JP2008543300A - 測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
・蛍光インターカレート剤(SYBR Green等)
・DNAポリメラーゼの5’−3’ヌクレアーゼ活性を用いる加水分解プローブ(TaqManプローブ及びLNAプローブ等)
・ヘアピンプローブ(Molecular Beacon及びScorpionとして知られているもの等)
・ハイブリダイゼーションプローブ(FRETプローブ、TaqMan MGBプローブ、及びMGB Eclipseプローブとして知られているもの等)
pfu DNAポリメラーゼ活性の存在下で、二重蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドを増幅反応のプライマーとして用いたリアルタイム増幅アッセイ
対照プラスミド(pMTB−Control)は、結核菌(MTB)のIS6110領域の335bp断片をpBlueScript SK(+)プラスミドにクローニングすることによって取得した。
以下のオリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーとして使用されるであろう。
第1ステップでは、温度を95.0℃に360秒維持した。
第2のステップでは、下記のサイクルを45回反復した。
95.0℃の温度で5秒。
57.0℃の温度で5秒。
60.0℃の温度で40秒。
pfu DNAポリメラーゼを用いたリアルタイム増幅システムにおける、反応プライマーとして蛍光二重標識を有するオリゴヌクレオチド(Lionプローブ)を使用した場合、又はフッ化物挿入剤(SYBR Green)を使用した場合の蛍光発光効率の比較
変異体2PF:LionプローブIS及びIS−INVとのハイブリダイゼーション領域の最後2塩基の変異。これは、両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマー3’末端最後の2塩基を不対にする。
以下のオリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーとして用いられた。
第2のステップでは、下記のサイクルを45回反復した。
95.0℃の温度で5秒。
57.0℃の温度で5秒。
60.0℃の温度で40秒。
蛍光標識されたssDNAプローブに対するpfuの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性不在の確認
第2のステップでは、下記のサイクルを40回反復した。
95.0℃の温度で10秒
58.0℃の温度で20秒
68.0℃の温度で60秒
混入5’−3’エキソヌクレアーゼ活性の不在の実証
サイトメガロウイルスポリメラーゼ(CMV)のコーディング領域における350塩基対(bp)の保存断片をpBlueScriptプラスミドSK(+)にクローニングすることによって得られたプラスミド(pCMV)。
プライマーCMVF(配列番号06:5’−GATAGACACACACTGCAAA−3’)。前述のプラスミドpCMVにクローニングされた、CMVゲノムの領域と完全に(100%相同性)ハイブリダイズする順方向プライマー。
第2のステップでは、下記のサイクルを45回反復した。
95.0℃の温度で5秒
57.0℃の温度で5秒
60.0℃の温度で40秒
液中ハイブリダイゼーション及び重合反応の非存在下における、二重蛍光標識を有するプローブ及びpfu DNAポリメラーゼ活性を用いた特定の核酸配列の検出アッセイ
結核菌(MTB)のIS6110領域の335bp断片をpBlueScript SK(+)プラスミドにクローニングすることによって得られた対照プラスミド(pMTB−Control)。
以下のオリゴヌクレオチドを検出プローブとして用いた。
初期測定5サイクル:
第1セクション:58℃で10秒、20℃/sの曲線
第2セクション:58℃で10秒、20℃/sの曲線
第1セクション:95℃で10秒、20℃/sの曲線
第2セクション:58℃で20秒、20℃/sの曲線
第3セクション:72℃で60秒、20℃/sの曲線
第1セグメント:40℃で600秒、20℃/sの曲線
CMV−INV−Blockをプローブとして用いたアッセイ
サイトメガロウイルスポリメラーゼ(CMV)のコーディング領域における350塩基対(bp)の保存断片をpBlueScript SK(+)プラスミドにクローニングすることによって得られたプラスミド(pCMV)。
プライマーCMVF(配列番号06)。プラスミドpCMV及びpMUT−CMVにクローニングされた、CMVゲノムの領域と完全に(100%相同性)ハイブリダイズする順方向プライマー。このプライマーは、DNA合成のオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する。
第2のステップでは、下記のサイクルを45回反復した。
95.0℃の温度で5秒。
57.0℃の温度で5秒
60.0℃の温度で40秒
Claims (30)
- 測定可能なシグナルの直接的な生成を介して、核酸、DNA又はRNAを検出する方法であって、
核酸基質にハイブリダイズできる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと共に、3’−5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が前記核酸基質に接触したとき、前記3’−5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の活性によって、前記シグナルは生成され、
前記オリゴヌクレオチド鎖の3’末端又はその隣接塩基のところで、1つ又は複数の塩基は不対状態であり、
それらは、前記酵素3’−5’ヌクレアーゼの活性によって分離し、
前記測定可能なシグナルを生成する、
方法。 - 前記オリゴヌクレオチドは、その鎖上の任意の位置にある少なくとも1つの塩基が標識されている、請求項1に記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端又はそれに隣接している塩基が標識されている、請求項2に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの両末端である3’末端と5’末端とが標識されている、請求項2に記載の方法。
- フッ化物で標識されている、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’末端は、フッ化物クエンチャーで標識され、前記3’末端は、フッ化物レポーターで標識されている、請求項4に記載の方法。
- 前記酵素、前記オリゴヌクレオチド、及び前記核酸基質は、水溶液中にある、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸基質は、固体支持体に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸基質は、その前の遺伝子増幅ステップであるin vitro転写(cDNA)又は等温増幅によって生成されたDNA鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸基質は、動物又は植物の生体試料、細胞培養物、食品、又は水、土、若しくは空気の試料に由来するものである、請求項1に記載の方法。
- プライマー伸長システム、PCRシステム、又は等温増幅システム等の核酸増幅システムに連結して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記PCRシステムは、リアルタイムPCRシステムである、請求項12に記載の方法。
- 1塩基が異なる核酸配列を検出し、識別するために使用する方法であって、
3’末端に対象とする変異を有するオリゴヌクレオチドを用いて、
前記核酸基質に変異がある場合に検出可能なシグナルを生成する、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - コドンをコードする核酸中の変異の存在を検出するのに使用される方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端に分析されるべきコドンを有し、
前記核酸がこのコドン中に変異を提示している場合に検出可能なシグナルを生成する、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - ヌクレオチドとポリメラーゼ活性を有する酵素との混合物の存在下で、前記シグナルの生成に使用される1種又は複数種の前記オリゴヌクレオチドが、前記シグナルの生成と同時に核酸の伸長が起こるように前記核酸基質とハイブリダイズする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する酵素、鎖置換活性及び/又は5’−3’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに少なくとも2種のプライマー、の混合物の存在下で、前記オリゴヌクレオチドは、対象となる前記核酸に結合し、伸長反応のプライマーとして作用することなく、前記3’−5’ヌクレアーゼ活性によって前記シグナルを生成するためのプローブとして機能する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性を有する酵素は、校正3’−5’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記校正3’−5’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性である、請求項18に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その塩基の結合位置を前記3’−5’ヌクレアーゼ活性から保護するために、その塩基の結合が非ホスホジエステル結合又はスペーサーの包含によって修飾されている、請求項15に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、特定の位置での加水分解から保護するために、その3’末端が修飾されている、請求項20に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、鎖置換活性を有するポリメラーゼの前記5’−3−ヌクレアーゼ活性を阻止するための修飾がされている、請求項17に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、前記伸長反応を阻止するために、その3’末端が修飾されている、請求項17に記載の方法。
- ハイブリダイゼーションシステムは、重合反応の非存在下、少なくとも1回のハイブリダイゼーション/触媒反応で行われる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション/触媒反応は、システムの中で、リアルタイムでモニターされる、請求項24に記載の方法。
- 試料中の核酸の配列を決定するキットであって、
少なくとも、決定される前記核酸の配列に相補的な配列を含み、かつ、その3’末端に1つ又は複数の非相補的な塩基を有するオリゴヌクレオチドと、
3’−5’ヌクレアーゼ校正活性を有するポリメラーゼ酵素と、
を少なくとも含む、キット。 - 前記核酸に対する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項26に記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端がブロックされている、請求項26に記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端がフッ化物レポーターで標識され、その5’末端がフッ化物クエンチャーで標識されている、請求項26に記載のキット。
- デオキシヌクレオチドを含む、請求項26に記載のキット。
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