JP5878681B2 - 核酸の検出を改善するための塩基修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の使用 - Google Patents
核酸の検出を改善するための塩基修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の使用 Download PDFInfo
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Description
本発明の態様は、概して、新規の改善された核酸検出法に関し、さらに詳細には、塩基修飾二重鎖安定化ヌクレオシド三リン酸の使用を含む、新規の改善されたPCRベース核酸検出法に関する。
この出願は、2006年4月28日に出願された米国仮特許出願第60/795,705号および2006年10月4日に出願された同第60/849,526号(これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
I.DNA検出技術。
s M.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9436−9440,1988)、それ故、PCRに最適な伸長温度を規定する。原則的に、そうした高温(例えば、75℃)でのPCRの実施は、幾つかの利点をもたらす。例えば、高温での伸長は、変性工程/段階(約95℃)とアニーリング/伸長工程/段階との温度ギャップ/差を20℃に減少させ、その結果、PCRサイクル中の昇温に関する時間を節約することができ、この節約時間は、特定のリアルタイムPCR機器(例えば、ABI 7700または7900、およびBio−Rad iCyclerTMなど)には有意であり得る。加えて、高温でのPCRは、より配列特異的である。なぜなら、低温では、誤増幅およびプライマー−二量体の形成が、増進/加速されるからである。しかし、そうした最適なTaq温度でPCRを行う利点に反して、70℃より高いアニーリング温度の使用は非常に稀であり、実施上の理由(例えば、プローブ/標的二重鎖安定性)から、プライマーアニー
リングに最も一般的に用いられる温度は、約56−58℃から約60−62℃の範囲であり、そしてどちらかと言えばアニーリング後に一般には追加の伸長段階(>72℃)を導
入して、その伸長工程/段階の効率を向上させる。残念なことに、追加の伸長段階(>72℃)の温度を上昇させることによってPCR反応のこの態様は向上するが、低いアニーリング温度への反応物の短時間の暴露でさえ、「ミスプライミング」およびプライマー−二量体形成を誘発し得る。それにもかかわらず、本質的に核酸またはDNAの構造的および熱力学的多様性にかんがみて、代表的なアニーリング範囲(約56−58から約60−62℃)は存続している。すなわち、A/Tリッチ二重鎖は、比較的高いG/C含有率を有する二重鎖より有意に安定性が劣り、およびより高いアニーリング温度を利用する反応条件は、先行技術の方法の範囲を有意に制限するであろう。例えば、図1に示す例示的なTmデータは、アニーリングと最適なTaq伸長との間の差に基づく効率に関する問題を示している。
Lee S.E.ら、Nucleic Acids Res.(2001)29:1565−1573 Held H.A.and Benner S.A、Nucleic Acids Res.(2002)30:3857−3869 Kuwahara M.ら、Nucleic Acids Res.Suppl.(2003)3:37−38
本発明の態様は、より安定な増幅産物に備えるために、本明細書に開示する塩基修飾デオキシヌクレオシド5’−三リン酸(dNTP)を使用する核酸増幅を含む、核酸の新規検出方法を提供する。
核酸ごとに提供される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの1つより多くが、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供され、修飾DNAの少なくとも1つは、その増幅に任意の段階において、該オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのためのテンプレートとしての役割を果たす。一定の態様において、標的核酸の検出は、増幅後に行われる。他の態様において、標的核酸の検出は、リアルタイムで行われる。一定の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化dNTPは、それぞれの天然dNTPを完全に置換する。他の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化dNTPは、それぞれの天然dNTPの画分を表す。一定の態様において、反応混合物は、それぞれの天然dNTPを置換する場合、またはそれぞれの天然dNTPの画分を表す場合、各々の場合の塩基修飾二重鎖安定化dNTPの1つより多くを含む。一定の態様において、塩基修飾二重鎖安定化dNTPは、下記式Iである:
本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
増幅および検出反応を含む、サンプル中の標的核酸の検出方法であって、該増幅および/または検出反応において使用されるオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性が、DNAポリメラーゼと少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPとを含む反応混合物中で、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAを増幅することによって改善される、方法。
(項目2)
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって:
標的核酸と、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPを含有するデオキシヌクレオシド5’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程;
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAのコピーが得られ、該修飾DNAが、該増幅の任意の段階において該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドのためのテンプレートとしての役割を果たす、工程;および
該修飾DNAを検出する工程であって、該修飾DNAの存在が、該サンプル中の標的核酸の存在の指標となる、工程;
を含む、方法。
(項目3)
前記標的核酸が、DNAである、請求項2に記載の方法。
(項目4)
前記標的核酸が、RNAである、請求項2に記載の方法。
(項目5)
前記標的核酸が、RNAであり、該標的核酸の増幅が、逆転写酵素を使用して該RNAの少なくとも1つのDNAコピーを合成する段階を含む、請求項2に記載の方法。
(項目6)
1つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸を増幅するために使用され、前記修飾DNAが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項2に記載の方法。
(項目7)
1つより多くの標的核酸を増幅および検出する、請求項2に記載の方法。
(項目8)
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および検出される標的核酸ごとに提供する、請求項7に記載の方法。
(項目9)
前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つより多くを、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供し、ならびに前記修飾DNAの少なくとも1つが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項7に記載の方法。
(項目10)
前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項2に記載の方法。
(項目11)
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項2に記載の方法。
(項目12)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを完全に置換する、請求項2に記載の方法。
(項目13)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPの画分を表す、請求項2に記載の方法。
(項目14)
前記反応混合物が、各々、それぞれの天然dNTPを置換するか、またはそれぞれの天然dNTPの画分を表す、前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPの1つより多くを含む、請求項2、12および13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、式I:
(項目16)
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項2に記載の方法。
(項目17)
前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅の使用を含む、請求項2に記載の方法。
(項目18)
前記標的核酸を増幅する工程が、検出PCRの使用を含む、請求項2に記載の方法。
(項目19)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが、標識を含有し、該標識を、前記修飾DNAの検出に使用する、請求項2に記載の方法。
(項目20)
前記標識が、蛍光標識である、請求項19に記載の方法。
(項目21)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが、構造修飾物を含有する、請求項2に記載の方法。
(項目22)
前記構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物である、請求項21に記載の方法。
(項目23)
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項22に記載の方法。
(項目24)
前記二重鎖安定化修飾物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端にコンジュゲートしたテールを含む、請求項22に記載の方法。
(項目25)
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項24に記載の方法。
(項目26)
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項24に記載の方法。
(項目27)
前記修飾DNAを検出する工程が、検出剤の使用を含み、該検出剤が、該修飾DNAと相互作用して検出シグナルをもたらし、該シグナルの検出が、前記反応混合物中の該修飾DNAの存在の指標となる、請求項2に記載の方法。
(項目28)
前記検出剤が、蛍光剤を含む、請求項27に記載の方法。
(項目29)
前記蛍光剤が、前記修飾DNAと相互作用してその蛍光特性を変化させ、それによって
、前記検出シグナルをもたらす、請求項28に記載の方法。
(項目30)
前記蛍光剤が、SYBR Green色素を含む、請求項29に記載の方法。
(項目31)
(i)少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTP、ならびに(ii)以下の成分:オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼおよび検出剤、のうちの少なくとも1つを含む、請求項2および27のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
(項目32)
サンプル中の標的核酸の検出方法であって:
標的核酸と、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPを含有するデオキシヌクレオシド5’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程;
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAのコピーが得られる、工程;
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程;
該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを該修飾DNAにハイブリダイズさせて、複合体を形成する工程;および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程;
を含む、方法。
(項目33)
前記標的核酸が、DNAである、請求項32に記載の方法。
(項目34)
前記標的核酸が、RNAである、請求項32に記載の方法。
(項目35)
前記標的核酸が、RNAであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該RNAの少なくとも1つのDNAコピーを合成する段階を含む、請求項32に記載の方法。
(項目36)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子の部分またはフラグメントである、請求項32に記載の方法。
(項目37)
1つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、少なくとも1つの前記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および/または検出される標的核酸ごとに提供する、請求項32に記載の方法。
(項目38)
1つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーおよび/または1つより多くのオリゴヌクレオチドプローブを、前記標的核酸を増幅および/または検出する工程において使用する、請求項32に記載の方法。
(項目39)
前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅反応の使用を含む、請求項32に記載の方法。
(項目40)
前記標的核酸を増幅する工程が、検出PCRの使用を含む、請求項32に記載の方法。(項目41)
前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項32に記載の方法。
(項目42)
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項32に記載の方法。
(項目43)
前記オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブまたは修飾核酸のうちの少なくとも1つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項32に記載の方法。
(項目44)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを完全に置換する、請求項32に記載の方法。
(項目45)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPの画分を表す、請求項32に記載の方法。
(項目46)
前記標的核酸を増幅する工程が、各々、それぞれの天然dNTPを置換するか、またはそれぞれの天然dNTPの画分を表す、1つより多くの塩基修飾二重鎖安定化dNTPの使用を含む、請求項32、44および45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、式I:
(項目48)
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項32に記載の方法。
(項目49)
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび/または修飾DNAのうちの少なくとも1つが、標識を含有し、該標識が、前記修飾DNAの検出を可能にする、請求項32に記載の方法。
(項目50)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブが、前記標識を含有する、請求項49に記載の方法。
(項目51)
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項50に記載の方法。
(項目52)
前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項51に記載の方法。
(項目53)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーもしくは前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブのいずれか、またはそれらの両方が、1つ以上の構造修飾物を
含有する、請求項32に記載の方法。
(項目54)
前記1つ以上の構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物を含む、請求項53に記載の方法。(項目55)
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項54に記載の方法。
(項目56)
前記二重鎖安定化修飾物が、二重鎖安定化テールを含む、請求項54に記載の方法。
(項目57)
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項56に記載の方法。
(項目58)
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項56に記載の方法。
(項目59)
前記オリゴヌクレオチドプローブが、FRETプローブであり、該FRETプローブが、前記修飾DNAと複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項32に記載の方法。
(項目60)
前記FRETプローブが、ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブを含む、請求項59に記載の方法。
(項目61)
前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、Scorpionプライマーである、請求項36および60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、Beaconプローブを含む、請求項60に記載の方法。
(項目63)
前記FRETプローブが、切断可能なFRETプローブを含む、請求項59に記載の方法。
(項目64)
前記切断可能なFRETプローブが、TaqManプローブを含む、請求項63に記載の方法。
(項目65)
前記検出PCRを、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、該オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸の指数関数的増幅をもたらすのに適する、請求項40に記載の方法。
(項目66)
前記検出PCRが、定量的PCRを含む、請求項40および65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPと、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよびDNAポリメラーゼから選択される成分の少なくとも1つとを含む、請求項32に記載の方法を行うためのキット。
(項目68)
サンプル中の標的核酸の検出方法であって:
標的核酸と、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすのに十分な少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPを含有するデオキシヌクレオシド5’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物中で検出PCRを用いて該標的核酸を増幅させる工程であって、該少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAのコピーが得られる、工程;
該修飾DNAにハイブリダイズさせて複合体を形成する少なくとも1つのオリゴヌクレ
オチドプローブを使用して、該修飾DNAを検出する工程;および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程;
を含む方法。
(項目69)
前記標的核酸が、DNAである、請求項68に記載の方法。
(項目70)
前記標的核酸が、RNAであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該RNAの少なくとも1つのDNAコピーを合成する段階を含む、請求項68に記載の方法。
(項目71)
前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子のフラグメントの部分である、請求項68に記載の方法。
(項目72)
1つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、前記ポリヌクレオチドプライマーの少なくとも2つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つを、標的核酸ごとに提供する、請求項68に記載の方法。
(項目73)
前記修飾DNAを検出する工程を、前記増幅の後に行う、請求項68に記載の方法。
(項目74)
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項68に記載の方法。
(項目75)
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび/または修飾DNAのうちの少なくとも1つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項68に記載の方法。
(項目76)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを完全に置換する、請求項68に記載の方法。
(項目77)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPの画分を表す、請求項68に記載の方法。
(項目78)
前記標的核酸を増幅する工程が、各々、それぞれの天然dNTPを置換するか、またはそれぞれの天然dNTPの画分を表す、1つより多くの塩基修飾二重鎖安定化dNTPの使用を含む、請求項68に記載の方法。
(項目79)
前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、式I:
(項目80)
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項68および74のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記オリゴヌクレオチドプローグが、標識を含有する、請求項68に記載の方法。
(項目82)
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項81に記載の方法。
(項目83)
前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項82に記載の方法。
(項目84)
前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方もしくは両方、または前記オリゴヌクレオチドプローブ、または該プライマー(単数もしくは複数)および該プローブの両方が、1つ以上の構造修飾物を含有する、請求項68に記載の方法。
(項目85)
前記1つ以上の構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物を含む、請求項84に記載の方法。(項目86)
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項85に記載の方法。
(項目87)
前記二重鎖安定化修飾物が、二重鎖安定化テールを含む、請求項85に記載の方法。
(項目88)
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項87に記載の方法。
(項目89)
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項87に記載の方法。
(項目90)
前記オリゴヌクレオチドプローブが、FRETプローブを含み、該FRETプローブが、前記修飾DNAと前記複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項68に記載の方法。
(項目91)
前記FRETプローブが、ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブを含む、請求項90に記載の方法。
(項目92)
前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、Scorpionプライマーを含む、請求項71および91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、beaconプローブを含む、請求項91に記載の方法。
(項目94)
前記FRETプローブが、切断可能なFRETプローブを含む、請求項90に記載の方法。
(項目95)
前記切断可能なFRETプローブが、TaqManプローブを含む、請求項94に記載の方法。
(項目96)
前記検出PCRが、定量的PCRを含む、請求項68および74のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPと、2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすように設計されるプライマー、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブおよび1つのDNAポリメラーゼから選択される成分の少なくとも1つとを含む、請求項68に記載の方法を行うためのキット。
本明細書において用いる場合、生化学、核酸化学、分子生物学および分子遺伝学の用語および記号は、当分野における標準的な取決めおよびテキスト、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory,1989);Kornberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,New York,1992);Gaits,ed.,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984);Lehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,New York,1975);Eckstein,ed.,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991)などに従う。加えて、本発明の理解を容易にするために、多数の用語を本明細書において定義する。
本発明の特定の態様は、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾核酸(例えば、DNA)の増幅および検出を含む、改善された核酸検出法に関する。好ましい態様において、修飾核酸(例えば、DNA)は、DNAポリメラーゼおよび塩基修飾二重鎖安定化dNTPの存在下でのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって生産および増幅される。本発明の態様は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブと修飾DNAとの複合体を安定化することにより、増幅もしくは検出段階または両方に恩恵をもたらす。
図5−11ならびに図5、6、9、10および11に例示するように、本発明は、核酸検出において使用するオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性を実質的に改善し、そしてまた、これにより、Taqのような熱安定性DNAポリメラーゼの動作に最適な72−75℃の範囲の温度までPCRのアニーリング温度を上昇させることができる。従って、好ましい態様において、これは、アニーリング段階と伸長段階との「合体」をもたらす。
)で完全に置換した、例示的な実験の結果を示す。図5Cにおける例示的な実験セットでは塩基修飾プライマーおよびプローブを使用したが、すべてのヌクレオシド三リン酸(dNTP)は天然であった。図5Dは、図5Bおよび図5Cの両方のシステム修飾を組み合わせ、同時に用いた、リアルタイムTaqMan(登録商標)アッセイを表す;すなわち、塩基修飾プライマーおよびプローブをdATPの完全d(2−amA)TP置換とともに用いた。
DNA検出技術。本発明の修飾DNAは、電気的力(例えば、電気泳動)、重力(例えば、沈降)、分光法(例えば、放射線分光法、UV、質量分析法、蛍光、化学発光、化学蛍光など)、吸着、磁性、クロマトグラフィ(HPLC、逆相、イオン交換、体積排除、など)、タンパク質との反応(制限酵素(restrictase)、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼおよび他の酵素活性)、結合親和性などをはじめとする(しかし、これらに限定されない)、任意の物理的、化学的または生物学的手段によって検出することができる。一定の実施形態において、修飾DNAは、増幅段階中または直後に標識され、その標識が修飾DNAの検出に利用される。有用な標識としては、同位体、放射性標識、例えば32P、結合部分、例えばビオチン、発光および質量タグ、リン光または蛍光部分、蛍光色素(単独で、またはFRET効果により発光スペクトルを抑制するまたはシフトさせることができる他の色素もしくは部分と併用で)が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明の修飾DNAは、増幅反応中(リアルタイム)または後に検出剤を使用して検出することができる。好ましい検出剤は、インターカレーティング色素および蛍光剤、例えば臭化エチジウムである。例えば、Wittwer
C.T.らにより米国特許第6,174,670号および同第6,569,627号に、ならびにHiguchi R.ら(1992)Biotechnology,10:413−417;Higuchi R.ら(1993)Biotechnology,11:1026−1030に記載されているインターカレーティング色素を使用して、PCRにおける増幅産物を検出することができる。好ましい蛍光剤は、核酸と相互作用するとその蛍光特性を変化させ、その結果、検出可能なシグナルをもたらす分子である。Schneeberger C.ら(1995)PCR Methods Appl.,4:234−238およびMackay J.,Landt O.(2007)Methods Mol.Biol.,353:237−262(これらは、本明細書に参照により組み込まれる)に記載されているように、InvitrogenからのSYBR Green IおよびIIは、好ましい蛍光剤である。
in Fluorescence Spectroscopy.Plenum Press,New York,V.2:53−126)。標的核酸とプローブとの配列特異的ハイブリッドの形成は、プローブの蛍光特性の変化をもたらし、それによって核酸標的を検出する。リアルタイムFRETベースのアッセイは、特に臨床診断に、よく適している。ここで留意すべき重要な要因は、上で論じているインターカレーティング色素および蛍光剤(例えば、臭化エチジウム、SYBR Green)の場合とは異なり、検出が配列特異的であり、事実上、偽陽性結果をなくす。FET効果を活用する多くの検出設計が今日までに報告されている。
DNAポリメラーゼ。DNAポリメラーゼは、本発明の核酸アッセイの実施における重要な成分である。本発明に従って有用なDNAポリメラーゼは、天然ポリメラーゼ、ならびに5’から3’のおよび/または3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ突然変異体の両方を含む。核酸ポリメラーゼは、異なる熱安定性度を有し得る。DNAポリメラーゼの選択は、本発明において適用される増幅および検出反応の選択に通常は関係する、多数の要因によって決定される。一定の実施形態において、DNAポリメラーゼは、好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長することができる温度で鎖置換活性を示す。DNA増幅が、DNA鎖の1本の置換に基づく等温増幅の多くの場合において、例えば、SDAおよびローリングサイクル型増幅において、好ましくは、DANポリメラーゼは、5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性を欠く。本発明のDNAポリメラーゼは、バクテリオファージ、古菌、真性細菌および真核生物の酵素をはじめとする様々な天然源から単離することができる。
Green、TaqManおよびMolecular Beacon検出システムでのリアルタイムアッセイの設計に有用である。一般に、オリゴヌクレオチドプローブのTm値は、対応する増幅プライマーのTmより5−7℃高い。
増幅および検出のための核酸の作製。本発明の特定の態様は、試験サンプル中の標的核酸の検出方法に関する。サンプルは、検出すべき核酸以外の、通常は生物学的性質の、材料を含有する、細胞、組織、流体、血漿、血清、尿、涙、便、唾液、異なる器官のフラグメント、組織、血球などであり得る。増幅および検出段階を行う前に、対象となる核酸を、一般に、サンプルから精製および単離する必要がある。好ましくは、標的核酸には、増幅および検出反応に干渉するタンパク質および任意の他の物質が十分にない。標的核酸の単離および精製には、市販のキットおよび専門機器を含む多数の方法を利用することができる。例えば、核酸は、フェノール/クロロホルム有機試薬での有機抽出、それに続くエタノール沈殿、固相吸着法、および塩誘導DNA沈殿法を用いて、単離することができる。核酸単離技術を行う際のガイダンスは、例えば、Ausubelら,eds.(1993)Current Protocols in Molecular Biology Vol.1,Chapter 2,Section I,John Wiley & Sons,New York;Walshら(1991)Biotechniques,10:506−513;Boomら、米国特許第5,234,809号;Millerら(1988)Nucleic Acids Res.,16:1215において見出すことができる。一般に、異なる源から単離される対象となる核酸の量を制限して、直接検出を可能にする。従って、適する増幅手順を用いてそれらの標的核酸を増幅する必要がある。
セイは、リアルタイム検出アッセイである。
Res.,34:e81e)、ならびに幾つかの検出技術がNASBA増幅と併用された(Niesters H.G.(2001)Methods,25:419−429)。PCRは、非常に互換性のある反応であり、多くのリアルタイムアッセイは、今日まで、この増幅システムに基づいて開発されおり、例えば、これは、本明細書において引用する非常に多数の特許および原稿に反映されている。本明細書において提供する実施例も、FRETプローブ検出反応、TaqManおよびScorpion技術を利用するリアルタイム検出PCRを例証する。
通常の当業者は、本発明に従って修飾DNAを増幅および検出する際に本発明が塩基修飾二重鎖安定化dNTPを使用することに驚かされることだろう。核酸検出アッセイの必要条件、特に、検出PCRの難しい時間および温度制約を満たすには、修飾dNTPの基質特性は、天然dNTPのものと厳密に一致する必要がある。dNTPの構造変化には、通常、DNAポリメラーゼとの相互作用に関するそれらの基質特性の負の変化が付随することは、当該技術分野において十分に確立されている(本明細書における「背景技術」参照)。例えば、修飾dNTPをあまり効率的に組み込むことができず、これは、核酸検出アッセイに許容されない程に増幅を遅速させる場合がある。さらに、DNAポリメラーゼは、特にPCRにおいて、2つの互いに異なる機会:(i)成長DNA鎖に修飾dNTPを組み込むとき、および(ii)前のサイクルにおいて生産された塩基修飾テンプレートを使用してWatson−Creek相補物を組み込むとき;に修飾塩基に直面する。Sawai H.ら(2002)Bioconjug.Chem.,13:309−316によって行われた研究によると、これら2つの機会における塩基修飾に対するDNAポリメラーゼの応答は異なることがある。修飾DNA内の二次構造要素の優先的安定化が、この件についてのさらに別の理由である。本発明の実施例において標的核酸として使用した96−mer標的オリゴデオキシリボヌクレオチドを含めて、事実上、いずれの、ランダムに取ったポリヌクレオチドも、そのポリヌクレオチド内の1つの配列とその同じポリヌクレオチドのさらに別の配列との「偶発的」相補性のため、二次構造の要素、例えば、バルジループ、内部ループ、ヘアピン、Y構造、非相同ループなどを構成する。本発明の修飾DNAでは、オリゴヌクレオチド成分(プライマーまたはプローブ)と(オリゴヌクレオチドが修飾されない場合の)1本の鎖しか修飾されない修飾DNAとで形成された複合体とは対照的に、二重鎖の両方の鎖に二重鎖安定化修飾物が組み込まれる。原核生物、ファージおよび真核生物からの幾つかのタイプのDNAポリメラーゼの進歩は、二次構造にフォールディングすると予測された、一定のDNA配列では妨げられる(例えば、LaDuca R.J.ら(1983)Biochemistry,22:5177−5188;Bedinger Pら(1989)J.Biol.Chem.,264:16880−16886;Bierne H.and Michel B.(1994) Mol.Microbiol.,13:17−23)。核酸における二次構造の安定化は、RNA検出の際に観察される一定の二重鎖安定化塩基修飾のマイナスの結果の原因であった(Nguyen A.ら(2002)BMC Biotechnology,2:14;Hacia J.G.ら(1998)Nucleic Acids Res.,26:4975−4982。このように、当該技術分野において認識されている増幅および検出反応の複雑さのため、核酸検出アッセイに対する、特に、検出PCRに対するいずれの修飾dNTPまたはそれらの組み合わせの効果も、本発明まで予測できなかったことは、当業者には理解されるであろう。
15−21およびProsnyak M.I.ら(1994)Genomics,21:490−494に記載されている修飾プライマーおよびプローブと、有効に併用できることを示している。塩基性修飾物を標的DNAに組み込もうと(図5B)、またはプライマーおよびプローブ構造に組み込もうと(図5C)、同様のシステム安定化が観察した。両方のアプローチの併用(図5D)は、安定なシステム動作が75℃ほども高い温度で観察された、未だかつてない累積効果をもたらした;非常に有意な功績。ここで使用したJumgStart DNAポリメラーゼ(Sigma)は、天然Taqポリメラーゼの抗体ブロックバージョンである。このポリメラーゼは熱安定性であり、PCR変性段階の高温に耐えて最大活性を発現し、約75℃で毎秒60を超えるヌクレオチドを組み込む(Takagi M.ら(1997)Appl.Environ.Microbiol,63:4504-4510;Innis M.A.ら(1988)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,85:9436−9440)。いずれの特定の理論による拘束も受けないが、70℃を超えるPCR温度を用いるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性に関して予想された急速な低下は、その最適な動作の温度範囲に入るTaqポリメラーゼ活性の増大によって十分に補償することができる。これは、65から75℃の広い温度範囲でのリアルタイム曲線の間に本質的に差がない理由の説明となり得る。実際、こうした高温でのPCRの実施は、多くの点で非常に有益であり得る。例えば、これは、温度上昇に関する時間を節約し、時間の節約は、ABI 7700または7900およびBio−Rad iCyclerのような一部のリアルタイム型機器には有意であり得る。高温でのPCRは、より配列特異性でもある。最適な温度でPCRを行うことの利点は明らかであるが、70℃より高いアニーリング温度の使用について出版物に掲載された報告は、非常に稀である。低温でのPCRの相対的な能率の悪さは当該技術分野において周知であり、一般には追加の伸長段階(>72℃)を導入してこの問題を解決している。しかし、低温への反応物の短い暴露であっても、「ミスプライミング」およびプライマー−二量体形成を誘発し得る。PCRにおいて低温を用いる主な理由は、DNAそれ自体および特にその構造的および熱力学的多様性である。A/Tリッチ二重鎖は、高いG/C含有率を有する二重鎖より有意に安定性が劣る。図3に示す例示的な二重鎖安定化dNTPは、いずれも、核酸検出アッセイにおいて本発明を実施する際に使用することができる。しかし、dATPおよびdTTPの塩基修飾類似体の使用が好ましい。これらの塩基修飾ヌクレオチドの増幅産物への組み込みは、A−T塩基対を安定させる。天然A−T塩基対のG−Cに対する相対的不安定性は、常に論点になっており、A−Tリッチ標的の一部を不確定なものにし、または増幅不能および従って検出不能にさえする。本発明は、この問題に有効な解決をもたらす。さらに、本発明の有効性は、検出される核酸の塩基組成に正比例する。標的配列のA/T含有率が高いほど、核酸検出アッセイにおいて本発明を適用して達成することができる恩恵が大きい。
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Claims (65)
- サンプル中の標的核酸の検出方法であって、
標的核酸と、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPを含有するデオキシヌクレオシド5’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程;
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPがDNAアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAのコピーが得られる、工程;
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供して、該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを該修飾DNAにハイブリダイズさせて、複合体を形成する工程;および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程;
を含む、方法。 - 前記標的核酸が、DNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、RNAであり、該標的核酸の増幅が、逆転写酵素を使用して該RNAの少なくとも1つのDNAコピーを合成する段階を含む、請求項1に記載の方法。
- 1つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸を増幅するために使用され、前記修飾DNAが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項1に記載の方法。
- 1つより多くの標的核酸を増幅および検出する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを、増幅および検出される標的核酸ごとに提供する、請求項5に記載の方
法。 - 前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つより多くを、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供し、ならびに前記修飾DNAの少なくとも1つが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項5に記載の方法。
- 前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを完全に置換する、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを部分的に置換する、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPの1つより多くを含み、該塩基修飾二重鎖安定化dNTPは各々、それぞれの天然dNTPを完全に、または部分的にのいずれかで置換する、請求項1、10および11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸を増幅する工程が、検出PCRの使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが、標識を含有し、該標識を、前記修飾DNAの検出に使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光標識である、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが、二重鎖安定化修飾物を含有し、該二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドおよび/または前記オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端にコンジュゲートしたテールのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記テールが、インターカレーターを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記修飾DNAを検出する工程が、検出剤の使用を含み、該検出剤が、該修飾DNAと相互作用して検出シグナルをもたらし、該シグナルの検出が、前記反応混合物中の該修飾DNAの存在の指標となる、請求項1に記載の方法。
- 前記検出剤が、蛍光剤を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記蛍光剤が、前記修飾DNAと相互作用してその蛍光特性を変化させ、それによって、前記検出シグナルをもたらす、請求項23に記載の方法。
- 前記蛍光剤が、SYBR Green色素を含む、請求項24に記載の方法。
- (i)少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTP、ならびに(ii)以下の成分:オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼおよび検出剤、のうちの少なくとも1つを含む、請求項1および22のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
- 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子の部分またはフラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 1つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、少なくとも1つの前記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および/または検出される標的核酸ごとに提供する、請求項1に記載の方法。
- 1つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーおよび/または1つより多くのオリゴヌクレオチドプローブを、前記標的核酸を増幅および/または検出する工程において使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブまたは修飾DNAのうちの少なくとも1つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび/または修飾DNAのうちの少なくとも1つが、標識を含有し、該標識が、前記修飾DNAの検出を可能にする、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブが、前記標識を含有する、請求項31に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光標識を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、FRETプローブであり、該FRETプローブが、前記修飾DNAと複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項1に記載の方法。
- 前記FRETプローブが、ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、Scorpionプライマーである、請求項27および35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FRETプローブが、切断可能なFRETプローブを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記検出PCRを、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、該オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸の指数関数的増幅をもたらす、請求項16に記載の方法。
- 前記検出PCRが、定量的PCRを含む、請求項38に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の検出方法であって:
標的核酸と、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすための少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPを含有するデオキシヌクレオシド5’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物中で検出PCRを用いて該標的核酸を増幅させる工程であって、該少なくとも1つの塩基修飾二重鎖安定化dNTPがDNAアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾DNAのコピーが得られる、工程;
該修飾DNAにハイブリダイズして複合体を形成する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを使用して、該修飾DNAを検出する工程;および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程;
を含む方法。 - 前記標的核酸が、DNAである、請求項40に記載の方法。
- 前記標的核酸が、RNAであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該RNAの少なくとも1つのDNAコピーを合成する段階を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子のフラグメントの部分である、請求項40に記載の方法。
- 1つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、前記ポリヌクレオチドプライマーの少なくとも2つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つを、標的核酸ごとに提供する、請求項40に記載の方法。
- 前記修飾DNAを検出する工程を、前記増幅の後に行う、請求項40に記載の方法。
- 前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項40に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび/または修飾
DNAのうちの少なくとも1つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項40に記載の方法。 - 前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを完全に置換する、請求項40に記載の方法。
- 前記塩基修飾二重鎖安定化dNTPが、それぞれの天然dNTPを部分的に置換する、請求項40に記載の方法。
- 前記標的核酸を増幅する工程が、1つより多くの塩基修飾二重鎖安定化dNTPの使用を含み、該塩基修飾二重鎖安定化dNTPは各々、それぞれの天然dNTPを完全にまたは部分的にのいずれかで置換する、請求項40に記載の方法。
- 前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項40および46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、標識を含有する、請求項40に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光標識を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方もしくは両方、または前記オリゴヌクレオチドプローブ、または該プライマーの1つもしくは複数と該プローブとの両方が、1つ以上の二重鎖安定化修飾物を含有し、該二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドおよび/または前記オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端にコンジュゲートしたテールのうちの少なくとも1つを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記テールが、インターカレーターを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、FRETプローブを含み、該FRETプローブが、前記修飾DNAと前記複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項40に記載の方法。
- 前記FRETプローブが、ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、Scorpionプライマーを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション誘発FRETプローブが、beaconプローブを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記FRETプローブが、切断可能なFRETプローブを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記切断可能なFRETプローブが、TaqManプローブを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記検出PCRが、定量的PCRを含む、請求項40および46のいずれか一項に記載の方法。
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