CN104689310B - 一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法，其属于生物制药领域。以海藻酸钠为壁材，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌灭活全菌为芯材，利用乳化法制备嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗。利用该嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌－海藻酸钙微囊口服疫苗免疫银鲫，能够显著提高的血清酶活性，白细胞吞噬活性，其对银鲫的相对保护率为：46.7％。微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，疫苗安全性与储存稳定性较好。

Description

一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及 制备方法

技术领域

本发明涉及动物疫苗制备技术，具体涉及一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法。本发明的疫苗主要适用于鱼类。

背景技术

嗜水气单胞菌(AeromonaShydrophila，Ah)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii，Av)可引起鱼类、两栖类和爬行类动物爆发出血性败血症，导致淡水鱼皮肤出血(出血性败血症)和大量死亡，给规模化淡水鱼养殖业带来了巨大经济损失。应用抗生素等传统疗法易诱发细菌耐药，药物残留及环境生态破坏等一系列问题。

目前所开发的嗜水气单胞菌疫苗(全菌疫苗、基因工程疫苗)均为注射免疫或浸泡免疫。虽然与注射免疫、浸泡免疫相比，口服免疫效果较差，但鱼口服免疫具有使用方便、安全好、鱼群应激小、适于规模化及重复免疫等特点，有望成为最有前景的鱼类免疫途径。

由于鱼类胃酸性环境及肠内消化酶的破坏，传统疫苗到达肠粘膜之前被大量降解，即使有少量的抗原到达肠粘膜也无法形成持续性的免疫刺激，很难诱发高效的免疫应答，而通过增加免疫剂量或免疫次数来提高免疫效果又大大提高了免疫成本，免疫效果较差。近年来，国内外许多学者先后利用各种聚合物微囊传递系统开展口服疫苗研究。

2006年A.P.ROdrigueS等人利用植物油乳化法研制嗜水气单胞菌海藻酸钠口服疫苗，但所制备微球的粒径较大，平均粒径约为50μm，不符合理想微球的粒径要求(10μm左右)，可能会影响抗原提呈细胞对微球的摄取，动物免疫试验效果未见报道。

海藻酸钠(C₆H₇O₈Na)n是由α－L－甘露糖醛酸(M单元)与β－D－古罗糖醛酸(G单元)依靠1，4－糖昔键连接而组成的线性共聚物。海藻酸钠粉末遇水变湿，可缓慢的完全水化并溶解。海藻酸盐可通过其古罗糖酸的钠离子与二联阳离子(Ca₂ ^十)交换而瞬时凝胶化成球。

发明内容

本发明的目的在于开发一种在鱼类消化系统中相对稳定，粒径适中，易被巨噬细胞捕获，具有缓释性和抗原保护性，且生物相容性好的微囊抗原传递系统。并将该微囊抗原传递系统应用于嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌，开发出嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联微囊口服疫苗，以克服灭活疫苗直接口服免疫效果差的缺陷。

本发明的技术方案是：申请人制备了一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗，包括海藻酸钙控释微囊以及包封于所述微囊中的灭活嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌，该灭活疫苗含有的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的保藏号分别为CCTCC NO:M2013566和 CCTCC NO:M 2013565；所述抗原已灭活。

本发明的进一步改进包括：

所述嗜水气单胞菌的抗原和维氏气单胞菌的抗原体积含量一致。

所述的海藻酸钙控释微囊包裹嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率(96.31士0.20)％，载菌量(2.37士0.36)×10⁸cfu/mg。该括号内内容为本领域技术人员常用表示方法，本领域技术人员可以准确无误的理解该描述所表达的意思。

海藻酸钙控释微囊粒径为10.35μm。

本发明的另一目的在于，提供一种用于生产权利要求1所述的嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗的菌株，该菌株分别是嗜水气单胞菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013566；和维氏气单胞菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013565。

本发明进一步提供一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗的制备方法，将嗜水气单胞菌株及维氏气单胞菌株复壮后于28℃下扩大培养，经0.2％的福尔马林灭活后，12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤细菌，将细菌浓度调整为1.0×10¹⁰cfu/mL；在均质匀浆机的搅动下，将海藻酸钠和上述灭活菌液以体积比1：1的比例配成海藻酸钠一抗原乳浊液，其中海藻酸钠浓度为2.0％W/V，搅拌温度为45℃，菌胶比为1：6，搅拌速度为600r/m/min，乳化时间为l 5min；该乳浊液经喷雾干燥机雾化后直接喷入经磁力搅拌机搅动的含有2％CaCl₂的pH＝3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，形成海藻酸钙微囊，经离心，收集海藻酸钙微囊；再将收集的微囊冷冻干燥后，封盖包装；其中所述的海藻酸钙控释微囊包裹灭活嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率为(96.31士0.20)％，载菌量(2.37士0.36)×10⁸cfu/mg。

优选的，上述的海藻酸钙控释微囊粒径为10.35μm。

上述抗原菌株的分离鉴定方法如下所述：

嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，申请人自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。根据攻毒试验中，每组鲫鱼的死亡情况，并结合个菌株毒力因子的特点，筛选出了毒力因子多，毒性强的菌株作为疫苗制备备用菌株:嗜水气单胞菌XDMG(1),其LD₅₀为1.5×10⁵cfu/mL。维氏气单胞菌XDLG(1),其LD₅₀为4.5×10⁵cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号分别为CCTCC NO:M 2013566和CCTCC NO:M 2013565。取样时间为2010年7月,地点:新乡,卫辉东湖,分别取自于麦穗鱼和鲢鱼的肝部。

本发明选取豫北地区毒力因子多、免疫源性高、毒性强的嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌制成二联灭活口服缓释微球疫苗。采用甲醛灭活制备疫苗，对鲫鱼(30～35g)进行口服免疫， 进行血清抗体效价检测，病理切片分析和攻毒保护试验。结果表明，鲫鱼在经口服免疫后，第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗体；病理切片也表明，该疫苗能够对鲫鱼靶器官产生很好的保护作用；攻毒保护试验中，免疫组的免疫保护率达46.7％。嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼有显著的免疫保护效应，可作为预防细菌性败血症感染的疫苗。

将所制备的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗与一定量的经去水浸泡软化过的商品化鱼用饲料粉末混合后，压制成条，晾干，制成颗粒。

免疫途径：口服免疫。对鱼群禁食24h后，将一定量的含有嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗的鱼饲料颗粒投入水中，供鱼群自由采食。免疫剂量为:每克体重的鱼投放微囊口服疫苗0.2mg(即:每克体重的鱼免疫细菌5.0×10⁷cfu)。首免10天后，进行二免，用法及剂量同前。

本发明的有益效果是：

1.壁材来源广泛本研究所使用的壁材为天然高分子材料，其来源广泛，价格低廉且具有免疫增强作用，已被FDA批准用于药物的添加剂或辅料，安全，无毒性。

2.制作工艺简单本研究所采用的改良喷雾一离子交联技术，制作工艺简单，成本较低，有利用工业化生产。制备工艺所用试剂安全，低毒，制备过程中未产生有毒物质。

3.微囊性状较理想所制备微囊圆整，平均粒径较小(10.35μm士0.163μm)，粒径分布较均匀；抗原包被率约(96.31士0.20)％，载菌量(2.37士0.36)×10⁸cfu/mg；微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，安全性与储存稳定性较好。

4.储存及运输方便本疫苗在常温下(25℃)保存9个月以上而保持良好的抗原性。节约了冰冻冷藏与运输的成本，便于推广。

5.操作方便，免疫效果较好口服免疫对动物的应激小，操作方便，人力成本低，便于规模化推广。该疫苗无异味，适口性良好，鱼群易采食，免疫效果较好。

6.应用前景广阔所开发的微囊抗原传递系统对可抵抗胃肠中酸碱环境的刺激，对抗原的保护较好，且具有缓释作用，可对机体形成脉冲式刺激，可推广应用于鱼类其它病原的口服疫苗的开发，加快鱼类口服疫苗的研究进程。

附图说明

图1是3株A.Aeromonashydrophil XDMG(1)中aer(1)、alt(2)、ahp(3)以及β-hly(4)基因的PCR扩增结果。

图2三种来源苗菌株四种毒力基因相对表达1典型病鱼分离菌株2鱼源菌株3水源菌株。

图3各组血清抗体效价平均值。

图4光镜下实验组与对照组鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肠道组织的组织切片。

具体实施方式

为了使本发明更易于理解，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。单本实施例不是对本发明的限制。

实施例

1材料

1.1菌株

嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。

1.2试验动物

健康鲫鱼购自新乡市郊某渔场，每条鱼质量约为30g，长度为12～15cm。使用前先于实验室驯养1周，充气，控制水温28℃左右，定期清污换水、喂食。

1.3培养基

LB营养肉汤的配制:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g,磷酸二氢钾1.0g，蒸馏水1000mL，混匀，加热溶解，调PH值至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min。

LB琼脂平板的配制:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，混匀，加热溶解，调PH值至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃无菌倾注平板。

2方法

2.1疫苗菌株的筛选

2.1.1毒力因子PCR检测及分型

4种引物：气溶素(aer)、β-溶血素(β-hly)、细胞兴奋肠毒素(alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)均由上海生工生物技术公司合成，其序列见表1。采用25μL体系进行PCR反应，模板浓度为30ng/μL，琼脂糖凝胶进行电泳，检测4种毒力因子。

表1 4种毒力基因PCR扩增引物序列及目的片段大小

2.1.2毒力因子的实时定量分析

设计的4种毒力基因的实时定量引物(见表2)。筛选出毒力因子多的菌株，提取RNA时行反转录合成cDNA，采用10μL体系在PR0961101428实时定量PCR仪器上进行反应，检测4种毒力因子的相对表达量。

表2 4种毒力基因实时引物序列及目的片段大小

2.1.3半数致死浓度(LD₅₀)的测定

实验室保存的菌株活化后，接种于营养肉汤28℃摇床培养16h。培养物利用血小球计数板计数，每株菌的实验组分5组，每组10尾鱼，将菌液以10^-1，10^-2，10^-3，10^-4倍比稀释，每稀释度菌液腹腔注射鲫鱼，每尾注射0.2mL,同时设生理盐水对照。实验鱼养于已消过毒的水族箱里，自来水已曝气24h，充气，控制水温28℃左右，定期清污换水、投喂食物。每天记录每组鱼的死亡情况，参考Reed-Muench法计算半数致死浓度(LD₅₀)。

2.2全菌灭活疫苗的制备

2.2.1菌种来源

XDLG(1)；XDMG(1)。

2.2.2菌种活化与扩大培养

在无菌条件下从嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌原菌种干粉中挑取少量菌苔，接种于营养肉汤试管中摇床培养后，画线接种于琼脂平皿，28℃培养18－24h，生长出菌落，经检查无杂菌后，再挑取单菌落接种于盛200mL营养肉汤培养基三角瓶中(pH 7.2)，28℃振荡培养(振荡频率为120次/分—130次/分)，培养18－24h待用。

菌种可继续用三角瓶进行扩大培养，接种量为10％，培养方法同菌种的培养，然后加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，28℃摇床培养24h，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的含量均为50％，经0.2％的福尔马林灭活后，12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤细菌，将细菌浓度调整为1.0×10¹⁰cfu/mL，制得二联菌的灭活疫苗。但用摇床培养时，产量较低，因此一般采用发酵罐培养。

种子罐培养

发酵罐灭菌后冷却到28℃即可接种。在无菌条件下按1％的比例将制好的扩大菌液接种于冷却到28℃的种子罐内进行培养。接种后控温28℃，压力为0.05MPa通气量1：1和220r/min搅拌条件下培养18－24h。接种后22h开始每隔2h取样一次检测，当菌体生长整齐；处于对数生长期；含菌量为1×10⁸cfu/mL以上；无杂菌污染；pH 7.0-7.5。即可移种至发酵罐内发酵培养。

发酵罐培养

在无菌条件下将种子罐的细菌培养液按1％的接种比例接种于冷却到28℃的发酵罐内进行培养，培养条件及检测指标同上。当含菌量达到生产需要后，即可以用0.2％的福尔马林对发酵罐菌液进行灭活。

2.2.3微球疫苗及制备

在均质匀浆机的搅动下，将海藻酸钠和上述灭活菌液以体积比1：1的比例配成海藻酸钠一抗原乳浊液，其中海藻酸钠浓度为2.0％W/V，搅拌温度为45℃，菌胶比为1：6，搅拌速度为600r/m/min，乳化时间为l 5min；该乳浊液经喷雾干燥机雾化后直接喷入经磁力搅拌机搅动的含有2％CaCl₂的pH＝3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，形成海藻酸钙微囊，经离心，收集海藻酸钙微囊；再将收集的微囊冷冻干燥后，封盖包装；其中所述的海藻酸钙控释微囊包裹灭活嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率为(96.31士0.20)％，载菌量(2.37士0.36)×10⁸cfu/mg

2.3疫苗无菌检测与安全性试验

取上述制备的灭活疫苗涂布平板，28℃培养48h，观察有无菌落出现。

对鱼群禁食24h后，将含有嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗的鱼饲料颗粒投入水中，供鱼群自由采食。免疫剂量为:每克体重的鱼投放微囊口服疫苗0.2mg(即:每克体重的鱼免疫细菌5.0×10⁷cfu)。首免10天后，进行二免，用法及剂量同前。观察试验鲫鱼的反应和死亡情况。

2.4鲫鱼的免疫接种

实验组和对照组各80尾鲫鱼，实验组自由采食，按每克体重的鱼投放嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗0.2mg(即:每克体重的鱼免疫细菌5.0×10⁷cfu)。首免10天后，进行二免，用法及剂量同前；对照投放等量的常规饲料。每天充气，投喂食物，水温控制在28℃左右。

2.5血清抗体检测

鲫鱼免疫后，每周从各组鱼中随机取5尾，注射器尾动脉/静脉取血，血液收集于离心管，使其4℃下自然沉降，分离血清。96孔板每孔加入生理盐水50μL后,分别加入2倍比稀释免疫鱼血清和和对照鱼血清,然后加入灭活的二联菌液作为抗原，培养板于28℃恒温箱1h，再放入4℃冰箱过夜后判定结果。

2.6病理切片分析

鲫鱼免疫21天后，随机挑取实验组和对照组的鱼，以50LD₅₀嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌攻击，12h后解剖取其肝脏、脾脏、肾脏以及肠道组织固定，包埋，经冰冻切片机切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封存后，于光学显微镜下观察并对比实验组与对照组中鱼各组织器官的变化。

2.7攻毒保护试验

在首次免疫21天后，每组随机挑取30尾鱼，以50LD₅₀嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌攻击，同样采取口服免疫的方式，同样环境下培养10d，每天观察并记录各组死亡数，根据公式计算鱼的免疫保护率：

免疫保护(％)＝(对照组鱼种死亡率-试验组鱼种死亡率)/对照组鱼种死亡率×46.7％

3结果

3.1疫苗菌株的筛选试验

3.1.1毒力因子PCR检测及分型

52株菌中只有3种毒力基因型：aer⁺alt⁺ahp⁺hly⁺、aer⁺alt^-ahp⁺hly⁺、aer⁺alt⁺ahp^-hly^+-。其中4种毒力因子都有的aer⁺alt⁺ahp⁺hly⁺型占67.3％(35/52)。图1为3种毒力基因型的代表菌株PCR扩增结果见图1。

3.1.2毒力因子的实时定量分析

利用含有4种毒力基因型的aer⁺alt⁺ahp⁺hly⁺代表株对4种毒力基因进行实时定量分析。以16SRNA为内参，以典型病鱼分离株为对照，分别对鱼源、水源菌株进行定量分析，其代表菌株的相对表达量见图2。典型病鱼分离株4种毒力基因相对表达量最高且差异显著。

3.1.3半数致死浓度(LD₅₀)的测定

选择4种毒力因子相对表达量均高的菌株活化，进行了半致死浓度LD₅₀的测定。根据攻毒试验中，每组鲫鱼的死亡情况，并结合个菌株毒力因子的特点，筛选出了毒力因子多，毒性强的菌株作为疫苗制备备用菌株:嗜水气单胞菌,其LD₅₀为1.5×10⁵cfu/mL。维氏气单胞菌,其LD₅₀为4.5×10⁵cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号分别为CCTCC NO:M 2013566和CCTCC NO:M 2013565。3.2疫苗无菌检测和安全性试验

试验用灭活疫苗涂布平板培养48h后，无菌落出现，证明疫苗灭活完全。

动物安全实验中，疫苗口服鲫鱼后均无异常反应，证明疫苗是安全无毒性的。

3.3血清抗体检测

每条鱼血清凝集抗体效价及其平均值见图3。由图3可知，鲫鱼在经口服免疫后，第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗体。

3.4病理切片分析

实验组与对照组病理切片见图4，如图4所示，图A为免疫组鱼肝细胞可见肝细胞呈多角状，排列均匀有规则(箭头所示)图B为免疫组鱼脾脏可见脾实质红髓与白髓相间排列，无明显的分界，网状组织中充满着不同发育阶段的红细胞、粒细胞、淋巴细胞等(箭头所示)。图C为免疫组鱼肾脏，可见其形态大小正常，皮髓质界限清晰，肾窦无分离，肾小管正常(箭头所示)；图D为免疫组鱼肠道组织，上皮组织细胞、淋巴细胞、粘膜内层、黏膜下层细胞形态正常(箭头所示)；图E为对照组鱼的肝脏，肝细胞包浆疏松且出现明显气球样变性，后期出现大量的肝细胞坏死及淋巴细胞浸润，红细胞肿大、破裂、溶解，毛细血管、小血管破损，管壁扁平，内皮细胞肿胀，变性，严重溶血，可见棕黄色血源性色素沉积(箭头所示)；图F为对照组鱼的脾脏，可见脾脏红髓与白髓难以辨认，小体结构不清，组织细胞大量溶解、坏死、血源性色素沉积最为显著(箭头所示)；图G为对照组鱼的肾脏，可见肾小体坏死，肾小球囊腔变大，肾小管上皮细胞肿胀、变性、坏死、崩解(箭头所示)；图H为对照组鱼的肠道，可见肠绒毛坏死、脱落，肠绒毛上皮细胞坏死、脱落，杯状细胞大量增生(箭头所示)。说明疫苗对鲫鱼产生了保护作用，当嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌侵入鱼体内时，鱼的免疫系统可识别并消灭病原菌，以免细菌对组织造成损伤。

3.5口服疫苗攻毒保护试验

口服疫苗能对鲫鱼产生一定的保护作用，其免疫保护率为46.7％(见表3)；未免疫的对照组鲫鱼全部死亡，从死鱼内脏中回收到攻毒株。

表3口服免疫后3周的免疫保护率

本研究从新乡地区自然患细菌性败血症的病例中分离、筛选出强毒株，采用甲醛灭活的方法制备嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌灭活疫苗，并用此疫苗来免疫鲫鱼，由于是灭活的全菌疫苗，既安全无毒，又保存了细菌的绝大部分抗原成分，且采用的是毒力因子最多，毒性最强的菌株作为疫苗菌株，所以能对更多种强毒株产生免疫保护作用。血清抗体检测试验说明，在免疫反应中，产生了抗体，特异性免疫发挥了重要作用。从病理切片可以看出，嗜水气单胞菌可以侵入鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肠道等组织，并造成严重的损伤，疫苗可以在细菌进入这些组织之前将其杀灭，很好的保护了鱼体的安全。

本发明利用该嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌－海藻酸钙微囊口服疫苗免疫银鲫，能够显著提高的血清酶活性，白细胞吞噬活性，其对银鲫的相对保护率为：46.7％。微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，疫苗安全性与储存稳定性较好。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.保藏号分别为CCTCC NO:M 2013566和CCTCC NO:M 2013565的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌在制备防治银鲫细菌性败血病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜水气单胞菌的抗原和维氏气单胞菌的抗原体积含量一致。

3.一种用于生产权利要求1所述的嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗的菌株，其特征在于，该菌株分别是嗜水气单胞菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013566；和维氏气单胞菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013565。