CN105675598A - 一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及应用，首先采用尿素使牛血清白蛋白变性，然后采用1,4-二巯基苏糖醇还原剪切牛血清白蛋白得到含巯基的链状牛血清白蛋白，通过与氯化血红素交联制得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素骨架复合物，进而将其作为稳定剂和还原剂合成纳米金簇，并得到基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶，具有廉价、催化活性高、稳定好等优点，解决了血红素本身催化活性低、不溶于水、水溶液中易团聚、以及在氧化媒介中结构易被破坏等缺点,扩大了血红素的应用范围。可用于常见食品中H2O2含量的快速、高灵敏的检测，检测过程不涉及复杂光电仪器使用，简单易操作，可望在生物催化领域得到广泛的应用。
Description
技术领域
本发明属于酶催化与传感检测技术领域，涉及一种蛋白模拟酶的制备方法，具体涉及一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及其在常见食品中H2O2速测中的应用。
背景技术
蛋白酶作为一种高效、特异的生物催化剂，能催化机体内众多生物反应，并被广泛应用于功能催化和生物检测等领域。然而，天然蛋白酶也有诸多缺点，例如，易被降解、成本高、储存困难，特别是其活性易受外部环境条件（pH，温度和抑制剂等）影响而变性失活等。同时，常见蛋白酶（如过氧化氢酶、过氧化物酶、肌红蛋白和血红蛋白）的催化活性中心是血红素。近年来，研究人员致力于研发基于血红素的蛋白模拟酶，如细胞色素P450模拟酶和丝氨酸蛋白酶模拟物，其中，尤以过氧化物模拟酶因被应用于过氧化氢和葡萄糖等检测而引起了人们的广泛关注。
血红素本身作为一种铁卟啉能够通过催化H2O2氧化反应底物产生颜色变化，表现出了类过氧化物酶的活性；此外，它作为基于可逆的Fe(III)/Fe(II)氧化还原电对的电子给予体，对亚硝酸盐、氧气、氧化氮、L-酪氨酸、过氧化氢等小分子表现出很强的电催化性能。然而，将血红素直接应用于各种催化领域仍然面临很大的挑战：（1）血红素本身催化活性低且不溶于水；（2）水溶液中易聚集成活性很低的二聚体；（3）氧化性媒介中其结构易于被破坏而使催化活性减弱。为了解决这些问题，一些研究工作者尝试采用对血红素进行化学修饰或固定化以改良其催化性能，特别是，随着纳米制备技术的高速发展，纳米材料也被广泛用于改善蛋白酶及其模拟物的催化活性。例如，纳米金颗粒被用于修饰辣根过氧化物蛋白酶以提高其催化活性，但均收效甚微。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，通过模拟天然蛋白酶的结构和催化原理，提供了一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，制备出一种具有高催化活性的AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶。
同时，本发明还提供了上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（即AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶）的应用。
本发明技术方案如下：
一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，其特征在于：首先采用尿素使牛血清白蛋白（BSA）变性，然后采用1,4-二巯基苏糖醇（DTT）还原剪切牛血清白蛋白得到含巯基的链状牛血清白蛋白（dBSA），通过与氯化血红素（Hem）交联制得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素（dBSA-Hem）骨架复合物，进而将其作为稳定剂和还原剂合成纳米金簇（AuNCs），并得到基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶(即AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶)。
上述基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，步骤为：
1）室温下，将牛血清白蛋白（BSA）、尿素、EDTA和水混合，搅拌20min，得浓度分别为7-10mg/mL牛血清白蛋白、5-8M尿素和1.8-3.2mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇（DTT）至浓度为0.08-0.2mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白（dBSA）溶液，备用；
2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、氯化血红素和水混合，得浓度分别为90-120mM1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、70-100mMN-羟基琥珀酰亚胺和1.5-3.0mg/mL氯化血红素的混合液，20-25℃搅拌活化1h，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1:10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在35-40℃下搅拌1-3h，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素（dBSA-Hem）溶液；
3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与8-12mM的四氯金酸（HAuCl4）水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10min，然后加入1.0M的NaOH水溶液调节混合溶液pH值为10-12，并在37℃下继续搅拌8-10h，再用去离子水透析10-14h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
步骤1）中，所述的牛血清白蛋白、尿素、EDTA与1,4-二巯基苏糖醇的优选浓度依次为8.0mg/mL，6M，2.0mM，0.10mM；
步骤1）中，所述去离子水透析时间优选12h；
步骤2）中，所述的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与氯化血红素的优选浓度依次为100mM，80mM，2.0mg/mL；
步骤2）中，加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液后，搅拌温度优选37℃-，搅拌时间优选2h；
步骤2）中，所述去离子水透析时间优选12h；
步骤3）中，所述的四氯金酸水溶液优选10mM；
步骤3）中，所述的调节混合溶液pH值优选12。
步骤3）中，所述的37℃下继续搅拌时间优选8h。
步骤3）中，所述去离子水透析时间优选12h；
制备方法中，所述室温为20-25℃；所述的溶液如无特别说明，均为水配；所述的透析采用规格为14KDa的透析袋。
本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（即AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶）的应用：用于食品中H2O2含量的速测，测试方法为比色法或电分析法。所述的电分析法是利用生物相容性的壳聚糖将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶固定于电极表面，然后用于食品中H2O2含量的速测。
本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶，采用比色法对食品中H2O2含量的速测时，方法为：
1）建立标准曲线：室温条件下,将上述制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为10μL2.0μg/mL的水溶液，然后加入到200μL含0.69mMTMB的柠檬酸缓冲溶液中，然后分别加浓度梯度范围为0.0030-0.21mM的H2O2，静置20min，在波长652nm下分别测定吸光度值，建立浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程；
2）待测样品检测：将待测样品预处理得稀释液，将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，滴入到稀释液中进行显色反应，在波长652nm下测定吸光度值，然后结合浓度-吸光度标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度；
步骤1）中所述柠檬酸缓冲溶液，pH为7.40，浓度为0.1M。
本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶采用比色法速测食品中H2O2含量时，可测定的H2O2浓度范围为：3.0x10-6-2.1x10-4mol/L，检测限为1.0x10-6mol/L。
本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶，采用电分析法对食品中H2O2含量的速测时，方法为：
1）建立标准曲线：向浓度为1.0mM的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶水溶液中加入0.5wt%的壳聚糖，混合均匀配制为电极修饰液，取5μL电极修饰液滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；然后用pH7.4的PBS缓冲溶液，配制一系列浓度梯度的H2O2-PBS溶液，H2O2浓度范围在0.0020-0.22mM，采用线性扫描(CV)的方法，用修饰电极分别测定不同浓度H2O2-PBS溶液的响应电流，建立浓度-响应电流标准曲线，得标准曲线方程；
2）待测样品检测：
将待测样品预处理得稀释液，然后取0.1mL稀释液与5mLpH7.4的PBS缓冲溶液混合，得待测样品-PBS溶液；将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，取5μL滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；采用线性扫描(CV)的方法，用修饰电极测定待测样品-PBS溶液的响应电流，然后结合浓度-响应电流标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度。
本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶电分析法速测食品中H2O2含量时，可测定的H2O2浓度范围为：2.0x10-6-2.2x10-4mol/L,检测限为1.0x10-6mol/L。
上述比色法和电分析法中，步骤2）待测样品检测所述的待测样品：若为固体样品，清水浸泡前需超声细胞粉粹，在3倍体积的清水中浸泡24-28h，取浸泡上清液用清水稀释2-8倍，得稀释液；若为液体样品，则直接用清水稀释2-8倍，得稀释液。
本发明技术方案原理解释：
牛血清白蛋白(BSA)作为一类常见球蛋白,含有583个氨基酸残基，稳定性较好,常用作酶的稳定剂。本发明通过模拟天然蛋白酶的结构及其催化原理，首先，采用尿素使牛血清白蛋白（BSA）变性，进而采用1,4-二巯基苏糖醇还原剪切BSA得到含巯基的链状变性BSA（dBSA），通过与带羧基的血红素（Hem）交联制得dBSA-Hem骨架复合物；其次，将dBSA-Hem骨架复合物作为稳定剂和还原剂合成纳米金簇（AuNCs），制备具有类过氧化物酶催化活性的AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶。结果表明，由此形成的高导电能力的纳米金簇可接近或深入该蛋白模拟酶中Hem的催化活性中心，一方面，通过发挥纳米导线功能促进酶催化的电子传输能力；另一方面，极大地增强了AuNCsdBSA-Hem中Hem对底物的吸附能力；由此制得的AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶，其催化活性显著高于常见Hem（5倍以上），同时，将之固定于电极表面，呈现出极高的H2O2电催化性能。此外，采用该蛋白模拟酶实现了对常见食品中H2O2的高灵敏速测。
本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（AuNCsdBSA-Hem）的合成机理：BSA作为一类常见球蛋白含有583个氨基酸残基，其中35个半胱氨酸通过17个二硫键相连接；在尿素的作用下，BSA发生变性并暴露出35个半胱氨酸残基，在二巯基苏糖醇的还原剪切作用下，形成含巯基的链状BSA（dBSA）；经采用碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化Hem的羧基，使与带氨基的dBSA发生交联，形成dBSA-Hem骨架复合物，在碱性条件下加入HAuCl4后，dBSA上氨基酸残基（如巯基）与Au3+发生螯合作用，并将之还原形成金纳米簇，制得AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶。本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法过程示意图如图1所示。
本发明技术方案主要优点：
1）将dBSA与Hem交联，解决了血红素本身催化活性低、不溶于水、水溶液中易团聚、以及在氧化媒介中结构易被破坏等缺点,扩大了血红素的应用范围。
3）通过本发明方法制得的AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶，形成的高导电能力的纳米金簇可接近或深入该蛋白模拟酶中Hem的催化活性中心，发挥纳米导线功能促进酶催化的电子传输能力；并且，由于Au的引入极大地增强了AuNCsdBSA-Hem中Hem对底物的吸附能力，具有极高的催化性能。
4）通过本发明方法制得的AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶，具有廉价、催化活性高、稳定好等优点，可用于常见食品中H2O2含量的快速、高灵敏的检测，检测过程不涉及复杂光电仪器使用，简单易操作，可望在生物催化领域得到广泛的应用。
附图说明
图1为本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法过程示意图；
图2中A为不同材料的紫外吸收光谱表征图：(a)Hem、(b)AuNCsdBSA-Hem、(c)dBSA；B为催化TMB-H2O2反应产物的吸光度曲线图：(a)AuNCsdBSA-Hem、(b)Hem-AuNCs、(c)Hem；
图3中A为不同模拟酶催化双氧水的显色反应响应曲线比较：(a)AuNCsdBSA-Hem、(b)Hem-AuNCs、(c)Hem（其中：2.0μg/mLHem和0.69mMTMB）：B)为基于AuNCsdBSA-Hem的比色法测定H2O2的校正曲线（H2O2浓度范围0.0030-0.21mM，插图为对应显色反应产物的实物照片图）；
图4中A为不同模拟酶对H2O2的电催化响应曲线比较：（a）AuNCsdBSA-Hem、（b）Hem-AuNCs、（c）Hem（其中，1和2分别为加入H2O2前后的电流响应比较）；B为基于AuNCsdBSA-Hem的电分析法测定H2O2的校正曲线（H2O2浓度范围0.0020-0.22mM）；
图5为基于AuNCsdBSA-Hem的比色法测定样品中H2O2的浓度-吸光度标准曲线和标准曲线方程；
图6为基于AuNCsdBSA-Hem的电化学法测定样品中H2O2的浓度-响应电流标准曲线和标准曲线方程。
具体实施方式
通过结合具体实施例描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
实施例1
一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，步骤为：
1）室温下，将牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，搅拌20min，得浓度分别为8.0mg/mL牛血清白蛋白、6.0M尿素和2.0mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇至浓度为0.10mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析12h，得含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，备用；
2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、氯化血红素和水混合，得浓度分别为100mM1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、80mMN-羟基琥珀酰亚胺和2.0mg/mL氯化血红素的混合液，22℃搅拌活化1h，按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1：10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在37℃下搅拌2h，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析12h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液；
3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与10mM的四氯金酸水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10min，然后加入1.0M的NaOH水溶液调节混合溶液pH值为12，并在37℃下继续搅拌8h，再用去离子水透析12h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
实施例2
一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，步骤为：
1）室温下，将牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，搅拌20min，得浓度分别为7.0mg/mL牛血清白蛋白、5.0M尿素和1.8mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇至浓度为0.08mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析10h，得含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，备用；
2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、氯化血红素和水混合，得浓度分别为90mM1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、70mMN-羟基琥珀酰亚胺和1.5mg/mL氯化血红素的混合液，20℃搅拌活化1h，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1：10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在35℃下搅拌1h，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析10h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液；
3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与8mM的四氯金酸水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10min，然后加入1.0M的NaOH水溶液调节混合溶液pH值为10，并在37℃下继续搅拌8h，再用去离子水透析10h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
实施例3
一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，步骤为：
1）室温下，将牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，搅拌20min，得浓度分别为10.0mg/mL牛血清白蛋白、8.0M尿素和3.2mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇至浓度为0.20mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，备用；
2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、氯化血红素和水混合，得浓度分别为120mM1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、100mMN-羟基琥珀酰亚胺和3.0mg/mL氯化血红素的混合液，25℃搅拌活化1h，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1：10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在40℃下搅拌3h，再用规格为14KDa的透析袋在去离子水中透析14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液；
3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与12mM的四氯金酸水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10min，然后加入1.0M的NaOH水溶液调节混合溶液pH值为12，并在37℃下继续搅拌10h，再用去离子水透析14h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶蛋白模拟酶的表征、催化性能与H2O2检测性能考察：
样品选取实施例1制备的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（AuNCsdBSA-Hem）蛋白模拟酶。
（1）首先采用紫外吸收光谱表征了AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶，并将之与Hem和dBSA进行了比较，结果如图2A所示，可以看出397nm峰是Hem的特征吸收峰，280nm峰是BSA的特征吸收峰，dBSA-Hem与AuNCs重组后，在397和280nm处均有特征吸收峰，表明AuNCsdBSA-Hem模拟酶的形成。此外，合成的AuNCsdBSA-Hem产物在397nm处的吸收峰较Hem明显减弱且趋于平缓，表明生成的模拟酶产物不同于原来的血红素。
采用AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶催化TMB-H2O2反应，并将之与Hem-AuNCs和Hem的催化性能进行比较，结果如图2B所示。经过比较其反应产物的吸光度曲线，可以看出所合成的AuNCsdBSA-Hem的模拟酶的催化性能远远高于Hem-AuNCs和Hem。
（2）在最优实验条件下，首先，考察了AuNCsdBSA-Hem催化双氧水的显色反应响应性能，并与Hem-AuNCs和Hem进行了比较，结果如图3A所示。由图3A可知，在相同反应条件下AuNCsdBSA-Hem对不同浓度H2O2的响应灵敏度显著大于Hem-AuNCs和Hem。其主要原因是AuNCsdBSA-Hem中高导电能力的AuNCs可接近或深入该蛋白模拟酶中Hem的催化活性中心，并发挥纳米导线功能，从而促进了酶催化的电子传输能力；同时，AuNCs的引入增强了AuNCsdBSA-Hem中Hem对反应底物的吸附能力。其次，基于AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶的比色法测定H2O2的校正曲线如图3B所示，发现AuNCsdBSA-Hem测定不同浓度的H2O2的线性范围为：3.0x10-6-2.1x10-4mol/L,线性相关系数为0.9843，检测限为1.0x10-6mol/L。可见，采用AuNCsdBSA-Hem模拟酶的比色法具有优良的检测H2O2的性能。
（3）实验将AuNCsdBSA-Hem蛋白模拟酶通过壳聚糖包埋固定于电极表面，首先，考察了其对H2O2的电催化响应性能，并将之与Hem-AuNCs和Hem进行了比较，结果如图4A所示。由此可知，加入H2O2之前，AuNCsdBSA-Hem（a1）峰电流明显高于Hem-AuNCs（b1）和Hem（c1）,并且峰电位值明显低于后两者；同时，加入H2O2后，三个电极的还原峰电流均有一定程度提高，但其电流提高幅度以AuNCsdBSA-Hem为最大，并保持良好的峰型，表明AuNCsdBSA-Hem修饰的电极具有更好的电子传输能力和电催化H2O2的活性。其次，采用修饰了AuNCsdBSA-Hem的电极测定了不同浓度的H2O2，得到的电分析结果的校正曲线如图4B所示，发现其测定不同浓度的H2O2的线性范围为：2.0x10-6-2.2x10-4mol/L,线性相关系数为0.9966，检测限为1.0x10-6mol/L。可见，AuNCsdBSA-Hem模拟酶具有优良的电分析H2O2的性能。
采用本发明制备的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（AuNCsdBSA-Hem）蛋白模拟酶，对常见食品中过氧化氢含量的速测。
实施例4：肉制品中H2O2含量的速测
以市场随机选取的新鲜牛肚为例。在市场随机取样，选取某一大型商场内某品牌牛肚用超声细胞粉粹机进行制样，并分别采用比色法和电化学方法进行检测。
一、比色法对上述牛肚样品中H2O2含量速测，方法为：
1）建立标准曲线：室温条件下,将实施例1制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为10μL2.0μg/mL的水溶液，然后加入到200μL含0.69mMTMB的柠檬酸缓冲溶液（pH7.40、0.1M）中，然后分别加浓度为0.003mM、0.005mM、0.008mM、0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.05mM、0.1mM、0.14mM、0.18mM、0.21mM的H2O2，静置20min，在波长652nm下分别测定吸光度值，建立浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程（如图5）；
2）待测样品检测：将待测样品超声细胞粉粹后，在3倍体积的清水中浸泡25h，取浸泡上清液分别用清水稀释5倍，得稀释液；将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，滴入到稀释液中进行显色反应，在波长652nm下测定吸光度值，然后结合浓度-吸光度标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度。结果见表1。
加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论值。
二、电分析法对上述牛肚样品中H2O2含量速测，方法为：
1）建立标准曲线：向浓度为1.0mM的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶水溶液中加入0.5wt%的壳聚糖，混合均匀配制为电极修饰液，取5μL电极修饰液滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；然后用pH7.4的PBS缓冲溶液，配制一系列浓度梯度的H2O2-PBS溶液，H2O2浓度为10-4mM、4×10-4mM、8×10-4mM、0.002mM、0.008mM、0.04mM、0.08mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM，采用线性扫描(CV)的方法，用修饰电极分别测定不同浓度H2O2-PBS溶液的响应电流，建立浓度-响应电流标准曲线，得标准曲线方程（如图6）；
2）待测样品检测：
将待测样品超声细胞粉粹后，在3倍体积的清水中浸泡25h，取浸泡上清液用清水稀释5倍，得稀释液；然后取0.1mL稀释液与5mLpH7.4的PBS缓冲溶液混合，得待测样品-PBS溶液；将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，取5μL滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；采用线性扫描(CV)的方法，用修饰电极测定待测样品-PBS溶液的响应电流，然后结合浓度-响应电流标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度。结果见表2。
其它肉制品中过氧化物分析均按上述方法进行检测，结果如下表1和2：
表1比色分析法结果
表2电分析法结果
实施例5：乳制品中H2O2含量的速测
以新鲜常温奶为例。在超市中随机取奶制品，取适量用清水稀释5倍，得稀释液，并分别采用比色法和电化学方法进行检测，检测方法同实施例4。
结合标准曲线及方程（图5，图6）计算所含H2O2浓度。其它水发食品中过氧化物类浓度均按上述方法进行检测，获得的结果如下表3和4：
表3比色分析法结果
表4电分析法结果
实施例6：水发食品H2O2含量的速测
在市场随机取样，分别采用比色法和电化学方法进行检测。方法同实施例4，标准曲线和方程见图5、图6，其它水发食品中H2O2浓度均以上述方法进行检测，获得的结果如下表5和6：
表5比色分析法结果
表6电分析法结果
Claims (10)
1.一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，其特征在于：首先采用尿素使牛血清白蛋白变性，然后采用1,4-二巯基苏糖醇还原剪切牛血清白蛋白得到含巯基的链状牛血清白蛋白，通过与氯化血红素交联制得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素骨架复合物，进而将其作为稳定剂和还原剂合成纳米金簇，并得到基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
1）室温下，将牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，搅拌20min，得浓度分别为7-10mg/mL牛血清白蛋白、5-8M尿素和1.8-3.2mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇至浓度为0.08-0.2mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白液，备用；
2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、氯化血红素和水混合，得浓度分别为90-120mM1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、70-100mMN-羟基琥珀酰亚胺和1.5-3.0mg/mL氯化血红素的混合液，20-25℃搅拌活化1h，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1：10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在35-40℃下搅拌1-3h，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液；
3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与8-12mM的四氯金酸水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10min，然后加入1.0M的NaOH水溶液调节混合溶液pH值为10-12，并在37℃下继续搅拌8-10h，再用去离子水透析10-14h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的牛血清白蛋白、尿素、EDTA与1,4-二巯基苏糖醇的浓度依次为8.0mg/mL，6M，2.0mM，0.10mM。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与氯化血红素的浓度依次为100mM，80mM，2.0mg/mL；加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液后，搅拌温度为37℃-，搅拌时间为2h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述的四氯金酸水溶液为10mM；所述的调节混合溶液pH值为12；所述的37℃下继续搅拌时间为8h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1）、2）、3）中，所述去离子水透析时间为12h；所述室温为20-25℃；所述的溶液如无特别说明，均为水配；所述的透析采用规格为14KDa的透析袋。
7.上述1-6任一权利要求制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶的应用，其特征在于：用于食品中H2O2含量的速测，测试方法为比色法或电分析法。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的比色法方法为：
1）建立标准曲线：室温条件下,将上述制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为10μL2.0μg/mL的水溶液，然后加入到200μL含0.69mMTMB的柠檬酸缓冲溶液中，然后分别加浓度梯度范围为0.0030-0.21mM的H2O2，静置20min，在波长652nm下分别测定吸光度值，建立浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程；
2）待测样品检测：将待测样品预处理得稀释液，将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，滴入到稀释液中进行显色反应，在波长652nm下测定吸光度值，然后结合浓度-吸光度标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度；
步骤1）中所述柠檬酸缓冲溶液，pH为7.40，浓度为0.1M。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的电分析法方法为：
1）建立标准曲线：向浓度为1.0mM的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶水溶液中加入0.5wt%的壳聚糖，混合均匀配制为电极修饰液，取5μL电极修饰液滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；然后用pH7.4的PBS缓冲溶液，配制一系列浓度梯度的H2O2-PBS溶液，H2O2浓度范围在0.0020-0.22mM，采用线性扫描的方法，用修饰电极分别测定不同浓度H2O2-PBS溶液的响应电流，建立浓度-响应电流标准曲线，得标准曲线方程；
2）待测样品检测：将待测样品预处理得稀释液，然后取0.1mL稀释液与5mLpH7.4的PBS缓冲溶液混合，得待测样品-PBS溶液；将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0μg/mL的水溶液，取5μL滴加到已清洗干净的玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极；采用线性扫描的方法，用修饰电极测定待测样品-PBS溶液的响应电流，然后结合浓度-响应电流标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：步骤2）待测样品检测所述的待测样品：若为固体样品，清水浸泡前需超声细胞粉粹，在3倍体积的清水中浸泡24-28h，取浸泡上清液用清水稀释2-8倍，得稀释液；若为液体样品，则直接用清水稀释2-8倍，得稀释液。
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