JPH11313685A - 標的核酸の検出における標識プライマー - Google Patents
標的核酸の検出における標識プライマーInfo
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- JPH11313685A JPH11313685A JP10355733A JP35573398A JPH11313685A JP H11313685 A JPH11313685 A JP H11313685A JP 10355733 A JP10355733 A JP 10355733A JP 35573398 A JP35573398 A JP 35573398A JP H11313685 A JPH11313685 A JP H11313685A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検出すべきＤＮＡセグメントの増幅の観察ま
たは測定方法の単純化。 【解決手段】 標識プライマー（たとえばポリメラーゼ
連鎖反応用）において、プライマーのオリゴヌクレオチ
ド鎖の２末端がレポーター染料分子およびクエンチャー
分子で標識され、標識プライマーの３′末端の少なくと
も最終塩基が増幅すべきＤＮＡ配列と相補性ではないプ
ライマーが用いられる。この標識プライマーを使用する
ＤＮＡ配列の検出方法（ポリメラーゼ連鎖反応による）
において、増幅に１種または２種以上の熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼを用い、その一方はまた校正読み取り活性
を有し、標識プライマーの非対合塩基をそれに結合した
クエンチャー分子とともに放出させてレポーター染料の
波長の蛍光を増大を生じ、それによりこの蛍光染料で標
識されたＤＮＡ配列の形成を指示する方法も記載されて
いる。
たは測定方法の単純化。 【解決手段】 標識プライマー（たとえばポリメラーゼ
連鎖反応用）において、プライマーのオリゴヌクレオチ
ド鎖の２末端がレポーター染料分子およびクエンチャー
分子で標識され、標識プライマーの３′末端の少なくと
も最終塩基が増幅すべきＤＮＡ配列と相補性ではないプ
ライマーが用いられる。この標識プライマーを使用する
ＤＮＡ配列の検出方法（ポリメラーゼ連鎖反応による）
において、増幅に１種または２種以上の熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼを用い、その一方はまた校正読み取り活性
を有し、標識プライマーの非対合塩基をそれに結合した
クエンチャー分子とともに放出させてレポーター染料の
波長の蛍光を増大を生じ、それによりこの蛍光染料で標
識されたＤＮＡ配列の形成を指示する方法も記載されて
いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅反応（た
とえばポリメラーゼ連鎖反応）のための標識プライマ
ー、および標識プラーマーを使用する核酸増幅過程によ
りＤＮＡ配列を検出する方法に関する。
とえばポリメラーゼ連鎖反応）のための標識プライマ
ー、および標識プラーマーを使用する核酸増幅過程によ
りＤＮＡ配列を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】周知のように、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）はサンプル中の少量の既知の核酸配列を検出する
のにきわめて効果的な方法である［Erlich, H.A., Gelf
and,D., Sninsky, J.J.（1991), Science, 252：1643-1
651（この報告の記載は引用により本明細書に導入す
る); PCR Products. Current metods and applications
(1993), B.A.White編, Humana Press, Totowa, New Jer
sey, IBBN 0-89603-244-2（この記載は引用により本明
細書に導入される)］、たとえばウイルスＤＮＡの配列
が既知であれば、相対する一本鎖上の領域に相補性であ
り、求めるＤＮＡ配列に隣接する１対のプライマーを合
成することが可能である。ついでそれ自体周知のＰＣＲ
条件下に、通常は３０回以上の反応サイクルを連続的に
用い、特異的ＤＮＡを大量にインビトロで増幅させるこ
とができる。ＰＣＲサイクルは、求めるたとえばウイル
スＤＮＡがサンプル中に存在すると、特定のサイズを有
し２つのプライマーとそれらの間のたとえばウイルスＤ
ＮＡの長さからなるＤＮＡフラグメントを増幅させる。
ＰＣＲ法はきわめて高感度であり、したがって、きわめ
て少量のＤＮＡを高い信頼度をもって検出するために使
用することができる。
ＣＲ）はサンプル中の少量の既知の核酸配列を検出する
のにきわめて効果的な方法である［Erlich, H.A., Gelf
and,D., Sninsky, J.J.（1991), Science, 252：1643-1
651（この報告の記載は引用により本明細書に導入す
る); PCR Products. Current metods and applications
(1993), B.A.White編, Humana Press, Totowa, New Jer
sey, IBBN 0-89603-244-2（この記載は引用により本明
細書に導入される)］、たとえばウイルスＤＮＡの配列
が既知であれば、相対する一本鎖上の領域に相補性であ
り、求めるＤＮＡ配列に隣接する１対のプライマーを合
成することが可能である。ついでそれ自体周知のＰＣＲ
条件下に、通常は３０回以上の反応サイクルを連続的に
用い、特異的ＤＮＡを大量にインビトロで増幅させるこ
とができる。ＰＣＲサイクルは、求めるたとえばウイル
スＤＮＡがサンプル中に存在すると、特定のサイズを有
し２つのプライマーとそれらの間のたとえばウイルスＤ
ＮＡの長さからなるＤＮＡフラグメントを増幅させる。
ＰＣＲ法はきわめて高感度であり、したがって、きわめ
て少量のＤＮＡを高い信頼度をもって検出するために使
用することができる。
【０００３】国際特許出願 WO 92／02638（引用により
本明細書に導入される）には、検出すべきＤＮＡ（一本
鎖として）、すなわち標的ＤＮＡを含有するまたはその
含有が疑われるサンプルを、２つの異なるプライマーす
なわち、増幅すべきＤＮＡ鎖すなわち標的ＤＮＡに隣接
する順行プライマーおよび逆行プライマーとハイブリダ
イズさせるＤＮＡ配列の検出方法が開示されている。WO
92／02638 の好ましい実施態様において提供される標
識オリゴヌクレオチドプローブは、その５′末端および
その３′末端の両者における標識としての蛍光染料シス
テムとともに、さらに反応に使用される。この標識プロ
ーブは、増幅すべきＤＮＡセグメント内すなわち標的Ｄ
ＮＡ内の２つのプライマーの間にハイブリダイズするよ
うに選択される。好ましい標識としてプローブに結合さ
れる２種の蛍光染料は一方の染料すなわちレポーター染
料の蛍光が第二の分子すなわちクエンチャーの接近によ
って、蛍光共鳴エネルギー転移（Stryer，L. 1978；Flu
orescence energy transferas a spectroscopic ruler.
Ann．Rev．Biochem. 47: 819-845；引用により本明細
書に導入される）として知られる過程により低下（「ク
エンチング」）するという特徴的な性質を有する。上述
の配列によって特徴づけられる２種のプライマーの間の
ＤＮＡに結合するこの標識プローブは、たとえば以下の
配列を有する。 5′FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA
3′
本明細書に導入される）には、検出すべきＤＮＡ（一本
鎖として）、すなわち標的ＤＮＡを含有するまたはその
含有が疑われるサンプルを、２つの異なるプライマーす
なわち、増幅すべきＤＮＡ鎖すなわち標的ＤＮＡに隣接
する順行プライマーおよび逆行プライマーとハイブリダ
イズさせるＤＮＡ配列の検出方法が開示されている。WO
92／02638 の好ましい実施態様において提供される標
識オリゴヌクレオチドプローブは、その５′末端および
その３′末端の両者における標識としての蛍光染料シス
テムとともに、さらに反応に使用される。この標識プロ
ーブは、増幅すべきＤＮＡセグメント内すなわち標的Ｄ
ＮＡ内の２つのプライマーの間にハイブリダイズするよ
うに選択される。好ましい標識としてプローブに結合さ
れる２種の蛍光染料は一方の染料すなわちレポーター染
料の蛍光が第二の分子すなわちクエンチャーの接近によ
って、蛍光共鳴エネルギー転移（Stryer，L. 1978；Flu
orescence energy transferas a spectroscopic ruler.
Ann．Rev．Biochem. 47: 819-845；引用により本明細
書に導入される）として知られる過程により低下（「ク
エンチング」）するという特徴的な性質を有する。上述
の配列によって特徴づけられる２種のプライマーの間の
ＤＮＡに結合するこの標識プローブは、たとえば以下の
配列を有する。 5′FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA
3′
【０００４】この性質の配列は、多くの会社から注文し
て入手することが可能であり、５′−ヌクレアーゼアッ
セイ、すなわち TaqMan（登録商標）アッセイにおける
使用が意図される。上述の方法は Livak K. J., Flood
S. J. A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K. Oligonuc
leotides with fluorescent dyes at opposite endspro
videsystem useful for detecting PCR product and nu
cleic acid hybridization. PCR Metod and Appl. 199
5; 4: 357-362（引用により本明細書に導入される）に
詳細に記載されている。
て入手することが可能であり、５′−ヌクレアーゼアッ
セイ、すなわち TaqMan（登録商標）アッセイにおける
使用が意図される。上述の方法は Livak K. J., Flood
S. J. A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K. Oligonuc
leotides with fluorescent dyes at opposite endspro
videsystem useful for detecting PCR product and nu
cleic acid hybridization. PCR Metod and Appl. 199
5; 4: 357-362（引用により本明細書に導入される）に
詳細に記載されている。
【０００５】このプローブの特異的な性質は、染料（Ｆ
ＡＭ）すなわちプローブの５′末端に結合するレポータ
ー染料の蛍光が、第二の蛍光染料（ＴＡＭＲＡ）すなわ
ちプローブの３′末端に配置されるクエンチャー染料の
接近によって低下することである（上記参照）。
ＡＭ）すなわちプローブの５′末端に結合するレポータ
ー染料の蛍光が、第二の蛍光染料（ＴＡＭＲＡ）すなわ
ちプローブの３′末端に配置されるクエンチャー染料の
接近によって低下することである（上記参照）。
【０００６】新たなＤＮＡ鎖が増幅の過程で、適当な好
ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼたとえばＴaqＤＮ
Ａポリメラーゼの影響下に形成されたとすると、それは
一本鎖からの標識プローブを置換するのみでなく、その
５′→３′ヌクレアーゼ活性によってプローブを分解
し、それにより２種の蛍光染料が放出される。これによ
りレポーター染料の蛍光は最早、クエンチャー染料によ
って抑制されず増大する。この場合、蛍光分光光度計を
使用してレポーター染料の波長で蛍光を測定すれば新た
に形成されたＤＮＡの量に相当する蛍光の増大を観察す
ることができる。
ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼたとえばＴaqＤＮ
Ａポリメラーゼの影響下に形成されたとすると、それは
一本鎖からの標識プローブを置換するのみでなく、その
５′→３′ヌクレアーゼ活性によってプローブを分解
し、それにより２種の蛍光染料が放出される。これによ
りレポーター染料の蛍光は最早、クエンチャー染料によ
って抑制されず増大する。この場合、蛍光分光光度計を
使用してレポーター染料の波長で蛍光を測定すれば新た
に形成されたＤＮＡの量に相当する蛍光の増大を観察す
ることができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】検出すべきＤＮＡセグ
メントの増幅の観察または測定を可能にするためには、
順行プライマーおよび逆行プライマーに加えて標識プロ
ーブが要求されるという事実はこの方法の欠点として考
えざるを得ない。したがって、この既知の方法の単純化
という目的が生じた。
メントの増幅の観察または測定を可能にするためには、
順行プライマーおよび逆行プライマーに加えて標識プロ
ーブが要求されるという事実はこの方法の欠点として考
えざるを得ない。したがって、この既知の方法の単純化
という目的が生じた。
【０００８】２種のプライマーの少なくとも１種を、た
とえば本発明の好ましい実施態様におけるレポーター分
子およびクエンチャー分子（一般的な用語では相互作用
性の標識系）で標識し、同時に、標識されたプライマー
は増幅すべきＤＮＡ鎖と完全にはハイブリダイズしない
ことが保証されるように注意を払えば、ポリメラーゼ連
鎖反応に付加的な標識プローブを使用する必要はないこ
とが見出された。
とえば本発明の好ましい実施態様におけるレポーター分
子およびクエンチャー分子（一般的な用語では相互作用
性の標識系）で標識し、同時に、標識されたプライマー
は増幅すべきＤＮＡ鎖と完全にはハイブリダイズしない
ことが保証されるように注意を払えば、ポリメラーゼ連
鎖反応に付加的な標識プローブを使用する必要はないこ
とが見出された。
【０００９】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
核酸増幅反応（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応）のた
めの標識プライマーに関し、このプライマーは、好まし
い実施態様においてはそのプライマーの３′末端または
その近傍で標識系により、好ましい実施態様においてで
レポーター染料分子およびクエンチャー分子により標識
され、この方法で標識されるプライマーの３′末端の少
なくとも１個好ましくは少なくとも２〜５個またはそれ
以上の塩基（すなわち３′末端の故意にミスマッチさせ
た部分）は増幅すべきＤＮＡ配列と相補性ではない。標
識または標識系部分は、３′末端ミスマッチ部分好まし
くは３′末端ヌクレオチドに結合させる。非対合領域の
長さは、使用される特定の標識および特定のポリメラー
ゼに応じて、本技術分野の熟練者には周知のように選択
および／または至適化される。このような標識プライマ
ーはその３′末端において増幅すべきＤＮＡ配列と完全
な塩基対を形成することはできない。増幅に用いられ、
校正読み取り活性（proof-reading properties）を有し
ていなければならないポリメラーゼの影響下に、標識プ
ライマーの非対合塩基は、実際の伸長反応が起こる前に
ポリメラーゼの３′→５′核酸分解活性により、使用さ
れた標識たとえばレポーター染料分子またはクエンチャ
ー分子に応じてそれとともに放出される。これはしかし
ながら、クエンチャーがレポーター染料に対し空間的に
近位にはも早存在せず、したがってレポーター染料の蛍
光が増大する例示のような場合を生じて、標的核酸の存
在および／または標的核酸の増幅を指示することにな
る。
核酸増幅反応（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応）のた
めの標識プライマーに関し、このプライマーは、好まし
い実施態様においてはそのプライマーの３′末端または
その近傍で標識系により、好ましい実施態様においてで
レポーター染料分子およびクエンチャー分子により標識
され、この方法で標識されるプライマーの３′末端の少
なくとも１個好ましくは少なくとも２〜５個またはそれ
以上の塩基（すなわち３′末端の故意にミスマッチさせ
た部分）は増幅すべきＤＮＡ配列と相補性ではない。標
識または標識系部分は、３′末端ミスマッチ部分好まし
くは３′末端ヌクレオチドに結合させる。非対合領域の
長さは、使用される特定の標識および特定のポリメラー
ゼに応じて、本技術分野の熟練者には周知のように選択
および／または至適化される。このような標識プライマ
ーはその３′末端において増幅すべきＤＮＡ配列と完全
な塩基対を形成することはできない。増幅に用いられ、
校正読み取り活性（proof-reading properties）を有し
ていなければならないポリメラーゼの影響下に、標識プ
ライマーの非対合塩基は、実際の伸長反応が起こる前に
ポリメラーゼの３′→５′核酸分解活性により、使用さ
れた標識たとえばレポーター染料分子またはクエンチャ
ー分子に応じてそれとともに放出される。これはしかし
ながら、クエンチャーがレポーター染料に対し空間的に
近位にはも早存在せず、したがってレポーター染料の蛍
光が増大する例示のような場合を生じて、標的核酸の存
在および／または標的核酸の増幅を指示することにな
る。
【００１０】したがって、本発明はまた核酸増幅によっ
てＤＮＡ標的核酸を検出する方法において、プライマー
の１種が上述の特徴を有する方法に関する。１種または
２種以上の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用すること
が可能であり、その少なくとも１種は校正活性をもって
いなければならない増幅において、標識プライマーの非
対合塩基はついで、標識または標識系部分たとえばそれ
に結合したレポーター染料とともに放出され、シグナル
の増大たとえばレポーター染料の波長における蛍光の増
大を生じる。
てＤＮＡ標的核酸を検出する方法において、プライマー
の１種が上述の特徴を有する方法に関する。１種または
２種以上の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用すること
が可能であり、その少なくとも１種は校正活性をもって
いなければならない増幅において、標識プライマーの非
対合塩基はついで、標識または標識系部分たとえばそれ
に結合したレポーター染料とともに放出され、シグナル
の増大たとえばレポーター染料の波長における蛍光の増
大を生じる。
【００１１】
【発明の実施の形態】この新規な方法においては、順行
プライマーもしくは逆行プライマーまたはその両者をレ
ポーターおよびクエンチャー分子によってそれぞれ上述
のように標識することができる。クエンチャー染料は反
応溶液中に放出されるが、新たに形成されたＤＮＡセグ
メントもプライマーの残部に加えて蛍光レポーター染料
をもっている。これは定量的適用に好ましい操作であ
る。しかしながら、クエンチャーおよびレポーター染料
による標識化は、逆の様式でも、すなわちレポーター染
料が溶液中に放出され、新たに形成されたＤＮＡセグメ
ントがクエンチャーをもつように行うことも同様に可能
である。数種のパラメーターを同時に平行して検出（多
重検出）する場合は、平行して検出可能なレポーター染
料の選択が好都合であり、本発明は多重検出にきわめて
適していることを以下に開示する。
プライマーもしくは逆行プライマーまたはその両者をレ
ポーターおよびクエンチャー分子によってそれぞれ上述
のように標識することができる。クエンチャー染料は反
応溶液中に放出されるが、新たに形成されたＤＮＡセグ
メントもプライマーの残部に加えて蛍光レポーター染料
をもっている。これは定量的適用に好ましい操作であ
る。しかしながら、クエンチャーおよびレポーター染料
による標識化は、逆の様式でも、すなわちレポーター染
料が溶液中に放出され、新たに形成されたＤＮＡセグメ
ントがクエンチャーをもつように行うことも同様に可能
である。数種のパラメーターを同時に平行して検出（多
重検出）する場合は、平行して検出可能なレポーター染
料の選択が好都合であり、本発明は多重検出にきわめて
適していることを以下に開示する。
【００１２】一般的な方法では、分光光度的、光化学的
または化学的方法によって検出できる残基を導入するこ
とにより、以下に記載するように、プライマーの３′末
端を標識するかまたは標識系部分に結合させる。標識を
プライマーに連結または接合させる方法はもちろん、使
用する標識の種類およびプライマー上の標識の位置に依
存する。
または化学的方法によって検出できる残基を導入するこ
とにより、以下に記載するように、プライマーの３′末
端を標識するかまたは標識系部分に結合させる。標識を
プライマーに連結または接合させる方法はもちろん、使
用する標識の種類およびプライマー上の標識の位置に依
存する。
【００１３】本発明における使用に適した様々な標識な
らびにそれらをプライマー中に包含させる方法は本技術
分野において周知であり、それらに限定されるものでは
ないが、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼおよ
び西洋ワサビペルオキシダーゼ）と酵素基質、放射性原
子、蛍光染料、発色原、化学ルミネッセンス標識、電子
化学ルミネッセンス標識、たとえば Origen（登録商
標，Igen)、特異的結合パートナーを有するリガンドま
たは互いに相互作用してシグナルを増強、変化もしくは
減弱できる任意の他の標識が包含される。もちろん、増
幅がＰＣＲを介して行われ、温度サイクル装置を用いて
実施されなければならない場合は、標識はこの自動化過
程に要求される温度サイクルに安定でなれればならな
い。
らびにそれらをプライマー中に包含させる方法は本技術
分野において周知であり、それらに限定されるものでは
ないが、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼおよ
び西洋ワサビペルオキシダーゼ）と酵素基質、放射性原
子、蛍光染料、発色原、化学ルミネッセンス標識、電子
化学ルミネッセンス標識、たとえば Origen（登録商
標，Igen)、特異的結合パートナーを有するリガンドま
たは互いに相互作用してシグナルを増強、変化もしくは
減弱できる任意の他の標識が包含される。もちろん、増
幅がＰＣＲを介して行われ、温度サイクル装置を用いて
実施されなければならない場合は、標識はこの自動化過
程に要求される温度サイクルに安定でなれればならな
い。
【００１４】放射性原子としては32Ｐが好ましい。核酸
に32Ｐを導入する方法は本技術分野において周知であ
り、たとえば、キナーゼによる５′標識またはニックト
ランスレーションによるランダム挿入が包含される。酵
素は通常それらの活性によって検出される。「特異的結
合パートナー」とはそれに特異的なリガンドモノクロー
ナル抗体を結合できるタンパク質を意味する。他の特異
的結合パートナーには、ビオチンとアビジンまたはスト
レプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および本技術
分野において周知の多数の受容体−リガンドカップルが
包含される。
に32Ｐを導入する方法は本技術分野において周知であ
り、たとえば、キナーゼによる５′標識またはニックト
ランスレーションによるランダム挿入が包含される。酵
素は通常それらの活性によって検出される。「特異的結
合パートナー」とはそれに特異的なリガンドモノクロー
ナル抗体を結合できるタンパク質を意味する。他の特異
的結合パートナーには、ビオチンとアビジンまたはスト
レプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および本技術
分野において周知の多数の受容体−リガンドカップルが
包含される。
【００１５】同じ標識が幾つかの異なる様式で働くこと
が可能であるように、以上の記述は各種標識の異なるク
ラスへの類別を意味するものではない。たとえば、125
Ｉは放射性標識としてもまた電子稠密試薬としても作用
できる。ＨＲＰは酵素としてもまたモノクローナル抗体
に対する抗原としても働くことができる。さらに所望の
効果を得るために、様々な標識を組み合わせることもで
きる。たとえば、プライマーをビオチンで標識し、その
プライマーの存在は125Ｉ標識アビジンまたはＨＲＰ標
識抗−ビオチンモノクローナル抗体で検出される。本技
術分野の熟練者には他の交換および可能性は自明の通り
であり、それらは本発明の範囲内において均等物とみな
されるものである。
が可能であるように、以上の記述は各種標識の異なるク
ラスへの類別を意味するものではない。たとえば、125
Ｉは放射性標識としてもまた電子稠密試薬としても作用
できる。ＨＲＰは酵素としてもまたモノクローナル抗体
に対する抗原としても働くことができる。さらに所望の
効果を得るために、様々な標識を組み合わせることもで
きる。たとえば、プライマーをビオチンで標識し、その
プライマーの存在は125Ｉ標識アビジンまたはＨＲＰ標
識抗−ビオチンモノクローナル抗体で検出される。本技
術分野の熟練者には他の交換および可能性は自明の通り
であり、それらは本発明の範囲内において均等物とみな
されるものである。
【００１６】本発明の標識プライマーの構築において標
識として使用するための蛍光原にはローダミンおよび誘
導体、たとえばテキサスレッド、フルオレセインおよび
誘導体、たとえば５−ブロモメチルフルオレセイン、ル
シフェルイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ2Ｎ−ク
マリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ3−クマ
リン−３−アセテート、７−ＮＨ2−４−ＣＨ3−クマリ
ン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビメイ
ン、ピレントリスルホネート、たとえばカスケードブル
ーならびにモノブロモトリメチルアンモニオビメインが
包含される。一般的に、広いストークス・シフトを有す
る蛍光原が好ましく、モノクロモメーターよりもフィル
ター付きの蛍光光度計の使用を可能にし、検出効率を増
大させる。しかしながら、選択される特定の標識（単数
または複数）は均一アッセイ系での検出を可能にする特
性（たとえばレポーター／クエンチャー関係）を有する
ことが好ましい。
識として使用するための蛍光原にはローダミンおよび誘
導体、たとえばテキサスレッド、フルオレセインおよび
誘導体、たとえば５−ブロモメチルフルオレセイン、ル
シフェルイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ2Ｎ−ク
マリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ3−クマ
リン−３−アセテート、７−ＮＨ2−４−ＣＨ3−クマリ
ン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビメイ
ン、ピレントリスルホネート、たとえばカスケードブル
ーならびにモノブロモトリメチルアンモニオビメインが
包含される。一般的に、広いストークス・シフトを有す
る蛍光原が好ましく、モノクロモメーターよりもフィル
ター付きの蛍光光度計の使用を可能にし、検出効率を増
大させる。しかしながら、選択される特定の標識（単数
または複数）は均一アッセイ系での検出を可能にする特
性（たとえばレポーター／クエンチャー関係）を有する
ことが好ましい。
【００１７】開示される過程における標識の検出または
確認は様々な方法で達成され、使用される標識（単数ま
たは複数）の起源に依存する。本発明の好ましい実施態
様においては、蛍光の増大が適当な蛍光光度計で測定さ
れる。
確認は様々な方法で達成され、使用される標識（単数ま
たは複数）の起源に依存する。本発明の好ましい実施態
様においては、蛍光の増大が適当な蛍光光度計で測定さ
れる。
【００１８】本発明の好ましい実施態様においては、単
一のプライマー上に２種の相互作用する標識がレポータ
ー／クエンチャー標識システムとして使用される（上記
記載および実施例参照）。
一のプライマー上に２種の相互作用する標識がレポータ
ー／クエンチャー標識システムとして使用される（上記
記載および実施例参照）。
【００１９】レポーター分子の例は、６−カルボキシ−
フルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボ
キシ−フルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−Ｘ
−カルボキシ−テトラメチルローダミン（ＲＯＸ）であ
る。クエンチャー分子の例は、６−カルボキシ−テトラ
メチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）または４−（４′−ジ
メチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹ
Ｌ）である。ＴＡＭＲＡは蛍光染料であるが、ＤＡＢＣ
ＹＬは蛍光染料ではない。
フルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボ
キシ−フルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−Ｘ
−カルボキシ−テトラメチルローダミン（ＲＯＸ）であ
る。クエンチャー分子の例は、６−カルボキシ−テトラ
メチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）または４−（４′−ジ
メチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹ
Ｌ）である。ＴＡＭＲＡは蛍光染料であるが、ＤＡＢＣ
ＹＬは蛍光染料ではない。
【００２０】新規な増幅反応には様々なＤＮＡポリメラ
ーゼを使用できる。使用するＤＮＡポリメラーゼが校正
読み取り活性を有する場合には、１種の単一のポリメラ
ーゼ［たとえば ＵＬＴma（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Perkin Elmer 用 RocheMolecular Systems, Bran
chburg, New Jersey, USA 製］を用いて反応を実施する
ことができる。そうでなければ、数種のポリメラーゼの
混合物を使用する必要があり、たとえば、Ｔaq ＤＮＡ
ポリメラーゼに加えて３′→５′ヌクレアーゼ活性を有
する他のポリメラーゼも使用される。Ｔli ＤＮＡポリ
メラーゼ（Promega Corporation,Madison, WI, USA）、
またはＶent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolab
s, Beverly, MA, USA）は、３′→５′ヌクレアーゼ活
性を有する適当な熱安定性ポリメラーゼである。本発明
には、Sigma Corp. によって販売されている ＡccuＴaq
（登録商標）ＬＡ ＤＮＡポリメラーゼミックス（添付
資料１）がきわめて適している。このようなミックスお
よび関連酵素組成物は米国特許第5,436,149号の実施例
６に記載されている。この特許の開示はその全体が引用
により本明細書に導入される。
ーゼを使用できる。使用するＤＮＡポリメラーゼが校正
読み取り活性を有する場合には、１種の単一のポリメラ
ーゼ［たとえば ＵＬＴma（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Perkin Elmer 用 RocheMolecular Systems, Bran
chburg, New Jersey, USA 製］を用いて反応を実施する
ことができる。そうでなければ、数種のポリメラーゼの
混合物を使用する必要があり、たとえば、Ｔaq ＤＮＡ
ポリメラーゼに加えて３′→５′ヌクレアーゼ活性を有
する他のポリメラーゼも使用される。Ｔli ＤＮＡポリ
メラーゼ（Promega Corporation,Madison, WI, USA）、
またはＶent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolab
s, Beverly, MA, USA）は、３′→５′ヌクレアーゼ活
性を有する適当な熱安定性ポリメラーゼである。本発明
には、Sigma Corp. によって販売されている ＡccuＴaq
（登録商標）ＬＡ ＤＮＡポリメラーゼミックス（添付
資料１）がきわめて適している。このようなミックスお
よび関連酵素組成物は米国特許第5,436,149号の実施例
６に記載されている。この特許の開示はその全体が引用
により本明細書に導入される。
【００２１】新規な方法は、プライマーの非対塩基が校
正読み取り機能を有するポリメラーゼの攻撃点であると
いう事実の認識に基づくものである。使用する熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼは、非ハイブリダイズ塩基を場合に
応じてクエンチャーまたはレポーター分子とともに放出
させる３′→５′ヌクレアーゼ活性、好ましくは３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性を有する。
正読み取り機能を有するポリメラーゼの攻撃点であると
いう事実の認識に基づくものである。使用する熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼは、非ハイブリダイズ塩基を場合に
応じてクエンチャーまたはレポーター分子とともに放出
させる３′→５′ヌクレアーゼ活性、好ましくは３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００２２】新規方法において使用されるプライマー
は、平均的Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ比について標的核酸に関
連する対合またはマッチ領域の１８〜２５塩基のオリゴ
ヌクレオチドから構成されることが好ましいが、Ａ／Ｔ
塩基対合が多い場合には、多少長くて、ＰＣＲについて
上に開示された一般的方法に一致することが好ましい。
は、平均的Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ比について標的核酸に関
連する対合またはマッチ領域の１８〜２５塩基のオリゴ
ヌクレオチドから構成されることが好ましいが、Ａ／Ｔ
塩基対合が多い場合には、多少長くて、ＰＣＲについて
上に開示された一般的方法に一致することが好ましい。
【００２３】開示された方法は、核酸の増幅たとえばＰ
ＣＲの実行に２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）
しか要求しないので、たとえば WO 92／02638 に比べ単
純化されている点でとくに価値がある。これはウイルス
の配列または数種のウイルスパラメーターを同時に検出
する場合のように、様々な標的配列の検出のためたとえ
ば保存的核酸セグメントを増幅しなければならない場合
に有利である。
ＣＲの実行に２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）
しか要求しないので、たとえば WO 92／02638 に比べ単
純化されている点でとくに価値がある。これはウイルス
の配列または数種のウイルスパラメーターを同時に検出
する場合のように、様々な標的配列の検出のためたとえ
ば保存的核酸セグメントを増幅しなければならない場合
に有利である。
【００２４】これに加えて、本明細書に記載の方法は、
蛍光の増大は増幅されたＤＮＡの量に正比例するので、
定量的な増幅にきわめて適している。
蛍光の増大は増幅されたＤＮＡの量に正比例するので、
定量的な増幅にきわめて適している。
【００２５】本発明のもっとも好ましい実施態様は、核
酸の増幅法としてＰＣＲを使用し、３′ミスマッチプラ
イマーを消光可能な蛍光染料分子によって標識し、上記
分子の少なくとも１種が上記プライマーのミスマッチ
３′末端にまたはその範囲内に存在する方法である。Ｒ
ＮＡ標的を検出する場合には、ＰＣＲによる増幅に先立
って標的ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を行う。標的核酸が
豊富である場合は、標識プライマーを使用する以外は、
本技術分野の熟練者に周知のプロトコールに従う単一正
常ＰＣＲとすることが好ましい（実施例２）。高感度の
標的検出が所望の場合には、非標識の完全にマッチした
プライマーを使用して標的を増幅する第一の増幅を、本
発明の標識プライマーを用いる入れ子ＰＣＲ（nested P
CR）による標的核酸の第二の増幅に先行して実施する。
特に第二の増幅（入れ子ＰＣＲ）では、３′ミスマッチ
部分またはテイルを有するまたは有しない非標識プライ
マーの添加はそれが増幅をさらに効率的にし、標識プラ
イマーの減量を可能にする点で有利となることが見出さ
れた。
酸の増幅法としてＰＣＲを使用し、３′ミスマッチプラ
イマーを消光可能な蛍光染料分子によって標識し、上記
分子の少なくとも１種が上記プライマーのミスマッチ
３′末端にまたはその範囲内に存在する方法である。Ｒ
ＮＡ標的を検出する場合には、ＰＣＲによる増幅に先立
って標的ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を行う。標的核酸が
豊富である場合は、標識プライマーを使用する以外は、
本技術分野の熟練者に周知のプロトコールに従う単一正
常ＰＣＲとすることが好ましい（実施例２）。高感度の
標的検出が所望の場合には、非標識の完全にマッチした
プライマーを使用して標的を増幅する第一の増幅を、本
発明の標識プライマーを用いる入れ子ＰＣＲ（nested P
CR）による標的核酸の第二の増幅に先行して実施する。
特に第二の増幅（入れ子ＰＣＲ）では、３′ミスマッチ
部分またはテイルを有するまたは有しない非標識プライ
マーの添加はそれが増幅をさらに効率的にし、標識プラ
イマーの減量を可能にする点で有利となることが見出さ
れた。
【００２６】本発明の方法で使用する試薬は診断用キッ
トにパッケージすることができる。診断用キットは別個
の容器中に標識プライマーを包含する。プライマー（単
数または複数）が標識されていない場合には、特異的な
標識試薬をキット中に包含させることができる。キット
にはまたサンプルの調製および増幅に必要な他の適当な
パッケージ試薬および材料、たとえば標的核酸の抽出溶
液、緩衝液、ｄＮＴＰおよび／または重合手段、検出分
析のためのたとえば酵素および固相抽出剤、ならびにア
ッセイの実施の指示書を含有させることができる。本発
明の他の目的は開示された方法に有用なサンプル中の標
的核酸の検出用の様々な反応混合物である。サンプルは
ヒトまたは動物起源の体液、または関心のある生体成分
の抽出液である。好ましいサンプルは血液、血漿または
それらから得られる任意の生成物である。
トにパッケージすることができる。診断用キットは別個
の容器中に標識プライマーを包含する。プライマー（単
数または複数）が標識されていない場合には、特異的な
標識試薬をキット中に包含させることができる。キット
にはまたサンプルの調製および増幅に必要な他の適当な
パッケージ試薬および材料、たとえば標的核酸の抽出溶
液、緩衝液、ｄＮＴＰおよび／または重合手段、検出分
析のためのたとえば酵素および固相抽出剤、ならびにア
ッセイの実施の指示書を含有させることができる。本発
明の他の目的は開示された方法に有用なサンプル中の標
的核酸の検出用の様々な反応混合物である。サンプルは
ヒトまたは動物起源の体液、または関心のある生体成分
の抽出液である。好ましいサンプルは血液、血漿または
それらから得られる任意の生成物である。
【００２７】以下に本発明を実施例によって例示する
が、これらは本発明を限定するものではない。
が、これらは本発明を限定するものではない。
【００２８】
【実施例】実施例１ この実施例は高感度を要求する適用についてのものであ
る。この場合は増幅の第一ラウンドを標識プライマーか
ら構成される入れ子ＰＣＲの前に実施する。Ｃ型肝炎ウ
イルスＲＮＡの検出には、それをまず最初に標準方法を
用いて抽出し（たとえば、Ishizawa M., Kobayashi Y.,
Miyamura T., Matsuma S: Simpleprocedure of DNA is
olation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 1
9:5792 参照。この記載は引用により本明細書に導入さ
れる）、単離されたＲＮＡをついで逆転写し、標準方法
（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅する。入れ子増幅および
検出反応は以下のようにセットアップする。
る。この場合は増幅の第一ラウンドを標識プライマーか
ら構成される入れ子ＰＣＲの前に実施する。Ｃ型肝炎ウ
イルスＲＮＡの検出には、それをまず最初に標準方法を
用いて抽出し（たとえば、Ishizawa M., Kobayashi Y.,
Miyamura T., Matsuma S: Simpleprocedure of DNA is
olation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 1
9:5792 参照。この記載は引用により本明細書に導入さ
れる）、単離されたＲＮＡをついで逆転写し、標準方法
（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅する。入れ子増幅および
検出反応は以下のようにセットアップする。
【００２９】５μlの１０×ＵＬＴma緩衝液（100mM Tri
s-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-E
lmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマ
ー１（配列表の配列番号：１参照；10pmpl／μl）、４
μlのプライマー２（配列表の配列番号：２参照；10pmp
l／μl）、０.２５μlのプライマー３（配列表の配列番
号：３参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）
および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlのＲＴ
−ＰＣＲ反応液に加え、ついで全体を１８.２５μlの水
と混合して以下の温度サイクルに付す。 １．初期変性、９０℃において１分間、 ２．各場合、５６℃において２８秒間の変性ならびに５
６℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サ
イクル、 ３．評価まで４℃に冷却。
s-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-E
lmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマ
ー１（配列表の配列番号：１参照；10pmpl／μl）、４
μlのプライマー２（配列表の配列番号：２参照；10pmp
l／μl）、０.２５μlのプライマー３（配列表の配列番
号：３参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）
および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlのＲＴ
−ＰＣＲ反応液に加え、ついで全体を１８.２５μlの水
と混合して以下の温度サイクルに付す。 １．初期変性、９０℃において１分間、 ２．各場合、５６℃において２８秒間の変性ならびに５
６℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サ
イクル、 ３．評価まで４℃に冷却。
【００３０】ＰＣＲ反応は蛍光光度計で評価する。この
ためには、蛍光をレポーターの波長（FAMについては518
nm）で測定する。標的核酸を含まない陰性対照の蛍光に
基づく閾値を計算し、未知の値を評価するために使用す
る。
ためには、蛍光をレポーターの波長（FAMについては518
nm）で測定する。標的核酸を含まない陰性対照の蛍光に
基づく閾値を計算し、未知の値を評価するために使用す
る。
【００３１】実施例２ この実施例は高感度を要求しない適用についてのもので
ある。この場合、単一の増幅反応は標識プライマーを含
有する。Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅にはそれをまず
最初に標準方法を用いて抽出した（たとえば、Ishizawa
M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S: Simplep
rocedure of DNA isolation from human serum. Nucl.
Acids Res. 1991; 19:5792参照）。増幅は以下のように
セットアップする。
ある。この場合、単一の増幅反応は標識プライマーを含
有する。Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅にはそれをまず
最初に標準方法を用いて抽出した（たとえば、Ishizawa
M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S: Simplep
rocedure of DNA isolation from human serum. Nucl.
Acids Res. 1991; 19:5792参照）。増幅は以下のように
セットアップする。
【００３２】５μlの１０×ＵＬＴma緩衝液（100mM Tri
s-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-E
lmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマ
ー４（配列表の配列番号：４参照；10pmpl／μl）、４
μlのプライマー５（配列表の配列番号：５参照；10pmp
l／μl）、０.２５μlのプライマー６（配列表の配列番
号：６参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）
および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlの抽出
されたＤＮＡ（すなわち標的核酸）に加え、ついで全体
を１８.２５μlの水と混合して以下の温度サイクルに付
す。 １．初期変性、９０℃において１分間、 ２．各場合、９４℃において２８秒間の変性ならびに５
８℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サ
イクル、 ３．評価まで４℃に冷却。
s-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-E
lmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマ
ー４（配列表の配列番号：４参照；10pmpl／μl）、４
μlのプライマー５（配列表の配列番号：５参照；10pmp
l／μl）、０.２５μlのプライマー６（配列表の配列番
号：６参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）
および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlの抽出
されたＤＮＡ（すなわち標的核酸）に加え、ついで全体
を１８.２５μlの水と混合して以下の温度サイクルに付
す。 １．初期変性、９０℃において１分間、 ２．各場合、９４℃において２８秒間の変性ならびに５
８℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サ
イクル、 ３．評価まで４℃に冷却。
【００３３】結果の評価は実施例１の記載と同様に実施
する。実施例１および２のいずれにおいても、レポータ
ーはＦＡＭとし、クエンチャーはＴＡＭＲＡとした。
する。実施例１および２のいずれにおいても、レポータ
ーはＦＡＭとし、クエンチャーはＴＡＭＲＡとした。
【００３４】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｃ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：５′非翻訳領域 配列： 5′GCGTCTAGCCATGGCGTTAGT 3′ 21 配列番号：２ 配列の長さ：29 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：Yes アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｃ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：５′非翻訳領域 配列： 5′CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT 3′ 29 配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｃ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：５′非翻訳領域 配列： 5′REPORTER-CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT-QUENCHER 3′ 29 配列番号：４ 配列の長さ：22 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｂ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：コア遺伝子 配列： 5′AATCCACACTCCGAAAGACACC 3′ 22 配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｂ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：プレコア遺伝子 配列： 5′GCCTCCAAGCTGTGCCTTGG 3′ 20 配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源： 生物名：Ｂ型肝炎ウイルス ゲノム内での位置： 特徴：プレコア遺伝子 配列： 5′REPORTER-GCCTCCAAGCTGTGCCTTGGTGAA-QUENCHER 3′ 24
【図１】本発明の方法（Taq Womanアッセイ）のサイク
ルを示す図である。Ａは非対合３′末端を有する順行プ
ライマー、Ｂは逆行プライマー、Ｒはレポーター分子、
そしてＱはクエンチャー分子を示す。いわゆるアニーリ
ングは１で行われ、その３′末端は相補性ではないので
非対合のままである。いわゆる校正読み取りは２におい
て、校正読み取り活性を有する酵素によって行われ、非
対合３′末端が矯正すなわち除去される。いわゆる鎖伸
長（伸長相）は３で行われ、ついでこの相は４で完了す
る。
ルを示す図である。Ａは非対合３′末端を有する順行プ
ライマー、Ｂは逆行プライマー、Ｒはレポーター分子、
そしてＱはクエンチャー分子を示す。いわゆるアニーリ
ングは１で行われ、その３′末端は相補性ではないので
非対合のままである。いわゆる校正読み取りは２におい
て、校正読み取り活性を有する酵素によって行われ、非
対合３′末端が矯正すなわち除去される。いわゆる鎖伸
長（伸長相）は３で行われ、ついでこの相は４で完了す
る。
Claims (12)
- 【請求項１】 一本鎖ＤＮＡから成るサンプル中の標的
核酸の検出方法において、 (ａ) 上記サンプルを順行および／または逆行プライマ
ーと接触させ、この場合、少なくとも１種のプライマー
は標的核酸に関して上記プライマーの３′末端の故意に
ミスマッチさせた部分に標識または標識系部分を有し、
上記ミスマッチ部分は少なくとも１個のヌクレオチド、
好ましくは２〜５個またはそれ以上のヌクレオチドから
なり、上記標的核酸が存在する場合に、そのそれぞれの
相補性ＤＮＡ配列に上記順行および／または逆行プライ
マーがアニーリングされるハイブリダイゼーション条件
時に二重鎖混合物が創成され、 (ｂ) 工程(ａ)の混合物を、３′→５′校正読み取り活
性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼまたはこのよう
な校正読み取り活性を有する酵素の混合物と、上記ポリ
メラーゼまたは酵素混合物の３′→５′ヌクレアーゼ活
性がアニーリングしたプライマーをその３′ミスマッチ
部分において切断して標識または標識系部分を放出させ
るのに適当な条件下に維持し、 (ｃ) 標識または標識系部分の放出を検出および／また
は測定する方法。 - 【請求項２】 標的核酸を増幅させてさらに多量の標識
または標識系部分を放出させる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 増幅はＰＣＲで、また標的核酸がＲＮＡ
の場合には所望によりＲＴ−ＰＣＲで実施する請求項１
または２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】 標識は順行および／または逆行プライマ
ーの３′および５′末端領域に連結されたレポーター／
クエンチャー分子対である請求項１〜３のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項５】 レポーター分子は、プライマーのミスマ
ッチ３′部分に存在し、クエンチャー分子は、上記プラ
イマーのマッチ部分にレポーター分子から適当な距離を
おいて存在する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 クエンチャー分子はプライマーのミスマ
ッチ３′部分に存在し、レポーター分子は上記プライマ
ーのマッチ部分にレポーター分子から適当な距離をおい
て、好ましくは５′末端に存在する請求項４記載の方
法。 - 【請求項７】 上記核酸ポリメラーゼまたは上記酵素混
合物は熱安定性である請求項１〜６のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項８】 プライマーおよび標識または標識系を適
当に選択することにより多重標的を同時に検出する請求
項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 サンプルは動物またはヒト体液、好まし
くは血漿である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれかに記載の方法
に使用される標識プライマーおよび適当な核酸ポリメラ
ーゼまたは酵素混合物からなるサンプル中の標的核酸を
検出するためのキット。 - 【請求項１１】 プライマーは標的ウイルス核酸を検出
する請求項１０記載のキット。 - 【請求項１２】 標的核酸を検出するための反応混合物
であって請求項１〜８のいずれかに記載の方法に使用さ
れる増幅前標識プライマーおよび適当な核酸ポリメラー
ゼまたは酵素混合物からなる反応混合物。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19755642A DE19755642B4 (de) | 1997-12-15 | 1997-12-15 | Markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion |
| DE19806850A DE19806850A1 (de) | 1998-02-19 | 1998-02-19 | Markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion |
| DE19834913A DE19834913A1 (de) | 1998-08-03 | 1998-08-03 | Markierter Primer zum Nachweis amplifizierter Nukleinsäuren |
| DE19834913:0 | 1998-08-03 | ||
| DE19755642:6 | 1998-08-03 | ||
| DE19806850:6 | 1998-08-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11313685A true JPH11313685A (ja) | 1999-11-16 |
| JP4331812B2 JP4331812B2 (ja) | 2009-09-16 |
Family
ID=27218019
Family Applications (1)
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