CN113358590B - 高效三足镁离子dna酶步行机及其在检测抗生素中的应用 - Google Patents

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Abstract

高效三足镁离子DNA酶步行机及其在检测抗生素中的应用，所述三足镁离子DNA酶步行机是由抗生素目标物适配体识别反应引起的三个在其两端含有镁离子DNA酶劈开碱基序列的功能发夹H1、H2和H3之间的催化发夹组装反应形成；本发明采用均相、无蛋白酶参与的反应体系很好避免了传统方法使用复杂的纳米材料来进行信号放大所面临的繁琐实验操作，也排除了蛋白酶与核酸或核酸副产物共存可能引起的假阳性信号干扰；本方法所构建的双模式信号转导策略，不仅可以通过裸眼简单直观的比色来实现快捷的半定量分析，还可以利用高灵敏的光电化学方法来进行目标物的准确定量，因而在复杂基质中抗生素残留的快速筛查与准确检测领域具有很好的应用价值。

Description

高效三足镁离子DNA酶步行机及其在检测抗生素中的应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，具体是高效三足镁离子DNA酶步行机及其在检测抗生素中的应用。
背景技术
抗生素作为一类保护人类和动物健康的重要药物，被广泛应用于医疗、农业、畜牧业和水产养殖业等领域。然而，近年来抗生素的滥用使得细菌的耐药性不断提高，从而导致抗生素抗性基因甚至“超级细菌”不断出现。此外，过量使用抗生素还会对人体免疫系统、组织器官造成一定程度的毒副作用甚至带来致癌、致畸的威胁。例如，作为一种稳定价廉的广谱抗生素，卡那霉素通常在畜牧业及家禽、水产养殖业中被人们广泛应用。这样，各种禽畜食品中的抗生素残留最终会通过食物链进入到人体，从而对人类带来听力减退、耳鸣等各种不同程度的毒副作用，甚至严重的神经和肾毒反应。因此，发展一种高灵敏、高选择性的分析方法来实现复杂基质中的抗生素残留准确检测对于食品质量保证、环境安全监测，以及保障人类健康都具有非常重要的意义。
与传统的色谱分析方法相比，以基于体外SELEX技术获取的高特异性核酸适配体构建的生物传感器不仅具有成本低廉、化学稳定性好，以及生物识别能力强等优良性能，而且还可以方便的用于发展各种均相分析方法来有效避免传统异相生物传感器操作繁琐的不足，因而在抗生素的方便低成本现场检测领域具有很好的应用前景。尽管人们已在抗生素均相生物传感方法研究领域开展了不少研究，但是如何发展合适的信号放大技术来实现其对低含量分析物的准确检测仍然是该领域面临的最大挑战。幸运的是，核酸适配体对目标分析物高特异性生物识别反应引起的核酸构象变化及其自组装反应为人们方便的将各种等温核酸扩增技术引入该领域提供了可能。一方面，核酸适配体生物识别反应暴露或释放的寡核苷酸链可用作一种有用的信号单元来结合各种核酸链扩增技术实现指数信号放大。更重要的是，核酸适配体特定的碱基序列、核酸结构及熵驱动自由能也使得人们可以设计各种循环放大机制来极大提高信号/目标物比，从而来实现其较传统策略更为有效的信号放大。基于不同的催化反应机制，等温核酸扩增技术可以分为酶扩增技术和无酶扩增技术两大类。然而其中基于蛋白酶催化活性构建的酶扩增生物传感器非常容易受到外部环境的干扰，同时一些蛋白酶分子与其他核酸或核酸副产物之间的共存还可能带来严重的交叉反应风险。为此，基于各种无蛋白酶的核酸扩增技术来构建性能优良的新型生物传感策略具有广泛的应用前景。其中，非酶扩增技术主要包括催化核酸(DNAzymes)催化辅助扩增和基于熵驱动的各种催化核酸组装反应（例如杂交链反应(HCR)、催化发夹自组装反应(CHA)等）。
值得注意的是，近年来这些无蛋白酶扩增技术也被广泛用作各种DNA步行机这一类新型分子机器的驱动力。通过目标物生物识别反应来诱导启动各种DNA步行机在其预设的轨道平台上的自动多次行走，可以很好的实现级联信号输出，因而使得DNA步行机被人们广泛当做一类新型信号放大技术应用于各种自动均相分析方法的构建中。然而，其相对较低的步行效率对其分析应用中信号放大效果的限制目前仍然是该领域面临的最大挑战之一。
发明内容
本发明的目的就是针对传统抗生素检测方法所面临的操作繁琐、分析成本较高，以及基于核酸适配体构建的均相生物传感方法通常需要使用蛋白质酶、DNA步行机在生物传感中信号放大效率不高等问题，提供一种高效三足镁离子DNA酶步行机，并将其应用于抗生素的比色和光电化学双模式检测中，该DNA步行机基于目标物识别作用引起的双重CHA反应组装而成，因而可有效增大DNA步行分子的局部浓度及其步行效率，从而可在采用三维步行轨道和多足DNA步行机的基础上为DNA步行机在生物传感中的信号放大能力增强提供了一种新型有效途径，在此基础上发展的双模抗生素检测方法具有操作简单、灵敏度和自动化程度高、线性范围宽、选择性和重复性好检测成本低廉等优良性能，可以广泛地应用于食品或环境等复杂介质中的抗生素残留的现场方便筛查和准确检测。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的高效三足镁离子DNA酶步行机，由抗生素目标物适配体识别反应引起的三个在其两端含有镁离子DNA酶(MNAzyme)劈开碱基序列的功能发夹H1、H2和H3之间的催化发夹组装(CHA)反应形成。与此同时，本发明所述的三足镁离子DNA酶步行机在探针发夹HP功能化磁珠平台上的自动化步行还可释放出另外一条“伪目标物”S1链来与H1、H2和H3进行另一个CHA反应形成相同的该三足镁离子DNA酶步行机。
本发明中所述发夹H1的碱基序列为5′-GAT ATC AGC GAT TGG AGT TGG GTG ATGCTG TGG GTG CAC CCA CTT CAC CAC CCA CTC GAT CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
本发明中所述发夹H2的碱基序列为5′-GAT ATC AGC GAT ATC GAG TGG GTG GTGAAG TGG GTG CAC CCA ACA ACC CAC CCA CAA GAC CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
本发明中所述发夹H3的碱基序列为5′-GAT ATC AGC GAT GTC TTG TGG GTG GGTTGT TGG GTG CAC CCA CAG CAT CAC CCA ACT CCA CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
本发明还提供了高效三足镁离子DNA酶步行机在检测抗生素中的应用。
优选地，本发明中所述抗生素为卡那霉素、氯霉素、四环素等。
本发明还提供了高效三足镁离子DNA酶步行机在检测卡那霉素中的应用，包括以下步骤：
（1）探针发夹HP序列与HP功能化磁珠（MB）步行平台的制备；
（2）均相生物识别引发CHA反应诱导HCR过程；
（3）双模式比色、光电化学检测标准溶液中的卡那霉素的含量；
（4）样品中卡那霉素含量的检测。
进一步地，本发明的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测卡那霉素中的应用，包括以下具体步骤：
（1）探针发夹HP序列与HP功能化磁珠平台的制备
取100 μL浓度为10 mg/mL均匀分散的羧基化磁珠于离心管中，用1 mL浓度为50mM pH=6.0的4-吗啡啉乙磺酸(MES)缓冲溶液磁分离洗涤三次后，将洗涤后的羧基化磁珠重新分散于1 mL含有浓度为20 mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20 mg/mL N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的50 mM pH=6.0的MES缓冲溶液的活化试剂中，并在25 oC下涡旋混匀反应30 min；将所得产物用含有0.05%（v/v） Triton X-100浓度为10 mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三遍后，再重新分散于950 μL的工作溶液中，并向其中加入50 μL浓度为20 μM发夹HP，所述发夹HP的碱基序列为5′-(CH2)6-NH2-TTT TTT TTTTGG AGT TTT GTG GTC TTA GAG TAT rAG GAT ATC CCA CAG CAT CAC CCA AAA CTC CA-3′，于25 oC涡旋混匀反应3 h后，再向其中加入500 μL含5% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的50mM pH=7.4 Tris-甘氨酸缓冲溶液的封闭剂，25 oC涡旋混匀反应60 min以充分封闭磁珠上多余活性位点，即得HP功能化磁珠；再将所得的HP功能化磁珠进行磁分离，用含有质量分数为0.05% Triton X-100的浓度为10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次后，再分散于1mL含0.1% BSA、100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（2）均相生物识别引发CHA反应诱导HCR过程
取11支PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11，向每支PV管中加入60 μL含有浓度为100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，并按编号由小到大向PV管中依次加入40 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.001pg/mL、0.01 pg/mL、0.05 pg/mL、0.1 pg/mL、1 pg/mL和0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、 1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中还含有100 mMNaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl，再向每份溶液中加入20 µL含有浓度为0.5 µM卡那霉素适配体发夹Apt的10 mM 含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl 的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述卡那霉素适配体发夹Apt的碱基序列为5′-CAC CCA CTG GAG TTC TGG TGAACC TGT ATT TCA TCA CCC AGA ACT CCA G-3′，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述每份溶液中分别加入20 µL步骤（1）中制备的HP功能化磁珠，以及含有20 µL 浓度为1 µM发夹H1、20 µL浓度为1 µM发夹H2、20 µL浓度为1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于200 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再向其中加入20 µL 浓度为2.5 µM发夹H4和20 µL 浓度为2.5 µM 发夹H5，所述发夹H4的碱基序列为5′-AGG GCG GGT GGG TCT TAG AGT TGG AGAATT GTA CTC TAA GAC CAC AAA ACT GGG T-3′，发夹H5的碱基序列为5′-TGG GTC AAT TCTCCA ACT CTA AGT GTT TTG TGG TCT TAG AGT TGG GTA GGG CGG G-3′，于37 oC涡旋混匀反应60 min后，继续向其中加入20 µL浓度为40 µM的氯化血红素于37 ℃涡旋混匀反应60min，反应产物再次用含有0.05 % Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（3）双模式比色、光电化学检测标准溶液中的卡那霉素的含量
取50 µL步骤（2）#1、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，分别向其中加入20 µL含有浓度为20 mM 2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；
取50 µL步骤（2）#1、#2、#3、#5、#6、#7、#8、#9、#10 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，对反应溶液进行磁分离后向其中加入50 µL含有1 mM 对苯酚(HQ)和1 mM H2O2的10mM pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液，于37 oC下反应25 min；将反应后的上清液转移到修饰了10µL 2 mg/mL BiOI与20 μL 0.4 wt %的壳聚糖(CS)的印刷电极(CS/BiOI/SPCE)上温育10min，用10 mM pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液仔细清洗电极后，取50 μL 0.1 M pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液于电极表面，在-0.1 V的施加电压下进行光电化学检测，以建立光电流与卡那霉素浓度之间的定量关系；
（4）样品中卡那霉素含量的检测
取处理后的样品溶液20 µL，加入30 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mMKCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl 缓冲溶液；再向其中加入10 µL 浓度为0.5 µM卡那霉素适配体发夹Apt溶液，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述溶液中分别加入10 µL步骤（1）中制备的HP功能化磁珠，以及含有10 µL 1 µM发夹H1、10 µL 1 µM发夹H2、10 µL 1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl、10 mMMgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120 min；将上述反应产物用含有0.05% TritonX-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再次向其中加入10 µL 2.5 µM发夹H4和10 µL 2.5 µM 发夹H5，37 oC涡旋混匀反应60 min后，继续向其中加入10 µL 40 µM的氯化血红素于37℃涡旋混匀反应60 min，反应产物再次用含有0.05%Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于180 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，向其中加入20 µL含有20 mM ABTS、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（3）中得到的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。
本发明的工作原理是：通过核酸碱基和核酸功能单元的设计，将抗生素卡那霉素适配体发夹Apt的径环区域的部分碱基设计为可以触发催化发夹自组装(CHA)反应的引物序列，利用Apt对抗生素的特异性识别使得其发夹DNA发生构象变化，暴露可以引发CHA的碱基序列；在引入末端均含有镁离子DNA酶(MNAzyme)催化核心劈开碱基序列的三个功能发夹H1、H2、H3后，通过CHA级联反应组装形成由三个复合发夹构成的三足镁离子DNA酶步行机。磁珠平台上组装的探针发夹HP的环部区域修饰有一个MNAzyme的识别位点(rA)以及用于识别MNAzyme的底物序列，同时其靠近5'末端的茎部区域被设计为杂交链反应(HCR)的引物序列，其靠近3'末端的茎部区域被设计为与Apt部分碱基相同的序列，以充当后续第二重CHA反应的触发剂。当三足镁离子DNA酶步行机特异性识别剪切修饰在磁珠上的探针发夹HP后，MNAzyme的酶促反应将引发磁珠中S1链的释放，使得三足镁离子DNA酶步行机在磁珠表面上行走，释放的S1链可作为第二重CHA反应的引发剂，组装形成更多的三足镁离子DNA酶步行机，增大三足镁离子DNA酶步行机的局部浓度，提高其步行效率，从而实现双重CHA级联放大策略，最终得到大量S2修饰磁珠。由于保留在磁珠上的S2片段可以触发含有1/4和3/4劈开G4链体序列的发夹H4、H5进行HCR，因而，在血红素和K+存在时，磁珠表面将组装形成含有大量G-四链体/血红素DNA酶(G4-DNAzyme)的DNA双链。基于均相反应生成定量的G4-DNAzyme的催化ABTS2-/H2O2体系的显色反应，实验首先利用紫外-可见吸收光谱法考查了不同浓度的卡那霉素的比色信号响应。此外，还借助于G4-DNAzyme的高灵敏催化底物反应，将HQ催化氧化生成定量的缺电子载体BQ，并利用光电电极平台SPCE/BiOI/壳聚糖上壳聚糖与BQ之间的席夫碱和迈克尔加成反应来定量捕获BQ，进而实现光电化学信号转导。由此即可成功实现该方法的比色和光电化学双模式信号转导，这样既可通过裸眼进行半定量分析，还可通过光电化学对卡那霉素进行准确定量。
本发明由待测目标物识别引起的双重CHA介导该三足镁离子酶DNA步行机的组装来有效提高其局部浓度和步行信号放大效率，从而实现待测目标物的准确测定。本发明所采用的核酸适配体不仅具有较传统抗体稳定性更好，成本更为低廉等优点，而且核酸适配体与卡那霉素分析物之间的特异性识别作用既可以很好保证该方法在复杂介质分析中的优良选择性，同时核酸生物识别作用引起的核酸结构变化还可为各种新型核酸信号放大技术的引入提供了新途径；目标物识别引发双重CHA介导的双重目标物循环，极大的提高了MNAzymes功能化三足镁离子DNA酶步行机的局部浓度和步行效率，此外三足镁离子DNA酶步行机的三维步行放大效果，以及HCR组装反应均可极大促进反应效率的提高和信号响应的增强；本方法采用均相、无蛋白酶参与的反应体系既很好避免了传统方法使用复杂的纳米材料来进行信号放大所面临的繁琐实验操作，也排除了蛋白酶与核酸或核酸副产物共存可能引起的假阳性信号干扰；此外，本方法所构建的双模式信号转导策略，不仅使其可以通过裸眼简单直观的比色来实现快捷的半定量分析，还可以利用高灵敏的光电化学方法来进行目标物的准确定量，因而在复杂基质中抗生素残留的快速筛查与准确检测领域具有很好的应用价值。
本发明构建的双模式生物传感方法可以方便、简单地用于抗生素残留快速筛查与准确定量分析，具有选择性好、灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优良性能，可在0.01 pg/mL~10 ng/mL浓度范围内实现对卡那霉素的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、成本较高、时间较长、重复性不好等缺陷。
附图说明
图1是本发明的检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测卡那霉素中的应用，包括以下步骤：
（1）探针发夹HP序列与HP功能化磁珠平台的制备
取100 μL浓度为10 mg/mL均匀分散的羧基化磁珠于离心管中，用1 mL浓度为50mM pH=6.0的4-吗啡啉乙磺酸(MES)缓冲溶液磁分离洗涤三次后，将洗涤后的羧基化磁珠重新分散于1 mL含有浓度为20 mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20 mg/mL N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的50 mM pH=6.0的MES缓冲溶液的活化试剂中，并在25 oC下涡旋混匀反应30 min；将所得产物用含有0.05%（v/v） Triton X-100浓度为10 mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三遍后，再重新分散于950 μL的工作溶液中，并向其中加入50 μL浓度为20 μM发夹HP，所述发夹HP的碱基序列为5′-(CH2)6-NH2-TTT TTT TTTTGG AGT TTT GTG GTC TTA GAG TAT rAG GAT ATC CCA CAG CAT CAC CCA AAA CTC CA-3′，于25 oC涡旋混匀反应3 h后，再向其中加入500 μL含5% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的50mM pH=7.4 Tris-甘氨酸缓冲溶液的封闭剂，25 oC涡旋混匀反应60 min以充分封闭磁珠上多余活性位点，即得HP功能化磁珠；再将所得的HP功能化磁珠进行磁分离，用含有质量分数为0.05% Triton X-100的浓度为10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次后，再分散于1mL含0.1% BSA、100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（2）均相生物识别引发CHA反应诱导HCR过程
取11支PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11，向每支PV管中加入60 μL含有浓度为100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，并按编号由小到大向PV管中依次加入40 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.001pg/mL、0.01 pg/mL、0.05 pg/mL、0.1 pg/mL、1 pg/mL和0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、 1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中还含有100 mMNaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl，再向每份溶液中加入20 µL含有浓度为0.5 µM卡那霉素适配体发夹Apt的10 mM 含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl 的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述卡那霉素适配体发夹Apt的碱基序列为5′-CAC CCA CTG GAG TTC TGG TGAACC TGT ATT TCA TCA CCC AGA ACT CCA G-3′，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述每份溶液中分别加入20 µL步骤（1）中制备的HP功能化磁珠，以及含有20 µL 浓度为1 µM发夹H1、20 µL浓度为1 µM发夹H2、20 µL浓度为1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于200 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再向其中加入20 µL 浓度为2.5 µM发夹H4和20 µL 浓度为2.5 µM 发夹H5，于37 oC涡旋混匀反应60min后，继续向其中加入20 µL浓度为40 µM的氯化血红素于37℃涡旋混匀反应60 min，反应产物再次用含有0.05 % Triton X-100的10 mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mMMgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
上述发夹H1、H2、H3、H4、H5的碱基序列分别为：
H1：5′-GAT ATC AGC GAT TGG AGT TGG GTG ATG CTG TGG GTG CAC CCA CTT CACCAC CCA CTC GAT CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
H2：5′-GAT ATC AGC GAT ATC GAG TGG GTG GTG AAG TGG GTG CAC CCA ACA ACCCAC CCA CAA GAC CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
H3：5′-GAT ATC AGC GAT GTC TTG TGG GTG GGT TGT TGG GTG CAC CCA CAG CATCAC CCA ACT CCA CAC CCA TGT TAC TCT-3′。
H4：5′-AGG GCG GGT GGG TCT TAG AGT TGG AGA ATT GTA CTC TAA GAC CAC AAAACT GGG T-3′。
H5：5′-TGG GTC AAT TCT CCA ACT CTA AGT GTT TTG TGG TCT TAG AGT TGG GTAGGG CGG G-3′。
（3）双模式比色、光电化学检测标准溶液中的卡那霉素的含量
取50 µL上述#1、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，分别向其中加入20 µL含有20 mM 2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系得到卡那霉素标准溶液的工作曲线，见下表1。
表1 卡那霉素标准溶液工作曲线
检测物 线性范围（ng/mL） 线性相关系数 检测限（fg/mL）
卡那霉素 0.0001~10 0.998 9.4
取50 µL上述#1、#2、#3、#5、#6、#7、#8、#9、#10 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，对反应溶液进行磁分离后向其中加入50 µL含有1 mM 对苯酚(HQ)和1 mM H2O2的10 mMpH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液，于37 oC下反应25 min；接着反应产物的上清液转移到修饰了10 µL 2 mg mL-1 BiOI与20 μL 0.4 wt %的壳聚糖(CS)的印刷电极(CS/BiOI/SPCE)上温育10 min，用10 mM pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液仔细清洗电极后，取50 μL 0.1 M pH=7.0Tris-HCl缓冲溶液于电极表面，在-0.1 V的施加电压下进行光电化学检测，以建立光电流与卡那霉素浓度之间的定量关系，得到卡那霉素标准溶液的工作曲线，见下表2。
表2 卡那霉素标准溶液工作曲线
检测物 线性范围（ng/mL） 线性相关系数 检测限（fg/mL）
卡那霉素 0.00001~1 0.993 0.55
从上表1和表2可以看出，两种分析方法的线性相关系数均大于0.99，说明两种方法的可行性良好。
实施例2 奶粉样品中卡那霉素含量的检测
根据实施例1得到的工作曲线，检测奶粉样品中卡那霉素的含量。称取市售的奶粉1 g溶解于5 mL 10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl、10mM MgCl2和10 mM KCl，取溶解后的奶粉溶液100 µL，向其中加入质量分数为20%的乙酸调节至pH=4.6，20 min后离心除去样品中凝固的蛋白质和脂肪，再用0.22 μm的滤膜过滤处理样品溶液，并将样品溶液重新调至pH=7.4；
取处理后的样品溶液20 µL，加入30 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mMKCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl 缓冲溶液；再向其中加入10 µL 0.5 µM 卡那霉素适配体发夹Apt溶液，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述溶液中分别加入10 µL步骤（1）中制备的HP功能磁珠，以及含有10 µL 1 µM发夹H1、10 µL 1 µM发夹H2、10 µL 1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mMKCl，于25 oC涡旋混匀反应120min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mMMgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再次向其中加入10 µL 2.5 µM发夹H4和10 µL 2.5 µM 发夹H5，37 oC涡旋混匀反应60min后，继续向其中加入10 µL 40 µM的氯化血红素于37 oC涡旋混匀下反应60 min，反应产物再次用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于180 µL含有100 mMNaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，向其中加入20 µL含有20 mM ABTS、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据上述工作曲线计算卡那霉素的含量。
检测结果表明，牛奶样品中无卡那霉素残留检出。继续向上述奶粉样品中加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表3。
表3 奶粉样品溶液的加标回收实验结果
序号 加入量（ng/mL） 平均回收量（ng/mL） RSD（%，n=5） 平均回收率（%）
1 0.1 0.1041 4.7 104.1
2 0.01 0.01043 4.8 104.3
3 0.001 0.00105 3.8 105.0
从上表3可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差(RSD)为3.8-4.8%，加标回收率104.1-105.0%，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。
实施例3 蜂蜜样品中卡那霉素含量的检测
根据实施例1得到的工作曲线，检测蜂蜜样品中卡那霉素的含量。称取市售的蜂蜜2 g溶解于4 mL 10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl、10mM MgCl2和10 mM KCl；再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液；取处理后的样品溶液20 µL，加入30 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl 缓冲溶液；再向其中加入10 µL 0.5 µM 卡那霉素适配体发夹Apt溶液，于37 oC涡旋混匀反应30min；接着向上述溶液中分别加入10 µL步骤（1）中制备的HP功能磁珠，以及含有10 µL 1 µM发夹H1、10 µL 1 µM发夹H2、10 µL 1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再次向其中加入10 µL 2.5 µM发夹H4和10 µL 2.5 µM 发夹H5，37oC涡旋混匀反应60 min后，继续向其中加入10 µL 40 µM的氯化血红素于37 oC涡旋混匀下反应60 min，反应产物再次用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于180 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，向其中加入20 µL含有20 mM ABTS、20 mM H2O2的10 mMpH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据上述工作曲线计算卡那霉素的含量。
检测结果表明，蜂蜜样品中无卡那霉素残留检出。继续向上述蜂蜜样品中加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表4。
表4 蜂蜜样品溶液的加标回收实验结果
序号 加入量（ng/mL） 平均回收量（ng/mL） RSD（%，n=5） 平均回收率（%）
1 0.1 0.0966 3.8 96.6
2 0.01 0.01032 4.4 103.2
3 0.001 0.00097 3.4 97.0
从上表3可以看出，本实施例3测试结果的相对标准偏差(RSD)为3.4-4.4%，加标回收率为96.6-103.2 %，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

Claims (5)

1.高效三足镁离子DNA酶步行机，其特征在于：是由抗生素目标物适配体识别反应引起的三个在其两端含有镁离子DNA酶劈开碱基序列的功能发夹H1、H2和H3之间的催化发夹组装反应形成；所述发夹H1的碱基序列为5′-GAT ATC AGC GAT TGG AGT TGG GTG ATG CTGTGG GTG CAC CCA CTT CAC CAC CCA CTC GAT CAC CCA TGT TAC TCT-3′，所述发夹H2的碱基序列为5′-GAT ATC AGC GAT ATC GAG TGG GTG GTG AAG TGG GTG CAC CCA ACA ACCCAC CCA CAA GAC CAC CCA TGT TAC TCT-3′，所述发夹H3的碱基序列为5′-GAT ATC AGCGAT GTC TTG TGG GTG GGT TGT TGG GTG CAC CCA CAG CAT CAC CCA ACT CCA CAC CCATGT TAC TCT-3′。
2.如权利要求1所述的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测抗生素中的应用。
3.如权利要求2所述的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测抗生素中的应用，其特征在于：所述抗生素为卡那霉素、氯霉素、四环素。
4.如权利要求2或3所述的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测卡那霉素中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）探针发夹HP序列与HP功能化磁珠步行平台的制备；
（2）均相生物识别引发CHA反应诱导HCR过程；
（3）双模式比色、光电化学检测标准溶液中的卡那霉素的含量；
（4）样品中卡那霉素含量的检测。
5.如权利要求4所述的高效三足镁离子DNA酶步行机在检测卡那霉素中的应用，其特征在于包括以下具体步骤：
（1）探针发夹HP序列与HP功能化磁珠平台的制备
取100 μL浓度为10 mg/mL均匀分散的羧基化磁珠于离心管中，用1 mL浓度为50 mM pH=6.0的4-吗啡啉乙磺酸缓冲溶液磁分离洗涤三次后，将洗涤后的羧基化磁珠重新分散于1mL含有浓度为20 mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和20 mg/mL N-羟基丁二酰亚胺的50 mM pH=6.0的MES缓冲溶液的活化试剂中，并在25 oC下涡旋混匀反应30min；将所得产物用含有0.05% v/v Triton X-100浓度为10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三遍后，再重新分散于950 μL的工作溶液中，并向其中加入50 μL浓度为20 μM发夹HP，所述发夹HP的碱基序列为5′-(CH2)6-NH2-TTT TTT TTT TGG AGT TTT GTG GTC TTAGAG TAT rAG GAT ATC CCA CAG CAT CAC CCA AAA CTC CA-3′，于25 oC涡旋混匀反应3 h后，再向其中加入500 μL含5% w/v牛血清白蛋白的50 mM pH=7.4 Tris-甘氨酸缓冲溶液的封闭剂，25 oC涡旋混匀反应60 min以充分封闭磁珠上多余活性位点，即得HP功能化磁珠；再将所得的HP功能化磁珠进行磁分离，用含有质量分数为0.05% Triton X-100的浓度为10mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次后，再分散于1 mL含0.1% BSA、100 mM NaCl、10 mMMgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（2）均相生物识别引发CHA反应诱导HCR过程
取11支PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11，向每支PV管中加入60 μL含有浓度为100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，并按编号由小到大向PV管中依次加入40 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.001 pg/mL、0.01 pg/mL、0.05 pg/mL、0.1 pg/mL、1 pg/mL和0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、 1 ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中还含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl，再向每份溶液中加入20 µL含有浓度为0.5 µM卡那霉素适配体发夹Apt的10 mM 含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl 的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述卡那霉素适配体发夹Apt的碱基序列为5′-CAC CCA CTG GAG TTC TGG TGA ACCTGT ATT TCA TCA CCC AGA ACT CCA G-3′，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述每份溶液中分别加入20 µL步骤（1）中制备的HP功能化磁珠，以及含有20 µL 浓度为1 µM发夹H1、20 µL浓度为1 µM发夹H2、20 µL浓度为1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mM NaCl，10 mM MgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于200 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再向其中加入20 µL 浓度为2.5 µM发夹H4和20 µL 浓度为2.5 µM 发夹H5，所述发夹H4的碱基序列为5′-AGG GCG GGT GGG TCT TAG AGT TGG AGAATT GTA CTC TAA GAC CAC AAA ACT GGG T-3′，发夹H5的碱基序列为5′-TGG GTC AAT TCTCCA ACT CTA AGT GTT TTG TGG TCT TAG AGT TGG GTA GGG CGG G-3′，于37 oC涡旋混匀反应60min后，继续向其中加入20 µL浓度为40 µM的氯化血红素于37℃涡旋混匀反应60min，反应产物再次用含有0.05 % Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（3）双模式比色、光电化学检测标准溶液中的卡那霉素的含量
取50 µL步骤（2）#1、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，分别向其中加入20 µL含有浓度为20 mM 2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；
取50 µL步骤（2）#1、#2、#3、#5、#6、#7、#8、#9、#10 PV管中的反应溶液于洁净的新PV管，对反应溶液进行磁分离后向其中加入50 µL含有1 mM 对苯酚和1 mM H2O2的10 mM pH=7.0Tris-HCl缓冲溶液，于37 oC下反应25 min；将反应后的上清液转移到修饰了10 µL 2 mg/mL BiOI与20 μL 0.4 wt %的壳聚糖的印刷电极上温育10 min，用10 mM pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液仔细清洗电极后，取50 μL 0.1 M pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液于电极表面，在-0.1V的施加电压下进行光电化学检测，以建立光电流与卡那霉素浓度之间的定量关系；
（4）样品中卡那霉素含量的检测
取处理后的样品溶液20 µL，加入30 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl 缓冲溶液；再向其中加入10 µL 浓度为0.5 µM卡那霉素适配体发夹Apt溶液，于37 oC涡旋混匀反应30 min；接着向上述溶液中分别加入10 µL步骤（1）中制备的HP功能化磁珠，以及含有10 µL浓度为 1 µM发夹H1、10 µL 浓度为1 µM发夹H2、10 µL 浓度为1 µM发夹H3的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液中含有100 mMNaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl，于25 oC涡旋混匀反应120 min；将上述反应产物用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于100 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；再次向其中加入10 µL 浓度为2.5 µM发夹H4和10 µL浓度为 2.5 µM 发夹H5，37 oC涡旋混匀反应60 min后，继续向其中加入10 µL 40 µM的氯化血红素于37℃涡旋混匀反应60min，反应产物再次用含有0.05% Triton X-100的10 mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液磁分离洗涤三次，并重新分散于180 µL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM KCl的10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，向其中加入20 µL含有20 mM ABTS、20 mM H2O2的10 mM pH 7.4Tris-HCl缓冲溶液的显色剂，于25 oC显色反应5 min；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（3）中得到的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。
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EP3282020A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-14 Technische Universität Braunschweig Method for amplifying signals from single molecules and system or kit therefore
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