CN104109676B - 杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂色曲菌素(Ver A)适配体以及检测Ver A的适配体电化学生物传感器。本发明所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针。本发明所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括所述的杂色曲菌素适配体。本发明建立了一种电化学适配体生物传感器检测Ver A的方法，为Ver A的检测提供了一种新的方法和途径，具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优点。

Description

杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种杂色曲菌素(Ver A)适配体以及检测Ver A的适配体电化学生物传感器。

背景技术

杂色曲菌素(Ver A，versicolorin A)即1,6,8-三羟基-2-羟甲基蒽醌，是黄曲霉毒素B1及杂色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代谢过程中的重要前体物，其结构含有与AFB1和ST相同的毒性基团—双呋喃环。研究表明对粮食在储藏过程中的Ver A进行监测，有利于对尚未检出或仅低水平检出黄曲霉毒素污染的粮食起到预警的作用。此外，20世纪80年代，Wong等初步研究了Ver A的急性毒性和致畸变性，其LD50(小鼠静脉注射)为20mg/kg，致突变剂量(ames test)为800ng/皿，因而杂色曲菌素的毒性不容忽视。

随着国内外对AFB1、ST的危害性重视程度日益加深，很多高灵敏性的分析检测方法也随之成熟，但对Ver A的污染和检测关注仍然不足。目前主要的分析检测的Ver A方法包括HPLC(高效液相色谱)和TLC(薄层色谱)。HPLC方法分辨率高、稳定性好、成本较低，但是样品的预处理过程较繁琐，操作技术水平要求高，对样品的前处理要求苛刻，灵敏度不够高；而TLC方法操作简单、无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可靠性也不强。相比而言，酶生物传感器具有耗时短，操作简单，特异性强等优点，但由于酶本身的不稳定性，可能造成假阳性或假阴性结果。适配体电化学生物传感器是基于适配体的特异性作用，采用电化学的检测手段实现对目标物的定量分析的装置。与蛋白质相比，适配体具有更优越的特点：亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广等。因此，利用适配体电化学生物传感器检测目标物，不仅具有耗时短，操作简单、特异性强、灵敏度高、可在线和易于微型化等优点，还避免了酶本身的影响，因此受到了人们高度重视。目前，利用适配体电化学生物传感器检测Ver A尚未见报道。

发明内容

为了解决现有Ver A检测技术单一，检测方案复杂，检测时间过长的缺点，本发明的第一个目的在于提供一种杂色曲菌素适配体，对于杂色曲菌素(Ver A)具有高灵敏度、高选择性，可用于制备检测Ver A的核酸适配体电化学传感器。

本发明所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，n和m表示整数。

根据本发明所述的杂色曲菌素适配体的进一步特征，所述适配体的5’端进行氨基修饰。优选地，所述5’端氨基修饰基团为-(CH₂)₆-NH₂-。

适配体5’端修饰的目的是为了引入固定端，本领域所熟知，不同的支撑基质直接固定适配体所采用的修饰方式是不同的，金电极多采用巯基修饰或生物素修饰，玻碳电极常采用5’氨基修饰，目前公开文献未见有在金电极上采用5’氨基修饰的方式进行适配体固定。本发明所述的适配体是采用5’端氨基的修饰方式，经实验表明，既可用于玻碳电极，也可用于目前公开文献未有报道的金电极。而且，本发明进一步确定了采用-(CH₂)₆-NH₂-的氨基基团修饰的最佳方案。

本发明的第二个目的在于提供一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，能实现对Ver A的高灵敏度、高选择性的快速检测。

本发明所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括根据本发明所述的杂色曲菌素适配体。

本发明进一步提供了所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法。

本发明所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

i)金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及无水乙醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液(浓硫酸:30％H₂O₂＝7:3，V:V)中活化10min，即得到活化的金电极；

ii)电极修饰：将活化后的金电极浸入到1umol·1^-1适配体组装液中(含1mol·1^{- 1}NaCl)，4℃下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。

本发明的第三个目的是提供了根据本发明所述的核酸适配体电化学生物传感器在检测Ver A方面的应用。

例如，本发明所述的适配体电化学生物传感器可用于检测真菌毒素等用途。

本发明的第四个目的是提供了一种基于本发明所述的适配体传感器检测VerA的方法。

本发明所述的基于本发明所述的适配体传感器检测Ver A的方法，包括以下步骤：

i)适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制：

将所述的适配体电化学生物传感器用ddH₂O冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体电化学生物传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，在5m mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值Ip₀。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；

将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的Ver A标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH₂O冲洗去除非特异性吸附的Ver A。在5m mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安(DPV)分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；

记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n＝1,2…9)，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△Ip。以各Ver A标准液浓度的对数为横坐标，以其对应的△Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；

ii)实际样品检测：

玉米样品处理：取0.1g优质玉米粉，加入含4ml80％的甲醇溶液的EP管中，然后分别加入不同浓度的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用ddH₂O稀释100倍后用于电化学检测；

微分脉冲伏安法检测：根据权利要求5标准曲线绘制检测参数及检测方法，对分别含0.03ng/ml，0.3ng/ml，0.8ng/ml，50ng/ml的Ver A玉米样品进行DPV分析，通过建立的标准曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。

本发明所述的适配体电化学生物传感器是以本发明所述的适配体为分子识别元件来检测Ver A的，其原理是：在Ver A存在的情况下，本发明所述的适配体与Ver A特异性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，进一步影响电解液中铁氰化钾与电极界面的电子转移速率，即阻抗发生变化。通过建立Ver A浓度的对数与ΔIp之间的线性关系，就可以达到检测Ver A的作用。

本发明的有益效果是：本发明基于适配体与Ver A的特异性识别作用，采用DPV为电化学检测技术，建立了一种电化学适配体生物传感器检测Ver A的方法，为Ver A的检测提供了一种新的方法和途径。

与目前的Ver A检测方法相比较，本发明具有如下优点：

(1)该传感器的制备是基于适配体与Ver A的特异性识别作用所构建的，相比蛋白质而言，适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广，长时间暴露不易变性，对周围环境要求不高等特点。

(2)采用金电极为工作电极，利用Au-N键的作用实现了对适配体的一步修饰，大大简化了适配体的修饰过程。

(3)适配体电化学传生物感器制备过程试剂用量极少，检测仪器为电化学工作站，与传统的检测手段相比，该方法具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优点。

附图说明

图1为Ver A的适配体电化学生物传感器在不同浓度Ver A标准溶液中检测的DPV图谱。

图2为Ver A的适配体电化学生物传感器在不同浓度Ver A标准溶液中检测的信号变化趋势图。

图3为Ver A标准溶液检测得到的标准曲线图。

具体实施方式

实施例一：Ver A的适配体电化学生物传感器的构建

(一)试剂与仪器

杂色曲菌素(本实验室制备，纯度99.96％，待检测VA均为含1‰甲醇的水溶液。)，文中所述的Ver A的核酸适配体由上海生物工程有限公司合成。Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl、KCl、K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O、K₃[Fe(CN)₆]、30％H₂O₂、浓硫酸、无水乙醇、甲醇均为分析纯，购自广州化学试剂厂。实验用水为超纯水(电阻率：18.2MΩ/cm)。

Epsilon电化学工作站(美国BAS公司)。实验采用三电极系统：以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，以金电极(Au,内径Φ＝2mm)或修饰电极为工作电极。

Ver A核酸适配体序列为：CCCCAAGCCGCACATAT长度为17个碱基的单链DNA探针，且5’端进行氨基修饰即：-(CH₂)₆-NH₂-CCCCAAGCCGCACATAT。

Ver A核酸适配体组装液的配制：组装液为1u mol·1^-1的5’端修饰了氨基即：-(CH₂)₆-NH₂-CCCCAAGCCGCACATAT的单链DNA适配体溶液，用1mol·1^-1的NaCl溶液溶解配制。

(二)适配体电化学生物传感器的构建

1.金电极预处理

将待修饰金电极分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉末打磨至镜面。超纯水超声清洗2次(5min/次)。将处理后的电极浸入新鲜配制的Piranha热溶液(浓硫酸：30％H₂O₂＝7:3,V:V)活化10min；再分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次(5min/次)。

2.电极修饰

处理后的电极用超纯水冲洗，浸入到1umol·1^-1适配体组装液中，4℃下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。

Ver A核酸适配体序列从5’端到3’端的核酸序列如：(SEQ ID NO.1)，5’端修饰了氨基即-(CH₂)₆-NH₂-CCCCAAGCCGCACATAT。

浓度100μmol/L的Ver A适配体溶液是5’端修饰了氨基即-(CH₂)₆-NH₂-CCCCAAGCCGCACATAT的DNA适配体探针溶液。

实施例二：适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制

将所述的适配体电化学生物传感器用ddH₂O冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体电化学生物传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，在5m mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值Ip₀。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s。

将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的Ver A标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH₂O冲洗去除非特异性吸附的Ver A。在5m mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s。

记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n＝1,2…9)，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值ΔIp。以各VA标准液浓度的对数为横坐标，以其对应的ΔIp为纵坐标作图，建立标准曲线。如图1和图2所示，随着Ver A浓度的增加，响应信号Ip呈现先增后降的趋势。在1.0×10^-2ng/ml-1.0×10²ng/ml浓度范围内，ΔIp随VA浓度的增加而增大，ΔIp与VA浓度的对数呈现很好的线性关系(R²＝0.9864)，ΔIp(uA)＝-4.74lgC(ng/ml)-6.92(图3)，检测限为0.01ng/ml(S/N＝3)。

实施例三：实际样品检测

将本发明所述的适配体传感器用于实际样品测定及检测其回收率，所述的样品可以是农副产品和粮食作物包括玉米、花生、大米、小麦等，也可以是其它可能含有Ver A的产品如饲料、饮料、食用植物油等。

本实施例中选用玉米样品进行检测。

玉米样品处理：取0.1g优质玉米粉，加入含4ml80％的甲醇溶液的EP管中，然后分别加入不同浓度的、定量的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用ddH₂O稀释100倍后用于电化学检测。

微分脉冲伏安法检测：DPV检测参数及检测方法如实施例二所示，对分别含0.03ng/ml，0.3ng/ml，0.8ng/ml，50ng/ml Ver A的玉米样品进行DPV分析，通过实施例二建立的标准曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。测定结果如表1所示，所测得样品的相对标准偏差在之间2.34％-14.55％之间，加标回收率在81.4％-104.3％之间，平均回收率为94.625％。

表1：玉米样品中Ver A含量的测定结果

样品号	滴加量(ng/ml)	检出量(ng/ml)	RSD(％)	回收率(％)
					1	0.03	0.0310	2.34	103.4
2	0.3	0.268	7.96	89.4
					3	0.8	0.651	14.55	81.4
4	50	52.16	2.99	104.3

实施例四：基于不同的适配体构建的电化学生物传感器

在上述实施例一至三中，通过实验验证了基于序列为SEQ ID NO.1的杂色曲菌素核酸适配体构建的电化学生物传感器在检测玉米样品的效果。

进一步的实验表明，在SEQ ID NO.1即CCCCAAGCCGCACATAT中，核心序列是AAGCCGCAC，而其他碱基可以任意搭配，只要符合长度为13-21个碱基的要求。表2是实验中设计的一系列适配体及其实验结果：

表2：杂色曲菌素核酸适配体

上表中，采用了一些极端的序列例子，例如在序列AAGCCGCAC的两端加上连续的A或G或C或T，进行实验测试，结果表面，这些序列的灵敏度都非常接近，由此充分证明本发明所述的杂色曲霉素适配体的核心序列是AAGCCGCAC。由于核心序列只有9个碱基，为了产业应用的需要，在上表的测试中同时设计了不同长度的序列进行实验，结果表明在13～21个碱基长度内含有上述核心序列的核酸序列都是有效的。由此确定本发明所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针。

Claims (7)

1.一种杂色曲菌素适配体，其特征在于，所述适配体为序列如SEQ ID NO：1-14任一所示的单链DNA探针。

2.根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述适配体的5’端进行氨基修饰。

3.根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述适配体的5’端具有氨基修饰基团- (CH₂)₆-NH₂-。

4.一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，其特征在于，所述的核酸适配体电化学传感器包括根据权利要求1至3之一所述的杂色曲菌素适配体。

5.根据权利要求4所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

i）金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及无水乙醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液中活化10min，即得到活化的金电极，所述Piranha溶液中，浓硫酸与30%H₂O₂的体积比为7:3；

ii）电极修饰：将活化后的金电极浸入到含有1 umol·1^-1如权利要求1-3之一所述的适配体的组装液中，4℃下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器；所述适配体组装液含1 mol·1^-1 NaCl。

6.根据权利要求4所述的核酸适配体电化学生物传感器在检测Ver A方面的应用。

7.一种基于权利要求4所述的适配体传感器检测Ver A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

i）适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制：

将所述的适配体电化学生物传感器用ddH₂O冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体电化学生物传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，在5mmol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]， 含0.1 mol·1^-1 KCl的电解液中进行微分脉冲伏安分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值Ip₀；电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；

将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 ng/ml的Ver A标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH₂O冲洗去除非特异性吸附的Ver A；在5m mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]， 含0.1 mol·1^-1 KCl的电解液中进行微分脉冲伏安即DPV分析；电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；

记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn，其中n=1,2…9，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△Ip；以各Ver A标准液浓度的对数为横坐标，以其对应的△Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；

ii）实际样品检测：

玉米样品处理：取0.1g优质玉米粉，加入含4ml 80%的甲醇溶液的EP管中，然后分别加入不同浓度的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用ddH₂O稀释100倍后用于电化学检测；

微分脉冲伏安法检测：根据标准曲线绘制检测参数及检测方法，对分别含0.03ng/ml，0.3ng/ml，0.8ng/ml，50ng/ml的Ver A 玉米样品进行DPV分析，通过建立的标准曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。