CN112029828B - 一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法及其应用，通过在目标分析物Kana核酸适配体S1的5’末端修饰Zn2+连接核酸酶碱基序列并将其活性抑制在发夹结构中，利用S1对Kana的特异性识别使得发夹DNA发生构象变化；引入互补链S2杂交后，利用核酸外切酶III的催化反应实现目标分析物循环同时释放Zn2+连接核酸酶后用于催化连接L1和3’端磷酸咪唑功能化L2形成Linker；该Linker可通过核酸杂交反应引起两条互补DNA链功能化金纳米粒子的聚集反应，并伴随着吸光度信号降低与卡那霉素分析物浓度之间的定量关系；本发明的分析方法操作方便，成本低廉，灵敏度高，重复性和稳定性好，具有很好的应用价值。

Description

一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法及其应用。
背景技术
近年来，抗生素在医疗、畜牧业等相关领域中的滥用引起的其较为严重的残留污染问题越来越受到人们广泛关注。包括我国在内的不少国家和地区，不仅在一些蜂蜜、禽肉制品、乳制品等食品中，甚至在一些河流、湖泊等环境水体中都出现了明显的抗生素残留超标现象。这些抗生素残留可通过食物链在人体中的富集对人类健康造成极大威胁。例如，卡那霉素是一种的氨基糖苷类高效广谱抗生素，主要用于多数革兰阴性菌和部分耐药金黄色葡萄球菌所引起的呼吸道、泌尿道感染和败血症、乳腺炎等，内服用于肠道感染如鸡白痢、伤寒、副伤寒、禽霍乱、畜禽大肠杆菌病等，对鸡慢性呼吸道病、猪喘气病及萎缩性鼻炎，对鳖红脖子病及名特优水产品疾病等亦有一定效果。然而，卡那霉素有效治疗量与中毒量界限较为接近，长期、大量使用不仅可以引起听力减退、耳鸣、神经接头处兴奋传导阻滞，甚至还会产生肾毒反应和药物过敏等严重的毒副作用及耐药性。因此，包括我国在内的许多国家和地区都对食物和环境介质中的卡那霉素等抗生素残留提出了严格的限制标准。
在过去的几十年里，广大科研工作者已经围绕抗生素检测方法研究开展了不少卓有成效的工作。其中，以气相色谱法、高效液相色谱法等分离分析方法在此领域应用最为广泛。然而，这些方法不仅需要十分昂贵的仪器，分析成本较高，而且一般只能在实验室中进行，很难满足实际应用中的实时、现场检测需要。与之相比，基于抗体等特异性生物识别作用与各种光、电化学信号检测技术发展起来的生物传感器由于操作简单，无需大型仪器，选择性较好，样品消耗和分析成本较低，因而具有很好的性能优势和发展前景。尽管近年来人们已经在各种抗生素光、电生物传感方法研究方面开展了不少工作，但是它们多数都是基于固相基底上的多步修饰与异相分析而构建的，不仅需要繁琐的多步温育、分离和洗涤操作，甚至还要结合各种复杂的纳米材料信号放大作用来提高其分析灵敏度，同时多步操作还会在一定程度上影响方法的重复性和分析效率，提高分析成本，十分不利于其广泛使用。因此，发展一种操作简单，且具有灵敏度高、准确性好、成本低廉等优良性能的抗生素生物传感新方法对于实现食品或水体等复杂介质中的抗生素残留现场快速筛查具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是针对目前卡那霉素等抗生素的检测方法存在操作繁琐、分析效率低、分析成本较高等问题，提供一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法，该方法具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优点，可以广泛地应用于食品或水体等复杂介质中的抗生素残留现场快速筛查。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一种检测卡那霉素(Kana)的均相比色生物分析方法，包括以下步骤：
(1)DNA链的预处理
取6个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5和#6，向#1、#2、#5PV管中各加入190μL浓度为20mM pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液；
接着向#1PV管中加入10μL浓度为20μM含有Zn2+连接核酸酶碱基序列的Kana核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-ACC TCA AGA CCT TTC GCT AGA TGT CCA AGTGGT CTT GAG GTT CTG-3’；
再向#2PV管中加入10μL浓度为20μM与核酸适配体S1部分互补配对序列S2，所述S2的碱基序列为5’-CAG AAC CTG ACA TCT AGT TTT-3’；
再向#3PV管中加入10μL浓度为80μM 3’-末端含有15个A碱基的DNA探针A1，所述DNA探针A1的碱基序列为5’-CGT CCA AGA TTT TTA AAA AAA AAA AAA AA -3’；
再向#4PV管中加入10μL浓度为80μM 5’-末端含有15个A碱基的DNA探针A2，所述DNA探针A2的碱基序列为5’-AAA AAA AAA AAA AAA TTT TTA AGA CCC GCT C-3’；
再向#5PV管中加入10μL浓度为20μM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1，所述底物链L1的碱基序列为5’-GGG TCT TGA ACC C-3’；
最后向#6PV管中加入80μL浓度为100μM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L2，所述底物链L2的碱基序列为5’-TCT TGG ACA AGC-PO4-3’；
将#1PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液S1；再将#2、#3、#4、#5和#6PV管中的溶液均加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S2、A1、A2、L1和L2溶液待用；
再向#6PV管中加入20μL 50mM pH＝6.0含有0.5M咪唑和0.5M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲溶液，室温活化2h后向其中加入10μL 3M醋酸钠和200μL乙醇溶液以在底物链L2的3’端接上咪唑官能团形成Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2，将所得产物离心分离，弃去上层清液后用20mM pH＝7.0Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次，重新分散于800μL 20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液中，于-20℃保存待用；
(2)功能化金纳米粒子的制备
取2支PV管并分别编号为#7、#8，向每个PV管中加入1.0mL浓度为13mM金纳米粒子(Au NPs)，离心弃去上层清液后重新分散于装有1.0mL浓度为20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液和质量分数为0.5％吐温-20的混合溶液中，用浓度为0.1M K2CO3调至pH＝8；
再分别向#7和#8PV管中加入10μL步骤(1)#3和#4PV管中迅速降温的浓度为80μM底物链A1和A2，室温缓慢搅拌反应12h之后，分别往#7和#8PV管中逐滴加入浓度为1.0M NaCl溶液，直到PV管中最终NaCl浓度为0.1M，每次加入NaCl溶液的时间间隔大于0.5h；再于37℃条件下继续涡旋反应24h以促进#7PV管中Au NP/A1(GNP1)和#8PV管中Au NP/A2(GNP2)的形成；最后，于10000rpm转速条件下离心15min弃去上层清液，将收集所得到的GNP1和GNP2产物用浓度为20mM pH＝7.0的HEPES缓冲液反复离心洗涤三次后分散至1mL含有质量分数为0.5％BSA、100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液中，于4℃保存待用。
(3)均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量
取7支PV管，向每支PV管中加入45μL含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液；接着向每支PV管中加入经步骤(1)退火处理后的10μL 1μM发夹DNA溶液S1、10μL 1μM单链DNA溶液S2、10μL 1μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10μL1μM作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5μL 4U/μL核酸外切酶III，再向每个PV管中分别加入10μL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL和10ng/mL 20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液，于37℃涡旋混匀反应150min；再向每个PV管中加入50μL GNP1和50μL GNP2后，于37℃涡旋混匀反应60min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与Kana浓度之间的定量关系。
(4)样品中卡那霉素含量的检测
取处理后的样品溶液10μL，加入45μL含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液；接着往其中加入经步骤(1)退火处理后的10μL 1μM发夹DNA溶液S1、10μL 1μM单链DNA溶液S2、10μL 1μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10μL 1μM作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5μL 4U/μL核酸外切酶III，于37℃涡旋混匀反应150min；再向每个PV管中加入50μL GNP1和50μL GNP2后，于37℃涡旋混匀反应60min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤(2)中得到的吸光度与Kana浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。
本发明还提供了一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法在检测样品中卡那霉素含量中的应用。
本发明的工作原理是：通过碱基设计，在目标分析物Kana核酸适配体S1的5’末端修饰了Zn2+连接核酸酶碱基序列并将其活性抑制在发夹结构中，利用S1对Kana的特异性识别使得发夹DNA发生构象变化，形成S1/Kana复合物；在引入互补链S2杂交之后，S1/Kana和S2发生部分互补配对形成含有平末端结构的S1/Kana/S2复合物，通过核酸外切酶III的催化目标分析物循环来提高方法的灵敏度的同时释放出Zn2+连接核酸酶。此时，释放的Zn2+连接核酸酶可同时捕获底物链L1和作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2并在Zn2+辅助作用下催化连接L1和作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2形成一段新的连接DNA(Linker)。基于核酸链置换作用，Linker可通过与DNA链A1和A2之间的杂交作用来连接两种金纳米粒子，使其从分散状态转变为聚集状态并引起金纳米粒子吸光度信号的降低。此外，链置换反应释放出来的Zn2+连接核酸酶可以进一步参与同L1和作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2的杂交循环反应，实现该方法的比色信号放大及分析灵敏度提高。基于该Kana高特异性核酸适配体识别，以及核酸外切酶III酶催化目标物循环及其释放的Zn2+连接核酸酶催化引起的链置换反应的双重信号放大作用构建的上述金纳米粒子聚集反应显色体系，即可成功建立均相检测产物吸光度信号与卡那霉素分析物浓度之间的定量关系。
本发明所采用的核酸适配体不仅具有较传统抗体稳定性更好，成本更为低廉等优点，而且核酸适配体与卡那霉素分析物之间的特异性识别作用可以很好保证该方法在复杂介质分析中的优良选择性；核酸外切酶III催化底物循环和Zn2+连接核酸酶催化引起的链置换反应的信号放大作用不仅有效保证了该方法较高的分析灵敏度，而且很好避免了传统方法使用复杂的纳米材料来进行信号放大所面临的操作繁琐且容易引起非特异性吸附信号干扰的弊端；更重要的是，基于碱基设计的全部生物识别及核酸和核酸酶信号放大反应都在均相溶液中一步混匀进行，操作十分方便，自动化程度高，完全排除了非均质生物测定中繁琐的多步操作和较高的实验技术要求，比色信号检测不仅简单直观，不需要昂贵的信号标记和大型仪器，而且具有很好的重复性，因而较传统方法具有十分突出的性能优势，在食品、水体等复杂介质中卡那霉素残留的现场、快速检测领域具有很好的应用价值。
本发明构建的生物传感方法可以方便、简单地用于卡那霉素含量的高选择性检测，具有灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优良性能，可在0.1pg/mL～10ng/mL浓度范围内实现对卡那霉素的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、成本较高、时间较长、重复性不好等缺陷。
附图说明
图1是本发明的检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法，包括以下步骤：
(1)DNA链的预处理
取6个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5和#6，向#1、#2、#5PV管中各加入190μL浓度为20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液；
接着向#1 PV管中加入10μL浓度为20μM含有Zn2+连接核酸酶碱基序列的Kana核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-ACC TCA AGA CCT TTC GCT AGA TGT CCAAGT GGT CTT GAG GTT CTG-3’；
再向#2 PV管中加入10μL浓度为20μM与核酸适配体S1部分互补配对序列S2，所述S2的碱基序列为5’-CAG AAC CTG ACA TCT AGT TTT-3’；
再向#3 PV管中加入10μL浓度为80μM 3’-末端含有15个A碱基的DNA探针A1，所述DNA探针A1的碱基序列为5’-CGT CCA AGA TTT TTA AAA AAAAAA AAA AA-3’；
再向#4 PV管中加入10μL浓度为80μM 5’-末端含有15个A碱基的DNA探针A2，所述DNA探针A2的碱基序列为5’-AAA AAA AAA AAA AAA TTT TTA AGA CCC GCT C-3’；
再向#5 PV管中加入10μL浓度为20μM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1，所述底物链L1的碱基序列为5’-GGG TCT TGA ACC C-3’；
最后向#6 PV管中加入80μL浓度为100μM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L2，所述底物链L2的碱基序列为5’-TCT TGG ACA AGC-PO4-3’；
将#1 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液S1；再将#2、#3、#4、#5和#6PV管中的溶液均加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S2、A1、A2、L1和L2溶液待用；
再向#6 PV管中加入20μL 50mM pH＝6.0含有0.5M咪唑和0.5M EDC的MES缓冲溶液，室温活化2h后向其中加入10μL 3M醋酸钠和200μL乙醇溶液以在底物链L2的3’端接上咪唑官能团形成Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2，将所得产物离心分离，弃去上层清液后用20mM pH＝7.0Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次，重新分散于800μL 20mMpH＝7.4HEPES缓冲溶液中，于-20℃保存待用；
(2)功能化金纳米粒子的制备
取2支PV管并分别编号为#7、#8，向每个PV管中加入1.0mL浓度为13mM金纳米粒子(Au NPs)，离心弃去上层清液后重新分散于装有1.0mL浓度为20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液和质量分数为0.5％吐温-20的混合溶液中，用浓度为0.1M K2CO3调至pH＝8；
再分别向#7和#8 PV管中加入10μL步骤(1)#3和#4 PV管中迅速降温的浓度为80μM底物链A1和A2，室温缓慢搅拌反应12h之后，分别往#7和#8 PV管中逐滴加入浓度为1.0MNaCl溶液，直到PV管中最终NaCl浓度为0.1M，每次加入NaCl溶液的时间间隔大于0.5h；再于37℃条件下继续涡旋反应24h以促进#7 PV管中Au NP/A1(GNP1)和#8 PV管中Au NP/A2(GNP2)的形成；最后，于10000rpm转速条件下离心15min弃去上层清液，将收集所得到的GNP1和GNP2产物用浓度为20mM pH＝7.0的HEPES缓冲液反复离心洗涤三次后分散至1mL含有质量分数为0.5％BSA、100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液中，于4℃保存待用。
(3)均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量
取7支PV管，向每支PV管中加入45μL含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液；接着向每支PV管中加入经步骤(1)退火处理后的10μL 1μM发夹DNA溶液S1、10μL 1μM单链DNA溶液S2、10μL 1μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10μL1μM作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5μL 4U/μL核酸外切酶III，再向每个PV管中分别加入10μL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL和10ng/mL 20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液，于37℃涡旋混匀反应150min；再向每个PV管中加入50μL GNP1和50μL GNP2后，于37℃涡旋混匀反应60min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与Kana浓度之间的定量关系，以建立吸光度与Kana浓度之间的定量关系，得到卡那霉素标准溶液的工作曲线，见下表1。
表1卡那霉素标准溶液工作曲线
检测物 线性范围(ng/mL) 线性相关系数 检测限(fg/mL)
卡那霉素 0.0001～10 0.999 8.5
实施例2奶粉样品中卡那霉素含量的检测
根据实施例1得到的工作曲线，检测奶粉样品中卡那霉素的含量。称取市售的奶粉1g溶解于5mL浓度为20mM pH＝7.4HEPES缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100mM NaCl，10mMMgCl2和1mM ZnCl2，取溶解后的奶粉溶液100μL，向其中加入质量分数为20％的乙酸调节至pH＝4.6，20min后离心除去样品中凝固的蛋白质和脂肪，再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液，并将样品溶液重新调至pH＝7.4；
取处理后的样品溶液10μL，加入45μL含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液。接着往其中加入经步骤(1)退火处理后的10μL 1μM发夹DNA溶液S1、10μL 1μM单链DNA溶液S2、10μL 1μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10μL 1μM作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5μL 4U/μL核酸外切酶III，于37℃涡旋混匀反应150min；接着向每个PV管中加入50μL GNP1和50μL GNP2后，于37℃涡旋混匀反应60min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据上述工作曲线计算卡那霉素的含量。
检测结果表明，牛奶样品中无卡那霉素残留检出。继续向上述奶粉样品中加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表2。
表2奶粉样品溶液的加标回收实验结果
序号 加入量(ng/mL) 平均回收量(ng/mL) RSD(％，n＝5) 平均回收率(％)
1 5 5.01 4.1 100.2
2 0.5 0.489 2.9 97.8
3 0.05 0.0.0494 2.6 98.7
4 0.005 0.00503 3.9 100.6
5 0.0005 0.0005025 4.7 100.5
从上表2可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差(RSD)为2.6-4.7％，加标回收率为97.8-100.6％，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。
实施例3蜂蜜样品中卡那霉素含量的检测
根据实施例1得到的工作曲线，检测蜂蜜样品中卡那霉素的含量。称取市售的蜂蜜2g溶解于4mL浓度为20mM pH＝7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2；再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液；取过滤后的样品溶液10μL，加入45μL含有100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM ZnCl2的20mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液。接着往其中加入经步骤(1)退火处理后的10μL 1μM发夹DNA溶液S1、10μL 1μM单链DNA溶液S2、10μL 1μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10μL 1μM作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5μL 4U/μL核酸外切酶III，于37℃涡旋混匀反应150min；接着向每个PV管中加入50μL GNP1和50μL GNP2后，于37℃涡旋混匀反应60min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据上述工作曲线计算卡那霉素的含量。
检测结果表明，蜂蜜样品中无卡那霉素残留检出。继续向上述蜂蜜样品中加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表3。
表3蜂蜜样品溶液的加标回收实验结果
序号 加入量(ng/mL) 平均回收量(ng/mL) RSD(％，n＝5) 平均回收率(％)
1 5 5.23 2.9 104.5
2 0.5 0.484 4.2 96.7
3 0.05 0.0.0489 3.6 97.9
4 0.005 0.00499 4.7 99.9
5 0.0005 0.0005065 4.9 1.013
从上表3可以看出，本实施例3测试结果的相对标准偏差(RSD)为2.9-4.9％，加标回收率为96.7-104.5％，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

Claims (2)

1.一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）DNA链的预处理
取6个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5和#6，向#1、#2、#5 PV管中各加入190 µL浓度为20 mM pH=7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；
再向#1 PV管中加入10 µL浓度为20 µM含有Zn2+连接核酸酶碱基序列的卡那霉素核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’ - ACC TCA AGA CCT TTC GCT AGA TGT CCAAGT GGT CTT GAG GTT CTG - 3’；
再向#2 PV管中加入10 µL浓度为20 µM与核酸适配体S1部分互补配对序列S2，所述S2的碱基序列为5’ - CAG AAC CTG ACA TCT AGT TTT - 3’；
再向#3 PV管中加入10 µL浓度为80 µM 3’-末端含有15个A碱基的DNA探针A1，所述DNA探针A1的碱基序列为5’ - CGT CCA AGA TTT TTA AAA AAA AAA AAA AA - 3’；
再向#4 PV管中加入10 µL浓度为80 µM 5’-末端含有15个A碱基的DNA探针A2，所述DNA探针A2的碱基序列为5’ - AAA AAA AAA AAA AAA TTT TTA AGA CCC GCT C - 3’；
再向#5 PV管中加入10 µL浓度为20 µM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1，所述底物链L1的碱基序列为5’ - GGG TCT TGA ACC C - 3’；
最后向#6 PV管中加入80 µL浓度为100 µM的Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L2，所述底物链L2的碱基序列为5’ - TCT TGG ACA AGC -PO4 - 3’；
将#1 PV管中的溶液加热至95 oC，保持5 min后缓慢降温2 h至室温，得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液S1；再将#2、#3、#4、#5和#6 PV管中的溶液均加热至95 oC，保持5 min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S2、A1、A2、L1和L2溶液待用；
再向#6 PV管中加入20 μL 50 mM pH= 6.0含有0.5 M咪唑和0.5 M 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物缓冲溶液，室温活化2 h后向其中加入10 μL 3 M醋酸钠和200 μL乙醇溶液以在底物链L2的3’端接上咪唑官能团形成Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2，将所得产物离心分离，弃去上层清液后用20 mM pH=7.0 Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次，重新分散于800 μL 20 mM pH=7.4 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中，于-20 oC保存待用；
（2）功能化金纳米粒子的制备
取2支PV管并分别编号为#7、#8，向每个PV管中加入1.0 mL 浓度为13 mM 金纳米粒子(Au NPs)，离心弃去上层清液后重新分散于装有1.0 mL 浓度为20 mM pH=7.4 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液和质量分数为0.5 % 吐温-20的混合溶液中，用浓度为0.1 M K2CO3调至pH=8；
再分别向#7和#8 PV管中加入10 μL步骤（1）中#3和#4 PV管中迅速降温的浓度为80 µM底物链A1和A2，室温缓慢搅拌反应12 h之后，分别往#7和#8 PV管中逐滴加入浓度为1.0 MNaCl溶液，直到PV管中最终NaCl浓度为0.1 M，每次加入NaCl溶液的时间间隔大于0.5 h；再于37 oC条件下继续涡旋反应24 h以促进#7 PV管中Au NP/A1和#8 PV管中Au NP/A2的形成；最后，于10000 rpm转速条件下离心15 min弃去上层清液，将收集所得到的GNP1和GNP2产物用浓度为20 mM pH=7.0 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液反复离心洗涤三次后分散至1 mL含有质量分数为0.5 % BSA、100 mM NaCl、10 mM MgCl2和1 mM ZnCl2的20 mM pH=7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中，于4 oC保存待用；
（3）均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量
取7支PV管，向每支PV管中加入45 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和1 mM ZnCl2的20mM pH=7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；接着向每支PV管中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 1 μM发夹DNA溶液S1、10 μL 1 μM单链DNA溶液S2、10 μL 1 μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10 μL 1 μM 作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5µL 4U/µL核酸外切酶III，再向每个PV管中分别加入10 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.0001 ng/mL、0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL和10 ng/mL 20mM pH=7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，于37 oC涡旋混匀反应150 min；再向每个PV管中加入50µL GNP1和50 µL GNP2后，于37 oC涡旋混匀反应60 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；
（4）样品中卡那霉素含量的检测
取处理后的样品溶液10 µL，加入45 μL含有100 mM NaCl、10 mM MgCl2和1 mM ZnCl2的20 mM pH=7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；接着往其中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 1 μM发夹DNA溶液S1、10 μL 1 μM单链DNA溶液S2、10 μL 1 μM Zn2+连接核酸酶的1/2底物链L1、10 μL 1 μM 作为Zn2+连接核酸酶1/2底物链的3’端磷酸咪唑功能化的L2和5 µL4U/µL核酸外切酶III，于37 oC涡旋混匀反应150 min；再向每个PV管中加入50 µL GNP1和50 µL GNP2后，于37oC涡旋混匀反应60 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（2）中得到的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。
2.如权利要求1所述的一种检测卡那霉素的均相比色生物分析方法在检测样品中卡那霉素含量中的应用。
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