其中所述固定化互补寡核苷酸最初与部分互补的寡核苷酸杂交；并且捕获所述cDNA链包括允许所述cDNA链置换所述部分互补的寡核苷酸。
6.权利要求5所述的方法，其中所述部分互补的寡核苷酸比所述固定化寡核苷酸更短并且比所述cDNA更短。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述固定化寡核苷酸和部分互补的寡核苷酸包括报告基团-淬灭剂对。
8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述被置换的部分互补的寡核苷酸不形成用于进一步扩增的底物。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增包括具有SED ID NO:4-7的核苷酸序列的引物的使用。
10.对于SARS-CoV-2的测定方法，其中编码ORF9c蛋白末端处或末端附近的Leu-Thr-Asp(LTD)序列的核酸的一部分被扩增并检测。
11.试剂盒，其包含具有SEQ ID NO:3-7以及任选地还具有SEQ ID NO:8和9的序列的寡核苷酸。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述具有SEQ ID NO:8的寡核苷酸固定在固体支持物上。
13.扩增样品中靶RNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供含有所述靶RNA分子的样品；
b)提供与所述靶RNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与P2p引物和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中所述第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供与所述P2p引物和/或所述P2*引物重叠并与所述靶RNA分子互补的置换DNA链(disDNA)；
e)允许所述P2p引物和P2*引物与所述靶RNA退火，以形成带RNA切口的DNA双链体；
f)连接所述P2p引物和P2*引物，以形成RNA-DNA双链体，其中所述DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许所述disDNA从所述双链体中置换所述连接的P2p-P2*DNA链；
h)允许所述不稳定引物与所述连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接所述P1c*引物和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；
j)允许所述不稳定cDNA链与所述第一cDNA链解离；
k)允许所述P2p引物和P2*引物与所述不稳定cDNA链退火，并且允许所述不稳定引物与所述第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接所述引物以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生所述第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中所述连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
14.权利要求13所述的方法，其中所述不稳定引物包含选自脱碱基位点的存在或与相应互补序列错配的一种或多种特征。
15.权利要求14所述的方法，其中一个不稳定引物包含错配，且一个不稳定引物包含脱碱基位点。
16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中每对的上游引物在5’末端包含磷酸基因。
17.权利要求13-16中任一项所述的方法，其进一步包括检测至少一条所述cDNA链的步骤。
18.权利要求13-17中任一项所述的方法，其中至少一个所述引物包含标记。
19.权利要求17或18所述的方法，其中所述检测步骤包括经由互补寡核苷酸捕获至少一条所述cDNA链，所述互补寡核苷酸链任选地固定在固体支持物上。
20.权利要求19所述的方法，其中所述固定化互补寡核苷酸最初与部分互补的寡核苷酸杂交；且捕获所述cDNA链包括允许所述cDNA链置换所述部分互补的寡核苷酸。
21.权利要求20所述的方法，其中所述部分互补的寡核苷酸比所述固定化寡核苷酸短并且比所述cDNA短。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述固定化互补寡核苷酸和部分互补的寡核苷酸包含报告基团-猝灭剂对。
23.权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述被置换的部分互补的寡核苷酸不形成用于进一步扩增的底物。
24.权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子是病毒RNA，优选SARS-CoV-2RNA。
25.权利要求13-24中任一项所述的方法，其中所述引物具有SED ID NO:4-7的核苷酸序列。
26.权利要求13-25中任一项所述的方法，其中所述DNA连接酶是PBCV-1DNA连接酶。
27.用于扩增靶RNA序列的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)液体预混液，其包含PBCV-1DNA连接酶、Tris、MgCl2、ATP和DTT；
b)以冻干的形式，适合进行RT-LIDA的寡核苷酸引物和置换DNA。
28.权利要求27所述的试剂盒，其进一步包括报告基团寡核苷酸和与所述报告基团寡核苷酸杂交的猝灭剂寡核苷酸，其中任选地将所述报告基团寡核苷酸固定在固体支持物上。
29.连接缓冲液，其通过选择pH>＝8.0、ATP<＝1mM和锰阳离子的使用中的一个或多个来限制AppDNA连接中间复合物的产生。
30.扩增样品中靶DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供含有所述靶DNA分子的样品；
b)提供与所述靶DNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与所述P2p引物和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中所述第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA解折叠酶；
e)允许SSB和DNA解折叠酶将所述靶DNA分子的双链分开，从而允许所述P2p引物和P2*引物与所述靶DNA退火，以形成带DNA切口的DNA双链体；
f)连接所述P2p引物和P2*引物，以形成DNA-DNA双链体，其中一条DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许所述连接的P2p-P2*DNA链从所述双链体解离；
h)允许所述不稳定引物与所述连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接所述P1c*引物和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；
j)允许所述不稳定cDNA链与所述第一cDNA链解离；
k)允许所述P2p引物和P2*引物与所述不稳定cDNA链退火，并且允许所述不稳定引物与所述第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接所述引物以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生所述第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中所述连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
31.扩增样品中靶RNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供含有所述靶RNA分子的样品；
b)提供与所述靶RNA分子的连续部分互补的第一和第二DNA引物(P2p、P2*)；
c)提供与所述P2p引物和P2*引物互补的第三和第四DNA引物(P1c*、P1(csp))，其中所述第三和第四DNA引物是不稳定引物；
d)提供单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA解折叠酶；
e)允许所述P2p引物和P2*引物与所述靶RNA退火，以形成带RNA切口的DNA双链体；
f)连接所述P2p引物和P2*引物，以形成RNA-DNA双链体，其中所述DNA链是连接的P2p-P2*；
g)允许所述SSB和DNA解折叠酶从所述双链体中置换所述连接的P2p-P2*DNA链；
h)允许所述不稳定引物与所述连接的P2p-P2*DNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
i)连接所述P1c*引物和P1(csp)引物，以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定DNA链；
j)允许所述不稳定cDNA链与所述第一cDNA链解离；
k)允许所述P2p引物和P2*引物与所述不稳定cDNA链退火，并且允许所述不稳定引物与所述第一cDNA链退火以形成带DNA切口的DNA双链体；
l)连接所述引物以形成产物DNA双链体，所述产物DNA双链体具有对应于所述P2p-P2*引物的第一cDNA链和对应于所述不稳定P1c*-P1(csp)引物的第二不稳定cDNA链；和
m)重复步骤j)至l)以产生所述第一和第二cDNA链的多个拷贝；
其中所述连接步骤用不具有单碱基突出端或平末端连接能力的DNA连接酶进行。
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