CN102925583A - Pcr法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法，包括：将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含1～10mol/L的甜菜碱。另外，本发明还提供了一种运用上述的样本处理方法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的方法。本发明方法操作简单，成本低，使整个检测流程时间缩短40％，可用于一般性的家蚕微粒子虫检测，更适合于样本量较大的蚕卵(或蚕种、蚕蛹、蛾)家蚕微粒子虫检疫。

Description

PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法。

背景技术

家蚕微粒子虫(Nosema bombycis Naegeli 1857)是家蚕微粒子病的病原。家蚕微粒子虫是一种原生动物，当其在家蚕体内寄生时，以孢子形态出现最多，孢子为单细胞构造，通常为椭圆形，外包裹0.5微米厚的孢子壁，孢子壁很坚韧，能耐弱酸和碱，对外界的抵抗力很强。家蚕微粒子病是一种全身性感染的慢性蚕病，病程较长，且在家蚕的各个发育阶段都有不同的病征和病变，是毁灭性蚕病之一，被世界各养蚕国家确定为强制检疫对象。

1865～1970年，法国科学家巴斯德(Louis Pasteur)对家蚕微粒子病害进行了一系列的研究，发现微粒子原虫是该病害的病原，并可通过食下和胚种两个途径感染家蚕。巴斯德建立了母蛾单蛾光学显微镜检疫的技术方法，但随着蚕种生产量的扩大，检疫工作量大幅上升，单蛾光学显微镜检疫技术无法适应生产需求。

上世纪60年代，日本科学家建立了母蛾集团光学显微镜检疫技术，我国在80年代的主要蚕区开始推广应用至今。母蛾集团检疫在一定程度上节省了检疫时间和成本，但仍存在一些问题，其一是母蛾检疫是一种产品的间接检疫，在检疫结果与产品的对应性上存在明显缺陷；其二是光学显微镜在鉴别不同种类微孢子虫或类似物时的能力十分有限。

分子生物学技术的高速发展，为家蚕微粒子虫的检测提供了新的技术方法和手段，也使直接针对蚕卵进行检疫成为了可能，科学家针对免疫学检测技术和PCR检测技术在家蚕微粒子虫检测中的应用进行了广泛研究。

现有免疫学技术特别是酶标技术和胶体金技术在技术上具备良好的商业化平台，但由于家蚕微粒子虫的大个体和高比重等特性，使其检测的稳定性和灵敏度等方面存在缺陷，难于在生产上应用。

PCR检测技术在家蚕微粒子虫的检测中可以避免免疫学技术所存在的上述问题，操作也较为容易，成本相对较低，但在实际应用过程中还存在着一定的缺陷。一般在PCR检测过程中，都需要先提取待测样本的核苷酸，而该过程因耗时较长，不适合生产中大批量样本的检测；通过对样本进行煮沸的处理后直接进行LAMP技术，节省了核苷酸提取过程，简单易行，但其过高的假阳性，特异性不佳，因而其只能应用于一般性病原虫检查而无法应用于检疫性病原虫；荧光定量PCR方法虽然具有很好的特异性和批量检测的优点，但仍然避免不了核苷酸的制备过程，检疫成本相对较高。

发明内容

本发明提供了一种蚕卵样本的处理方法，解决了现有PCR法检测家蚕微粒子虫需提取蚕卵样本的核苷酸，耗时较长的问题。

一种蚕卵样本的处理方法，包括：将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含1～10mol/L的甜菜碱。

所述蚕卵样本可以是即时浸酸的蚕卵、或冷藏浸酸后的蚕卵、多化性蚕卵或自然越年蚕卵。

碱性环境可以诱导家蚕微粒子虫孢子发芽，弹出极丝，释放孢原质及核酸，但强碱性环境不利于PCR的进行，因此需要将溶液pH值调节至中性；另外，加入甜菜碱可以一定程度上消除蚕卵成分会对PCR反应造成的干扰，优选的，甜菜碱的浓度为5～8mol/L，最优选的，甜菜碱的浓度为5mol/L。

优选的，所述前处理液包含0.5～2mol/L的NaOH。由于蚕卵具有坚硬的外壳，家蚕微粒子虫的孢子也有坚硬的孢子壁，两者都不易破裂，氢氧化钠可以软化和崩解蚕卵外壳，更优选的，所述NaOH的浓度为1mol/L。

蚕卵在前处理液中的放置时间影响蚕卵的崩解率、微粒子虫孢子的发芽率以及释放核酸的量，所述放置时间优选为30～120min，在这个时间范围内，PCR结果差异不大。

本发明还提供了一种检测蚕卵中家蚕微粒子虫的方法，包括：

(1)取蚕卵样本，利用所述的处理方法对蚕卵样本进行处理，获得PCR模板；

(2)设计特异性引物，利用步骤(1)获得的PCR模板进行PCR扩增；

(3)将PCR扩增产物电泳分离，染色成像，根据成像结果判定蚕卵样本中是否含有家蚕微粒子虫。

扩增参数的选择也有可能影响最终的检测结果，本发明PCR扩增的参数优选为：预变性95℃，5min；变性95℃，0.5min，退火48.3℃，0.5min，延伸72℃，1min，循环35次；延伸72℃，5min。

本发明又提供一组检测家蚕微粒子虫的特异性引物，具体为：

正向引物：5′-ATAAATCGGAGGGCAAAT-3′；

反向引物：5′-TAAGCCGCACAATCCAC-3′。

该组引物根据家蚕微粒子虫的高度保守的小亚基核糖体RNA基因设计。

扩增片段长度为408bp，因此如果凝胶图谱中出现408bp的条带，则说明蚕卵样本中携带家蚕微粒子虫。

本发明方法操作简单，成本低，使整个检测流程时间缩短40％(3小时)，可用于一般性的家蚕微粒子虫检测，更适合于样本量较大的蚕卵(或蚕种、蚕蛹、蛾)家蚕微粒子虫检疫。

附图说明

图1为本发明实施例1中的PCR扩增产物电泳图；

其中，M为核酸分子量标记；1为健康家蚕所产的蚕卵样本；2、3、4、5和6分别为感染孢子浓度为10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷个/mL家蚕微粒子虫的家蚕所产的蚕卵样本；

图2为本发明实施例2中的PCR扩增产物电泳图；

其中，M为核酸分子量标记；0和1为健康蚕卵中混入1.0μL孢子浓度为10⁹个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；3和5为健康蚕卵中混入1.0μL孢子浓度为10⁷个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；7和9为健康蚕卵中混入1.0μL孢子浓度为10⁵个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；

图3为本发明实施例3中的PCR扩增产物电泳图；

其中，M为核酸分子量标记；1、2、3、4、5、6、7、8、9和10均为感染孢子浓度为10⁴个/mL家蚕微粒子虫的家蚕所产蚕卵中的死卵样本；

图4为本发明实施例4和实施例5中的PCR扩增产物电泳图；

其中，M为核酸分子量标记；1、2、3和4为感染孢子浓度为10⁴个/mL家蚕微粒子虫的家蚕的幼虫中肠样本；A1、A2、A3和A4为感染孢子浓度为10⁸个/mL家蚕微粒子虫的家蚕蚕蛹样本；B1、B2、B3和B4为感染孢子浓度为10⁸个/mL家蚕微粒子虫的家蚕母蛾样本；C1、C2、C3和C4是4个健康母蛾样本。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐释。

实施例1 感染家蚕微粒子虫的蚕卵检测

(1)引物设计

针对家蚕微粒子虫的小亚基核糖体RNA基因(N bombycis SSU rRNAFJ854546.1)为靶向，设计特异性引物，扩增片段的长度为408bp，其中：

正向引物(NB-SSU599F)：5′-ATAAATCGGAGGGCAAAT-3′；

反向引物(NB-SSU599R)：5′-TAAGCCGCACAATCCAC-3′。

(2)样本准备及处理

感染家蚕微粒子虫的次代蚕卵的准备：常规饲养蚕种，5龄起蚕后，按照每头家蚕100μL家蚕微粒子虫孢子液的剂量，进行不同家蚕微粒子虫孢子浓度(孢子浓度分别为10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷个/mL)的舔食，4小时内食尽，接着进行常规饲养、上蔟、羽化、交配(交配时用的雄蛾为健康个体)和产卵，交配后产下的卵即为次代蚕卵，将蚕卵即时浸酸。

将即时浸酸的蚕卵置于25℃和相对湿度为80％的培养箱内放置10天，取转青的蚕卵，放入PCR管，加入5μL的样本前处理液(含1.0mol/L氢氧化钠和5.0mol/L甜菜碱)，加盖，25℃放置120min，用50μL枪头捣碎蚕卵，加入5μL 1mol/L盐酸，加盖放置，用于PCR扩增，当天用毕即可。

(3)PCR扩增

在步骤(2)中得到的含处理过的蚕卵样本的PCR管内中，加入下列试剂：

10×buffer              5μL

(含：Tris-HCl，100mmol/L；KCl，500mmol/L；MgCl₂，15mmol/L)

dNTP                    2μL

(dATP、dGTP、dCTP和dTTP分别为2.5mmol/L)

将上述组分混匀后置于PCR仪中进行扩增，PCR扩增的参数为：预变性95℃，5min；变性95℃，0.5min，退火48.3℃，0.5min，延伸72℃，1min，循环35次；延伸72℃，5min。

PCR扩增完成后将PCR扩增产物立即进行凝胶电泳检测，也可将其放置4℃，一周内电泳检测。

(4)凝胶电泳检测和结果记录

制备1％琼脂糖凝胶液：称取0.7g(小胶用0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中，加入70mL(小胶用50mL)1×TAE(Tris-乙酸，0.04mol/L；EDTA，0.001mol/L，pH8.0)，瓶口用保鲜膜封盖，用洁净牙签刺3～5个小孔，微波炉加热煮沸3次，每次2min，每次煮沸后摇匀，直至琼脂糖全部融化，即成1.0％琼脂糖凝胶液。在其冷却至约70℃(手触瓶子略有烫觉)时加入7μL(小胶用5μL)的0.4mg/mL EB溶液，摇匀，注意在所有摇匀过程中都必须避免产生气泡。

胶板制备：取洗净并晾干的制胶槽、制胶盒和样品梳，组装后，水平放置。将冷却到65℃左右的1％琼脂糖凝胶液小心地倒入内槽玻璃板上，使凝胶液缓慢展开，形成均匀胶层，覆盖保鲜膜。室温下静置，直至凝胶完全凝固，轻轻的垂直拔出样品梳。

电泳：将载有1％琼脂糖凝胶胶板的制胶槽放到电泳槽中，向电泳槽内添加1×TAE电泳缓冲液，没过胶板约1mm即可。在PCR扩增产物中加入适量的上样缓冲液，混匀，即为样品液，取10μL样品液沿着胶孔的边缘匀速加入胶孔内，在加样品液过程中杜绝产生气泡。

以15～20V/cm的电压电泳20～30min后，以指示剂跑出制胶槽即刻为准，取出制胶槽。将胶块滑入保鲜膜，放入凝胶成像仪内成像，调焦后拍摄和存盘记录结果。

由图1可见，舔食孢子浓度分别为10⁴、10⁵、10⁶和10⁷个/mL家蚕微粒子虫的家蚕所产的蚕卵，经检测后，在400bp左右位置出现特异性条带，说明蚕卵中含有家蚕微粒子虫，而舔食10³个/mL家蚕微粒子虫孢子浓度的家蚕所产的蚕卵未检测到条带，可能在该浓度下，家蚕不能够感染家蚕微粒子虫，所产下的蚕卵也就不含有家蚕微粒子虫，也可能是本方法的灵敏度所限，但目前非抽提核酸的PCR或其它方法都无法检测，尽管如此，本方法仍可以比较灵敏且特异的检测蚕卵中是否含有家蚕微粒子虫。

实施例2 健康蚕卵混入家蚕微粒子虫孢子后的检测

(1)引上物设计

引物设计同实施例1中的步骤(1)。.

(2)样本处理

将健康蚕卵(即时浸酸的蚕卵、冷藏浸酸后的蚕卵、多化性蚕卵或自然越年蚕卵)，置于25℃和相对湿度为80％的培养箱内放置10天，取点青或转青的蚕卵，放入PCR管，加入5μL的样本前处理液(含1mol/L氢氧化钠和5mol/L甜菜碱)，加盖，25℃放置30min以上，用50μL枪头捣碎蚕卵，再加1.0μL家蚕微粒子虫孢子液，家蚕微粒子虫孢子浓度分别为10⁵、10⁷和10⁹个/mL，加5.0μL 1.0mol/L盐酸，加盖放置，用于PCR扩增，当天用毕即可。

(3)PCR扩增

PCR扩增过程同实施例1中的步骤(3)。

(4)凝胶电泳检测和结果记录

凝胶电泳检测过程同实施例1中的步骤(4)。

由图2可见，所有混入家蚕微粒子虫孢子的蚕卵样本都可以在400bp左右位置观察到特异性条带，本方法可以灵敏的检测到蚕卵中是否混有家蚕微粒子虫。

实施例3 死卵的家蚕微粒子虫检测

(1)引物设计

引物设计同实施例1中的步骤(1)。

(2)样本准备和处理

常规饲养蚕种，5龄起蚕后，按照每头蚕100μL家蚕微粒子虫孢子液的剂量舔食，家蚕微粒子虫孢子浓度10⁴个/mL，4小时内食尽，接着进行常规饲养、上蔟、羽化、交配(交配时用的雄蛾为健康个体)和产卵，交配后产下的卵即为次代蚕卵。

将次代蚕卵即时浸酸和常规催青至转青，从中挑出10个死卵，死卵的卵印为三角形，放入PCR管，每个PCR管内放一个，加入5μL的样本前处理液(含1mol/L氢氧化钠和5mol/L甜菜碱)，加盖，25℃放置120min以上(死卵因干瘪后较难使其崩解，因此在样品前处理液中可放置较长时间，放置120min或者放置24h对试验结果差异不大)用50μL枪头捣碎蚕卵，加入5μL 1mol/L盐酸，加盖放置，用于PCR反应，当天用毕即可。

(3)PCR扩增

PCR扩增过程同实施例1中的步骤(3)。

(4)凝胶电泳检测和结果记录

凝胶电泳检测过程同实施例1中的步骤(4)。

由图2可见，在10个死卵样本中，其中有9个死卵样本可以在400bp左右的位置观察到特异性条带，说明本方法可以较准确的检测家蚕的死卵中是否含有家蚕微粒子虫。

实施例4 感染家蚕微粒子虫的幼虫中肠组织检测

(1)引物设计

引物设计同实施例1中的步骤(1)。

(2)样本准备和处理

常规饲养蚕种，4龄起蚕后，按照每头家蚕20μL家蚕微粒子虫孢子液的剂量舔食，家蚕微粒子虫孢子浓度10⁴个/mL，接着进行常规饲养至5龄。

将5龄家蚕食桑5天后用两把镊子夹住体皮反向撕裂，露出中肠，用镊子取出少量中肠组织(约2×2cm)，放入PCR管，加入5μL的样本前处理液(含1mol/L氢氧化钠和5mol/L甜菜碱)，加盖，25℃放置min，用50μL枪头捣碎组织，加入5μL 1mol/L盐酸，加盖放置，用于PCR扩增，当天用毕即可。

(3)PCR扩增

PCR扩增过程同实施例1中的步骤(3)。

(4)凝胶电泳检测和结果记录

凝胶电泳检测过程同实施例1中的步骤(4)。

由图4可见，经检测后，所有经感染家蚕微粒子虫的家蚕的中肠样本中观察到了400bp左右的特异性条带，说明本方法可以特异性的检测家蚕中肠样本中是否含有家蚕微粒子虫。

实施例5 感染家蚕微粒子虫的蚕蛹和蛾的检测

(1)引物设计

引物设计同实施例1中的步骤(1)。

(2)样本准备和处理

常规饲养蚕种，5龄起蚕后，按照每头家蚕100μL家蚕微粒子虫孢子液的剂量舔食，家蚕微粒子虫孢子浓度为10⁸个/mL，接着进行常规饲养、上蔟和营茧，营茧后1周的蚕蛹作为待检测蚕蛹样本。

常规饲养蚕种，5龄起蚕后，按照每头家蚕100μL家蚕微粒子虫孢子液的剂量的舔食，家蚕微粒子虫孢子浓度为10⁸个/mL，接着进行常规饲养、上蔟和羽化，羽化后的母娥作为待检测母娥样本。

将待检测蚕蛹或母蛾放入5～15mL试管，加入1～5mL生理盐水(0.85％NaCl)，用捣碎机捣碎(约1000rpm，1min)，取2μL捣碎的组织液放入PCR管，加入2μL的样本前处理液(含1mol/L氢氧化钠和5mol/L甜菜碱)，加盖，25℃放置30min，加入2μL 1mol/L盐酸，加盖放置，用于PCR扩增，当天用毕即可。

(3)PCR扩增

PCR扩增过程同实施例1中的步骤(3)。

(4)凝胶电泳检测和结果记录

凝胶电泳检测过程同实施例1中的步骤(4)。

由图4可见，健康的母蛾样本未观察到PCR扩增的特异性条带，经感染家蚕微粒子虫的母蛾和蚕蛹样本在400bp左右的位置观察到一条特异性条带，说明本方法也可以特异性的检测母蛾或者蚕蛹样本中是否含有家蚕微粒子虫。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一些具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蚕卵样本的处理方法，其特征在于，包括：将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含1～10mol/L的甜菜碱。

2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述甜菜碱浓度为5～8mol/L。

3.如权利要求2所述的处理方法，其特征在于，所述甜菜碱浓度为5mol/L。

4.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述放置的时间为30～120min。

5.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述前处理液包含0.5～2mol/L的NaOH。

6.如权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述前处理液包含1mol/L的NaOH。

7.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述调节溶液pH值的试剂为盐酸。

8.一种蚕卵中家蚕微粒子虫的检测方法，包括：

(1)取蚕卵样本，利用权利要求1～5任一所述的处理方法对蚕卵样本进行处理，获得PCR模板；

(2)设计特异性引物，利用步骤(1)获得的PCR模板进行PCR扩增；

(3)将PCR扩增产物电泳分离，染色成像，根据成像结果判定蚕卵样本中是否含有家蚕微粒子虫。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引物为：

正向引物：5′-ATAAATCGGAGGGCAAAT-3′；

反向引物：5′-TAAGCCGCACAATCCAC-3′。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的参数为：预变性95℃，5min；变性95℃，0.5min，退火48.3℃，0.5min，延伸72℃，1min，循环35次；延伸72℃，5min。

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