CN106754427B

CN106754427B - 嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化方法

Info

Publication number: CN106754427B
Application number: CN201710040810.3A
Authority: CN
Inventors: 郭尚; 南晓洁; 周林
Original assignee: Institute Of Edible Fungi Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Edible Fungi Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: CN106754427A

Abstract

本发明公开了一种嗜蓝孢孔菌新菌株（Fomitiporia guoshangensis），该菌株已于2016年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13380。本发明嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化方法，包括（1）采用PDA加富培养基对嗜蓝孢孔菌子实体进行组织分离培养放入温度为25℃，湿度为65%的恒温培养箱中，避光黑暗培养7‑10天，菌丝长满培养皿，生产出纯母种嗜蓝孢孔菌菌株；（2）将纯母种嗜蓝孢孔菌菌株转接到首代嗜蓝孢孔菌母种菌株培养基上，培养出首代母种嗜蓝孢孔菌菌株，完成嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化。

Description

嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化方法

技术领域

本发明涉及一种嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化方法。

背景技术

嗜蓝孢孔菌 Fomitiporia是锈革孔菌科Hymenochaetaceae的一个属，首次被Murrill（1907）报道。在过去的一段时间里，大多数研究者认为嗜蓝孢孔菌属 Fomitiporia归属于桑黄属 Phellinus，并与桑黄属的 Phellinus punctatus– robustus的复合体具有很大的关连。这个复合体的主要特征是具有球形到近球形、厚壁、嗜蓝和似糊精状的担孢子，二系菌丝系统，多变的子实层刚毛和小隔胞(Fischer 1996)。 Fomitiporia通常具有两种子实体形态学结构： Fomitiporiapunctata的复合体的种表现为具有倒置的担子果（例如： Fomitiporialangloisii [模式种], Fomitiporiapunctata， Fomitiporiapseudopunctata， Fomitiporiaaethiopica等等）， Fomitiporia robusta 的复合体的种具有伞形菌盖的担子果（例如： Fomitiporia bakeri， Fomitiporia calkinsii， Fomitiporiarobusta等等）。近年来，根据分子生物学的研究表明， Phellinus punctatus– robustus复合体的种与锈革孔菌科Hymenochaetaceae形成了明显的、单系的分支(Decock et al. 2005)。在过去的20年间，根据形态学、分子生物学结合的研究，发现嗜蓝孢孔菌属 Fomitiporia的一些新的分类单元(Dai & Cui 2005；Dai et al. 2001；Dai & Zhang2002；Fischer 2002；Fischer & Binder 2004；Fischer et al. 2005)。Dai(1999)第一个撰写了桑黄属的专题报告，并且报道了7个种；到目前为止，在中国又发现了4个新的种(Cui et al. 2007； Dai & Cui 2005； Dai et al. 2001； Dai & Zhang 2002)。

发明内容

本发明提供一种嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化的方法。

本发明提供的嗜蓝孢孔菌新菌株（ Fomitiporia guoshangensis），该菌株已于2016年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13380。

本发明提供的嗜蓝孢孔菌新菌株的形态学特征为具有马蹄形担子果，盖状无柄，有时平伏反卷生长，单系菌丝系统；骨架菌丝在Melzer试剂和棉蓝试剂中呈负反应；担孢子近球形或球形，无色，厚壁等；与相近种 Fomitiporiahippophaeicola的主要区别是：具有囊状体，单系菌丝系统，担孢子在Melzer试剂中变黑，具有淀粉质反应；在5%氢氧化钾试剂菌丝中无任何变化，在棉蓝试剂中，担孢子、菌丝没有嗜蓝反应。以 Fomitiporialangloisii为模式种，基于嗜蓝孢孔菌属 Fomitiporia sp.系统发育学的研究，构建ITS、LSU、 tef1和 rpb2 四个基因的多基因树，结果表明 Fomitiporia guoshangensis与嗜蓝孢孔菌属亲缘关系较近，聚在一个分支中，并在系统发育树中形成了一个独立的亚分枝；形态和分子特征分析表明 Fomitiporia guoshangensis是嗜蓝孢孔菌属中的一个新的分类单元。

本发明的嗜蓝孢孔菌新菌株（ Fomitiporia guoshangensis）是2014年8月从山西大同右玉地区海拔1 352m，北纬39°59.13′、东经112°28.16′处，采集新鲜沙棘腐木上的子实体分离获得原始菌株。对子实体的营养及功能成分进行了测定，对子实体的急性毒性进行了研究，结果如下：

1. 本发明嗜蓝孢孔菌新菌株营养及功能成分的测定

1.1嗜蓝孢孔菌新菌株的一般营养成分含量

糖类、脂肪、蛋白质等是食物的主要构成，蛋白质含量的高低是衡量食物营养价值的重要指标，真菌多糖被称为“生物反应调节剂”，是评价食用菌加工品质优劣的重要指标。表1所示，本发明的嗜蓝孢孔菌新菌株样品中蛋白质含量达到16.10%，粗多糖含量为2.14%，粗脂肪含量为1.03%，其中粗脂肪含量较低，蛋白质和多糖含量相对较高，符合现代营养学对人们日常膳食要求。

1.2嗜蓝孢孔菌新菌株的氨基酸含量

氨基酸是蛋白质的主要组成成分，其中8种必须氨基酸人体不能合成，必须从食物中获得。一般食物中的氨基酸组成和含量难以满足人体对氨基酸的需求，因此氨基酸含量和组成是评价蛋白质量的重要指标。本发明的嗜蓝孢孔菌新菌株样品中氨基酸组成和含量如表2所示，其中必须氨基酸7种，非必须氨基酸10种。氨基酸总量占样品干重的12.51%，必须氨基酸含量为7.36%，非必须氨基酸含量为5.15%。氨基酸组成中必须氨基酸占58.8%，非必须氨基酸占42.2%。

1.3嗜蓝孢孔菌新菌株功能性成分含量

三萜类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒等广泛的生理活性，其一直是中药化学研究的热点。黄酮作为一种很强的抗氧化剂，能够延缓细胞的衰老、退化，并阻止癌症的发生。β-葡聚糖在预防“三高”、提高免疫力方面具有显著作用，同时作为益生元改善肠道菌群结构。硒是人体正常生理活动所必需的一种微量元素，具有维持人类机体抗病能力、保护器官、防止体内产生毒性物质等功能。

表3所示，本发明的嗜蓝孢孔菌新菌株子实体中三萜类化合物含量为120mg/100g，黄酮含量为6.59mg/100g，β-葡聚糖含量为13.4mg/g，硒元素含量为13μg/g。

2.采用小鼠做子实体的急性毒性的研究结果

2.1实验动物：从中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心购100只清洁级昆明小鼠，5～6周龄，体重（20±1）g，雌雄各半。

2.2受试物制备：（1）原粉组：将供试品置粉碎机中粉碎，80目过筛；用时称取所需供试品2.0g，加入去离子水，研磨、震摇混匀，定容至20mL备用。所配制浓度为：0.1g/mL。（2）水煎组：将供试品菌块掰成小块，加10倍量水浸泡2h后加热煎煮两次，每次半小时，合并煎液浓缩至所需浓度（1.4g/mL相当于生药）。

2.3 给药和观测方法：在预实验中发现本品毒性很小，无法求得半数致死剂量，故采用最大给药量试验：最大给药量指单次或 24 小时内多次（2-3次）给药所采用的最大给药剂量。将试验组分为对照组、原粉组及水煎组，每组20只，雌、雄各半；小鼠禁食不禁水过夜（16h）后给药，用灌胃注射器抽取药液，依照常规方法操作；用药组一次性灌胃给药，剂量为0.4mlL/10g·bw，原粉组相当于该菌 4g/kg体重，水煎组相当于该菌 56g/kg体重；对照组给予等容量生理盐水。然后连续观察14天，记录反应情况及死亡率；给药后14天观察结束时，在采血前12h动物禁食不禁水，摘眼球采血制备血清待测定。

2.4观察内容：给药后连续观察14天。给药当天结束后4小时内严密观察动物的毒性反应。以后观察时间内每天早、晚各观察1次。观察动物活动、饮食、皮毛及二便情况；毒性反应（给药后是否出现中毒症状、中毒发生的时间、持续时间、恢复期等）；动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等），记录所有死亡的情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等；记录动物体重变化（给药前及给药后14天称体重）；小鼠血液生化指标：丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA)的影响。

2.5急性毒性试验结果

2.5.1给药动物中毒症状、死亡情况和脏器观察用药组动物，给药后无明显反应。给药后观察期间内，给药组动物及对照组动物均无死亡，动物活动、饮食、皮毛及二便均未发现有明显异常。溶剂对照组，无明显症状。对照组大体解剖检查，未见心、肝、脾、肺、肾及胃肠等脏器异常，用药组大体解剖亦未发现各部分脏器有病变。

2.5.2动物体重变化实验动物小鼠实验前分组体重及给药后观察14天时的体重变化见表4。显示：给药后14天观察结束时，给药组小鼠体重跟对照组比较，水煎组雄性动物体重有所下降，与对照组比较差异有显著性意义（ p＜0.05），说明受试物通过水煎提取后，可能具有延缓体重增加的作用。其余均无显著差异（ p＞0.05）。结果表明该菌子实体对小鼠生长无不良影响，可认为该菌急性毒性，其中水煎组雄性小鼠体重增加量显著低于对照组，此菌可能有一定的减肥功效。

2.5.3 嗜蓝孢孔菌新菌株对小鼠部分血液生化指标的影响

表5为实验动物给药后14天观察结束时对小鼠血液生化指标的影响。可见给药后14天观察结束时，原粉组小鼠尿素氮（BUN）比对照组显著增大（ p＜0.05），水煎组小鼠天冬氨酸转氨酶（AST）极显著高于对照组（ p＜0.01）。ALT是反映肝细胞损伤最灵敏的酶学检测项目，轻微的损肝伤便能导致其显著增加。给药组的丙氨酸转氨酶(ALT) 和肌酐（CREA）含量与对照组比较均无显著差异（ p＞0.05）。AST和ALT均用于判断肝损伤程度，ALT是反映肝细胞损伤最灵敏的酶学检测项目。试验中水煎组小鼠ALT较对照组无显著差异，说明小鼠肝功能正常，水煎组小鼠AST极显著高于对照组，可能由运动、进食、睡眠等一些外界因素造成的。BUG和CREA是肾功能检测的重要指标，原粉组小鼠BUG显著高于对照组，而BUG受缺水、高蛋白食物等飞病变因素的影响，无法单纯反应肾脏功能损伤情况。另外，经过用药组大体解剖亦未发现各部分脏器有病变，同对照组比较，未发现有明显的差别，说明此菌对脏器无损伤作用。

3试验结论

嗜蓝孢孔菌新菌株子实体中的一般营养和功能性成分进行检测，初步得出此真菌蛋白含量丰富、氨基酸组成合理，脂肪含量较低；含有三萜类化合物、多糖类、黄酮类和硒元素等多种功能性化学成分。通过小鼠急性毒性试验分析，确定此菌属实际无毒级别，为其进一步的研究、开发和临床使用提供了理论依据。

本发明嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化方法，包括如下步骤：

（1）采用PDA 加富培养基对嗜蓝孢孔菌子实体进行组织分离培养放入温度为25℃，湿度为65%的恒温培养箱中，避光黑暗培养7-10 天，菌丝长满培养皿，生产出纯母种嗜蓝孢孔菌菌株；

（2）将纯母种嗜蓝孢孔菌菌株转接到首代嗜蓝孢孔菌母种菌株培养基上，培养出首代母种嗜蓝孢孔菌菌株，完成嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化。

所述的PDA 加富培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨1.5克，琼脂15克，磷酸二氢钾1.5克、硫酸镁1克，链霉素10μg/ml，四环素10μg/ml，水1000 毫升。

所述的PDA培养基制备方法是：将新鲜马铃薯去皮洗净，称取200克切成小块，放容器内加水煮沸，待马铃薯软熟后，用4层干净纱布过滤取上清，倒入另一烧杯，加入称好的琼脂和蛋白胨，继续加热，待全部融化后，再加入称量好的葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁，充分揽拌混匀，加水定容至1000 毫升，分装入三角瓶中，塞上棉塞，竖立放入高压灭菌锅内，在1.2kg/cm²的压力下、温度上升至121℃时，灭菌30分钟，压力降为0后取出三角瓶，将装有培养基的三角瓶置于已紫外灭菌超净工作台上，同时放入已灭菌的培养皿，待培养基温度降到55℃-60℃时根据三角瓶中培养基的体积按照每毫升10微克分别加入链霉素和四环素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀，制成PDA 加富培养基，再在无菌条件下将三角瓶内的培养基倒入培养皿中，每个培养皿倒10-15毫升即可，静置冷却，放入恒温培养箱中25℃培养48小时，检查无杂菌菌落，即可在无菌条件下将嗜蓝孢孔菌子实体组织接入培养皿中，进行组织分离培养，生产出纯母种嗜蓝孢孔菌菌株。

本发明的有益效果(1)本发明嗜蓝孢孔菌新菌株的子实体真菌蛋白含量丰富、氨基酸组成合理，脂肪含量较低，含有较多三萜类化合物、多糖类、黄酮类和硒元素的功能性化学成分，是一种营养成分比较均衡的食用菌新种。（2）通过小鼠急性毒性试验分析，确定本发明嗜蓝孢孔菌新菌株属实际无毒级别。（3）本发明嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化方法简单。

具体实施方式

本发明嗜蓝孢孔菌新菌株的驯化方法，包括如下步骤：

Claims

1.一种嗜蓝孢孔菌新菌株（Fomitiporia guoshangensis），该菌株已于2016年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13380。