CN112626242B - 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 - Google Patents

基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112626242B
CN112626242B CN202011449960.8A CN202011449960A CN112626242B CN 112626242 B CN112626242 B CN 112626242B CN 202011449960 A CN202011449960 A CN 202011449960A CN 112626242 B CN112626242 B CN 112626242B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
chain
salmonella typhimurium
dna
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011449960.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112626242A (zh
Inventor
郭智勇
卫文婷
郝婷婷
王照亮
林晗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN202011449960.8A priority Critical patent/CN112626242B/zh
Publication of CN112626242A publication Critical patent/CN112626242A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112626242B publication Critical patent/CN112626242B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/308—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells at least partially made of carbon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction

Abstract

本发明公开了基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法，特点是包括将DNA Walker摆臂链溶液和含待测食源性致病菌适配体的保护探针溶液等体积混合后反应后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液的步骤；将氨基化四氧化三铁和戊二醛混合，在室温下搅拌，磁清洗后悬浮于寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的Walker链溶液和发夹底物链混合液反应，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容后与待测溶液、取代链溶液和内切酶溶液混合孵育，取上清液进行荧光检测沉淀滴加在磁性玻碳电极上进行电化学发光检测，优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。

Description

基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源 性致病菌的方法
技术领域
本发明涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，尤其是涉及一种基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌是一种常见的厌氧革兰氏阴性细菌，广泛分布于环境中，它可以通过受污染的家禽，鸡蛋，牛奶，鱼和肉制品传播给人类。据估计每年由鼠伤寒沙门氏菌感染的肠炎可造成100万人死亡。随着人们对食品安全意识的增强，快速，高效，简单，特异性的鼠伤寒沙门氏菌检测方法的开发已成为食品安全卫生检查领域的必然趋势。
DNA Walker是一种模仿天然的分子运动的动态DNA步行器，核酸能沿着由DNA组装而成的轨道运动，其显著的运动性、可控性和加工性，在生物传感器中得到了广泛的应用。而核酸构象引发链取代利用的是Turberfield课题组提出的“远端立足点”概念。“远端立足点”是一段间隔区域将立足点区域与链取代分支迁移区域连接起来，使立足点区域和链取代分支迁移区域隔离开，这个区域可以起到减缓分支迁移过程的反应速率的作用，其为调控立足点介导的链取代反应提供了更多种可能。将核酸构象引发链取代和DNA Walker理论相结合，通过改变DNA间隔区域实现链取代从而触发DNA步行器运行，实现对非核酸目标物的检测。
荧光免疫检测技术专一性强、灵敏度高，可用于测量含量很低的生物活性化合物，例如蛋白质、激素、药物及微生物等。LC Green Plus作为新型无毒荧光染料激发波长为440-470nm，发射波长为470-520nm，可与DNA双链结合产生荧光，作为荧光信号标签。电化学发光（ECL）检测方法已被应用于许多生物分析领域，与传统的激光诱导发光探测器相比，因为省去了激发激光和光学滤波器，因此ECL检测仪器的复杂性和成本要小得多。目前，国内外还没有公开任何关于基于核酸构象引发链取代从而驱动DNA Walker的双信号检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学发光传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
（1）将10~20 µmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和10~20 µmol/L的含待测食源性致病菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，置于95 ℃变形8~12 min之后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液，其中摆臂链溶液和保护探针溶液的溶剂均为寡核苷酸贮存液；
（2）将3~5 µL 能嵌入双链间的核酸染料加入到500~600 µL 5~8 µM的发夹底物链溶液中，室温震摇 4~6 min，使核酸染料与DNA充分结合得到发夹底物链混合液；
（3）将1~2 mL 5~10 mg/mL 氨基化四氧化三铁和50~100 µL 戊二醛混合，在室温下搅拌50-70min，磁清洗后悬浮于2~5 mL 寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的50~60µL 5~10 µM 的受保护的DNA Walker链溶液和500~600 µL 5~8 µM 发夹底物链混合液，于35~38 ℃下反应20~40 min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至2~5 mL；
（4）将5~10 µL的含食源性致病菌的待测溶液、100~150 µL的步骤（3）得到的溶液、100~150 µL 0.1~0.5 µM 取代链溶液和1~3 µL 0.05~0.1 U/mL Nb. BbvCI内切酶溶液混合，在37 ℃孵育30 min，取上清液进行荧光检测，四氧化三铁沉淀滴加在磁性玻碳电极上进行电化学发光检测。
所述的食源性致病菌为鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或者副溶血性弧菌。
所述的鼠伤寒沙门氏菌适配体的序列为TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG；所述的保护探针的序列为：5'-CTTCAAGGCTAACATGGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGGAGGCAAGTGATCCGG-3'。
所述的金黄色葡萄球菌适配体的序列为：GCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT；所述的保护探针的序列5'-CTTCAAGGCTAACATGGGCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT GAGGCAAGTGATCCGG-3'。
所述的副溶血性弧菌适配体的序列为TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT；所述的保护探针的序列为5'-CTTCAAGGCTAACATGGTCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTGAGGCAAGTGATCCGG-3'。
步骤（1）中所述的DNA Walker摆臂链的序列为：5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTGGATC ACTTGCCTCAGCCT-3'。
步骤（2）中所述的发夹底物链的序列为：5'-Fc- CCATACCAGGCTGAGGCGATGTGTGTGGTATGGTTTTTTTTTT-NH2-3'。
步骤（4）中所述的取代链的序列为：5'-CCGGATCACTTGCCTCA CCATGTTAGCCTTGAAG-3'。
所述的寡核苷酸贮存液为pH=7~9的含1~3 mM EDTA和10~13 mM MgCl2•6H2O的30~50 mM Tris-HCl缓冲溶液。
发明原理：本发明旨在通过细菌与含适配体DNA片段的保护探针特异性结合后改变保护探针间隔区域引起DNA取代反应释放DNA摆臂链从而触发DNA Walker的运行，实现食源性致细菌鼠伤寒沙门氏菌的灵敏、准确、简单、快速检测。将链端修饰有氨基的发夹DNA和受保护的DNA Walker摆臂链、[Ru(dcbpy)3]2+通过氨基与氨基的键合作用组装在被戊二醛活化的氨基化四氧化三铁表面。当目标物鼠伤寒沙门氏菌存在时，保护探针的适配体片段与其特异性结合从而折叠适配体片段使其缩短，以匹配取代链的长度，进而发生链取代反应释放DNA Walker摆臂链并暴露出Nb.BbvCI的识别序列从而触发DNA Walker。摆臂链和发夹DNA通过碱基互补配对进行杂交形成新的双链DNA，而该DNA含有Nb.BbvCI的识别位点。因此，在Nb.BbvCI的作用下，能够对发夹DNA进行剪切，从而减少四氧化三铁上Fc的含量减弱抑制的[Ru(dcbpy)3]2+电化学发光，并释放发夹DNA双链间的核酸染料，使其进入与目标物鼠伤寒沙门氏菌相连的保护探针和取代链互补序列间形成荧光信号。因此，由核酸内切酶Nb.BbvCI剪切发夹DNA裂解引发了摆臂的自主行走。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）高灵敏度。采用DNA Walker技术实现信号放大，从而降低细菌的检测限。当细菌含量越多，释放的DNA Walker摆臂越多，在相同时间内被剪切的发夹DNA越多，越能削弱对[Ru(dcbpy)3]2+的抑制，电化学发光越强。
（2）操作方便。采用氨基化四氧化三铁作为DNA Walker基底，不仅提供较大的比表面积有助于DNA Walker摆臂和轨道的组装，而且由于四氧化三铁的磁性，磁清洗和制备磁吸附传感器时更快速、方便，有助于实验的快速操作。
（3）采用功能核酸构象引发链取代从而驱动DNA Walker。通过与鼠伤寒沙门氏菌特异性识别，保护探针鼠伤寒沙门氏菌适配体DNA片段发生折叠，从而使保护探针缩短已匹配取代链的长度。功能核酸构象引发链取代可用于实现对非核酸目标物的检测。
（4）两种相互验证的检测方法有助于避免检测结果的假阳性。采用电化学发光检测四氧化三铁悬浮液的沉淀部分，荧光免疫分析检测四氧化三铁悬浮液的上清液部分。两种信号相互验证，有助于避免检测结果的假阳性。
附图说明
图1为核酸构象引发链取代从而驱动DNA Walker对鼠伤寒沙门氏菌检测的流程图；
图2为电化学发光信号强度和鼠伤寒沙门氏菌浓度的关系；
图3为荧光信号强度和鼠伤寒沙门氏菌浓度的关系；
图4为该传感器分别对空白（black）、106 CFU/mL副溶血性弧菌（VP）、106 CFU/mL希瓦氏菌（SM）、106 CFU/mL阴沟肠杆菌（EC）、106 CFU/mL创伤杆菌（VV）、103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌（ST）和含103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的混合细菌（mixture）测得的电化学发光信号图；
图5为该传感器分别对空白（black）、106 CFU/mL副溶血性弧菌（VP）、106 CFU/mL希瓦氏菌（SM）、106 CFU/mL阴沟肠杆菌（EC）、106 CFU/mL创伤杆菌（VV）、103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌（ST）和含103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的混合细菌（mixture）测得的荧光信号图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
实施例1
一种基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，如图1所示，包括以下步骤：
（1）将15 µmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和15 µmol/L的含待测鼠伤寒沙门氏菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，置于95 ℃变形8~12 min之后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液；其中摆臂链溶液和保护探针溶液的溶剂均为寡核苷酸贮存液；鼠伤寒沙门氏菌适配体的序列为TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG；相应的保护探针的序列为：5'-CTTCAAGGCTAACATGGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGGAGGCAAGTGATCCGG-3'；DNA Walker摆臂链的序列为：5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTGGATC ACTTGCCTCAGCCT-3'；寡核苷酸贮存液为pH=7~9的含2mMEDTA和12 mM MgCl2•6H2O的40 mM Tris-HCl缓冲溶液；
（2）将4 µL 能嵌入双链间的核酸染料（LC Green Plus核酸染料）加入到550 µL 7µM的发夹底物链溶液中，室温震摇 4~6 min，使核酸染料与DNA充分结合得到发夹底物链混合液；其中发夹底物链的序列为：5'-Fc- CCATACCAGG CTGAGGCGAT GTGTGTGGTA TGGTTTTTTTTTT-NH2-3'；
（3）将1.5 mL 8 mg/mL 氨基化四氧化三铁和70 µL 戊二醛混合，在室温下搅拌60min，磁清洗后悬浮于3 mL 寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的55 µL 8 µM 的受保护的DNA Walker链溶液和500~600 µL 5~8 µM 发夹底物链混合液，于37 ℃下反应30 min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至3 mL；
（4）将8 µL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液、120 µL的步骤（3）得到的溶液、120 µL 0.3 µM 取代链溶液和2 µL 0.08 U/mL Nb. BbvCI内切酶溶液混合，在37 ℃孵育30min，取上清液进行荧光检测，四氧化三铁沉淀滴加在磁性玻碳电极上进行电化学发光检测，其中取代链的序列为：5'-CCGGATCACTTGCCTCA CCATGTTAGCCTTGAAG-3'。
ECL法检测鼠伤寒沙门氏菌：将反应后的Fe3O4滴加在磁性玻碳电极上作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，组成三电极体系放在电化学发光测试中进行测试。根据食源性致病菌不同浓度下释放的DNA Walker摆臂数量的不同，在相同时间内被剪切的发夹DNA也不同，导致对削弱 [Ru(dcbpy)3]2+的抑制不同。得到不同的电化学发光强度值并绘制电化学发光法的工作曲线，进而对待测溶液中鼠伤寒沙门氏菌浓度进行定量检测；当加入的鼠伤寒沙门氏菌浓度越高，释放的DNA Walker摆臂越多，在相同时间内被剪切的发夹DNA越多，越能削弱对[Ru(dcbpy)3]2+的抑制，电化学发光越强。检测不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的ECL强度-鼠伤寒沙门氏菌浓度关系，随着VP浓度增大，ECL强度依次增大。
如图2所示，不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的电化学发光强度(y)—鼠伤寒沙门氏菌浓度(x)对数线性关系，线性方程为y = 1145.28× logx +1194.31，相关系数R = 0.998，线性关系良好，可以用于未知样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。
荧光法检测鼠伤寒沙门氏菌：将反应后的上清液滴入荧光比色皿中，在激发光600nm时进行荧光强度检测。当鼠伤寒沙门氏菌存在时，保护探针的适配体片段与细菌特异性结合从而折叠适配体片段使其缩短，以匹配取代链的长度，进而发生链取代反应，与取代链进行碱基互补配对形成双链，核酸染料嵌入DNA双连间。鼠伤寒沙门氏菌浓度越高与含适配体片段的保护探针结合越多，发生连取代反应越多形成新的DNA双链越多从而导致荧光染料嵌入的位点越多，荧光信号越强。检测不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的荧光强度-鼠伤寒沙门氏菌浓度关系，随着VP浓度增大，荧光强度依次增大。
如图3所示，对不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的荧光信号强度 (y)—鼠伤寒沙门氏菌浓度(x)对数线性关系，线性方程为y =1421.90× logx-667.41，相关系数R = 0.998，线性关系良好，可以用于未知样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
（1）将10 µmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和10 µmol/L的含待测鼠伤寒沙门氏菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，寡核苷酸贮存液为pH=7的含1 mM EDTA和10mMMgCl2•6H2O的30 mM Tris-HCl缓冲溶液；
（2）将3 µL 能嵌入双链间的核酸染料（LC Green Plus核酸染料）加入到500 µL 8µM的发夹底物链溶液中，室温震摇 4~6 min；
（3）将1 mL 10 mg/mL 氨基化四氧化三铁和50 µL 戊二醛混合，在室温下搅拌50min，磁清洗后悬浮于2 mL 寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的50 µL 10 µM 的受保护的DNA Walker链溶液和500 µL 8 µM 发夹底物链混合液，于35 ℃下反应20min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至2 mL；
（4）将5 µL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液、100 µL的步骤（3）得到的溶液、100 µL 0.5 µM 取代链溶液和1 µL 0.1 U/mL Nb. BbvCI内切酶溶液混合。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
（1）将20 µmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和20 µmol/L的含待测鼠伤寒沙门氏菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，寡核苷酸贮存液为pH=9的含3 mM EDTA和13 mMMgCl2•6H2O的50 mM Tris-HCl缓冲溶液；
（2）将5 µL 能嵌入双链间的核酸染料（LC Green Plus核酸染料）加入到600 µL 5µM的发夹底物链溶液中，室温震摇 4~6 min；
（3）将2 mL 5 mg/mL 氨基化四氧化三铁和100 µL 戊二醛混合，在室温下搅拌70min，磁清洗后悬浮于5 mL 寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的60 µL 5 µM 的受保护的DNA Walker链溶液和600 µL 5 µM 发夹底物链混合液，于38 ℃下反应40 min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至5 mL；
（4）将10 µL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液、150 µL的步骤（3）得到的溶液、150µL 0.1 µM 取代链溶液和3 µL 0.05 U/mL Nb. BbvCI内切酶溶液混合。
实施例4
同上述实施例1，其区别在于：食源性致病菌为金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌适配体的序列为：GCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT相应保护探针的序列为5'-CTTCAAGGCTAACATGGGCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT GAGGCAAGTGATCCGG-3'。
实施例5
同上述实施例1，其区别在于：食源性致病菌为副溶血性弧菌，副溶血性弧菌适配体的序列为TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT；相应保护探针的序列为5'-CTTCAAGGCTAACATGGTCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTGAGGCAAGTGATCCGG-3'。
具体实施例二
图4所示，对空白（black）、106 CFU/mL副溶血性弧菌（VP）、106 CFU/mL希瓦氏菌（SM）、106 CFU/mL阴沟肠杆菌（EC）、106 CFU/mL创伤杆菌（VV）、103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌（ST）和含103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的混合细菌（mixture）测得的电化学发光信号图；从图中可以看出ECL检测方法对鼠伤寒沙门氏菌的检测有很好的选择性。
如图5所示，对空白（black）、106 CFU/mL副溶血性弧菌（VP）、106 CFU/mL希瓦氏菌（SM）、106 CFU/mL阴沟肠杆菌（EC）、106 CFU/mL创伤杆菌（VV）、103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌（ST）和含103 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的混合细菌（mixture）测得的电化学发光信号图；从图中可以看出荧光检测方法对鼠伤寒沙门氏菌的检测有很好的选择性。
综上所述，该方法检测鼠伤寒沙门氏菌的特异性在于适配体与细菌的特异性结合，因此该方法具有优越的选择性。
具体实施例三
为验证本发明在实际应用中的价值，在海水中加入鼠伤寒沙门氏菌的标准溶液作为实际样品，采用加标回收的方法对海水中不同浓度的食源性致病菌进行了检测，结果如表1所示；
表1海水样品的加标回收
Figure 8770DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，ECL法检测鼠伤寒沙门氏菌的回收率在91.8%～110.4%之间，相对标准偏差为 4.3%～11.0%，荧光法检测鼠伤寒沙门氏菌的回收率在92.7%～110.2%之间，相对标准偏差为 5.2%～10.9%，证明两者单独检测的准确性较好；采用电化学发光检测四氧化三铁悬浮液的沉淀部分，荧光免疫分析检测四氧化三铁悬浮液的上清液部分。两种信号相互验证，有助于避免检测结果的假阳性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌适配体（GTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG）
<400> 1
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 含鼠伤寒沙门氏菌适配体的保护探针（5'-CTTCAAGGCTAACATGGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGGAGGCAAGTGATCCGG-3'）
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌适配体（GCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTAT）
<400> 3
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 含金黄色葡萄球菌适配体的保护探针（5'-CTTCAAGGCTAACATGGGCGCCCTCACGTGGCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTATGAGGCAAGTGATCCGG-3'）
<400> 4
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌适配体（TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT）
<400> 5
40
<210> 6
<211> 73
<212> DNA
<213> 含副溶血性弧菌适配体的保护探针（5'-CTTCAAGGCTAACATGGTCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTGAGGCAAGTGATCCGG-3'）
<400> 6
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> DNA Walker摆臂链（5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTGGATCACTTGCCTCAGCCT-3'）
<400> 7
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 发夹底物链（5'-Fc-CCATACCAGGCTGAGGCGATGTGTGTGGTATGGTTTTTTTTTT-NH2-3'）
<400> 8
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 取代链（5'-CCGGATCACTTGCCTCACCATGTTAGCCTTGAAG-3'）
<400> 9

Claims (1)

1.一种非疾病诊断目的的基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将10～20μmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和10～20μmol/L的含待测鼠伤寒沙门氏菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，置于95℃变形8～12min之后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液，其中摆臂链溶液和保护探针溶液的溶剂均为寡核苷酸贮存液，所述的鼠伤寒沙门氏菌适配体的序列为TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG；所述的保护探针的序列为：5'-CTTCAAGGCTAACATGGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGGAGGCAAGTGATCCGG-3'，所述的DNA Walker摆臂链的序列为：5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTGGATCACTTGCCTCAGCCT-3'；
(2)将3～5μL能嵌入双链间的核酸染料加入到500～600μL 5～8μM的发夹底物链溶液中，室温震摇4～6min，使核酸染料与DNA充分结合得到发夹底物链混合液，其中所述的发夹底物链的序列为：5'-Fc-CCATACCAGGCTGAGGCGATGTGTGTGGTATGGTTTTTTTTTT-NH2-3'；
(3)将1～2mL 5～10mg/mL氨基化四氧化三铁和50～100μL戊二醛混合，在室温下搅拌50-70min，磁清洗后悬浮于2～5mL寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的50～60μL 5～10μM的受保护的DNA Walker链溶液和500～600μL 5～8μM发夹底物链混合液，于35～38℃下反应20～40min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至2～5mL，其中所述的寡核苷酸贮存液为pH＝7～9的含1～3mM EDTA和10～13mM MgCl2·6H2O的30～50mM Tris-HCl缓冲溶液；
(4)将5～10μL的含鼠伤寒沙门氏菌的待测溶液、100～150μL的步骤(3)得到的溶液、100～150μL 0.1～0.5μM取代链溶液和1～3μL 0.05～0.1U/mL Nb.BbvCI内切酶溶液混合，在37℃孵育30min，取上清液进行荧光检测，四氧化三铁沉淀滴加在磁性玻碳电极上进行电化学发光检测，其中所述的取代链的序列为：5'-CCGGATCACTTGCCTCACCATGTTAGCCTTGAAG-3'。
CN202011449960.8A 2020-12-11 2020-12-11 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 Active CN112626242B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011449960.8A CN112626242B (zh) 2020-12-11 2020-12-11 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011449960.8A CN112626242B (zh) 2020-12-11 2020-12-11 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112626242A CN112626242A (zh) 2021-04-09
CN112626242B true CN112626242B (zh) 2022-05-24

Family

ID=75309654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011449960.8A Active CN112626242B (zh) 2020-12-11 2020-12-11 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112626242B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113311151B (zh) * 2021-04-26 2023-08-22 齐鲁工业大学 一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法
CN114354701B (zh) * 2021-12-15 2024-02-13 宁波大学 基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法及其应用
CN114878647B (zh) * 2022-03-18 2024-04-09 江苏省农业科学院 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105675877A (zh) * 2016-03-01 2016-06-15 江南大学 一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法
EP3282020A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-14 Technische Universität Braunschweig Method for amplifying signals from single molecules and system or kit therefore
CN108375623A (zh) * 2018-01-12 2018-08-07 宁波大学 基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器的制备方法及其应用
CN108663418A (zh) * 2018-05-07 2018-10-16 福州大学 基于DNAWalker信号放大构建“Z”型光电适配体分析方法
CN108872582A (zh) * 2018-03-20 2018-11-23 安徽师范大学 一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用
CN108918509A (zh) * 2018-07-16 2018-11-30 青岛科技大学 一种基于CdSe量子点电致化学发光传感器的研制及其应用
CN108982483A (zh) * 2018-08-21 2018-12-11 青岛科技大学 一种基于Walker DNA和放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法
CN110006971A (zh) * 2019-03-12 2019-07-12 宁波大学 一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用
CN110093344A (zh) * 2019-05-13 2019-08-06 山东大学 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用
CN110129416A (zh) * 2019-06-03 2019-08-16 福建工程学院 DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法
CN110470714A (zh) * 2019-08-20 2019-11-19 青岛科技大学 一种基于dna步行器诱导构象转化和信号放大的电化学发光传感器及其应用
CN110904100A (zh) * 2019-12-05 2020-03-24 山东大学 一种轨道再生型dna步行器及应用
CN111474343A (zh) * 2020-03-11 2020-07-31 宁波大学 基于二维材料碳化钛Mxenes检测食源性致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法
CN111808925A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 福州大学 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10155797B2 (en) * 2015-09-11 2018-12-18 The Governors Of The University Of Alberta Binding-induced DNA nanomachines

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105675877A (zh) * 2016-03-01 2016-06-15 江南大学 一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法
EP3282020A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-14 Technische Universität Braunschweig Method for amplifying signals from single molecules and system or kit therefore
CN108375623A (zh) * 2018-01-12 2018-08-07 宁波大学 基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器的制备方法及其应用
CN108872582A (zh) * 2018-03-20 2018-11-23 安徽师范大学 一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用
CN108663418A (zh) * 2018-05-07 2018-10-16 福州大学 基于DNAWalker信号放大构建“Z”型光电适配体分析方法
CN108918509A (zh) * 2018-07-16 2018-11-30 青岛科技大学 一种基于CdSe量子点电致化学发光传感器的研制及其应用
CN108982483A (zh) * 2018-08-21 2018-12-11 青岛科技大学 一种基于Walker DNA和放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法
CN110006971A (zh) * 2019-03-12 2019-07-12 宁波大学 一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用
CN110093344A (zh) * 2019-05-13 2019-08-06 山东大学 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用
CN110129416A (zh) * 2019-06-03 2019-08-16 福建工程学院 DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法
CN110470714A (zh) * 2019-08-20 2019-11-19 青岛科技大学 一种基于dna步行器诱导构象转化和信号放大的电化学发光传感器及其应用
CN110904100A (zh) * 2019-12-05 2020-03-24 山东大学 一种轨道再生型dna步行器及应用
CN111474343A (zh) * 2020-03-11 2020-07-31 宁波大学 基于二维材料碳化钛Mxenes检测食源性致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法
CN111808925A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 福州大学 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A sensitive electrochemical strategy via multiple amplification reactions for the detection of E. coli O157: H7;Yan Li等;《Biosensors and Bioelectronics》;20191001;第147卷;111752 *
DNA walker-mediated biosensor for target-triggered triple-mode detection of Vibrio parahaemolyticus;Wenting Wei等;《Biosensors and Bioelectronics》;20210507;第186卷;113305 *
Stochastic DNA Dual-Walkers for Ultrafast Colorimetric Bacteria Detection;Haihong Yang等;《Anal. Chem.》;20200313;第92卷;4990-4995 *
分子印迹固相萃取-电化学发光检测牛奶中氯霉素;郝婷婷等;《分析试验室》;20120229;第31卷(第22期);105-108 *
基于快速伏安法电化学检测仪设计与实现;刘鹏等;《高技术通讯》;20191231;第29卷(第2期);195-201 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112626242A (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112626242B (zh) 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法
JP2809537B2 (ja) リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質
EP1448761B1 (en) An improvement in a method bacterial endospore quantification using lanthanide dipicolinate luminescence
CN110205394A (zh) 一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法
CN113340863B (zh) 一种无酶循环放大核酸适配体传感器及其制备方法和应用
CN102220417B (zh) 基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法
Yu et al. A comparative study of PCR product detection and quantitation by electrochemiluminescence and fluorescence
Liu et al. A novel method for sensitive detection of Escherichia coli O157: H7 based on an aptamer and hybridization chain reaction
CN111879926B (zh) 基于y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用
CN109402128A (zh) 黄曲霉毒素b1的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素b1检测试剂盒及检测方法
CA3179280A1 (en) Systems, devices and methods for analysis
CN110982916B (zh) 用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒
CN108318692A (zh) 基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
CN115308172A (zh) 用于检测恩诺沙星的基于结构转换的比率荧光适配体传感器及其应用
Guo et al. Label-free Detection of Zn2+ Based on G-quadruplex
CN112697763B (zh) 一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用
CN113340881B (zh) 目标物和氧化还原双响应适配体传感器及其制备方法和应用以及鱼腥藻毒素的定量检测方法
CN110387429B (zh) 用于大肠杆菌o157:h7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用
CN110698390B (zh) 一种识别亚硫酸氢根的荧光探针及其制备方法和检测方法
CN105675569B (zh) 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素a的方法及检测试剂盒
Kim et al. Development of MRSA and MRAB detection kit employing loop–mediated isothermal amplification and colorimetric indicator dye
CN113981119A (zh) 一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法
KR101437385B1 (ko) 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법
KR101971474B1 (ko) 벤질페니실린 검출용 핵산 압타머
Alhogail et al. Simple and rapid peptide nanoprobe biosensor for the detection of Legionellaceae

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant