CN109946293B

CN109946293B - 一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用

Info

Publication number: CN109946293B
Application number: CN201910345502.0A
Authority: CN
Inventors: 赖国松; 郭鹏
Original assignee: Hubei Normal University
Current assignee: Hubei Normal University
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: CN109946293A

Abstract

本发明公开了一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用，通过6条寡核苷酸链之间的DNA杂交反应分别构建两种Y型核酸限域体，进一步利用氯霉素核酸适配体与二者之间的杂交反应来抑制设计在两种Y型核酸限域体结构末端的类过氧化物DNA酶活性，由于氯霉素与其核酸适配体之间的特异性识别作用可引起上述DNA酶碱基序列的释放，进而结合氯化血红素形成DNA酶来实现其催化显色信号转导，以及显色产物吸光度与氯霉素分析物浓度之间的定量关系构建；本发明操作方便，成本低廉，选择性和灵敏度高，稳定性好，对于牛奶等复杂介质中氯霉素残留的快速检测具有很好应用价值。

Description

一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用。

背景技术

作为一种可用于有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌活性的广谱性抗生素，氯霉素（CAP）被广泛应用于抵御各种细菌引起的感染。虽然CAP在临床医学上具有十分重要的作用，但近年来它的滥用引起的抗生素残留污染对人类健康带来了极大威胁。例如，从食物或药物中摄入过量的CAP会使骨髓生长被抑制从而导致再生障碍性贫血和白血病等血液疾病的发生，同时还会损害肝脏、肾脏造成人体抵抗力下降，出现过敏感染等多种副作用。因此，世界上多个国家已经严令禁止在食用动物和动物源性食品中使用CAP，并对食品中的CAP残留提出了严格标准。例如，欧盟将包括肉类、牛奶、水产养殖产品和蜂蜜等在内的各种食品中的CAP最大允许限制设定为0.3ng/g，我国也规定在动物性食品中不得检出氯霉素。然而，低成本和高效的抗感染能力使得CAP至今依然在某些行业被非法使用，从而导致其在牛奶、肉和蜂蜜等动物产品中的积累并可能通过食物链积聚在人体内，对人类健康构成潜在威胁。为此，发展各种可用于食品等复杂基质中CAP残留准确检测的分析方法具有十分重要的意义。

目前，国家标准一般采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、酶联免疫吸附实验、毛细管电泳等分离分析方法来进行抗生素的检测，但是该方法仪器昂贵，检测成本及对操作人员的技术要求高，且一般只能在实验室中进行，很难满足实际应用中实时、现场检测的需要。为了有效解决这一问题，近年来人们先后将抗原（抗体）、DNA等生物识别作用与电化学、比色等分析方法相结合，发展了大量可用于抗生素快速、方便检测的生物分析或生物传感方法。其中，与酶联吸附免疫分析(ELISA)等免疫生物分析方法中所使用的各种抗体相比，核酸适配体由于具有稳定性更好、成本更为低廉、生物识别特异性更强等优良性质，因而将其用作一种“人工抗体”来发展各种抗生素生物分析或生物传感方法具有十分独特的优势。

尽管近年来人们已经在基于核酸适配体生物识别作用的抗生素分析方法研究方面开展了大量卓有成效的工作，但是这些方法一般都是基于固相基底上的异相分析模式而构建的，因而往往需要十分繁琐的界面修饰与核酸适配体固定，以及多步温育、分离和洗涤操作，因而不仅分析时间较长，操作繁琐，而且多步操作还会在一定程度上影响方法的重复性。因此，基于核酸适配体的高特异性生物识别作用发展一种操作简单、性能优良的氯霉素生物分析新方法，并将该方法应用于氯霉素的检测中具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是针对目前检测抗生素的方法所面临的操作繁琐、分析成本较高等问题，提供一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，该方法全部操作均通过在均相溶液中混匀反应而进行，操作方便，成本低廉，灵敏度和稳定性好，分析智能化程度高，因而对于食品等复杂介质中CAP残留的现场、快速检测具有很好的应用价值。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，包括以下步骤：

（1）制备核酸限域体复合物

依次将浓度为2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃单链DNA各10μL和10μL的氯霉素适配体（aptamer）加入至PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y1-aptamer 具有限域效应的核酸复合物；

与此同时，依次将浓度为2μM Y₂₁、Y₂₂和Y₂₃单链DNA各10μL加入至另一PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y2具有限域效应的核酸复合物；

再将上述两个PV管中的溶液混合，在37℃条件下充分混匀反应1h，从而形成Y1-aptamer-Y2核酸限域体复合物；

上述Y₁₁、Y₁₂、Y₁₃、Y₂₁、Y₂₂、Y₂₃单链DNA和氯霉素适配体的碱基系列分别为：

Y₁₁: 5’-GGA GCA GAC AAC GCC ACT CAT GTA GCA CCT ACC ACC GGG TAG GGCGGG TTG GG-3’；

Y₁₂: 5’-GTA GAT CAG AGT GTG CGT TGT CTG CTC CCT ACC ACC GGG TAG GGCGGG TTG GG-3’；

Y₁₃: 5’-GTG CTA CAT GAG TGA CAC TCT GAT CTA CCT ACC ACC GGG TAG GGCGGG TTG GG -3’；

Y₂₁: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTT TCA TCG ACA GATCCA GTC GCT GTC ATG-3’；

Y₂₂: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTC ATG ACA GCG ACTGTA CAG AAT CAT CTT-3’；

Y₂₃: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTA AGA TGA TTC TGTAGA TCT GTC GAT GAA-3’；

氯霉素适配体：5’-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G-3’；

（2）标准溶液中氯霉素含量的检测

取6份体积均为70µL的核酸限域体复合物溶液分别置于6支PV管中，分别向其中加入10μL浓度梯度为20nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM的氯霉素标准溶液，将反应液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，接着向每支PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin（氯化血红素）溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm~480nm波长范围内记录检测标准溶液的吸收光谱，并根据420nm波长处的吸光度大小来进行工作曲线的构建和标准溶液中CAP的定量分析；

（3）样品中氯霉素含量的检测

将样品进行前处理后，取处理后的样品溶液10µL置于PV管中，向其中加入70µL核酸限域体复合物溶液，将混合液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，再向PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，然后再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin（氯化血红素）溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1 h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm-480nm波长范围内记录检测溶液的吸收光谱，并根据其420nm波长处的吸光度大小和工作曲线来计算样品溶液中的CAP含量。

本发明还提供了一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法在检测样品中氯霉素含量中的应用。

本发明的工作原理是：首先通过碱基设计和DNA杂交反应构建两种Y型核酸限域体，其末端可与氯霉素核酸适配体部分杂交且含有类过氧化物DNA酶碱基序列；进而通过两种Y型核酸限域体与氯霉素核酸适配体之间的DNA杂交反应来制备一种交联核酸限域体复合物，以有效实现对类过氧化物DNA酶的活性抑制；当进行氯霉素靶向物分析时，氯霉素与其核酸适配体之间的高特异性生物识别即可引起上述交联核酸限域体复合物的解离以及Y型核酸结构末端的类过氧化物DNA酶碱基序列的相应释放，从而利用生成的DNA酶的催化显色反应来实现本方法的方便、灵敏比色信号转导，以及显色产物吸光度与氯霉素分析物浓度之间的定量关系构建。

本发明采用的核酸适配体不仅较传统抗体具有稳定性更好、成本更为低廉等优良性质，而且核酸适配体与氯霉素分析物之间更好的特异性识别作用可以很好保证该方法在复杂基质分析中的优良选择性；全部识别分析及都在均相溶液中通过核酸适配体的一步生物识别反应进行，因而操作十分简单，很好避免了传统生物分析及生物传感方法中复杂的界面修饰及多步异相分析操作对方法性能的影响；基于交联核酸限域体复合物中生物识别反应触发释放的大量DNA酶的催化显色反应来进行该方法比色信号转导策略构建，不仅简单方便，而且灵敏度较高，重复性和分析检测的智能化程度较高，因而较传统方法具有十分突出的性能优势和实用价值。

本发明构建的生物传感方法可以方便、简单地用于氯霉素抗生素含量的高选择性检测，具有信号转导简单直观、灵敏度较高、线性范围较宽、检测成本低廉等优良性能，可在20nM~1µM浓度范围内实现对氯霉素的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、分析成本较高、重复性不好等缺陷。

本发明的用于检测氯霉素的均相比色生物分析方法也可以用于检测其它抗生素，只需要根据其它抗生素的相关性质选择相应的核酸适配体，并设计相应DNA单链的碱基系列，即可实现其它抗生素的检测。

附图说明

图1是本发明的检测原理示意图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，包括以下步骤：

（1）制备核酸限域体复合物

依次将浓度为2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃单链DNA各10μL和10μL的氯霉素适配体（aptamer）加入至PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y1-aptamer具有限域效应的核酸复合物；

（2）标准溶液中氯霉素含量的检测

取6份体积均为70µL的核酸限域体复合物溶液分别置于6支PV管中，分别向其中加入10μL浓度梯度为20nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM的氯霉素标准溶液，将反应液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，接着向每支PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin（氯化血红素）溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的Hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm~480nm波长范围内记录检测溶液的吸收光谱，以建立在420nm波长处的吸光度与氯霉素（CAP）浓度之间的定量关系，得到氯霉素标准溶液的工作曲线，见下表1。

表1 氯霉素标准溶液工作曲线

检测物	线性范围（µM）	线性相关系数	检测限（µM）
				氯霉素	0.02-1	0.997	0.013

实施例2 奶粉样品中氯霉素含量的检测

称取市售的奶粉1g溶解于5mL浓度为20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，所述缓冲溶液中含有浓度为100mM的NaCl、浓度为2mM MgCl₂和浓度为5mM KCl，取溶解后的奶粉溶液100µL，向其中加入质量分数为20%的乙酸调节至pH=4.6，20min后离心除去样品中凝固的蛋白质和脂肪，再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液，并将样品溶液重新调至pH=7.4；取处理后的奶粉样品溶液10µL置于PV管中，向其中加入70µL核酸限域体复合物溶液，将混合液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，再向PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，然后再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin（氯化血红素）溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1 h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm-480nm波长范围内记录检测溶液的吸收光谱，根据实施例1得到标准溶液的工作曲线，检测奶粉样品中氯霉素的含量。

检测结果表明，牛奶样品中无氯霉素残留检出。继续向上述奶粉样品中加入不同浓度的氯霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表2。

表2 奶粉样品溶液的加标回收实验结果

序号	加入量（μM）	平均回收量（μM）	RSD（%，n=5）	平均回收率（%）
					1	0.04	0.037	5.6	92.5
2	0.1	0.095	4.8	95.0
					3	0.7	0.708	3.5	101.1

从上表2可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差（RSD）为3.5-5.6%，加标回收率92.5-101.1%，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

Claims

1.一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备核酸限域体复合物

依次将浓度为2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃单链DNA各10μL与10μL的氯霉素适配体加入至PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y1-aptamer具有限域效应的核酸复合物；

上述Y₁₁、Y₁₂、Y₁₃、Y₂₁、Y₂₂、Y₂₃单链DNA和氯霉素适配体的碱基系列为：

Y₁₁: 5’-GGA GCA GAC AAC GCC ACT CAT GTA GCA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG-3’；

Y₁₂: 5’-GTA GAT CAG AGT GTG CGT TGT CTG CTC CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG-3’；

Y₁₃: 5’-GTG CTA CAT GAG TGA CAC TCT GAT CTA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG -3’；

Y₂₁: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTT TCA TCG ACA GAT CCAGTC GCT GTC ATG-3’；

Y₂₂: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTC ATG ACA GCG ACT GTACAG AAT CAT CTT-3’；

Y₂₃: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTA AGA TGA TTC TGT AGATCT GTC GAT GAA-3’；

氯霉素适配体：5’-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G -3’；

（2）标准溶液中氯霉素含量的检测

取6份体积均为70µL的核酸限域体复合物溶液分别置于6支PV管中，分别向其中加入10μL浓度梯度为20nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM的氯霉素标准溶液，将反应液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，接着向每支PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的Hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm~480nm波长范围内记录检测标准溶液的吸收光谱，并根据420nm波长处的吸光度大小来进行工作曲线的构建和标准溶液中CAP的定量分析；

（3）样品中氯霉素含量的检测

将样品进行前处理后，取处理后的样品溶液10µL置于PV管中，向其中加入70µL核酸限域体复合物溶液，将混合液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，再向PV管中加入90μLpH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，然后再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1 h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外-可见分光光度计在390nm-480nm波长范围内记录检测溶液的吸收光谱，并根据其420nm波长处的吸光度大小和工作曲线来计算样品溶液中的CAP含量。

2.如权利要求1所述的一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法在检测样品中氯霉素含量中的应用。