CN113311151B - 一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯的荧光检测方法。本发明将可变构核酸适配体结构与球型核酸检测平台相结合，由于球型核酸的金纳米粒子表面设计了用于结合可变构核酸适配体“自由足”链的寡核苷酸链，又利用限制性内切酶在特定位点切割的特性，促使可变构核酸适配体“自由足”链可在金纳米粒子表面自由“行走”，设计成荧光信号放大的策略，扩大了痕量DEHP的检测范围，现场检测快速便携。与采用抗体识别检测目标物DEHP的现有技术相比，核酸适配体的特异识别性更好，结合力度更高，并且核酸适配体的制备时间相对抗体制备时间较短，且操作简单，更易于体外保存。
Description
技术领域
本发明属于有机污染物核酸检测技术领域，涉及一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，具体涉及一种基于可变构核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)的竞争性荧光检测方法。
背景技术
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一种由辛醇或异辛醇和邻苯二甲酸制成的有毒的增塑剂，除了乙酸纤维素、聚乙酸乙烯外，与绝大多数工业上使用的合成树脂和橡胶均有良好的相容性。由于其广泛的被应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和软管、乙烯基地板和墙纸、洗涤剂、润滑剂和个人护理产品等数百种产品中，同时也是一种雄激素拮抗剂，体内长期累积高剂量，可引起内分泌紊乱和人体免疫力下降，目前虽无法证实对人类是否致癌，但对动物会产生致癌反应。如欧洲食品安全机构(EFSA)规定，在人体内N,N-二乙基羟胺(DEHA)浓度达0.3mg/kg以上被认为是不安全的，而DEHP的浓度达到0.05mg/kg以上就被认为是不安全的。由于DEHP可作为包装材料的添加剂而被广泛使用，导致其在天然水体中的富集早已超出了国家饮用水的规定标准。因此，有必要对DEHP进行实时准确有效的监测与管理。
目前，DEHP的检测方法包括仪器分析法、免疫分析法和生物传感分析法。其中，DEHP的传统仪器分析法主要有气相色谱法、液相色谱法和分光光度法等。传统的仪器分析法耗时长、检测灵敏度低，且由于分析仪器昂贵、不易移动，阻碍了其在现场快速检测的应用。例如，GB/T5750.8-2006 12.1中使用液-液萃取填充柱气相色谱法测定生活饮用水及其水源水的DEHP就存在这些弊端。因此，快速便携是目前DEHP检测方法研究的重点。而免疫分析法又存在单克隆抗体制备时间长、多克隆抗体质量参差不齐及抗体识别靶分子假阳性等问题。而核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与对应的目标物进行高亲和力和强特异性的结合，为小分子目标物检测提供了一种新的高效快速识别的研究平台，由于其目标物种类范围广，具有良好的应用前景。因此，可以利用核酸适配体作为识别元件检测小分子有机污染物，并基于核酸适配体构建生物传感检测平台，由于目标识别、信号转导和跨不同种类生物分子的检测仪器存在巨大差异，所以开发通用检测平台非常具有挑战性。为了应对这一挑战，本发明将分析目标物的检测转化为其他信号输出，并通过放大平台建立稳定持续的信号输出量化分析目标物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，利用空间竞争抑制作用，基于可变构核酸适配体耦合球型核酸轨道平台，荧光检测水环境中的DEHP。利用可变构核酸适配体作为识别元件用于特异性结合DEHP，和在球型核酸表面“行走”，通过空间竞争作用抑制荧光信号产生，对比荧光信号变化值对DEHP的浓度进行量化。
术语说明：
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案如下：
一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，包括以下步骤：
将可变构核酸适配体与待测样品混合均匀，恒温反应30～60min；再加入限制性内切酶与球型核酸，10～20min后测定荧光信号值的变化，检测待测样品中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量；
所述可变构核酸适配体为茎环结构，包括“自由足”域和DEHP适配体域，可变构核酸适配体的碱基序列为：(5’-3’)CCTCAGCAACGCATAGGGTGCGACCACATACGCCCCATGTATGTCCCTTGGTTGTGCCCTATGCGTCCTCAGCA，碱基序列下划线部分为“自由足”域，其余部分为DEHP适配体域；
所述球型核酸是以金纳米粒子为核，功能性寡核苷酸链为壳，功能性寡核苷酸链的碱基序列为：(5’-3’)SH-TTTTTTTTTTGC*TGAGGAT-TAMRA，*为裂解位点，TAMRA为荧光基团，-SH为巯基。
根据本发明优选的，所述恒温反应的温度为35～40℃，进一步优选为37℃。
根据本发明优选的，所述限制性内切酶为Nt.BbvCI。
根据本发明优选的，所述可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为1～5nM，进一步优选为2.5nM。
根据本发明优选的，所述限制性内切酶在最终反应体系中的终浓度为0.1～0.5U/μL，进一步优选为0.2U/μL。
根据本发明优选的，所述球型核酸在最终反应体系中的终浓度为2-10nM，进一步优选为5nM。
根据本发明优选的，所述球型核酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
在反应器中，于剧烈搅拌下加热1wt％的HAuCl4溶液至沸腾，然后向其中加入30～40mM的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌，并反应10～20min，待溶液由纯黄色变为酒红色，移去热源，持续冷却至室温，得金纳米粒子溶液，于4℃避光保存备用；其中HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为(100～200):(3～5)；
(2)球型核酸的制备
将功能性寡核苷酸链溶解于二硫苏糖醇磷酸缓冲液(pH＝8)中，室温静置2～3h，然后用NAP-5柱洗脱除杂；将除杂后的50μM功能性寡核苷酸链与步骤(1)100μL金纳米粒子溶液混合，室温放置12h，加入20μL 3M NaCl溶液缓慢混合，10s超声处理，重复5次，间隔1h；室温放置24h；12000rpm离心30min，分离得到球型核酸，采用含有0.01％吐温20的PBS缓冲液洗涤3次后，分散于PBS缓冲液中，放置于4℃避光保存备用。
进一步优选的，步骤(2)中所述二硫苏糖醇磷酸缓冲液为二硫苏糖醇、Na2HPO4和KH2PO4的水溶液，其中，二硫苏糖醇浓度为0.45mM，Na2HPO4浓度为6.31mM，KH2PO4浓度为0.35mM。
进一步优选的，步骤(2)中所述PBS缓冲液(pH＝7)的配方为：0.1mol/LKH2PO4溶液和0.1mol/L Na2HPO4溶液，按照4：6的体积比混合均匀。
根据本发明优选的，采用标准加入法或标准曲线法检测待测样品中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量。
根据本发明优选的，所述待测样品在检测前依次采用0.45μm微孔有机滤膜及SPE柱除去同源干扰物质，并浓缩处理。
本发明中，按照国标GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法-水样的采集与保存》采集储存待测样品。
本发明的技术特点：
本发明的反应原理如图1所示，是将可变构核酸适配体与DEHP和球型核酸(SNA)之间竞争性相互作用转化为荧光信号，检测DEHP含量；其中，可变构核酸适配体的结构示意图如图2所示，可变构核酸适配体由两部分组成，分别是3’和5’端带有相同的八个碱基序列的“自由足”域和用于识别DEHP的适配体域；球型核酸(SNA)是以金纳米粒子为核，功能性寡核苷酸链为壳，功能性寡核苷酸链构成了可变构核酸适配体的于金纳米粒子表面“行走”的轨道。在没有DEHP存在的条件下，可变构核酸适配体保持稳定的颈环结构，将其加入到含有球型核酸(SNA)的溶液环境中，可变构核酸适配体的“自由足”域与球型核酸(SNA)的寡核苷酸链结合，形成双链，当加入限制性内切酶后，发生特异性酶切反应导致寡核苷酸链断裂，修饰于寡核苷酸链顶端的荧光基团从金纳米粒子(AuNPs)表面脱落，产生荧光信号，可变构核酸适配体的“自由足”域会与金纳米粒子(AuNPs)表面的下一个寡核苷酸链结合，循环至金纳米粒子(AuNPs)表面的寡核苷酸链全部断裂。在有DEHP存在的条件下，可变构核酸适配体的适配体域与DEHP产生特异性结合，形成三维的团状聚合物，由于该聚合物的空间结构相对较大，“自由足”域和球型核酸(SNA)寡核苷酸链的特异性结合、“自由足”域和DEHP的特异性结合产生竞争，使溶液中球型核酸(SNA)维持稳定状态，当加入限制性内切酶后，由于没有其切割位点，不产生荧光信号值变化。因此，通过荧光信号值的变化量来量化水体表层中DEHP的浓度。
因此，本发明开发了一种竞争抑制的可变构核酸适配体荧光传感检测平台，将可变构核酸适配体设计为包含“自由足”和适配体两域的颈环型探针，用于识别目标污染物，以及在球型核酸表面“行走”，通过可变构核酸适配体与目标污染物的结合，产生空间竞争性，抑制球型核酸荧光信号输出，可以将广泛的生物分子相互作用转化为统一的荧光信号条形码，通过荧光信号的变化值来准确量化水环境中的DEHP，该方法作为单一分析目标物的检测方法可以应用于水环境中分析目标物的现场检测。
本发明的有益效果：
1.与采用抗体识别检测目标物DEHP的现有技术相比，核酸适配体的特异识别性更好，结合力度更高，并且核酸适配体的制备时间相对抗体制备时间较短，且操作简单，更易于体外保存。
2.本发明将核酸适配体设计为可自由“行走”的可变构核酸适配体结构，相对于单独的适配体结构增加了序列相同的两条“自由足”链，可用于后续的信号转导设计，可调控性相较于单独的核酸适配体结构更高。
3.本发明将可变构核酸适配体结构与球型核酸检测平台相结合，由于球型核酸的金纳米粒子表面设计了用于结合可变构核酸适配体“自由足”链的寡核苷酸链，又利用限制性内切酶在特定位点切割的特性，促使可变构核酸适配体“自由足”链可在金纳米粒子表面自由“行走”，设计成荧光信号放大的策略，扩大了痕量DEHP的检测范围，现场检测快速便携。
附图说明
图1为本发明所述方法的原理图。
图2为可变构核酸适配体结构示意图。
图3为实施例1样品检测的工作曲线图。
图4为实施例2样品检测的工作曲线图。
图5为实施例3样品检测的工作曲线图。
图6为DEHP的标准曲线图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明涉及的保护范围不限于此。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作步骤。
实施例中涉及的核苷酸序列：
可变构核酸适配体的碱基序列为：(5’-3’)CCTCAGCAACGCATAGGGTGCGACCACATACGCCCCATGTATGTCCCTTGGTTGTGCCCTATGCGTCCTCAGCA，碱基序列下划线部分为“自由足”域，其余部分为DEHP适配体域；
功能性寡核苷酸链的碱基序列为：(5’-3’)SH-TTTTTTTTTTGC*TGAGGAT-TAMRA，*为裂解位点，TAMRA为荧光试剂，-SH为巯基，功能性寡核苷酸链通过巯基与金纳米粒子核连接，构成球型核酸；
上述核苷酸序列均由宝生物工程(大连)有限公司代理合成。
二硫苏糖醇磷酸缓冲液为二硫苏糖醇、Na2HPO4和KH2PO4的水溶液，其中，二硫苏糖醇浓度为0.45mM，Na2HPO4浓度为6.31mM，KH2PO4浓度为0.35mM。
实施例1
一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
在500mL的三颈烧瓶中，于剧烈搅拌下加热100mL 1wt％的HAuCl4溶液至沸腾，然后向其中加入5mL、38.8mM柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌，并反应15min，待溶液由纯黄色变为酒红色，移去热源，持续冷却至室温，得金纳米粒子溶液，于4℃避光保存备用；
(2)球型核酸的制备
将功能性寡核苷酸链溶解于二硫苏糖醇磷酸缓冲液(pH＝8)中，室温静置2h，然后用NAP-5柱洗脱除杂；将除杂后的50μM功能性寡核苷酸链与步骤(1)100μL金纳米粒子溶液混合，室温放置12h，加入20μL 3M NaCl溶液缓慢混合，10s超声处理，重复5次，间隔1h，室温放置24h；12000rpm离心30min，从反应体系中分离出球型核酸，用含有0.01％吐温20的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤球型核酸3次，再重新分散于PBS缓冲液中，球型核酸的浓度为100nM；放置于4℃避光保存备用；
(3)待测样品检测：
按照国标GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法-水样的采集与保存》采集储存，量取1L人工配置废水的微表层样品(该废水样品包含有50ng/L DEHP、25ng/L邻苯二甲酸的丁苄酯(BBP)、10ng/L邻苯二甲酸二(2-丙基庚)酯(DPHP)、20ng/L萘、10ng/L 3,3’,4,4’-四氯联苯(PCB 77)以及其他悬浮颗粒物)；通过0.45μm微孔有机滤膜，加入磷酸或氨水调节pH至中性；采用SPE柱进行样品纯化，分3次加入甲醇溶液2mL活化SPE柱，用去离子水洗脱SPE柱的活化剂，以1mL/min的流速，使待测样品全部通过SPE柱后，然后用氮气吹干SPE柱，加1mL 5％的甲醇水溶液，让其缓缓通过，以除去氯苯、多氯联苯及多环芳烃等同源干扰物质，通入净化空气10min，干燥SPE柱；用正己烷溶液10mL分3次洗脱(4、3、3mL)，收集3次洗脱液，浓缩定量装置浓缩至1mL；然后，按照标准加入法计算浓缩样品中DEHP含量，具体步骤如下：
取7份10μL浓缩水样，分别加入10μL浓度为1，2，4，8，12，16，20μg/L的DEHP标准液，与可变构核酸适配体溶液混合均匀，37℃恒温反应30min；再添加2μL、10U/μL限制性内切酶(Nb.BbvCI)与5μL步骤(2)得到的球型核酸，混合均匀并定容至100μL，可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为2.5nM；利用多功能微孔板检测仪，测定其20min后的荧光信号值变化。
按照标准加入法得出工作曲线如图3所示，其回归线性方程为y＝9.05x+23.05，R2＝0.999。
经工作曲线得出检测的最终反应体系中DEHP浓度为5.84μg/L，计算出待测样品中的DEHP的浓度为58.44ng/L，样品回收率为116.69％。
实施例2
一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，与实施例1的不同之处在于，两者的待测样品中各物质的含量有所不同，具体包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
在500mL的三颈烧瓶中，于剧烈搅拌下加热100mL1wt％的HAuCl4溶液至沸腾，然后向其中加入5mL、38.8mM柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌，并反应15min，待溶液由纯黄色变为酒红色，移去热源，持续冷却至室温，得金纳米粒子溶液于4℃避光保存备用；
(2)球型核酸的制备
将功能性寡核苷酸链溶解于二硫苏糖醇磷酸缓冲液(pH＝8)中，室温静置2h，然后用NAP-5柱洗脱除杂；将除杂后的50μM功能性寡核苷酸链与步骤(1)100μL金纳米粒子溶液混合，室温放置12h，加入20μL 3M NaCl溶液缓慢混合，10s超声处理，重复5次，间隔1h，室温放置24h；12000rpm离心30min，从反应体系中分离出球型核酸，用含有0.01％吐温20的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤球型核酸3次，再重新分散于PBS缓冲液中，球型核酸的浓度为100nM；放置于4℃避光保存备用；
(3)待测样品检测：
按照国标GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法-水样的采集与保存》采集储存，量取1L人工配置废水的微表层样品(该废水样品包含有100ng/L DEHP、30ng/LBBP、40ng/LDPHP、35ng/L萘、55ng/L PCB 77以及其他悬浮颗粒物)；通过0.45μm微孔有机滤膜，加入磷酸或氨水调节pH至中性；采用SPE柱进行样品纯化，分3次加入甲醇溶液2mL活化SPE柱，用去离子水洗脱SPE柱的活化剂，以1mL/min的流速，使待测样品全部通过SPE柱后，然后用氮气吹干SPE柱，加1mL 5％的甲醇水溶液，让其缓缓通过，以除去有机氯农药、氯苯、多氯联苯及多环芳烃等同源干扰物质，通入净化空气10min，干燥SPE柱；用正己烷溶液10mL分3次洗脱(4、3、3mL)，收集3次洗脱液，浓缩定量装置浓缩至1mL；然后，按照标准加入法计算浓缩样品中DEHP含量，具体步骤如下：
取7份10μL浓缩水样，分别加入10μL浓度为1，2，4，8，12，16，20μg/L的DEHP标准液，与可变构核酸适配体溶液混合均匀，37℃恒温反应30min；再添加2μL、10U/μL限制性内切酶(Nb.BbvCI)与5μL步骤(2)得到的球型核酸，混合均匀并定容至100μL，可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为2.5nM；利用多功能微孔板检测仪，测定其20min后的荧光信号值变化。
按照标准加入法得出工作曲线如图4所示，其回归线性方程为y＝8.96x+31.08，R2＝0.998。
经工作曲线得出检测的最终反应体系中DEHP浓度为11.07μg/L，计算出待测样品中的DEHP浓度为110.7ng/L，样品回收率为110.71％。
实施例3
一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，与实施例1的不同之处在于，两者的待测样品中各物质的含量略有不同，具体包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
在500mL的三颈烧瓶中，于剧烈搅拌下加热100mL1wt％的HAuCl4溶液至沸腾，然后向其中加入5mL、38.8mM柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌，并反应15min，待溶液由纯黄色变为酒红色，移去热源，持续冷却至室温，得金纳米粒子溶液，于4℃避光保存备用；
(2)球型核酸的制备
将功能性寡核苷酸链溶解于二硫苏糖醇磷酸缓冲液(pH＝8)中，室温静置2h，然后用NAP-5柱洗脱除杂；将除杂后的50μM功能性寡核苷酸链与步骤(1)100μL金纳米粒子溶液混合，室温放置12h，加入20μL 3M NaCl溶液缓慢混合，10s超声处理，重复5次，间隔1h，室温放置24h；12000rpm离心30min，从反应体系中分离出球型核酸，用含有0.01％吐温20的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤球型核酸3次，再重新分散于PBS缓冲液中，球型核酸的浓度为100nM；放置于4℃避光保存备用；
(3)待测样品检测：
按照国标GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法-水样的采集与保存》采集储存，量取1L人工配置废水的微表层样品(该废水样品包含有50ng/L DEHP、15ng/L BBP、5ng/LDPHP、10ng/L萘、5ng/L PCB 77以及其他悬浮颗粒物)；通过0.45μm微孔有机滤膜，加入磷酸或氨水调节pH至中性；采用SPE柱进行样品纯化，分3次加入甲醇溶液2mL活化SPE柱，用去离子水洗脱SPE柱的活化剂，以1mL/min的流速，使待测样品全部通过SPE柱后，然后用氮气吹干SPE柱，加1mL 5％的甲醇水溶液，让其缓缓通过，以除去有机氯农药、氯苯、多氯联苯及多环芳烃等同源干扰物质，通入净化空气10min，干燥SPE柱；用正己烷溶液10mL分3次洗脱(4、3、3mL)，收集3次洗脱液，浓缩定量装置浓缩至1mL；然后，按照标准加入法计算浓缩样品中DEHP含量，具体步骤如下：
取7份10μL浓缩水样，分别加入10μL浓度为1，2，4，8，12，16，20μg/L的DEHP标准液，与可变构核酸适配体溶液混合均匀，37℃恒温反应30min；再添加2μL、10U/μL限制性内切酶(Nb.BbvCI)与5μL步骤(2)得到的球型核酸，混合均匀并定容至100μL，可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为2.5nM；利用多功能微孔板检测仪，测定其20min后的荧光信号值变化。
按照标准加入法得出工作曲线如图5所示，其回归线性方程为y＝9.29x+22.61，R2＝0.999。
经工作曲线得出检测的最终反应体系中DEHP浓度为5.41μg/L，计算出水样中的DEHP浓度为54.1ng/L，样品回收率为108.2％。
实施例4
采用标准曲线法检测邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量
于37℃下，将可变构核酸适配体分别与10μL浓度为0，0.1，1，2，4，6，8，12，16，20μg/L的DEHP标准液混合均匀，37℃恒温反应30min；添加2μL10 U/μL限制性内切酶(Nb.BbvCI)与5μL实施例1步骤(2)得到的球型核酸，混合均匀并定容至100μL，可变构核酸适配体在反应体系中的终浓度为2.5nM；利用多功能微孔板检测仪，测定其20min后的荧光信号值变化；
由以上结果绘制标准曲线，结果如图6所示，其回归线性方程为y＝8.47x+7.35，R2＝0.998，标准曲线线性良好，可用于检测邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量。
采用标准曲线法检测邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量，线性检测范围为1～20μg/L；最低检测限为1.008μg/L(遵循3σ/斜率原则)。
Claims (10)
1.一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将可变构核酸适配体与待测样品混合均匀，恒温反应30~60min；再加入限制性内切酶与球型核酸，10~20min后测定荧光信号值的变化，检测待测样品中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量；
所述可变构核酸适配体为茎环结构，包括“自由足”域和DEHP适配体域，可变构核酸适配体的碱基序列为：（5’-3’）CCTCAGCAACGCATAGGGTGCGACCACATACGCCCCATGTATGTCCCTTGGTTGTGCCCTATGCGTCCTCAGCA，碱基序列下划线部分为“自由足”域，其余部分为DEHP适配体域；
所述球型核酸是以金纳米粒子为核，功能性寡核苷酸链为壳，功能性寡核苷酸链的碱基序列为：（5’-3’）SH-TTTTTTTTTTGC*TGAGGAT-TAMRA，*为裂解位点，TAMRA为荧光基团，-SH为巯基。
2.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述恒温反应的温度为35~40℃。
3.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Nt.BbvCI。
4.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为1~5nM。
5.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶在最终反应体系中的终浓度为0.1~0.5 U/µL。
6.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述球型核酸在最终反应体系中的终浓度为2-10 nM。
7.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述球型核酸的制备方法，包括如下步骤：
（1）金纳米粒子的制备
在反应器中，于剧烈搅拌下加热1wt%的HAuCl4溶液至沸腾，然后向其中加入30~40mM的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌，并反应10 ~ 20 min，待溶液由纯黄色变为酒红色，移去热源，持续冷却至室温，得金纳米粒子溶液，于4℃避光保存备用；其中HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为（100~200）:（3~5）；
（2）球型核酸的制备
将功能性寡核苷酸链溶解于pH=8的二硫苏糖醇磷酸缓冲液中，室温静置2 ~ 3 h，然后用NAP-5柱洗脱除杂；将除杂后的50 μM功能性寡核苷酸链与步骤（1）100 μL金纳米粒子溶液混合，室温放置12h，加入20μL 3 M NaCl溶液缓慢混合，10 s超声处理，重复5次，间隔1h；室温放置24h；12000 rpm离心30min，分离得到球型核酸，采用含有0.01%吐温20的PBS缓冲液洗涤3次后，分散于PBS缓冲液中，放置于4℃避光保存备用。
8.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述二硫苏糖醇磷酸缓冲液为二硫苏糖醇、Na2HPO4和KH2PO4的水溶液，其中，二硫苏糖醇浓度为0.45 mM，Na2HPO4浓度为6.31 mM，KH2PO4浓度为0.35 mM。
9.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PBS缓冲液的配方为：0.1 mol/LKH2PO4溶液和0.1 mol/L Na2HPO4溶液，按照4：6的体积比混合均匀，pH=7。
10.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，采用标准加入法或标准曲线法检测待测样品中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的含量。
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| CN202110454220.1A Active CN113311151B (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的荧光检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113311151B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018014025A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Ji Hoon Lee | Chemiluminescent biosensor for detecting coagulation factors |
| CN109828120A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-31 | 南京大学 | 基于靶标激发金纳米粒子表面dna循环的蛋白质荧光分析方法 |
| CN110618112A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-12-27 | 安徽师范大学 | 一种基于AuNPs@ZIF-8的适配体荧光传感器的制备方法及其应用 |
| CN112626242A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-04-09 | 宁波大学 | 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 |
-
2021
- 2021-04-26 CN CN202110454220.1A patent/CN113311151B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018014025A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Ji Hoon Lee | Chemiluminescent biosensor for detecting coagulation factors |
| CN109828120A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-31 | 南京大学 | 基于靶标激发金纳米粒子表面dna循环的蛋白质荧光分析方法 |
| CN110618112A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-12-27 | 安徽师范大学 | 一种基于AuNPs@ZIF-8的适配体荧光传感器的制备方法及其应用 |
| CN112626242A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-04-09 | 宁波大学 | 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Engineering of exosome-triggered enzyme-powered DNA motors for highly sensitive fluorescence detection of tumor-derived exosomes;Yanyan Yu et al;Biosensors and Bioelectronics;第167卷;112482 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113311151A (zh) | 2021-08-27 |
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