CN106198695A - 一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器，所述电化学适配体传感器是适配体与纳米复合物上的银纳米粒子通过银硫键固定在玻碳电极上组装而成，样品中的氯霉素被定量捕捉到传感器表面，在纳米复合物的催化作用下产生电信号；本发明的电化学适配体传感器具有灵敏度高、响应快、操作简便、成本低廉，选择性好，对推广适配体传感器在医药分析、食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及电分析化学检测技术领域，具体是一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器。
背景技术
氯霉素是一种高效广谱抗生素。氯霉素对许多需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、厌氧的拟杆菌、立克次氏体、衣原体及菌质体都有抑制作用，尤其对沙门氏菌属、流感杆菌和拟杆菌属等有良好的抗菌能力，被广泛用于动物各种传染性疾病的治疗。但由于氯霉素有严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，此外，长期微量摄入氯霉素不仅会使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，同时也会使机体内的正常菌群失调，使人们感染各种疾病。目前，由于氯霉素在食用动物中残留，因而可通过食物链在人体内积累，研究表明，氯霉素的污染和残留对人体是一种强力致癌物质。因此，许多国家和地区相继禁止或严格限制食用氯霉素，我国也规定在动物性食品中不得检出氯霉素。
迄今为止，检测氯霉素的方法有很多，如气相色谱法，高效液相色谱法，化学发光法和电分析化学方法等等。然而，气相色谱和高效液相色谱等方法仪器昂贵，检测成本高；传统电分析化学方法在测试样品时，具有相似的化学结构的物质容易产生电化学信号干扰；而免疫分析方法面临的制备抗体的高成本、耗时长、稳定性差等缺陷，也在一定程度上限制了其广泛应用。
核酸适配体是通过SELEX技术从人工合成的DNA/RNA文库中进行体外筛选得到的能与目标分子高亲和力高特异性的结合的单链寡核苷酸。核酸适配体作为一种新型的分子识别元件，由于其相对于抗体而言具有花费少、稳定性好、选择性高等特点，因而在药物分析、生物传感、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。
由于基于化学修饰电极构建的电化学传感器具有其独特的优势，如成本低廉，灵敏度高，方便实用，操作简单等，特别是纳米材料修饰电极优良的电催化性能可极大改善电化学传感器的电化学性能和伏安响应。因此，将纳米材料的电催化作用与适配体的特异性识别作用相结合发展一种用于检测氯霉素的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是针对目前检测氯霉素的方法成本高、耗时长、稳定性差等问题，提供一种快速检测样品中氯霉素含量的电化学适配体传感器。该电化学适配体传感器操作简便，成本低廉，灵敏度高，稳定性好，响应时间短。
本发明所述的氯霉素适配体含有ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAGTCG GTG GTA G碱基序列，且5’端修饰了5’-SH-(CH2)6。
本发明所述的一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器含有本发明所述的氯霉素适配体。
本发明所述的电化学适配体传感器是适配体与纳米复合物上的银纳米粒子通过银硫键固定在玻碳电极上组装而成，所述纳米复合物是由聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）功能化的还原石墨烯表面静电组装银纳米粒子制成，氯霉素被定量捕捉到传感器表面，在纳米复合物的催化作用下产生电信号。
本发明的一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
①聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）的制备
（1）将25mg的氧化石墨烯（GO）置于25mL水中，超声分散至溶液中无颗粒物，得到1mg/mL的氧化石墨烯（GO）分散液；
（2）向上述分散液中加入0.5mL 20%聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）电解质，搅拌30min后加入0.875mL的35%水合肼溶液，在100℃的油浴搅拌24h后离心分离，沉淀用水洗至中性后分散于25mL的水中，得到1mg/mL的聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）；
②还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物的制备
（1）将0.25mL 100mM的硝酸银溶液和0.25mL 100mM的柠檬酸三钠溶液加入到室温下正在搅拌的100mL的水中，加入6mL 新配置的5mM的硼氢化钠溶液并剧烈搅拌，得到黄色胶体银纳米粒子后继续搅拌30min，静置过夜；
（2）取0.5mL 1mg/mL的还原石墨烯（rGO）与4mL上述银纳米粒子室温下搅拌1h后离心分离，沉淀用水洗涤2-3次，得到1mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物；
③电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）的制备
（1）将玻碳电极使用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉上打磨，在水和乙醇中交替超声至电极表面光滑；取4μL 0.5mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物滴在玻碳电极上自然晾干；
（2）取10μL 5μM的氯霉素适配体滴在电极上，所述适配体中含有5mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）活化巯基，将电极在4℃下培育16h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的适配体，滴加10μL 1mM 的巯基己醇进行活性位点的封闭1h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的巯基己醇，在氮气的环境下晾干电极即得电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer），将制好的电化学适配体传感器置于4℃保存待用。
本发明的一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器检测氯霉素的方法，包括以下步骤：
（1）在制成的电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）上，滴加不同浓度的氯霉素溶液，每次滴加10μL，在37℃下温育40 min后用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗净；
（2）将上述电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂柱电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（3）将上述电化学适体传感器置于含有0.1 M氯化钾的50mM pH 7.4三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）检测溶液中，于-0.80 V至-0.10 V电位范围进行线性扫描伏安测定，扫速为50mV /s，根据记录的电化学信号，获得不同浓度的氯霉素工作曲线，根据工作曲线得出样品中氯霉素的浓度。
本发明的电化学适配体传感器的工作原理是：待测样品中的氯霉素与传感器表面对应的捕获适配体发生特异性结合，传感器表面结合的氯霉素在还原石墨烯银纳米粒子的催化作用下产生还原电流信号，该电流信号与待测样品中氯霉素的浓度成正相关，通过工作曲线即可得到样品中氯霉素的浓度。
本发明具有以下几个优点：
（1）提供了一种对氯霉素敏感的适配体作为分子识别元件，核酸适配体具有靶分子范围广，亲和力强，特异性高，稳定性好，制备和修饰方便，变性复性可逆，分子量小，无毒性，无免疫原性、组织渗透性好等优点；
（2）通过电化学方法进行分析检测，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本低；
（3）本发明结合了适配体和电化学传感器两方面的优势，既具有电化学传感器的高灵敏度、快响应、操作简便、成本低廉，又具有适配体的高选择性和特异性，本发明对推广适配体传感器在医药分析、食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。
附图说明
图1电化学适配体传感器的制备示意图；
图2电化学适配体传感器与目标分子作用的示意图。
具体实施方式
实施例1 一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
①聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）的制备
（1）将25mg的氧化石墨烯（GO）置于25mL水中，超声分散至溶液中无颗粒物，得到1mg/mL的氧化石墨烯（GO）分散液；
（2）向上述分散液中加入0.5mL 20%聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）电解质，搅拌30min后加入0.875mL的35%水合肼溶液，在100℃的油浴搅拌24h后离心分离，沉淀用水洗至中性后分散于25mL的水中，得到1mg/mL的聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）；
②还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物的制备
（1）将0.25mL 100mM的硝酸银溶液和0.25mL 100mM的柠檬酸三钠溶液加入到室温下正在搅拌的100mL的水中，加入6mL 新配置的5mM的硼氢化钠溶液并剧烈搅拌，得到黄色胶体银纳米粒子后继续搅拌30min，静置过夜；
（2）取0.5mL 1mg/mL的还原石墨烯（rGO）与4mL上述银纳米粒子室温下搅拌1h后离心分离，沉淀用水洗涤2-3次，得到1mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物；
③电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）的制备
（1）将玻碳电极使用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉上打磨，在水和乙醇中交替超声至电极表面光滑；取4μL 0.5mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物滴在玻碳电极上自然晾干；
（2）取10μL 5μM的氯霉素适配体滴在电极上，所述适配体中含有5mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）活化巯基，将电极在4℃下培育16h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的适配体，滴加10μL 1mM 的巯基己醇进行活性位点的封闭1h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的巯基己醇，在氮气的环境下晾干电极即得电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer），将制好的电化学适配体传感器置于4℃保存待用。
实施例2 氯霉素标准溶液的检测
（1）在实施例1制成的电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）上，滴加不同浓度的氯霉素溶液，每次滴加10μL，在37℃下温育40 min后用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗净；
（2）将上述电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂柱电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（3）将上述电化学适体传感器置于含有0.1 M氯化钾的50mM pH 7.4三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）检测溶液中，于-0.80 V至-0.10 V电位范围进行线性扫描伏安测定，扫速为50mV /s，根据记录的电化学信号，得到浓度梯度依次为0.01，2.5，5，10，20，35μM的氯霉素标准溶液的工作曲线，见下表1。
实施例3 牛奶中氯霉素的检测
根据实施例2得到工作曲线，检测牛奶样品中氯霉素的含量。取1.0g牛奶样品溶于5mL50mM Tris-HCl中，用20%的乙酸调至pH=4.6，培育20min后离心分离，取上清液经0.22μm的滤膜过滤，将滤液调至pH=7.4后进行检测。结果表明，牛奶样品中无氯霉素残留检出。再向上述牛奶样品中加入氯霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表2。
由上表2可以看出，测试结果的相对标准偏差（RSD）为1.5-4.8%，平均回收率为95.0-101.9%，说明本发明的电化学适配体传感器具有较高的准确度和精密度。
Claims (5)
1.一种氯霉素适配体，其特征在于：所述适配体含有ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACGGTC GGC GAG TCG GTG GTA G碱基序列，且5’端修饰了5’-SH-(CH2)6。
2.一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器，其特征在于：所述电化学适配体传感器含有如权利要求1所述的适配体。
3.根据权利要2所述的一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器，其特征在于：所述电化学适配体传感器是适配体与纳米复合物上的银纳米粒子通过银硫键固定在玻碳电极上组装而成，所述纳米复合物是由聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）功能化的还原石墨烯表面静电组装银纳米粒子制成，样品中的氯霉素被定量捕捉到传感器表面，在纳米复合物的催化作用下产生电信号。
4. 一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
①聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）的制备
（1）将25mg的氧化石墨烯（GO）置于25mL水中，超声分散至溶液中无颗粒物，得到1mg/mL的氧化石墨烯（GO）分散液；
（2）向上述分散液中加入0.5mL 20%聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）电解质，搅拌30min后加入0.875mL的35%水合肼溶液，在100℃的油浴搅拌24h后离心分离，沉淀用水洗至中性后分散于25mL的水中，得到1mg/mL的聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）的还原石墨烯（rGO）；
②还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物的制备
（1）将0.25mL 100mM的硝酸银溶液和0.25mL 100mM的柠檬酸三钠溶液加入到室温下正在搅拌的100mL的水中，加入6mL 新配置的5mM的硼氢化钠溶液并剧烈搅拌，得到黄色胶体银纳米粒子后继续搅拌30min，静置过夜；
（2）取0.5mL 1mg/mL的还原石墨烯（rGO）与4mL上述银纳米粒子室温下搅拌1h后离心分离，沉淀用水洗涤2-3次，得到1mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物；
③电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）的制备
（1）将玻碳电极使用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉上打磨，在水和乙醇中交替超声至电极表面光滑；取4μL 0.5mg/mL的还原石墨烯银纳米粒子（rGO/AgNPs）复合物滴在玻碳电极上自然晾干；
（2）取10μL 5μM的氯霉素适配体滴在电极上，所述适配体中含有5mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）活化巯基，将电极在4℃下培育16h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的适配体，滴加10μL 1mM 的巯基己醇进行活性位点的封闭1h，用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗去多余的巯基己醇，在氮气的环境下晾干电极即得电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer），将制好的电化学适配体传感器置于4℃保存待用。
5.一种基于如权利要求2或3所述的电化学适配体传感器检测氯霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）在制成的电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）上，滴加不同浓度的氯霉素溶液，每次滴加10μL，在37℃下温育40 min后用10mM的三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）洗净；
（2）将上述电化学适配体传感器（rGO /AgNPs /aptamer）作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂柱电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（3）将上述电化学适体传感器置于含有0.1 M氯化钾的50mM pH 7.4三羟甲基氨基甲烷酸盐缓冲液（Tris-HCl）检测溶液中，于-0.80 V至-0.10 V电位范围进行线性扫描伏安测定，扫速为50mV /s，根据记录的电化学信号建立还原峰电流与氯霉素浓度之间的工作曲线，根据工作曲线得出样品中氯霉素的浓度。
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