CN105067598A - 一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器及其检测氯霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，包括惰性电极和在惰性电极表面的氯霉素分子印迹聚合物薄膜；氯霉素分子印迹聚合物薄膜由以下步骤制得：以含有氯霉素和邻苯二胺的醋酸缓冲溶液为电解液，惰性电极为工作电极构建三电极体系；采用循环伏安法，聚合电位为0～0.8V，得到聚邻苯二胺-氯霉素薄膜；用洗脱剂洗脱后，获得氯霉素分子印迹聚合物薄膜；其中，醋酸缓冲溶液的pH值为5.2，醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.05～0.2mol/L；氯霉素和邻苯二胺物质的量浓度分别为1～50mmol/L。本发明提供的氯霉素分子印迹电化学发光传感器，可用于检测氯霉素，并且检测灵敏度高，选择性好。

Description

一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器及其检测氯霉素的方法

技术领域

本发明涉及抗生素检测领域，特别涉及一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器及其检测氯霉素的方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol)是一种由委内瑞拉链丝菌产生的抑菌性广谱抗生素，对各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌都具有有效杀灭或抑制作用。近年来，氯霉素被广泛应用于人类和动物传染性疾病的治疗，还常被添加到饲料中促进动物的生长和发育，导致了氯霉素在食品中残留。人们长期使用含氯霉素的药品或者食用含氯霉素的食品会对人体产生很大毒副作用，甚至引发严重的疾病，如灰婴综合症、白血病和再生障碍性贫血等。因此，检测食品中氯霉素含量对人类健康生活具有重大意义。

目前国内外常用的氯霉素测定方法为分光光度法。虽然此方法已被成功应用到食品中氯霉素的检测，但存在着检测灵敏度低、选择性差等问题。

发明内容

本发明实施例公开了一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器及其检测氯霉素的方法，用于解决分光光度法存在氯霉素检测灵敏度低，选择性差的问题。技术方案如下：

一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，包括惰性电极和在所述惰性电极表面电化学聚合的氯霉素分子印迹聚合物薄膜；所述氯霉素分子印迹聚合物薄膜由以下步骤制得：

以含有氯霉素和邻苯二胺的醋酸缓冲溶液为电解液，以所述惰性电极为工作电极构建三电极体系；

采用循环伏安法，电化学聚合所述氯霉素和所述邻苯二胺，聚合电位为0～0.8V，在惰性电极表面聚合得到聚邻苯二胺-氯霉素薄膜；

用洗脱剂去除聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素，获得所述氯霉素分子印迹聚合物薄膜；

其中，所述醋酸缓冲溶液的pH值为5.2，所述醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.05～0.2mol/L；所述氯霉素和所述邻苯二胺的物质的量浓度分别为1～50mmol/L。

在本发明的一种优选实施方式中，聚邻苯二胺-氯霉素薄膜在红外光谱中的特征吸收峰的波数分别为：N-H弯曲振动峰σ_N-H，波数为1633cm^-1；吩嗪环的伸缩振动特征峰ν_吩嗪环，波数为1409cm^-1；苯环上的C-N-C伸缩振动峰ν_C-N-C，波数为1111cm^-1；C＝O伸缩振动峰ν_C＝O，波数为1686cm^-1；-NO₂的对称伸缩振动峰波数为1347cm^-1。

在本发明的一种优选实施方式中，所述氯霉素与所述邻苯二胺的物质的量的比为1:(0.5～2)；所述电化学聚合的聚合圈数为20～40圈。

在本发明的一种优选实施方式中，所述氯霉素和所述邻苯二胺的物质的量浓度分别为10mmol/L。

在本发明的一种优选实施方式中，所述醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.1mol/L；所述扫描圈数为30圈。

在本发明的一种优选实施方式中，所述洗脱剂为9:1(v/v)的无水甲醇-乙酸溶液、0.01mol/LNaOH溶液或0.01mol/LHCl溶液。

本发明实施例还公开了一种应用上述氯霉素分子印迹电化学发光传感器检测氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤，

a)、采用三电极体系，确定氯霉素分子印迹电化学发光传感器的初始ECL强度ECL₀；其中，所述三电极体系包括：含有电化学发光试剂的pH为7.0的电解液，参比电极、对电极和工作电极，其中所述工作电极为氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

b)、配制不同已知C₁～C_n浓度的氯霉素溶液；

c)、将氯霉素分子印迹电化学发光传感器在C₁浓度的氯霉素溶液中浸泡指定时间，得到结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

d)、采用三电极体系，确定结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器ECL强度ECL₁；该三电极体系与步骤a)中的三电极体系的差别为：工作电极为结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

e)、用洗脱剂清洗结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

对已知C₂～C_n浓度的氯霉素溶液分别重复c)～e)步骤，即得到C₂～C_n浓度的氯霉素溶液对应的ECL强度，设为ECL₂～ECL_n；

f)、计算C₁～C_n浓度的氯霉素溶液对应的响应差值ΔECL₁～ΔECL_n，其中，ΔECL_i＝ECL₀–ECL_i，1≤i≤n；

g)、以氯霉素浓度C₁～C_n为横坐标或纵坐标，以响应差值ΔECL₁～ΔECL_n为纵坐标或横坐标建立标准曲线，得到氯霉素浓度与响应差值的线性方程；

h)、对某一未知浓度的氯霉素溶液重复c)～f)步骤，得到某一未知浓度的氯霉素溶液对应的响应差值，根据所述的线性方程，即可确定出未知浓度的氯霉素溶液的浓度。

在本发明的一种优选实施方式中，所述电解液为物质的量浓度为0.05～0.2moL/L的磷酸缓冲液，优选0.1mol/L的磷酸缓冲液。

在本发明的一种优选实施方式中，所述的电化学发光试剂是三联吡啶钌及其衍生物，所述三联吡啶钌或者其衍生物的物质的量浓度为0.05～5mmol/L，优选0.5mmol/L。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述磷酸缓冲液中含有DNA，所述DNA的浓度为0.03～3mg/mL，优选0.3mg/mL。

本发明提供的一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，以氯霉素为模板分子，邻苯二胺(o-phenylenediamine)为功能单体，在惰性电极表面聚合得到聚邻苯二胺-氯霉素薄膜，用洗脱剂洗脱掉氯霉素后得到氯霉素分子印迹聚合物薄膜，可特异性识别氯霉素，具有高度亲和性和稳定性，并且抗干扰能力强、结构可控以及环境耐受性强，可用于检测氯霉素，并且检测灵敏度高，选择性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为在金电极表面电化学聚合聚邻苯二胺-氯霉素薄膜的CV曲线图；

图2为邻苯二胺、聚邻苯二胺、聚邻苯二胺-氯霉素和氯霉素的红外光谱图；

图3为氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素、链霉素、卡那霉素和甲硝唑的响应差值图；

图4为结合0、0.001、0.005、0.05、0.4和0.5mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL曲线图；

图5为结合0、0.05、0.5、5、10、20和30μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL曲线图。

具体实施方式

本发明的技术方案一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，包括惰性电极和在惰性电极表面的氯霉素分子印迹聚合物薄膜；氯霉素分子印迹聚合物薄膜由以下步骤制得：

以含有氯霉素和邻苯二胺的醋酸缓冲溶液为电解液，以惰性电极为工作电极构建三电极体系；

采用循环伏安法，电化学聚合氯霉素和所述邻苯二胺，聚合电位为0～0.8V，在惰性电极表面聚合得到聚邻苯二胺-氯霉素薄膜；

用洗脱剂去除聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素，获得氯霉素分子印迹聚合物薄膜；

其中，醋酸缓冲溶液的pH值为5.2，醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.05～0.2mol/L；氯霉素和所述邻苯二胺的物质的量浓度分别为1～50mmol/L。

本发明研制的氯霉素分子印迹电化学发光传感器具有分子印迹聚合物(Molecularlyimprintedpolymer)的良好选择性、高度亲和性、高稳定性、结构可控性和环境耐受性的特点，可特异性地识别氯霉素分子。

在实际应用中，在电化学聚合之前对惰性电极进行抛光处理是本领域的常规手段，使得电化学聚合获得满意的结果。在本发明的技术方案中，在进行电化学聚合邻苯二胺和氯霉素之前，先将作为工作电极的惰性电极用0.05μm氧化铝粉对惰性电极进行抛光处理，然后在乙醇和蒸馏水中各振荡超声5min，用蒸馏水冲洗后干燥。

需要说明的是，本发明构建的三电极体系中的参比电极、对电极和工作电极是在一个电解池中并且三者保持一定的距离，并且参比电极可以为Ag/AgCl电极、饱和甘汞电极、Cu/CuSO₄电极等、对电极可以为Pt电极、碳电极等，本发明在此不作具体限定。

在本发明的技术方案中，惰性电极可以为金电极、铂电极、玻碳电极或石墨电极。

在本发明的技术方案中，采用循环伏安法，电化学聚合氯霉素和邻苯二胺，聚合电位为0～0.8V；扫速可由本领域的技术人员根据实验经验确定，在本技术方案中可以为0.05V/s。

优选地，氯霉素与邻苯二胺的物质的量的比为1:(0.5～2)。氯霉素上的羟基会与邻苯二胺上的氨基产生氢键作用，考虑到氯霉素与邻苯二胺上含有的相互作用的基团数目，当配比为1:(0.5～2)时得到交联度较好的分子印迹聚合物。聚合圈数可以为20～40圈，扫描圈数太少会影响聚合后电极表面的特异性识别位点数量，扫描圈数太多会使聚邻苯二胺-氯霉素薄膜太厚，影响氯霉素的洗脱效果。在氯霉素和邻苯二胺的物质的量浓度分别为10mmol/L，醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.1mol/L，扫描圈数为30圈的条件下，洗脱后获得的氯霉素分子印迹聚合物薄膜的厚度和氯霉素的特异性识别位点数量适中，从而使氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素的检测灵敏度高和检测范围宽。

再有，洗脱剂可以为9:1(v/v)的无水甲醇-乙酸溶液、0.01mol/LNaOH溶液或0.01mol/LHCl溶液，清洗10min就可将聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中绝大部分的氯霉素冲洗掉，为了保证冲洗的效果，通常冲洗10min以上，冲洗时间可由本领域技术人员根据实际经验掌握。

本发明还公开了应用上述氯霉素分子印迹电化学发光传感器检测氯霉素的方法，包括以下步骤：

a)、采用三电极体系，确定氯霉素分子印迹电化学发光传感器的初始ECL强度ECL₀；其中，三电极体系包括：含有电化学发光试剂的pH为7.0的电解液，参比电极、对电极和工作电极，其中工作电极为氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

b)、配制不同已知C₁～C_n浓度的氯霉素溶液；

c)、将氯霉素分子印迹电化学发光传感器在C₁浓度的氯霉素溶液中浸泡指定时间，得到结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

d)、采用三电极体系，确定结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器ECL强度ECL₁；该三电极体系与步骤a)中的三电极体系的差别为：工作电极为结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

e)、用洗脱剂清洗结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

对已知C₂～C_n浓度的氯霉素溶液分别重复c)～e)步骤，即得到C₂～C_n浓度的氯霉素溶液对应的ECL强度，设为ECL₂～ECL_n；

f)、计算C₁～C_n浓度的氯霉素溶液对应的响应差值ΔECL₁～ΔECL_n，其中，ΔECL_i＝ECL₀–ECL_i，1≤i≤n；

g)、以氯霉素浓度C₁～C_n为横坐标或纵坐标，以响应差值ΔECL₁～ΔECL_n为纵坐标或横坐标建立标准曲线，得到氯霉素浓度与响应差值的线性方程；

h)、对某一未知浓度的氯霉素溶液重复c)～f)步骤，得到某一未知浓度的氯霉素溶液对应的响应差值，根据g)步骤获得的线性方程，即可确定出未知浓度的氯霉素溶液的浓度。

本发明公开的检测氯霉素的方法，将氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素的特异选择性与电化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)技术的高灵敏度相结合，通过三电极体系与电致化学发光检测仪的联合应用未结合氯霉素和结合不同浓度氯霉素的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的响应差值，建立标准曲线的线性方程，对未知浓度的氯霉素进行定量分析。该方法是一种全新的检测氯霉素的方法，对氯霉素检测灵敏度高、检测范围宽，操作简单，选择性好，可应用于食品中氯霉素的检测。

在本发明中电化学发光试剂可选用三联吡啶钌及其衍生物，如羟基脲对联吡啶钌、三邻菲罗啉钌，也是本领域的常规选择，本发明在此不作具体限定，三联吡啶钌或者其衍生物的物质的量浓度为0.05～5mmol/L，优选0.5mmol/L。

在本发明的技术方案中，电解液为物质的量浓度为0.05～0.2mol/L的磷酸缓冲液，优选0.1mol/L的磷酸缓冲液，好处在于在0.1mol/L的磷酸缓冲液中，三联吡啶钌及其衍生物的ECL信号更加稳定。

该体系最大的特点是，在三联吡啶钌或其衍生物的磷酸缓冲液中加入DNA，可扩大ECL强度，显著提高检测氯霉素的灵敏度。优选DNA的浓度为0.03～3mg/mL，在此浓度下，DNA对三联吡啶钌或者其衍生物的ECL信号放大效果很好，可放大为原来的1.7～6.4倍。更优选为0.3mg/mL，在此浓度下，传感器对氯霉素的检测灵敏度提高约为未加DNA时的5倍。本发明对于DNA是哪种动物的DNA不作具体限定，可以选用鲑鱼精DNA、牛胸腺DNA、人类胎盘DNA、羊胰腺DNA等。

氯霉素分子印迹电化学发光传感器在氯霉素溶液中的浸泡时间，本领域人员可以根据实际经验来把握。在本发明中，浸泡时间可以为10～20min。

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。

仪器和材料

电化学工作站CHI660ACHInstruments，上海辰华仪器公司；

傅里叶变换红外光谱仪IRAffinity-1型，日本岛津公司；

电化学发光检测仪MPI-E型，西安瑞迈分析仪器有限责任公司；

所需试剂皆市售可得。

实施例1

1.1聚邻苯二胺-氯霉素薄膜的合成

首先用0.05μm氧化铝粉对金电极进行抛光处理，将处理后的金电极在乙醇和蒸馏水中各超声振荡5min，用蒸馏水冲洗后干燥备用。

将0.0646g氯霉素和0.0316g邻苯二胺溶于20mLpH为5.2物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸缓冲溶液中，得到氯霉素和邻苯二胺最浓度分别为10mmol/L，以此醋酸缓冲溶液为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，金电极作为工作电极，采用循环伏安法扫描，电压范围为0～0.8V，扫速为0.05V/s，扫描圈数为30圈，在金电极表面获得了聚邻苯二胺-氯霉素薄膜。

1.2聚邻苯二胺-氯霉素薄膜的表征

图1为在金电极表面电化学聚合聚邻苯二胺-氯霉素薄膜的CV曲线图。如图1所示，电化学聚合第一圈在0.55V左右得到邻苯二胺单体的不可逆氧化峰，随着连续的CV扫描，氧化峰电流逐渐降低，表明在金电极表面形成的聚邻苯二胺-氯霉素薄膜阻碍了邻苯二胺单体进一步到达电极表面。

在图2中，A代表邻苯二胺的红外光谱图；B代表聚邻苯二胺的红外光谱图；C代表聚邻苯二胺-氯霉素的红外光谱图；D代表氯霉素的红外光谱图。如图2所示，邻苯二胺单体(曲线A)在1632cm^-1处的N-H弯曲振动峰(σ_N-H)在聚邻苯二胺(曲线B)以及聚邻苯二胺-氯霉素的红外谱图中(曲线C)都可以观察到。聚邻苯二胺(曲线B)在1409cm^-1处吩嗪环的伸缩振动特征峰(ν_吩嗪环)以及1112cm^-1处苯环上的C-N-C伸缩振动峰(ν_C-N-C)在聚邻苯二胺-氯霉素的红外谱图(曲线C)中也可以观察到，但在邻苯二胺单体(曲线A)中观察不到，说明聚邻苯二胺以及聚邻苯二胺-氯霉素均包含了邻苯二胺单体的特征峰，同时还含有聚邻苯二胺的吩嗪环特征峰。由此可知，在电聚合聚邻苯二胺-氯霉素过程中，邻苯二胺单体已经成功聚合形成聚邻苯二胺。此外，在聚邻苯二胺-氯霉素的红外谱图中还可以发现氯霉素在1687cm^-1处的C＝O伸缩振动峰(ν_C＝O)和1347cm^-1处-NO₂的对称伸缩振动峰从而证实氯霉素模板分子被成功包埋在聚邻苯二胺-氯霉素中，从以上结果可知，聚邻苯二胺-氯霉素已经成功聚合。表1中列出了这四种物质的红外特征吸收峰及其归属。

表1邻苯二胺、聚邻苯二胺、聚邻苯二胺-氯霉素和氯霉素的红外特征吸收峰

1.3氯霉素分子印迹电化学发光传感器的制备

用体积比为9:1的无水甲醇-乙酸溶液冲洗金电极表面的聚邻苯二胺-氯霉素薄膜，冲洗20min，将聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素清洗掉，即获得了氯霉素分子印迹电化学发光传感器。

实施例2

将0.323g氯霉素和0.079g邻苯二胺溶于20mLpH为5.2物质的量浓度为0.05mol/L的醋酸缓冲溶液中，得到氯霉素终浓度为50mmol/L，邻苯二胺终浓度为25mmol/L，以此醋酸缓冲溶液为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，石墨电极作为工作电极，采用循环伏安法扫描，电压范围为0～0.8V，扫速为0.05V/s，扫描圈数为40圈，在金电极表面获得了聚邻苯二胺-氯霉素薄膜。

用0.01mol/LNaOH溶液冲洗金电极表面的聚邻苯二胺-氯霉素薄膜，冲洗30min，将聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素清洗掉，即获得了氯霉素分子印迹电化学发光传感器。

实施例3

将0.162g氯霉素和0.158g邻苯二胺溶于20mLpH为5.2物质的量浓度为0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中，得到氯霉素终浓度为25mmol/L，邻苯二胺终浓度为50mmol/L，以此醋酸缓冲溶液为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，铂电极作为工作电极，采用循环伏安法扫描，电压范围为0～0.8V，扫速为0.05V/s，扫描圈数为20圈，在金电极表面获得了聚邻苯二胺-氯霉素薄膜。

用0.01mol/LHCl溶液冲洗金电极表面的聚邻苯二胺-氯霉素薄膜，冲洗15min，将聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素清洗掉，即获得了氯霉素分子印迹电化学发光传感器。

实施例4

4.1检测实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度

a)、构建三电极体系：Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极、氯霉素分子印迹电化学发光传感器为工作电极，含0.3mg/mLDNA和0.5mmol/L三联吡啶钌的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液为电解液。

b)、将4.1a)步骤构建的三电极体系与电化学发光检测仪相连，检测氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度，所获得检测结果通过安装有电化学分析仪工作软件的计算机输出，由此获得了氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL₀。

4.2实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素的特异性识别

a)、分别配制浓度均为5μmol/L的氯霉素、链霉素、卡那霉素和甲硝唑溶液10mL；

b)、将实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器浸在5μmol/L的氯霉素溶液中15min，得到结合5μmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

c)、构建三电极体系：Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极、结合5μmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器为工作电极，含0.5mmol/L三联吡啶钌的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液为电解液；

d)、将4.2c)步骤构建的三电极体系与电致化学发光检测仪相连，检测氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度，所获得检测结果通过安装有电化学分析仪工作软件的计算机输出，由此获得了结合5μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL_氯霉素。

e)、计算氯霉素的ECL响应差值：ΔECL_氯霉素＝ECL₀-ECL_氯霉素；

f)、用积比为9:1的无水甲醇-乙酸溶液冲洗重结合5μmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器，冲洗15min；

g)、重复b)～f)步骤(3)次；

依据b)～g)步骤的方法分别对5μmol/L的链霉素，卡那霉素和甲硝唑溶液进行实验，分别获得了结合5μmol/L链霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL_链霉素，结合5μmol/L卡那霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL_卡那霉素和结合5μmol/L甲硝唑溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL_甲硝唑。具体实验数据见表2：

表2分别结合5μmol/L氯霉素、链霉素，卡那霉素和甲硝唑溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度

图3为表2对应的ECL响应差值图。由图3可知，该传感器对氯霉素的ECL响应差值明显高于其它三种干扰物质，结合5μmol/L氯霉素溶液后，氯霉素分子印迹电化学发光传感器表面的立体孔穴数量减少，阻碍了三联吡啶钌的电子传递，ECL响应明显降低，故ECL响应差值较大。而浸泡于其他三种干扰抗生素溶液中15min的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度无明显变化，得到的ECL响应差值很小，这是因为该传感器产生的与氯霉素的大小和形状相匹配的立体孔穴不与其它三种干扰抗生素相匹配，说明该传感器对氯霉素具有很高的选择性。

从实施例4可以看出氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素具有识别作用，并且这种识别是特异性的。

实施例5

a)、配制0、0.001、0.005、0.05、0.4和0.5mmol/L氯霉素溶液。

b)、将实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器浸泡在0mmol/L的氯霉素溶液，浸泡时间为15min。

c)、以结合0mmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器为工作电极构建三电极体系，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，含0.5mmol/L三联吡啶钌的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液为电解液。将此三电极体系与电致化学发光检测仪相连，检测氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度，所获得检测结果通过安装有电化学分析仪工作软件的计算机输出，由此测定结合0mmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL₀。

d)、用积比为9:1的无水甲醇-乙酸溶液冲洗结合0mmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器，冲洗20min。

依据b)～d)步骤的方法，重复b)～d)步骤的操作过程即可分别得到结合0.001、0.005、0.05、0.4和0.5mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度(如图4所示)。在图4中，曲线a的最高点为结合0mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线b的最高点为结合0.001mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线c的最高点为结合0.005mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线d的最高点为结合0.05mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线e的最高点为结合0.4mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线f的最高点为结合0.5mmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度。

e)、计算ECL响应差值ΔECL，0μmol/L氯霉素对应的ECL强度减去0.005、0.05和0.5mmol/L氯霉素对应的ECL强度，得到0.001、0.005、0.05、0.4和0.5mmol/L氯霉素的ΔECL分别为54.3、61.4、76.6、131.1、138.2。

f)、根据以氯霉素的浓度及其对应的响应差值ΔECL，得出线性方程：ΔECL＝61.02+0.163C(r＝0.991)。

配制某一未知浓度氯霉素溶液，将实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器浸泡在此氯霉素溶液，浸泡时间为15min。

检测依据c)和e)步骤的方法得到未知浓度氯霉素对应的响应差值97.1，带入f)步骤得到的线性方程中，得出氯霉素溶液的物质的量浓度为0.22mmol/L。

实施例6

6.1分别称取0、0.3、1、3、10和30mgDNA分别加入到10mL含有0.5mmol/L三联吡啶钌的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液中，溶解，DNA的浓度分别为0、0.03、0.1、0.3、1和3mg/mL，备用。

6.2检测实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度

构建三电极体系：Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极、氯霉素分子印迹电化学发光传感器为工作电极，分别以含有不同浓度的鲑鱼精DNA和0.5mmol/L三联吡啶钌的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液为电解液。实验结果见表3：

表3不同浓度DNA对氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度的影响

DNA浓度(mg/mL)	0	0.03	0.1	0.3	1	3
							ECL强度	185.9	317.2	593.9	970.3	1085.6	1197.3

从实施例可以看出在DNA浓度为0.03～3mg/mL时，三联吡啶钌的电化学发光信号均有不同程度的增强，并且当DNA浓度为0～0.3mg/mL时，三联吡啶钌的电化学发光信号随着DNA浓度的增大明显增强，当DNA浓度为0.3～3mg/mL时，虽然三联吡啶钌的电化学发光信号也随DNA浓度增大而有所增强，但是增强效果不明显，考虑到DNA价格比较昂贵，在实际应用中可选择0.3mg/mLDNA进行氯霉素的检测。

实施例7

a)、配制0、0.05、0.5、5、10、20和30μmol/L氯霉素溶液。

b)、将实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器浸泡在0μmol/L氯霉素溶液，浸泡时间为15min。

c)、以结合0μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器为工作电极构建三电极体系，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，含0.5mmol/L三联吡啶钌和0.3mg/mL的天然鲑鱼精双链DNA的0.1mol/LpH7磷酸缓冲液为电解液。将此三电极体系与电致化学发光检测仪相连，检测氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度，所获得检测结果通过安装有电化学分析仪工作软件的计算机输出，由此测定结合0μmol/L的氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度ECL₀。

d)、用积比为9:1的无水甲醇-乙酸溶液冲洗结合0μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器，冲洗15min。

依据b)～d)步骤的方法，重复b)～d)步骤的操作过程即可得到分别结合对0.05、0.5、5、10、20和30μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度(如图5所示)。在图5中，曲线a的最高点为结合0μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线b的最高点为结合0.05μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线c的最高点为结合0.5μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线d的最高点为结合5μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线d的最高点为结合10μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线d的最高点为结合20μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度；曲线d的最高点为结合30μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度。

e)、计算ECL响应差值ΔECL，0μmol/L氯霉素对应的ECL强度减去0.05、0.5、5、10、20和30μmol/L氯霉素对应的ECL强度，得到0.05、0.5、5、10、20和30μmol/L氯霉素的ΔECL分别为158.3、198.1、306.7、446.6、618.7、763.1。

f)、根据以氯霉素的浓度及其对应的响应差值ΔECL，得出线性方程：ΔECL＝198.83+19.94C(r＝0.995)，线性范围为0.05～30μmol/L，最低检测限(LOD)为0.37μmol/L。

配制某一未知浓度氯霉素溶液，将实施例1制得的氯霉素分子印迹电化学发光传感器浸泡在此氯霉素溶液中，浸泡时间为15min。

检测依据实施例6c)和e)步骤的方法得到未知浓度氯霉素对应的响应差值485.2，带入f)步骤得到的线性方程中，得出氯霉素溶液的物质的量浓度为14.4μmol/L。

实施例5和实施例7在检测0μmol/L和5μmol/L氯霉素溶液时，区别仅在于实施例7的三电极体系的电解液中多加入了0.3mg/mL的天然鲑鱼精双链DNA。实施例6中结合0μmol/L和5μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度分别为970.3和663.6，得到的ΔECL为306.7。实施例5中结合0μmol/L和5μmol/L氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度分别为185.7和124.3，得到的ΔECL为61.4。前者是后者的5倍多。可见，天然鲑鱼精双链DNA可成倍放大氯霉素重结合前后氯霉素分子印迹电化学发光传感器的ECL强度，提高了对氯霉素检测的灵敏度。

从以上实施例可以看出，本发明的氯霉素分子印迹电化学发光传感器对氯霉素具有特异性识别作用，应用其检测氯霉素的方法，对氯霉素检测灵敏度高、检测范围宽，操作简单，选择性好，尤其是加入鲑鱼精双链DNA后，显著提高了氯霉素检测的灵敏度。

实施例5和7仅仅是对利用本发明的氯霉素分子印迹电化学发光传感器检测氯霉素的方法的个别实施例的举例。在不同的三电极体系(改变电极、电解液的浓度范围、电化学发光试剂等)，本发明的检测方法不变。

以上对本发明所提供的一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器及其检测氯霉素的方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，其特征在于，包括惰性电极和在所述惰性电极表面的氯霉素分子印迹聚合物薄膜；所述氯霉素分子印迹聚合物薄膜由以下步骤制得：

以含有氯霉素和邻苯二胺的醋酸缓冲溶液为电解液，以所述惰性电极为工作电极构建三电极体系；

采用循环伏安法，电化学聚合所述氯霉素和所述邻苯二胺，聚合电位为0～0.8V，在惰性电极表面聚合得到聚邻苯二胺-氯霉素薄膜；

用洗脱剂去除聚邻苯二胺-氯霉素薄膜中的氯霉素，获得所述氯霉素分子印迹聚合物薄膜；

其中，所述醋酸缓冲溶液的pH值为5.2，所述醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.05～0.2mol/L；所述氯霉素和所述邻苯二胺的物质的量浓度分别为1～50mmol/L。

2.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述聚邻苯二胺-氯霉素薄膜在红外光谱中的特征吸收峰的波数分别为：N-H弯曲振动峰σ_N-H，波数为1633cm^-1；吩嗪环的伸缩振动特征峰ν_吩嗪环，波数为1409cm^-1；苯环上的C-N-C伸缩振动峰ν_C-N-C，波数为1111cm^-1；C＝O伸缩振动峰ν_C＝O，波数为1686cm^-1；-NO₂的对称伸缩振动峰波数为1347cm^-1。

3.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述氯霉素与所述邻苯二胺的物质的量的比为1:(0.5～2)；所述电化学聚合的聚合圈数为20～40圈。

4.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述氯霉素和所述邻苯二胺的物质的量浓度分别为10mmol/L。

5.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述醋酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.1mol/L；所述扫描圈数为30圈。

6.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述洗脱剂为9:1(v/v)的无水甲醇-乙酸溶液、0.01mol/LNaOH溶液或0.01mol/LHCl溶液。

7.一种应用如权利要求1-6中任一项所述的氯霉素分子印迹电化学发光传感器检测氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)、采用三电极体系，确定氯霉素分子印迹电化学发光传感器的初始ECL强度ECL₀；其中，所述三电极体系包括：含有电化学发光试剂的pH为7.0的电解液，参比电极、对电极和工作电极，其中所述工作电极为氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

b)、配制不同已知C₁～C_n浓度的氯霉素溶液；

c)、将氯霉素分子印迹电化学发光传感器在C₁浓度的氯霉素溶液中浸泡指定时间，得到结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

d)、采用三电极体系，确定结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器ECL强度ECL₁；该三电极体系与步骤a)中的三电极体系的差别为：工作电极为结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

e)、用洗脱剂清洗结合C₁浓度氯霉素溶液的氯霉素分子印迹电化学发光传感器；

对已知C₂～C_n浓度的氯霉素溶液分别重复c)～e)步骤，即得到C₂～C_n浓度的氯霉素溶液对应的ECL强度，设为ECL₂～ECL_n；

f)、计算C₁～C_n浓度的氯霉素溶液对应的响应差值ΔECL₁～ΔECL_n，其中，ΔECL_i＝ECL₀–ECL_i，1≤i≤n；

g)、以氯霉素浓度C₁～C_n为横坐标或纵坐标，以响应差值ΔECL₁～ΔECL_n为纵坐标或横坐标建立标准曲线，得到氯霉素浓度与响应差值的线性方程；

h)、对某一未知浓度的氯霉素溶液重复c)～f)步骤，得到某一未知浓度的氯霉素溶液对应的响应差值，根据所述的线性方程，即可确定出未知浓度的氯霉素溶液的浓度。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述电解液为物质的量浓度为0.05～0.2moL/L的磷酸缓冲液，优选0.1mol/L的磷酸缓冲液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在与，所述的电化学发光试剂是三联吡啶钌或者其衍生物，所述三联吡啶钌或者其衍生物的物质的量浓度为0.05～5mmol/L，优选0.5mmol/L。

10.如权利要求9所述的检测氯霉素的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液中含有DNA，所述DNA的浓度为0.03～3mg/mL，优选0.3mg/mL。