JP2008543300A - 測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法 - Google Patents

測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法 Download PDF

Info

Publication number
JP2008543300A
JP2008543300A JP2008516346A JP2008516346A JP2008543300A JP 2008543300 A JP2008543300 A JP 2008543300A JP 2008516346 A JP2008516346 A JP 2008516346A JP 2008516346 A JP2008516346 A JP 2008516346A JP 2008543300 A JP2008543300 A JP 2008543300A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
oligonucleotide
activity
amplification
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2008516346A
Other languages
English (en)
Inventor
シーズ， アントニオ マデジョン
ロペス， ジェマ ロシオ リモネス
マカロ， フランシスコ ジャヴィエール カルヴォ
ジル， ソニア ロドリゲス
デ サラビア ロサド， ペトロ マニュエル フランコ
Original Assignee
バイオツールズ バイオテクノロジカル アンド メディカル ラボラトリーズ， エス． アー．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオツールズ バイオテクノロジカル アンド メディカル ラボラトリーズ， エス． アー． filed Critical バイオツールズ バイオテクノロジカル アンド メディカル ラボラトリーズ， エス． アー．
Publication of JP2008543300A publication Critical patent/JP2008543300A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法及びその使用に関する。本発明によれば、上記シグナルが３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の作用で生成し、これをリアルタイムで検出及び定量化することができる。本発明の方法は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの使用を含み、これらを上記核酸と接触させる。上述のオリゴヌクレオチドの１つが基質核酸と完全にハイブリダイズしない場合、上記酵素によって不対塩基が切断され、それによって、そのオリゴヌクレオチド中に存在するマーカーが遊離され、上記測定可能なシグナルが生成するであろう。本発明の方法は、ＤＮＡ合成プライマーとして、あるいはハイブリダイゼーションプローブとしてのみ作用するオリゴヌクレオチドを用いて、エンコーディングコドン又は非コーディングコドン中の可変領域及び変異を検出するのに使用でき、熱安定性酵素又は非熱安定性酵素を用いた核酸増幅システムに、そして、リアルタイムＰＣＲ等の同時検出システムに連結することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の作用による、測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法及びその適用に関する。生成されたシグナルは、リアルタイムで、検出及び定量化できる。
上記核酸と完全にはハイブリダイズしない１つ又は複数のオリゴヌクレオチドに、上記核酸を接触させる。それによって、上記酵素が上記核酸を不対塩基に開裂させ、測定可能なシグナルを生成するであろう。
上記オリゴヌクレオチドは、標識することができる。
核酸の検出及び定量化は、分子生物学における最も重要な技法に属し、迅速に進化している。
核酸を分析する基礎的かつ古典的な技法には、電気泳働及びプローブハイブリダイゼーションがあり、これらは、液相及び固相の両方で実施できる。
核酸操作技法の開発における重要な１ステップが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応の略）の開発である。
ＰＣＲ技法（Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１３５０−１３５４（１９８５年）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、及び第４８００１５９号明細書）は、核酸の指数関数的な増幅を可能にする。
この増幅は、研究対象である核酸の熱による変性、増幅させる核酸における２箇所の相対領域への相補的なプライマーの結合、及びポリメラーゼ酵素の作用による核酸の伸長からなるサイクルを反復することによって行われる。この過程のサイクルを連続的に反復することによって、核酸の指数関数的な増幅がもたらされる。
ＰＣＲ技法では、研究対象である核酸の増幅を行うためにポリメラーゼを用いる。
ＤＮＡポリメラーゼは核酸の合成を触媒し、それらはすべて、５’−３’領域で核酸を重合させることができるという事実にもかかわらず、それらの間には、二重らせんのエキソヌクレアーゼ活性、一本鎖の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、二重鎖の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、又は逆転写酵素活性等の他の特性が存在するか存在しないかに関連した相違が存在する。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼは、複製された塩基の誤りを校正するので、はるかに高い精度でＤＮＡ複製を行う（Ｂｒｕｔｌａｇ，Ｄ．及びＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２年）、２４７：２４１−２４８）。校正活性を伴う３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを複製システムで用いた場合、得られるＤＮＡに含まれる塩基の誤りの割合は、これらのタイプの酵素を用いなかった複製産物より小さいものとなる（Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７年）、２５２：１８７３−１８８０）。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する校正ＤＮＡポリメラーゼは周知となっている。米国特許第５５００３６３号及び米国特許第５３５２７７８号明細書等の書類は、３’−５’校正活性を有する熱安定性の組換え体ポリメラーゼをいかにして入手及び産生するかに関する記述を含有する。
米国特許第６４８９１５０号には、３’−５’校正活性を有するこれらのタイプのＤＮＡポリメラーゼの、核酸合成のための使用が記載されている。
国際公開第０１８１６３１号パンフレットには、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下に、核酸中の可変部位を分析する方法が記載されている。この酵素は、プライマーの１つが可変部位を有する標的核酸に相補的でない場合には、そのプライマーの３’末端を切断し、このプライマーのマーカーを放出する。このマーカーが存在するか存在しないかが、その後、分析される。このようにして、混合物中に存在する配列の１つの増幅及び／又は選択的標識が行われる。しかし、この過程は検出可能なシグナルを生成せず、したがって、マーカーの存在の分析には、生成された産物の分析を追加して行う必要がある。
ＰＣＲの変法であるリアルタイムＰＣＲが開発された。この方法では、増幅過程及び検出過程が、さらに操作を必要とせずに同時に行われる。さらに、反応中に放出される蛍光は、形成されるＤＮＡの量に比例するので、各瞬間に合成されたＤＮＡの量を、蛍光検出によって増幅中に測定することができる。したがって、いかなる瞬間でも、増幅反応の速度式を測定し、知ることができる（Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ、Ｆｏｋｌｅｒ Ｃ、Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ Ｇ、Ｗａｔｓｏｎ Ｒ、「Ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３；１１：１０２６−３０）。
現在、リアルタイムＰＣＲ技法に関連したほとんどの設備は、いわゆるサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）に相当するが、これは、蛍光リーダーを内蔵し、任意の時に、増幅が行われている試験管それぞれの中で放出された蛍光を測定するように設計されている。
現在、リアルタイムＰＣＲで最も用いられている蛍光検出方式は以下の通りである。
・蛍光インターカレート剤（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等）
・ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を用いる加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎプローブ及びＬＮＡプローブ等）
・ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ及びＳｃｏｒｐｉｏｎとして知られているもの等）
・ハイブリダイゼーションプローブ（ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ、及びＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブとして知られているもの等）
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎというブランド名で知られており、米国特許第５４３６１３４号によって保護されている化合物は、頻繁に使用されている蛍光インターカレート剤である。この化合物は二本鎖核酸に結合するシアニンの誘導体であり、ＰＣＲ産物の増加に比例して増強される蛍光シグナルを放出する。
これらのインターカレート剤は、それらがＰＣＲの核酸産物に結合するのと同様にして、プライマー二量体及び他の非特異的産物にも結合でき、非特異的な増幅シグナルを有することがあり、その結果、標識された標的の濃度の過大評価をもたらす。
他の種類の蛍光標識化システムは、米国特許第５７２３５９１号明細書に記載されているブランド名ＴａｑＭａｎのもの等、加水分解プローブに相当する。これらのプローブは、５’末端のフッ化物レポーターと、３’末端のフッ化物遮断薬又はクエンチャーとに結合する。Ｔａｑｍａｎプローブは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼと共に、核酸増幅をモニターするのに用いられる。両フッ化物が共にプローブに結合した場合、レポーターがクエンチャーによって低減され、シグナルは放出されない。この核酸が、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって複製された場合、上記プローブは、増幅される核酸鎖に結合し、フッ化物レポーターが結合している上記プローブ５’末端が遊離し、蛍光シグナルの放出が生じる。
ヘアピンプローブは、それらの５’及び３’末端に逆方向反復塩基配列を有し、標的配列の非存在下では、これら２箇所の逆方向反復領域の相補性によって、ヘアピン型構造の形成が可能となっている。上記プローブの内部配列は標的配列に相補的であり、したがってその存在下では、ヘアピン構造が開き、これが、フッ化物レポーターとフッ化物クエンチャーとの間の距離を広げ、それによって、蛍光シグナルが放出される。
他の知られているプローブは、ハイブリダイゼーションプローブであり、それらの設計では、それぞれ異なったフッ化物で標識されている２つの特定のオリゴヌクレオチド配列をプローブとして使用する。これらのプローブの末端は相補的であり、通常、それらのうちの１つの３’末端がドナーとなる。この分子が光源によって励起されたとき、それはエネルギーを第２のプローブ、すなわちアクセプター分子の５’末端に移す。これら２つのプローブは、それらの特異的な標的に、両方のフッ化物が近接した状態でハイブリダイズするように設計され、したがって、共鳴エネルギーの移動は、両プローブが標的にハイブリダイズし、相互に極めて近接しているときにのみ起こる。
「Ｒｅｓｏｎｓｅｎｓｅ」、「Ｌｉｇｈｔ−ｕｐ」、「ＨｙＢｅａｃｏｎ」、「ＬＵＸ」、「Ｙｉｎ−ｙａｎｇ」、「Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ」等のプローブのような、使用がより限定的かつ初期的な他のタイプのプローブもある。
本発明は、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の作用によって、核酸を検出及び定量化する新規な方法を提供する。
本発明は、３’−５’ヌクレアーゼ活性に媒介された、検出可能及び／又は定量化可能なシグナルの生成によって、ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸の特定の配列を検出する方法に関する。この方法は、同定する核酸基質を、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させるものであり、このオリゴヌクレオチドは、その３’末端又はその隣接塩基である１つ又は複数の塩基を不対状態にしたまま上記核酸基質とハイブリダイズできるように設計されている。
オリゴヌクレオチド鎖の３’末端に不対塩基を有する二本鎖核酸構造は、３’−５’ヌクレアーゼ活性の基質として作用し、上記オリゴヌクレオチドの不対塩基の分離も提示し、それら塩基は、不対帯域の３’側の位置に存在し、測定可能なシグナルを生成する。
このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド／基質ハイブリットが形成される場合は、それら不対塩基の１つに、あるいは、二本鎖分子中の不対塩基の３’側の位置にある塩基にマーカーを含むことができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドは、任意の数の追加マーカーを、上記オリゴヌクレオチド鎖上の任意の位置に保持することができる。
マーカーという用語は、本発明で使用される場合、検出及び／又は定量化可能なシグナルを生成させるのに使用でき、上記オリゴヌクレオチドに連結できるいかなる原子又は分子も意味する。
マーカーは、蛍光、電気シグナル、電気化学又は磁気シグナル、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折によって、あるいは吸収、酵素活性、化学発光、発光、又は振動によって検出可能なものによって、シグナルを検出可能にすることができる。
本発明のさらに特定の態様では、上記オリゴヌクレオチド鎖は、フッ化物クエンチャー及びフッ化物レポーターの二重標識を提示する。
本発明のさらに特定の一実施形態では、上記フッ化物クエンチャーが上記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端にあり、一方、３’末端がフッ化物レポーターで標識される。
本方法の一実施形態では、それらの配列にいかなるタイプのマーカーも組み込んでいないオリゴヌクレオチドを重量測定によるアッセイの実施に用いる。これらのアッセイでは、生成されたシグナルの測定は、標識された化学基の分離によるのではなく、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって測定された、塩基又は塩基の化学基が上記オリゴヌクレオチドの３’末端から分離したときに生じた質量の相違による。
本発明の一実施形態では、上記３’−５’ヌクレアーゼ活性が、校正活性を有するポリメラーゼに由来する。
同様に、上記３’−５’ヌクレアーゼ活性、又は上記校正活性を伴うポリメラーゼ活性は、高温でのインキュベーションに耐性（熱安定性酵素）のものでも、あるいはそうでないもの（熱不安定性酵素）でもよい。
本発明の方法では、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、動物若しくは植物組織の切片若しくは伸長物、細胞培養物、又は生体物質一般、食品、空気、土壌、及び水試料等、その組成にこのタイプの分子を含有するいかなる複合試料から得られたものでもよい。同様に、核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物（ｃＤＮＡ）若しくは遺伝子増幅産物（ＰＣＲ）、等温増幅、又はローリングサークル増幅システムで生成されたもの等、以前に処理されている試料に由来するものでもよい。最後に、プローブ及び基質は、液体溶液中、又はプローブ若しくは基質が、任意の性質の固体支持体（膜、ガラス、プラスチック、又は同様なもの）に固定されているシステムに存在しうる。
この方法における１つの特定の増幅では、１塩基のみの変化で相違している核酸配列（ＳＮＰ）を検出及び識別するのにこれを用いることができる。これには、オリゴヌクレオチドが基質配列とハイブリダイズした際に、ＳＮＰに関連した変異が上記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置するように、上記オリゴヌクレオチドを設計する。
このオリゴヌクレオチドの配列は、上記変異を提示しない核酸基質とは完全にハイブリダイズし、上記変異の基質配列とハイブリダイズする場合には、結果として、３’末端に不対塩基を提示するであろう。ハイブリダイゼーションが上記オリゴヌクレオチドと上記変異を提示しない基質核酸配列との間で起こる場合、オリゴヌクレオチド／核酸基質二本鎖分子はいかなる対不形成もない完全なものであり、３’−５’ヌクレアーゼ活性の作用のいかなる基質も生成せず、したがって、オリゴヌクレオチドは完全状態のまま残り、いかなるシグナルも生成しない。
対照的に、上記変異を提示するＤＮＡ基質がハイブリダイズする場合には、核酸／オリゴヌクレオチド二本鎖が完全でなく、上記オリゴヌクレオチドの３’末端に不対塩基が残っており、混合物中に存在する３’−５’ヌクレアーゼ活性によって認識される。
この活性によって、不対塩基がオリゴヌクレオチド鎖から分離され、検出可能なシグナルを放出する。
この方法の一適用では、これは、核酸のエンコーディングコドンにおける、変異の存在を検出するのに用いられる。
このためには、分析されるコドンが上記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置するように、上記オリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドの配列は、検出する必要がない、変異体でない核酸基質には完全に相補的であるべきである。このコドン中に変異を有する基質核酸の存在下では、オリゴヌクレオチド／核酸基質二本鎖分子は、上記オリゴヌクレオチドの３’末端に変異塩基の対不形成を提示し、それらが３’−５’ヌクレアーゼ活性の基質に変換される。
この方法を用いることによって、任意の位置における正確な変異の場合も、このコドンにおける二重変異又は三重変異の場合も、エンコーディングコドンを構成する３つの塩基のいずれかの変化を検出することができる。
この適用では、標識オリゴヌクレオチドは、非ホスホジエステル結合による塩基の結合、又は上記オリゴヌクレオチドの一部の位置を、これらの位置が保存性変異を表す場合に３’−５’ヌクレアーゼ活性から保護する目的のスペーサーの包含等、その配列に付加的な変化を提示することができる。
本発明の一実施形態では、上記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドが、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介されたシグナルを生成する操作と、プライマー伸長及びポリメラーゼ活性に媒介された増幅の両方における核酸伸長反応のプライマーとしての操作との両方を同時に行い、シグナルの生成と同時に核酸伸長が起こる。
このために、オリゴヌクレオチド、核酸の伸長反応に必要なｄＮＴＰ混合物、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、及びポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ基質を上記酵素活性に適した緩衝剤と共に接触させる。
ＰＣＲタイプの遺伝子増幅反応の場合、方向性が反対の別のプライマーが必要である。このプライマーは、基準オリゴヌクレオチドである場合も、あるいは、基質ＤＮＡとハイブリダイズした際に、３’領域に不対塩基を提示するものである場合もある。３’−５’ヌクレアーゼ活性による校正を受ける２種類のプライマーを用いたＰＣＲシステムを適用することで、システムの特異性を増大させることができる。最後に、この第２のプライマーも標識することができ、第１のプライマーによって生成されるものと同一なシグナル又は異なるシグナルを生成する。
本発明のこの適用では、これが３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介された触媒反応、及びポリメラーゼ活性によって媒介された重合反応と連結されていることを考えると、用いられる酵素は、３’−５’ヌクレアーゼ校正活性を有するポリメラーゼでありうる。
同様に、プライマー伸長反応、特にＰＣＲ反応では、連続的な加熱／冷却サイクルの適用が必要であるので、用いられる酵素は、３’−５’ヌクレアーゼ校正活性を有する熱安定性ポリメラーゼでありうる。
この適用では、上記オリゴヌクレオチドの３’末端又はこの末端に隣接した塩基を除いて、検出するＤＮＡ基質とハイブリダイズするように、標識オリゴヌクレオチドを設計する。上記オリゴヌクレオチドが基質ＤＮＡをハイブリダイズした際に、上記オリゴヌクレオチドの３’末端に不対塩基を有する二本鎖分子が生成される。上記オリゴヌクレオチドの不対塩基は、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって分離され、これらの塩基に連結されていたマーカーを放出する。これらの塩基が分離された際、短縮されたオリゴヌクレオチドは、このとき、ＤＮＡ基質と完全にハイブリダイズするようになっており、３’末端に遊離ＯＨ基を提示し、したがって、このオリゴヌクレオチドは、このとき、ポリメラーゼ活性によって媒介された核酸鎖伸張のプライマーとして機能できる。
このタイプのアッセイでは、核酸合成のシグナル／プライマーを生成するのに用いられるオリゴヌクレオチドは、一部の位置を加水分解から保護するため、あるいは３’−５’ヌクレアーゼの活性による無修飾オリゴヌクレオチドの伸長反応を停止させる目的で、３’位置の最終塩基の水酸基をブロックするさらなる修飾を提示してもよく、また提示しなくともよい。
したがって、プライマー伸長反応又はＳＮＰのＰＣＲでは、３’末端がブロック（修飾）されていないオリゴヌクレオチドを使用することによって、検出するべきＤＮＡ及び同定される必要のないＤＮＡの伸長又は増幅が可能となる。
しかしながら、問題となっているＤＮＡの伸長又は増幅によってのみ、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介された検出可能なシグナルが生成される。
対照的に、３’末端を修飾されたオリゴヌクレオチドを使用することによって、検出する必要のない配列の増幅及びシグナル放出の両方が阻止される。
本発明の特定の一実施形態では、核酸伸長又は増幅システムのオリゴヌクレオチドは、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介されたシグナル生成器としてのみ機能し、反応のプライマーとしては機能しない。
このシステムでは、上記オリゴヌクレオチドがプローブとして機能し、対象である核酸に結合し、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介されたシグナルを生成する。その結果、このシステムは、２つ以上の核酸伸長反応用プライマー、プローブとして作用する標識オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ３’−５’ヌクレアーゼ校正活性、鎖置換活性及び／又は５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、並びにｄＮＴＰ及び適当な緩衝剤の混合物の存在を必要とする。別法では、ＤＮＡ合成を開始させるオリゴヌクレオチドプライマーは、基質とハイブリダイゼーションした際に、正確な不対塩基を３’末端に提示してもよく、また提示しないでもよい。
鎖置換活性を提示する酵素が５’−３’ヌクレアーゼ活性も提示している場合、生成されたシグナルが、確実に、反応に添加されたポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性に由来するものとするには、上記オリゴヌクレオチドに追加の修飾を導入しなければならない。このタイプのポリメラーゼの５’−３’活性を阻害するには、取り得るいくつかの戦略があり、それらは、オリゴヌクレオチドの５’末端にパリンドローム配列を包含させること、又はリン酸化及び５’−５’結合による逆方向性塩基の添加等の５’末端の化学修飾である。
最後に、プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの伸長を阻止するには、これも、リン酸化、及びこの化学基に結合する任意の分子の添加等、ＯＨ遊離末端をブロックする任意の技法によって、３’末端における追加の修飾を提示するべきである。
それぞれ異なったマーカーを有するオリゴヌクレオチドを同時に利用することによって、増幅反応の多重化、すなわち増幅配列中におけるそれぞれ異なった変化の分析が可能となる。
特定の適用では、上記方法が遺伝子増幅反応で使用され、その際、フッ化物クエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドは、上記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置し、その一方で、３’末端はフッ化物レポーターで標識されている。この適用では、増幅反応を、各増幅サイクルにおける蛍光発光をモニターできる測定器に連結させて実行し、増幅アッセイのリアルタイムでの実行を可能にする。この適用は、シグナル発生器として、かつ鎖伸長のためのプライマーとして同時に機能するオリゴヌクレオチドを用いて、あるいは伸長反応のプライマーとして関与しない純粋なプローブとして機能するオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
本発明の一実施形態では、ハイブリダイゼーションシステム中の特定の配列を検出するのに、重合反応の非存在下で、直接的なシグナルの生成が用いられる。この方法は、同定される核酸基質が高濃度である必要があり、上記核酸基質を標識されたプローブ及び３’−５’ヌクレアーゼ活性と接触させるものであり、これが順次、３’−５’ヌクレアーゼ校正活性を有するポリメラーゼに相当する。鎖の伸長が行われないので、この混合物はｄＮＴＰを含有しない。この方法は、単一のハイブリダイゼーション／触媒ステップで実施することも、連続的なサイクルで実施することもでき、それらのサイクルでは、１つの温度上昇ステップで、オリゴヌクレオチド及び核酸基質が分離され、それに続く、より低温のインキュベーションステップで、核酸基質が新規のプローブとハイブリダイズする。
したがって、この過程の各サイクルで、シグナルの線形増大がある。特定の実施形態では、鎖の５’末端がフッ化物クエンチャーで標識され、３’末端がフッ化物レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドが用いられる。この適用では、ハイブリダイゼーション／触媒サイクルを、各増幅サイクルでの蛍光放出をモニターできる測定器で行い、それによって、検出アッセイのリアルタイムでの実施が可能となる。
本発明で使用される試薬は、核酸検出キットとして提供することができる。これらのキットは、検出が所望されている配列に相補的な配列と、その鎖の３’末端にある１つ又は複数の非相補的な塩基とを有するオリゴヌクレオチドを含有する。上記オリゴヌクレオチドは標識されたものでもよく、標識されていない場合には、上記キットに特定の標識試薬を含有させることもできる。
上記キットは、３’−５’校正活性を有するポリメラーゼ（ｐｆｕ）等、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を含有する。上記キットは、ポリメラーゼ活性有する別の酵素を追加的に含有させることができる。
上記キットは、上記核酸の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有でき、これらは標識されたものでも、標識されていないものでもよい。
上記キットは、検出を行うのに必要な他の試薬、及び増幅に必要な物質、例えば、緩衝剤、ｄＮＴＰ、マグネシウムイオン、及びアッセイを行うための説明書も含有できる。
本明細書には、本発明の好ましい実施形態を例示する１セットの図が添付されているが、これは本発明の適用を限定するものではない。
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、オリゴヌクレオチドＩＳ及びＩＳ−ＩＮＶの、ＤＮＡ基質とのハイブリダイゼーションを示している。図１Ａ）ｐＭＴＢ−対照、図１Ｂ）変異体１Ｆ、図１Ｃ）変異体１Ｐ、図１Ｄ）変異体２ＰＦ。各図の中央にある配列はＤＮＡ基質の配列を示す。上部の配列はプライマーＩＳに相当し、底部の配列はプライマーＩＳ−ＩＮＶに相当する。四角い囲みは、プローブとＤＮＡ基質との間の不対塩基を示している。
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、左側に、様々なケースにおける様々なＤＮＡ基質のリアルタイムでの増幅結果を、サイクル数と対比した蛍光グラフ（ＦＡＭチャネル）で示している。これらの図の右側は、その過程の最終時点における増幅産物のアガロースゲルでの分析を示している。図２Ａ）ＩＳプローブ及びＤＮＡポリメラーゼを有する増幅混合物；図２Ｂ）ＩＳ−ＩＮＶプローブ及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを有する増幅混合物；図２Ｃ）ＩＳ−ＩＮＶプローブ及びＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼポリメラーゼを有する増幅混合物。
図３Ａ及び３Ｂは、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で蛍光源としてＩＳ−ＩＮＶプローブを用いたリアルタイムでの比較増幅アッセイ、又はｐｆｕの存在下でフッ化物挿入剤であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイムでの比較増幅アッセイ、の結果を示している。図３Ａは、サイクル数に対する蛍光グラフを示す。グラフの上部は、蛍光源としてＩＳ−ＩＮＶプローブを用いた際に得た増幅プロフィールを示し、底部は、フッ化物挿入剤であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて得られたプロフィールを示す。図２Ｂは、得られた増幅産物のアガロースゲル分析を示す。レーン１は１０−３希釈、レーン２は１０−６希釈、レーン３は１０−８希釈、そしてレーン４は、無ＤＮＡ陰性対照に相当し、レーンＭは１００ｂｐラダーに相当する。右側のレーンはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたアッセイに相当し、左側はＩＳ−ＩＮＶプローブに相当する。
図４は、本発明の実施例３に対応するリアルタイムでの増幅結果を、蛍光対サイクル数のグラフで示している。
図５Ａは、本発明の実施例４に対応するリアルタイムでの増幅結果を、蛍光対サイクル数のグラフで示し、図５Ｂは、その過程の最終時点に得られた増幅産物のアガロースゲルでの分析を示している。アガロースゲルで、右側の５レーンはプローブなしのＰＣＲ結果に相当し、左側の５レーンはプローブを用いたＰＣＲ結果に相当する。Ｍ：１００ｂｐラダー、２：ＤＮＡ ｐｏｌ ５’−３’ ｅｘｏ＋、３：Ｔａｑポリメラーゼｅｘｏ−、４；「無ＤＮＡ」対照を表す。
図６は、実施例５に示した独立ＤＮＡ合成系による検出結果を、蛍光対サイクル数のグラフで示している。
（実施例１）
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ活性の存在下で、二重蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドを増幅反応のプライマーとして用いたリアルタイム増幅アッセイ
プライマーハイブリダイゼーションの領域で様々なレベルの不対塩基を有する基質ＤＮＡの増幅及び蛍光検出のアッセイを、ＤＮＡポリメラーゼのｐｆｕ活性の存在下、二重標識プライマーを用いたリアルタイム増幅システムで行った。この実施例及び本発明の他の実施例では、マーカーを保持し、かつハイブリダイゼーションの際に３’端末又はその隣接塩基に、核酸基質との不対塩基を提示するように設計されたオリゴヌクレオチドに、Ｌｉｏｎプローブという総称が与えられている。不対塩基の提示は、上記オリゴヌクレオチドを、結果として部分的分解を受けやすいものにし、反応混合物に含まれる３’−５’ヌクレアーゼ活性によって媒介されたシグナルの生成を引き起こす。
このアッセイでは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）のＩＳ６１１０における保存領域を増幅した。使用された基質ＤＮＡ、プライマー、及びプローブを以下に示す。
基質ＤＮＡ
対照プラスミド（ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、結核菌（ＭＴＢ）のＩＳ６１１０領域の３３５ｂｐ断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドにクローニングすることによって取得した。
対照プラスミド（ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）にクローニングされた、３１０ｂｐの３つのＩＳ６１１０領域変異体配列（遺伝子増幅産物）は、以前に記載されている。
変異体１Ｐ：プライマーであるＬｉｏｎプローブＩＳ及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域の最後から２番目の塩基における変異。図１Ｃに見ることができるように、この変異は、それがこれら両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマーの３’末端最後の塩基に不対塩基を生成させる。
変異体１Ｆ：プライマーであるＬｉｏｎプローブＩＳ及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域の最後の塩基における変異。図１Ｂに示す通り、この変異は、両プライマーとのハイブリダイゼーションの際に、両プライマーの３’末端に不対塩基を生成させる。
変異体２ＰＦ：プライマーであるＬｉｏｎプローブＩＳ及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域の最後２塩基の変異。図１Ｄに見ることができるように、この変異は、両プライマーとのハイブリダイゼーションの際に、両プライマーの３’末端最後の２塩基に不対塩基を生成させる。
増幅プライマー
以下のオリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーとして使用されるであろう。
ＬｉｏｎプローブＩＳ（配列番号０１：５’−ＣＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＴＧＡ−３’）。末端に二重標識を提示する順方向プライマー。５’末端がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識され、３’末端がＦＡＭ遮断薬であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で標識されている。このプライマーは、プラスミド調節配列と完全にハイブリダイズし、変異体ＤＮＡ １Ｐ、１Ｆ、及び２ＰＦとの不対塩基を３’末端に提示する。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（配列番号２：５’−ＣＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＴＧＡ−３’）。プライマーＬｉｏｎプローブＩＳと同一配列であるが、末端標識が逆になっている順方向プライマー。したがって、５’末端がＴＡＭＲＡで標識され、３’末端がＦＡＭで標識されている。プライマーＩＳと同様に、このプライマーは、プラスミド調節配列と完全にハイブリダイズし、変異体ＤＮＡ １Ｐ、１Ｆ、及び２ＰＦとの不対塩基を３’末端に提示する。
プライマーＭＴ２（配列番号０３：５’−ＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴ−３’）。逆方向プライマー。前述した４つの基質の配列と完全にハイブリダイズする。このプライマーは、この実施例で行われたすべての実験で、逆方向プライマーとして使用された。
プライマーとして用いられたプローブにおける蛍光標識の方向性の影響を確かめるために、２種類の二者択一の混合物を試験した。１つはＩＳプローブを使用し、もう一方はＩＳ−ＩＮＶプローブを使用したものである。増幅混合物は以下の通りであった。
ＬｉｏｎプローブＩＳ及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを有する増幅混合物：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ社、スペイン、マドリード所在）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、ＬｉｏｎプローブＩＳ（最終濃度０．３μＭ）、及びオリゴヌクレオチドＭＴ２（最終濃度０．５ｍＭ）が含まれていた。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを有する増幅混合物：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（最終濃度０．３μＭ）、及びオリゴヌクレオチドＭＴ２（最終濃度０．５ｍＭ）が含まれていた。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ及びＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼを有する増幅混合物：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（最終濃度０．３μＭ）、及びオリゴヌクレオチドＭＴ２（最終濃度０．５ｍＭ）が含まれていた。
各混合物を用いて、ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドの増幅（５０００コピー）、変異体１Ｐ、１Ｆ、及び２ＰＦ（直接的ＰＣＲ産物）の増幅、並びにＤＮＡを含まない（無ＤＮＡ）対照をアッセイした。
増幅反応は、下記の増幅サイクルを用いて、リアルタイム増幅システムＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）で行った。
第１ステップでは、温度を９５．０℃に３６０秒維持した。
第２のステップでは、下記のサイクルを４５回反復した。
９５．０℃の温度で５秒。
５７．０℃の温度で５秒。
６０．０℃の温度で４０秒。
増幅反応過程は、６０℃でのインキュベーションステップ中に行われたＦＡＭチンャネルにおける蛍光レベルの測定によって、リアルタイムでモニターした。同様に、増幅産物は、エチジウムブロマイドで染色された１．５％アガロースゲルで分析した。結果を図２に示す。
図２Ａに示す通り、（５’ＦＡＭ−−−３’ＴＡＭＲＡで標識された）ＬｉｏｎプローブＩＳで増幅されたすべての試料が、増幅過程中に作成された蛍光曲線において陰性であった。対照的に、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ及びｐｆｕ−ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて増幅されたすべての試料が、高レベルの蛍光を伴った陽性であった。図２Ｂに示す通り、変異体１Ｆ（１）及び１Ｐ（２）の基質ＤＮＡを増幅させた場合には、蛍光が極めて迅速に現れ（閾値が非常に低い）、ｐＭＴＢ対照プラスミドの増幅（３）、及び無ＤＮＡ対照（４）では、はるかに遅かった。最後に、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないもの）及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶを用いて増幅した試料は、すべての場合で陰性であった。これは、ｐｆｕアッセイで得られたシグナルが、このエキソヌクレアーゼ活性の存在によるものであることを示す。
反対に、増幅産物のアガロースゲル分析は、ＬｉｏｎプローブＩＳで増幅したＤＮＡ変異体試料、及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶで増幅したＤＮＡ変異体試料の両方が、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合に陽性であり、すべての場合で、予測されたサイズ（２２０ｂｐ）の増幅バンドが現れることを示した。対照的に、ｐＭＴＢを用いて増幅した試料、及び無ＤＮＡ対照の試料は陰性であり、プライマー二量体に相当する低分子量のバンドが現れた。
得られた結果は、プライマーの３’末端にＤＮＡ基質との不対塩基を提示する二重標識プローブ（フッ化物及び遮断薬）を用いた蛍光シグナルの増幅及び生成に、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が効果的であることを確認するものである。しかし、この蛍光シグナルを生成させる場合、特定の標識の方向性が必須である。したがって、５’の位置にフッ化物を有し、３’の位置に遮断薬を有するプローブの使用は、増幅反応では有効であるが、蛍光シグナルの生成には有効でない。これは、ｐｆｕがその校正機能を行う際に、３’の位置から遮断薬を除去するが、増幅産物の５’末端には蛍光標識が組み込まれたまま残っており、そのＤＮＡ配列によって校正機能が阻止されるという事実によって説明できる。反対に、３’末端にフッ化物が結合し、５’末端に遮断薬が結合しているプローブを使用すると、ｐｆｕが校正機能を行い、フッ化物の直接放出が行われ、効果的な蛍光発光が可能となる。
無ＤＮＡ試料で蛍光シグナルが生じたこと、そして、それに伴って、アガロースゲルでプライマー二量体バンドが観測されたことは、このシステムでｐｆｕと組み合わせてプライマーとして使用されたプローブは、完全に異なった作用機作を提示するが、それらは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のフッ化物挿入剤を用いて得られる結果に類似した結果を生み出すことを示唆する。これは、ＤＮＡ基質の起源とは関係なく、プローブの３’末端における不対塩基でハイブリダイゼーションが起こるという条件で、ｐｆｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって媒介された蛍光発光が有効となるからである。
（実施例２）
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイム増幅システムにおける、反応プライマーとして蛍光二重標識を有するオリゴヌクレオチド（Ｌｉｏｎプローブ）を使用した場合、又はフッ化物挿入剤（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）を使用した場合の蛍光発光効率の比較
プローブの３’末端に不対塩基を生成する基質の存在下で、反応プライマーとして蛍光二重標識プローブを使用し、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅システムを使用すると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のフッ化物挿入剤を用いた得た結果に類似した蛍光結果を生むことが、実施例１で観測されたので、両システムの比較測定を行った。
それを行うには、実施例１で使用された増幅システムに類似した、ＭＴＢの増幅システムを使用する。使用される基質及びプライマーＤＮＡ並びにプローブを以下に示す。
ＤＮＡ基質
変異体２ＰＦ：ＬｉｏｎプローブＩＳ及びＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域の最後２塩基の変異。これは、両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマー３’末端最後の２塩基を不対にする。
増幅プライマー
以下のオリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーとして用いられた。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（配列番号０２）。蛍光二重標識プローブ（５’ＴＡＭＲＡ−−−ＦＡＭ３’）。変異体２ＰＦ配列基質の配列と部分的にハイブリダイズする。このプライマーは、基質とハイブリダイズした際に、その３’末端最後２塩基の不対形成を提示する。
プライマーＩＳＦＯＷ（配列番号０４：５’−ＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＧ−３’）。変異体２ＰＦ ＤＮＡ基質のＤＮＡ配列と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする順方向プライマー。
プライマーＩＳＲＥＶ（配列番号０５：５’−ＣＧＡＣＡＣＡＴＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＡ−３’）。変異体２ＰＦ ＤＮＡ基質のＤＮＡ配列と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする逆方向プライマー。
以下に示す、２種類の二者択一の反応混合物を調製した。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ及びｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼを有する増幅混合物：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（最終濃度０．３μＭ）、及びオリゴヌクレオチドＩＳＲＥＶ（最終濃度０．５ｍＭ）が含まれていた。
ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ及びｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅混合物：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、オリゴヌクレオチドＩＳＦＯＷ（最終濃度０．５μＭ）、オリゴヌクレオチドＩＳＲＥＶ（最終濃度０．５ｍＭ）、及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）が含まれていた。
各混合物を用いて、系列希釈（無希釈ＤＮＡ、並びに１／１０３、１／１０６、及び１／１０８希釈）及び無ＤＮＡ対照の増幅をアッセイした。
増幅反応は、下記の増幅サイクルを用いて、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）リアルタイム増幅システムで行った。
第１ステップでは、温度を９５．０℃に３６０秒維持した。
第２のステップでは、下記のサイクルを４５回反復した。
９５．０℃の温度で５秒。
５７．０℃の温度で５秒。
６０．０℃の温度で４０秒。
増幅反応過程は、６０℃でのインキュベーションステップ中に行われた、各増幅サイクルでのＦＡＭチンャネルにおける蛍光レベルの測定によって、リアルタイムでモニターした。同様に、増幅産物は、エチジウムブロマイドで染色された１．５％アガロースゲルで分析した。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。
図３Ａに示す通り、分析されたすべての試料は、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶの存在下で増幅させたもの、及び、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの存在下で増幅させたものの両方ともが陽性であった。しかし、蛍光シグナルの出現は、ＩＳ−ＩＮＶプローブで増幅された試料（グラフの上半分）の方が、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（グラフの下半分）で増幅された試料よりも早かった。したがって、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶで増幅された試料は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの存在下で分析された同一試料と比較して、Ｃｔ値（閾値サイクル）が、平均して約６．１５５サイクル減少していた。一方、無ＤＮＡ対照は、両アッセイで陽性であったが、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶで増幅された試料では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで増幅された対照より２．３５サイクル遅れて蛍光カーブが現れた。
表１の結果は、プローブＩＳ−ＩＮＶで増幅された試料で得られたＣｔ値、及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで得られたＣｔ値を示す。
Figure 2008543300
プローブＩＳ−ＩＮＶで増幅された試料と比較した、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで増幅された試料におけるＣｔ値の平均遅延は、分析された各希釈で得られたＣｔ値の相違の算術平均として計算した。
平均遅延＝［（Ａ５−Ａ１）＋（Ａ６−Ａ２）＋（Ａ７−Ａ３）］／３＝５．４６サイクル
各測定値の安全域は、無ＤＮＡ対照のＣＴ値と、分析された中で最も希釈率が高いもの（１０−８希釈）のＣｔ値との間の相違として計算した。
ＩＳ−ＩＮＶプローブで増幅された試料の安全域：Ａ４−Ａ３＝１１．１２サイクル
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて分析した試料の安全域：Ａ８−Ａ７＝３．０４サイクル
図３Ｂに示す通り、１．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルにおける増幅産物の分析は、蛍光を発生させるのに用いられたシステム（ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶか、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉか）に関係なく、増幅されたＤＮＡ試料全てに、予測されたサイズの増幅バンドが存在すること、及び無ＤＮＡ対照ではバンドが存在しないことを確認した。
得られた結果は、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で二重標識プローブをプライマーとして使用すると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のフッ化物挿入剤を用いて得られる結果に類似した結果を生じるが、新規の手法は、検出の感度、及び潜在的に特異性の両方を改善することを示す。したがって、蛍光の出現が最も早い値、及び得られた蛍光が最も高い値は、システムの感度がより良いことを示す。一方、増幅された試料のＣＴ値の減少と、無ＤＮＡ対照における蛍光シグナル出現の遅延との組合せは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎと比較した、所与のシグナルを検出するための安全域を増大させる。したがって、検出可能な最後の試料と、ＩＳ−ＩＮＶプローブを用いた実験におけるプライマー二量体シグナルとの間にあるサイクル数の相違は１１．８サイクルであり、それに対して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた増幅実験では３．３サイクルであった。
（実施例３）
蛍光標識されたｓｓＤＮＡプローブに対するｐｆｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性不在の確認
実施例１及び２でアッセイされたシステムで得られた蛍光シグナルが、ｐｆｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって媒介された標識プローブに依存しない分解によるものではないことを保証する目的で、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶを用いたインキュベーションアッセイを、ＤＮＡ基質の非存在下で、ｐｆｕを用いて行った。このために、以下に示す２種類の二者択一の反応混合物を調製した。
Ａ．追加プライマー以外のすべての増幅試薬を有する反応混合物。したがって、インキュベーション混合物は以下の組成を有した：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（最終濃度０．３μＭ）が含まれていた。
Ｂ．追加プライマー及びｄＮＴＰ以外のすべての増幅試薬を有する反応混合物。したがって、インキュベーション混合物は以下の組成を提示する：Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、及びＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（最終濃度０．３μＭ）が含まれていた。
両反応混合物における蛍光シグナルの生成は、ＤＮＡ基質の非存在下で、２回繰り返してアッセイした。用いたインキュベーション条件は、増幅アッセイで用いたものと同一であった。したがって、増幅アッセイは、下記の温度サイクルを用いて、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）リアルタイム増幅システムで行った。
第１ステップでは、温度を９５．０℃に２４０秒維持した。
第２のステップでは、下記のサイクルを４０回反復した。
９５．０℃の温度で１０秒
５８．０℃の温度で２０秒
６８．０℃の温度で６０秒
６８℃でのインキュベーションそれぞれで、ＦＡＭチンャネルにおける蛍光レベルを、全過程にわたってモニターした。
図４に示す通り、インキュベーション過程中には、いかなる場合にも蛍光シグナルが得られず、これは、結果として、上記のアッセイ中に得られた蛍光シグナルは、上記の基質に依存しない機構における、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による、二重標識を有するｓｓＤＮＡプローブの分解によって引き起こされたものではないことを保証している。
（実施例４）
混入５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の不在の実証
得られた結果の解釈に影響を与えるかもしれない、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ調製物中に潜在的に混入する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の完全な不在を確認するために、蛍光シグナルを生成するのに５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の存在を必要とするＴａｑＭａｎプローブを用いた増幅／検出アッセイを行った。
この実施例で用いられる実験モデルは、ヒトサイトメガロウイルスポリメラーゼ（ＣＭＶ）のコーディング領域における保存領域のＴａｑＭａｎプローブを用いた増幅及び検出システムである。使用された基質ＤＮＡ及びプローブを以下に示す。
基質ＤＮＡ
サイトメガロウイルスポリメラーゼ（ＣＭＶ）のコーディング領域における３５０塩基対（ｂｐ）の保存断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドＳＫ（＋）にクローニングすることによって得られたプラスミド（ｐＣＭＶ）。
増幅プライマー及び蛍光プローブ
プライマーＣＭＶＦ（配列番号０６：５’−ＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡ−３’）。前述のプラスミドｐＣＭＶにクローニングされた、ＣＭＶゲノムの領域と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする順方向プライマー。
プライマーＣＭＲ（配列番号０７：５’−ＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＡＴＴＣＧＴ−３’）。前述のプラスミドｐＣＭＶにクローニングされた、ＣＭＶゲノムの領域と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする逆方向プライマー。
ＣＭＶプローブ（配列番号０８：５’−ＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＡ−３’）。前述したＣＭＶＦ／ＣＭＶＲプライマーの組合せで増幅された産物の内部領域と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする二重蛍光標識化を有するＴａｑＭａｎプローブ（５’ＦＡＭ−−−−ＴＡＭＲＡ ３’）。
ＣＭＶＦ及びＣＭＶＲをプライマーとして用い、さらに、二重蛍光標識ＣＭＶプローブを有するＴａｑＭａｎプローブを検出システムとして含めて、プラスミドｐＣＭＶ（５０００〜５０コピー／反応の範囲）の連続１／１０希釈及び「無ＤＮＡ」陰性対照を分析した。このプローブは、（Ｔａｑポリメラーゼのように）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下では、Ｔａｑｍａｎタイプの加水分解プローブとして機能する。増幅プライマー及び加水分解プローブは両方とも、分析されるＤＮＡ基質配列との完全なハイブリダイゼーションを提示する。増幅アッセイは、Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ社製のＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ酵素活性及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにｅｘｏ Ｔａｑポリメラーゼ活性（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いて平行して行われた。
反応混合物は以下の組成を有する。ｄＮＴＰ、プライマーＣＭＶＦ（０．５μＭ）、プライマーＣＭＶＲ（０．５μＭ）、及びプローブＣＭＶ（０．３μＭ）を含有する混合物。ポリメラーゼ活性に関しては、下記の通り、各実験で異なった酵素を添加した。すなわち、５’−３’エキソヌクレアーゼ＋ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ ＤＮＡポリメラーゼ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−（Ｔｉｔａｎｉｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、又はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）である。すべての場合で、０．１ｕ／μｌの酵素を添加し、各酵素用の特別な緩衝剤で反応物を補完した。最終反応体積はすべての場合で２０μｌであった。
増幅反応は、下記の増幅サイクルを用いて、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）リアルタイム増幅システムで行った。
第１ステップでは、温度を９５．０℃に３６０秒維持した。
第２のステップでは、下記のサイクルを４５回反復した。
９５．０℃の温度で５秒
５７．０℃の温度で５秒
６０．０℃の温度で４０秒
図５Ａに示す通り、増幅反応の進展は、６０℃でのインキュベーションステップ中に行われた、ＦＡＭチンャネルにおける各増幅サイクルでの蛍光レベルの測定によって、リアルタイムでモニターした。同様に、１．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルで増幅産物を分析し、図５Ｂに示す結果を得た。
蛍光シグナルは、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼを用いて増幅された試料でのみ観察され、これとは対照的に、ｐｆｕ又はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｅｘｏ−を用いて増幅されたすべての試料が陰性であった（５）（図５Ａ）。これらの結果は、増幅産物をアガロースゲルで分析することによって確認された。アガロースゲル分析では、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ＋で処理された試料で、予測されたサイズの増幅バンドが観察され、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑ Ｅｘｏ−で処理された試料では、これらのバンドが完全に欠失していた（図５Ｂ）。
これらの結果は、両酵素でアッセイされた増幅システムにおける予測通りの挙動を確認するものである。
Ａ．ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで増幅された試料における蛍光シグナルの不在は、プローブが増幅プロセス中に分解したのではないことを示し、このようにしてアッセイされたｐｆｕの調製物中に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が存在しないことが保証される。対照的に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼで増幅された試料では、蛍光シグナルの生成が明らかに検出可能であった。
Ｂ．ｐｆｕで処理された試料における増幅バンドの不在は、使用された基質ＤＮＡと完全にハイブリダイズするプローブが、３’の位置にある塩基の分解を受けておらず、したがって、プローブのブロック（修飾）された末端が除去されておらず、それが増幅プライマーとして使用されるのを妨害していることを示す。一方、ｐｆｕは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性も、鎖置換活性も提示しないので、増幅プライマーの間のプローブを除去することができず、したがって、これが増幅過程の遮断物として機能する。対照的に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が伸長過程中にプローブを除去し、増幅過程を可能にするので、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ酵素の増幅は、このシステムで可能である。
したがって、これらの結果から、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅システムにおける蛍光シグナルの生成が、残存する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の存在によるものではないことが保証される。
（実施例５）
液中ハイブリダイゼーション及び重合反応の非存在下における、二重蛍光標識を有するプローブ及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いた特定の核酸配列の検出アッセイ
ｐｆｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、それに付随する重合反応が存在しなくても、核酸二本鎖分子３’末端の不対塩基に作用するので、この特性を用いて特異的な核酸検出システムを開発する可能性を、ｄＮＴＰの非存在下で、二重標識プローブ（５’ＴＡＭＲＡ−−−−ＦＡＭ ３’）及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いてアッセイした。ｄＮＴＰは、核酸新生鎖の伸長反応で基質として働きうる。
実験モデルとして、前述のＭＴＢ検出システムを用いた。以下の基質ＤＮＡ及びプローブが使用された。
基質ＤＮＡ
結核菌（ＭＴＢ）のＩＳ６１１０領域の３３５ｂｐ断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドにクローニングすることによって得られた対照プラスミド（ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）。
前述の対照プラスミド（ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）にクローニングされた、３１０ｂｐの３つのＩＳ６１１０領域変異体配列（遺伝子増幅産物）。
変異体１Ｐ：プライマーＩＳ及びＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域最後の塩基における変異。これは、両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマーの３’末端に非連結の塩基を生成する（図１Ｂのハイブリダイゼーション図を参照）。
変異体１Ｆ：プライマーＩＳ及びＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域最後の塩基における変異。これは、両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマーの３’末端に不対塩基を生成する（図１Ｃのハイブリダイゼーション図を参照）。
変異体２ＰＦ：プライマーＩＳ及びＩＳ−ＩＮＶとのハイブリダイゼーション領域の最後２塩基の変異。これは、両プライマーとハイブリダイズした際に、両プライマー３’末端最後の２塩基に不対ヌクレオチドを生成する（図１Ｄのハイブリダイゼーション図を参照）。
検出プローブ
以下のオリゴヌクレオチドを検出プローブとして用いた。
ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（配列番号０２）。プラスミド対照配列（ｐＭＴＢ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする、二重標識蛍光を備えたプローブ（５’ＴＡＭＲＡ−−−−ＦＡＭ ３’）。このプライマーは、変異体ＤＮＡ １Ｐ、１Ｆ、及び２ＰＦとの不対塩基を３’末端に提示する。
核酸重合に依存しないこの検出システムの予測される作用機作は、核酸基質との塩基相補性によるプローブの結合にある。ハイブリダイゼーションが完全な場合、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が機能せず、蛍光は放出されない。これは、対照プラスミドｐＭＴＢ−ｃｏｎｔｒｏｌを用いたアッセイの場合と同様であろう。対照的に、プラスミドの形成の際に、プローブの３’末端の塩基で不対形成が起きた場合、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、不対塩基を検出して、それらの塩基を分離し、蛍光発光を引き起こすであろう。これは、この実施例に含まれている各変異体のアッセイの場合と同様であろう。
このシステムが確実に機能するように、ｐｆｕ ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の機能を実証した前述の実施例でアッセイされた反応緩衝剤を用いて、反応を実施する。同様に、この過程中に改変されていない新規なプローブによる、触媒されたプローブの置換を促進するために、ＰＣＴアッセイで用いられる温度サイクルに類似のものを適用して、プローブの変性及び基質ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを可能にするであろう。
反応混合物の組成は以下の通りであった。０．１Ｕ／μｌのｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）、ＬｉｏｎプローブＩＳ−ＩＮＶ（０．３μＭ）、及びｐｆｕの特異的反応緩衝剤。反応の最終容積はすべての場合で２０μｌであった。
以下の温度サイクルを用いた。
初期測定５サイクル：
第１セクション：５８℃で１０秒、２０℃／ｓの曲線
第２セクション：５８℃で１０秒、２０℃／ｓの曲線
ハイブリダイゼーション３０サイクル：
第１セクション：９５℃で１０秒、２０℃／ｓの曲線
第２セクション：５８℃で２０秒、２０℃／ｓの曲線
第３セクション：７２℃で６０秒、２０℃／ｓの曲線
冷却、１サイクル
第１セグメント：４０℃で６００秒、２０℃／ｓの曲線
アッセイ結果は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイム増幅システムでモニターした。
得られた結果は、理論的に予測されていた結果を確認するものである。図６は、ｐＭＴＢ−ｃｏｎｔｒｏｌ試料（６）（プローブと基質との間の完全な対合）中、又は「無ＤＮＡ」対照試料（７）中で、蛍光シグナルが増大しないことがどのように観測されるかを示す。対照的に、分析された変異体、すなわち変異体１Ｆ（８）、１Ｐ（９）、及び２ＰＦ（１０）の試料では、有意な蛍光の増大が観測された。同様に、アッセイされた変異体のタイプに応じて、異なった収率の蛍光シグナルが観測された。すなわち、最大レベルの蛍光は、変異体試料１Ｐ（９）（プローブ３’末端の最後から２番目の塩基が不対形成する）及び変異体２ＰＦ（１０）（プローブ３’末端最後の２塩基が不対形成する）をアッセイすることによって得られた。対照的に、変異体１Ｆ（８）（プローブ３’末端最後の塩基が不対形成する）は、有意な増大を示したが、それは、前述の２つの場合より小さいものであった。
得られた結果は、３’−５’エキソヌクレアーゼ校正活性の存在下で、核酸の重合機構に依存せずに、核酸基質をハイブリダイズした際に３’末端に不対塩基を提示する二重蛍光標識（５’遮断薬−−−−３’フッ化物）を備えたＬｉｏｎ型プローブを使用して、液体ハイブリダイゼーションシステム中の特定の核酸配列を検出するこのシステムの機能性を示すものである。
（実施例６）
ＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｃｋをプローブとして用いたアッセイ
実施例１及び２で得られた結果は、３’−５’エキソヌクレアーゼ校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた遺伝子増幅システム、及びプローブの３’末端が、同定されるＤＮＡ基質との正確な不対塩基を提示するシステムで、二重蛍光標識（好ましくは、５’の位置にクエンチャーを有し、３’の位置にフッ化物を有する）を備えたプローブを使用して、特定の核酸配列を検出できる可能性を示すものである。
これらの条件で、プライマーと基質とのハイブリダイゼーションが起こると、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー３’末端の不対塩基を認識し、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって、フッ化物を有する不対塩基を分離する。この時点で、フッ化物とクエンチャーとが分離するので、蛍光が放出される。
しかし、このシステムでは、不対塩基が３’−５’エキソヌクレアーゼの作用で除去された際に、プライマーが新規ＤＮＡ鎖伸長のプライミングを行う用意ができるので、二重標識されたフッ化物は、同定プローブとして、そして増幅プライマーとしても機能する。実施例２で得られた結果に示されているように、これらの特徴を有するシステムを用いることによって、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のフッ化物挿入剤を用いて得られたものと同様な情報が得られる。したがって、基質に関連した配列の非特異的な増幅、又はプライマー二量体の形成によって、非特異的なシグナルが生成しうる。しかし、実施例２に示した通り、プライマー二量体の生成による非特異的なシグナルの生成は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで得られるものより遅くに起こり、増幅反応のプライマーとして機能しないプローブを用いて、３’−５’ヌクレアーゼ活性を用いたシグナル生成システムを使用することによって、検出の特異性を増強することができる。
この実施例は、以下の構造を有するシグナルを生成するのに、二重蛍光標識プローブを用いるリアルタイム増幅法について記載する。Ａ）同定される配列と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする２０ヌクレオチドの配列；Ｂ）上記オリゴヌクレオチド配列の３’に位置するスペーサー（ｄＳ）；Ｃ）２種類の蛍光標識（クエンチャー及びレポーター）を含有し、検出される配列とハイブリダイズしない３ヌクレオチドの配列。
以下の基質ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを使用する。
基質ＤＮＡ
サイトメガロウイルスポリメラーゼ（ＣＭＶ）のコーディング領域における３５０塩基対（ｂｐ）の保存断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドにクローニングすることによって得られたプラスミド（ｐＣＭＶ）。
増幅プライマー及び蛍光プローブ
プライマーＣＭＶＦ（配列番号０６）。プラスミドｐＣＭＶ及びｐＭＵＴ−ＣＭＶにクローニングされた、ＣＭＶゲノムの領域と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする順方向プライマー。このプライマーは、ＤＮＡ合成のオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する。
プライマーＣＭＶＲ（配列番号０７）。プラスミドｐＣＭＶ及びｐＭＵＴ−ＣＭＶにクローニングされた、ＣＭＶゲノムの領域を完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする逆方向プライマー。このプライマーは、ＤＮＡ合成のオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する。
ＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｋプローブ（配列番号０８：５’−ＴＣＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＴＡＡ−ｄｓスペーサー−−（ＴＡＭＲＡ）ｔｔ（ＦＡＭ）−３’）。二重蛍光標識５’ＴＡＭＲＡ−−−−ＦＡＭ ３’）を備え、以下の構造を有するプローブ。Ａ）同定される配列と完全に（１００％相同性）ハイブリダイズする２０ヌクレオチドの配列；Ｂ）上記オリゴヌクレオチド配列の３’に位置するスペーサー（ｄＳ）；Ｃ）２種類の蛍光標識（クエンチャー及びレポーター）を含有し、検出される配列とハイブリダイズしない３ヌクレオチドの配列。このプローブは、前述したプライマーＣＭＶＦ／ＣＭＶＲの組合せによって増幅された産物の内部領域とハイブリダイズする。
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び５’−３’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼの混合物をポリメラーゼ活性の供給源として用いて、プラスミドｐＣＭＶの１／１０系列希釈の増幅反応をアッセイした。アッセイを行った濃度範囲は、５０〜５００００コピーのプラスミド／反応である。反応混合物の組成は以下の通りであった。０．１ Ｕ／μｌの５’−３’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼ、０．１Ｕ／ｍｌのｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、プライマーＣＭＶＲ（最終濃度０．５μＭ）、プライマーＣＭＶＦ（最終濃度０．５μＭ）、プローブＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｃｋ（最終濃度０．５μＭ）、及び反応緩衝剤（Ｃｅｒｔａｍｐキット、Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）、すべての場合で最終反応体積は２０μｌ。
ＤＮＡポリメラーゼｐｆｕ活性又はＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを用いて同時に行った、プラスミドｐＣＭＶの連続１／１０希釈（範囲；５０〜５００００コピー／反応）の２つの増幅反応を対照として用いた。
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを有する反応混合物は以下の通りであった。Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて行った。最終反応体積２０μｌのこの混合物中には、０．１ｕ／μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、プライマーＣＭＶＲ（最終濃度０．５μＭ）、プライマーＣＭＶＦ（最終濃度０．５μＭ）、プローブＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｃｋ（最終濃度０．５μＭ）が組み込まれていた。
ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼを有する反応混合物は以下の通りであった。０．１Ｕ／ｍｌ ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ ＤＮＡポリメラーゼ）、反応緩衝剤、ｄＮＴＰ混合物、プライマーＣＭＶＲ（最終濃度０．５μＭ）、プライマーＣＭＶＦ（最終濃度０．５μＭ）、プローブＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏａｃｋ（最終濃度０．５μＭ）、及び反応緩衝剤（Ｃｅｒｔａｍｐキット、Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）、最終反応体積２０μｌ。
増幅反応は、下記の増幅サイクルを用いて、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）リアルタイム増幅システムで行った。
第１ステップでは、温度を９５．０℃に３６０秒維持した。
第２のステップでは、下記のサイクルを４５回反復した。
９５．０℃の温度で５秒。
５７．０℃の温度で５秒
６０．０℃の温度で４０秒
増幅反応の経過は、各増幅サイクルでのＦＡＭチンャネルにおける蛍光レベルを測定することによって、リアルタイムでモニターした。同様に、１．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルで増幅産物を分析した。
これらのアッセイで得られた結果を表２に示す。
Figure 2008543300
すべての場合で、陽性の結果がアガロースゲルで得られた。得られたバンドの長さは３３５ｂｐであったが、これは、ＣＭＶＦ／ＣＭＶＲプライマー対によって増幅された断片に相当する。いかなる場合でも、ＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｋプローブ／ＣＭＶＲプライマー対の増幅産物と同じサイズの増幅バンドは観察されなかった。これらの結果は、３ヌクレオチドの不対尾部を有するオリゴヌクレオチドＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｃｋの構造、及びＦＡＭ基の結合による３’末端のブロック（修飾）が、正しく増幅反応を遮断していたことを確認する。
ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼを用いて得られた結果（分析された基質に関係なく、ゲルでは陽性かつ蛍光では陰性）は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、この活性が結合したプローブを除去できることを示している。しかし、この活性は、プローブの３’に位置する不対ヌクレオチド尾部の完全性には影響を与えず、したがって、蛍光シグナルを生成しない。
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた結果は、校正活性の対象となったＣＭＶ−ＩＮＶ−ＢｌｏｋプローブによってプライミングされたＤＮＡ伸長反応が、スペーサーｄｓの存在によって遮断されたことを示しているようである。同様に、プライマーＣＭＶＦ／ＣＭＶＲによって媒介されたバンド増幅の不在は、この鎖置換活性が欠失しているための、ＣＭＶ−ＩＮＶ−Ｂｌｏｋプローブの挿入による、ｐｆｕ媒介の増幅反応の遮断を示すものであろう。これらの結果は、実施例４で得られた結果に類似している。実施例４では、ＴａｑＭａｎプローブが挿入された際に、ｐｆｕ媒介の増幅反応の阻害も観察されている。
ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼとｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼとを併せた活性を用いて得られた結果は、このシステムが正しく機能していることを確認する。したがって、アガロースゲルで陽性が観察されたことは、基質とハイブリダイズした、プローブの領域を分解し、断片が増幅されるのを可能にする、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の能力を確認する。最後に、増幅反応に伴って、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’ヌクレアーゼ校正活性の結果として、蛍光シグナルが得られた。
得られた結果は、スペーサーによって分離された２つの異なる領域を有するヌクレオチドの使用を確認する。それらのうち１つは、５’−３’ヌクレアーゼ活性による分解を受ける基質ＤＮＡに結合するのに使用され、もう一方は、３’−５’ヌクレアーゼ活性によって分解することのできる２つの蛍光標識が局在する、オリゴヌクレオチドの３’領域に位置し、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼ及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ活性の組合せの存在下で行われる遺伝子増幅反応の純粋な検出プローブとして機能する。
本発明の本質は、非限定的に記述されており、構成要素の材質、形態、大きさ、又は配置を変えることによって影響を受けないであろう。本明細書は、当業者が本発明の目的を再現するのを可能にするのに役立つ。

Claims (30)

  1. 測定可能なシグナルの直接的な生成を介して、核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出する方法であって、
    核酸基質にハイブリダイズできる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと共に、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が前記核酸基質に接触したとき、前記３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の活性によって、前記シグナルは生成され、
    前記オリゴヌクレオチド鎖の３’末端又はその隣接塩基のところで、１つ又は複数の塩基は不対状態であり、
    それらは、前記酵素３’−５’ヌクレアーゼの活性によって分離し、
    前記測定可能なシグナルを生成する、
    方法。
  2. 前記オリゴヌクレオチドは、その鎖上の任意の位置にある少なくとも１つの塩基が標識されている、請求項１に記載の検出方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端又はそれに隣接している塩基が標識されている、請求項２に記載の方法。
  4. 前記オリゴヌクレオチドの両末端である３’末端と５’末端とが標識されている、請求項２に記載の方法。
  5. フッ化物で標識されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記５’末端は、フッ化物クエンチャーで標識され、前記３’末端は、フッ化物レポーターで標識されている、請求項４に記載の方法。
  7. 前記酵素、前記オリゴヌクレオチド、及び前記核酸基質は、水溶液中にある、請求項１に記載の方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
  9. 前記核酸基質は、固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
  10. 前記核酸基質は、その前の遺伝子増幅ステップであるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ｃＤＮＡ）又は等温増幅によって生成されたＤＮＡ鎖である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記核酸基質は、動物又は植物の生体試料、細胞培養物、食品、又は水、土、若しくは空気の試料に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  12. プライマー伸長システム、ＰＣＲシステム、又は等温増幅システム等の核酸増幅システムに連結して実施される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ＰＣＲシステムは、リアルタイムＰＣＲシステムである、請求項１２に記載の方法。
  14. １塩基が異なる核酸配列を検出し、識別するために使用する方法であって、
    ３’末端に対象とする変異を有するオリゴヌクレオチドを用いて、
    前記核酸基質に変異がある場合に検出可能なシグナルを生成する、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. コドンをコードする核酸中の変異の存在を検出するのに使用される方法であって、
    前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端に分析されるべきコドンを有し、
    前記核酸がこのコドン中に変異を提示している場合に検出可能なシグナルを生成する、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. ヌクレオチドとポリメラーゼ活性を有する酵素との混合物の存在下で、前記シグナルの生成に使用される１種又は複数種の前記オリゴヌクレオチドが、前記シグナルの生成と同時に核酸の伸長が起こるように前記核酸基質とハイブリダイズする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  17. ヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する酵素、鎖置換活性及び／又は５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに少なくとも２種のプライマー、の混合物の存在下で、前記オリゴヌクレオチドは、対象となる前記核酸に結合し、伸長反応のプライマーとして作用することなく、前記３’−５’ヌクレアーゼ活性によって前記シグナルを生成するためのプローブとして機能する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ポリメラーゼ活性を有する酵素は、校正３’−５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記校正３’−５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記オリゴヌクレオチドは、その塩基の結合位置を前記３’−５’ヌクレアーゼ活性から保護するために、その塩基の結合が非ホスホジエステル結合又はスペーサーの包含によって修飾されている、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記オリゴヌクレオチドは、特定の位置での加水分解から保護するために、その３’末端が修飾されている、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記オリゴヌクレオチドは、鎖置換活性を有するポリメラーゼの前記５’−３−ヌクレアーゼ活性を阻止するための修飾がされている、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記オリゴヌクレオチドは、前記伸長反応を阻止するために、その３’末端が修飾されている、請求項１７に記載の方法。
  24. ハイブリダイゼーションシステムは、重合反応の非存在下、少なくとも１回のハイブリダイゼーション／触媒反応で行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ハイブリダイゼーション／触媒反応は、システムの中で、リアルタイムでモニターされる、請求項２４に記載の方法。
  26. 試料中の核酸の配列を決定するキットであって、
    少なくとも、決定される前記核酸の配列に相補的な配列を含み、かつ、その３’末端に１つ又は複数の非相補的な塩基を有するオリゴヌクレオチドと、
    ３’−５’ヌクレアーゼ校正活性を有するポリメラーゼ酵素と、
    を少なくとも含む、キット。
  27. 前記核酸に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項２６に記載のキット。
  28. 前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端がブロックされている、請求項２６に記載のキット。
  29. 前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端がフッ化物レポーターで標識され、その５’末端がフッ化物クエンチャーで標識されている、請求項２６に記載のキット。
  30. デオキシヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のキット。
JP2008516346A 2005-06-16 2005-06-16 測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法 Pending JP2008543300A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/ES2005/070093 WO2006136621A1 (es) 2005-06-16 2005-06-16 Método de detección de ácidos nucleicos mediante generación directa de una señal medible

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2008543300A true JP2008543300A (ja) 2008-12-04

Family

ID=37570129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008516346A Pending JP2008543300A (ja) 2005-06-16 2005-06-16 測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7919244B2 (ja)
EP (1) EP1892302A1 (ja)
JP (1) JP2008543300A (ja)
AU (1) AU2005333512A1 (ja)
CA (1) CA2579918A1 (ja)
WO (1) WO2006136621A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010207160A (ja) * 2009-03-11 2010-09-24 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology Ｄｎａ３’末端の修飾基除去用酵素試薬

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010018245A1 (es) * 2008-08-12 2010-02-18 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Método para la detección y/o cuantificación de un ácido nucleico substrato
US20110136105A1 (en) * 2009-12-05 2011-06-09 Evogen, Inc. Methods of quantifying nucleic acids
JP5822843B2 (ja) * 2009-12-21 2015-11-24 シージーン アイエヌシー Ｔｓｇプライマーターゲット検出
KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2012-05-03 주식회사 씨젠 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
EP3544015A1 (en) 2012-02-03 2019-09-25 California Institute of Technology Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays
EP3901243A1 (en) 2012-08-03 2021-10-27 California Institute of Technology Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements
KR101403507B1 (ko) * 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
CN109642252A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 加州理工学院 核酸反应及相关方法和组合物
CN107254553A (zh) * 2017-06-30 2017-10-17 中国科学院上海巴斯德研究所 用于检测多种病原体的荧光实时检测方法及应用
CN107164565A (zh) * 2017-07-18 2017-09-15 张梦玲 一种用于以实时荧光rt‑pcr检测样品中hiv‑1病毒的引物对和包含其的试剂盒
MX2022001468A (es) 2019-08-09 2022-07-19 Nutcracker Therapeutics Inc Metodos y aparatos de fabricación para remover material de una composición terapeutica.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11313685A (ja) * 1997-12-15 1999-11-16 Centeon Pharma Gmbh 標的核酸の検出における標識プライマー
WO2002029085A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 Id+Plus Ltd Nucleotide detection method
JP2003530893A (ja) * 2000-04-25 2003-10-21 ディーエヌエー サイエンシーズ インコーポレーテッド ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるヌクレオチド配列変異の検出

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5639611A (en) * 1988-12-12 1997-06-17 City Of Hope Allele specific polymerase chain reaction
US5500363A (en) 1990-04-26 1996-03-19 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US5352778A (en) 1990-04-26 1994-10-04 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US5948663A (en) 1990-12-03 1999-09-07 Stratagene Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5874283A (en) * 1995-05-30 1999-02-23 John Joseph Harrington Mammalian flap-specific endonuclease
US20020061532A1 (en) * 1997-02-14 2002-05-23 Mosaic Technologies, Inc. Method and apparatus for performing amplification of nucleic acids on supports
US5846726A (en) 1997-05-13 1998-12-08 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
US20070134686A1 (en) * 1999-10-29 2007-06-14 Stratagene California Methods and compositions for detection of a target nucleic acid sequence utilizing a probe with a 3' flap
US7625705B2 (en) * 1999-10-29 2009-12-01 Hologic, Inc. Methods and compositions for detection of a target nucleic acid sequence utilizing a probe with a 3′ flap
US6528254B1 (en) * 1999-10-29 2003-03-04 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid sequence
WO2001079561A2 (en) * 2000-04-17 2001-10-25 Liggett Stephen B Alpha-2 adrenergic receptor polymorphisms
US6350580B1 (en) * 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
US20030003468A1 (en) * 2000-12-19 2003-01-02 Hospital For Special Surgery Markers for disease susceptibility and targets for therapy
WO2003043402A2 (en) * 2001-10-19 2003-05-30 Proligo Llc Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
CA2482767A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Joseph F. Lawler, Jr. Reagents for monitoring nuclei acid amplification and methods of using same
CN1506471A (zh) * 2002-12-09 2004-06-23 核酸检测方法
CA2606156C (en) * 2005-04-18 2013-01-08 Ryan Parr Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11313685A (ja) * 1997-12-15 1999-11-16 Centeon Pharma Gmbh 標的核酸の検出における標識プライマー
JP2003530893A (ja) * 2000-04-25 2003-10-21 ディーエヌエー サイエンシーズ インコーポレーテッド ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるヌクレオチド配列変異の検出
WO2002029085A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 Id+Plus Ltd Nucleotide detection method

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010207160A (ja) * 2009-03-11 2010-09-24 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology Ｄｎａ３’末端の修飾基除去用酵素試薬

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005333512A1 (en) 2006-12-28
US7919244B2 (en) 2011-04-05
CA2579918A1 (en) 2006-12-28
US20070292868A1 (en) 2007-12-20
EP1892302A1 (en) 2008-02-27
WO2006136621A1 (es) 2006-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2008543300A (ja) 測定可能なシグナルの直接生成を用いた核酸検出法
US7348141B2 (en) Hybridization beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
JP5878681B2 (ja) 核酸の検出を改善するための塩基修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の使用
US20110212846A1 (en) Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
KR101404130B1 (ko) Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
CN107849603A (zh) 利用有限核苷酸组成的引物扩增
AU2001242634A1 (en) Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
KR20170041897A (ko) 핵산 검정에서 개선된 용융 판별 및 멀티플렉싱을 위한 프로브
JP6144623B2 (ja) 核酸測定用の核酸プローブ
JP6126381B2 (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
US20100216123A1 (en) Method of detecting mutation and kit used in the same
KR102648647B1 (ko) 짧은 호모폴리머릭 반복서열의 개선된 검출법
JP7045702B2 (ja) リアルタイムで核酸を検出するための一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法
JP2008306935A (ja) 核酸の迅速な検出方法
KR102265417B1 (ko) 단일염기다형성 다중 분석용 프라이머
US20150247200A1 (en) Method for Detecting C-Met Gene Using Cleavable Probe
CN106068329B (zh) 一种通过实时聚合酶链反应检测突变基因的方法
JP2022516250A (ja) 固相モログラフィーによる標的核酸の検出
WO2019140211A9 (en) Reaction condition composition for circularizing oligonucleotide probes
JP6389473B2 (ja) 高解像能融解の較正の改善
EP4350002A1 (en) Nachweis von molekularen analyten auf der grundlage massgeschneiderter sondenkonkurrenz
AU2014100267A4 (en) Multiplexed KRAS mutation detection assay
BR112017007229B1 (pt) Primers de reação de cadeia de polimerase e sondas para mycobacterium tuberculosis
JP2002101900A (ja) ヒトにおけるアセチル抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット

Legal Events

Date Code Title Description
RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20110113

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20110114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110113

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110114

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110222

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20111004