CN111879926B - 基于y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用，比色法包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，具体为：1）将DNA1与DNA2溶于反应缓冲体系中在85~95℃条件下加热5~10分钟，自然冷却到室温；2）经步骤1）后，在其所得体系继续加入3个茎环结构、比色信号探针SP，85~95℃条件下加热5~10分钟，自然冷却到室温；3）经步骤2）后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25~65℃条件下孵育30~60分钟，在步骤3）所得体系内加入氯化血红素、2,2'‑联氮‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸，混匀后室温放置10~40分钟，再加入H2O2，混匀后立即观察颜色变化；具有灵敏度高、成本低和结果可视化等优点，将在食品安全和环境监测领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及比色传感技术领域，具体的说，基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用。
背景技术
沙门氏菌是一种最重要的人畜共患病原菌，极其危害人类健康和畜牧养殖业的发展。而鼠伤寒沙门氏菌是目前已知的2500多种血清型中最为常见的一种，感染发病率居所有沙门氏菌之首。鼠伤寒沙门氏菌普遍的存在于蛋肉类产品及乳制品。即使极低浓度的鼠伤寒沙门氏菌依然可以引起人类的各种临床疾病，例如急性肠胃炎、败血症、以及败血症引发的各种内脏损伤等，有的病甚至可能致死。
目前鼠伤寒沙门氏菌的传统检测方法主要包括基于培养、聚合酶链式反应及其酶联免疫吸附的方法，这些方法普遍存在耗时耗力、操作繁琐、成本高、需要专业的仪器设备和操作人员的问题。随着人们对食品安全问题关注度的不断增长，传统方法已经不能满足人们的检测需要，急需发展一种操作简单、低成本和高灵敏集成的方法。比色传感器是光学传感器的一种，其信号的产生是通过裸眼可见的颜色变化实现的，因此无需专业的分析设备和操作人员监测信号，从而成为最具潜力发展成为“床旁检测”的一种方法。然而目前已报道的比色法对于鼠伤寒沙门氏菌检测普遍面临灵敏度低、不能直接检测菌体、涉及DNA提取或抗体固定等预处理和繁琐的步骤、需昂贵的特异性标记等问题，应用前景并不乐观。因此，制备一种集高灵敏度、低成本和操作简单于一体的比色法检测鼠伤寒沙门氏菌在食品安全和环境卫生等领域具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用，具有灵敏度高、成本低和结果可视化等优点，将在食品安全和环境监测领域具有良好的应用前景。
本发明通过下述技术方案实现：基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，该比色法通过Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系和G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系实现，其中，传感体系包括针对目标细菌的DNA1和DNA2、组装形成Y形结构的3个茎环结构(HPA、HPB、HPC)、比色信号探针SP、切刻内切酶Nt.BbvCI以及反应缓冲体系；所述DNA1和DNA2、3个茎环结构以及比色信号探针SP序列如序列表所示。
其中，DNA1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；DNA2具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；茎环结构HPA具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；茎环结构HPB具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；茎环结构HPC具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；比色信号探针SP具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
所述比色检测体系包括氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、H2O2。
在具体实现时，该比色法包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，所述制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系的具体方法为：
1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6溶于反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；
2)经步骤1)后，在其所得体系继续加入茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC、比色信号探针SP后85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；
3)经步骤2)后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟；
进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：还包括制备G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系：在所述步骤3)所得体系内加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟，再加入H2O2，混匀后立即观察颜色变化。
进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述的氯化血红素的浓度为0.2～1.6μM，所述的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度为0.5～3.5mM，所述的H2O2的浓度为2～6mM。
进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述DNA1与DNA2摩尔比为1:2～6，优选的DNA1与DNA2摩尔比为1:3；所述的3个茎环结构的浓度，即茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC的浓度皆为50～200nM，优选的3个茎环结构都浓度为100nM；所述比色信号探针SP浓度为100～500nM，优选都比色信号探针SP浓度为300nM；所述切刻内切酶Nt.BbvCI浓度为1～10U mL-1。
进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述3个茎环结构采用HPA、HPB、HPC构成。
进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述反应缓冲体系包括20～60mM醋酸钾、5～30mM Tris-醋酸、5～20mM醋酸镁，且反应缓冲体系pH 7～9。
采用所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用，包括下述步骤：
(1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6加入反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，混合均匀，在30～～40℃条件下孵育30～120分钟；然后加入50～200nM的茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC与100～500nM的比色信号探针SP在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入1～10U mL-1的切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟；
(2)取步骤(1)所得体系加入0.2～1.6μM氯化血红素和0.5～3.5mM2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟；
(3)向步骤(2)所得的反应体系中加入2～6mM H2O2，混匀后，立即观察溶液颜色变化。
当目标物(即鼠伤寒沙门氏菌)不存在时，比色信号探针SP稳定存在，末端的G-四链体序列由于相互“临近”而形成G-四链体结构，溶液呈现出绿色。而目标物存在时，会与DNA1中的适配体序列结合，导致DNA1-DNA2复合体结构不稳定而解旋，暴露出DNA1中引发链序列。引发链引发立足点介导的链置换反应自组装形成Y形结构，Y形结构的每一个分支末端与含有G-四链体序列的比色信号探针SP结合，比色信号探针SP在切刻内切酶的作用下被酶切成两段，使G-四链体序列“远离”而不能形成G-四链体结构。因此，随着检测体系中目标物浓度的增加，溶液呈现出由绿色到无色的颜色变化，实现可视化定性定量鼠伤寒沙门氏菌。该比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用检出限低至42CFU mL-1，具有强抗干扰能力，并且该比色法在乳制品和肉类中依然具有良好的检测性能。
基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在鼠伤寒沙门氏菌检测的抗干扰性能中的应用。
抗干扰性能分析：浓度为1×108CFU mL-1的铜绿假单胞杆菌、志赫氏菌、大肠杆菌(ATCC 25922)以及肠炎沙门氏菌分别与浓度为1×106CFU mL-1鼠伤寒沙门氏菌混合均匀后，用本发明比色法检测上述4种样品，最后用紫外-可见光谱仪测定信号值。
基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在牛奶样品和猪肉样品分析中的应用。
实际样品处理具体为：将脱脂奶粉溶于反应缓冲体系制备成6.25g/L的牛奶缓冲液，牛奶缓冲液8000rpm离心20分钟除去蛋白质沉淀，然后将牛奶缓冲液煮沸灭菌冷却至室温后，即得牛奶缓冲液，备用。取一片无菌猪肉浸泡于反应缓冲体系1小时，浸泡过后的溶液作为猪肉缓冲液备用。以上两种缓冲液(牛奶缓冲液、猪肉缓冲液)中加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌后，用本发明比色法进行检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明首次将切刻内切酶信号放大反应应用于Y形结构的每一个分支可以显著提高检测灵敏度。
本发明解决现有技术比色法在鼠伤寒沙门氏菌检测中存在的问题，能够实现鼠伤寒沙门氏菌高灵敏、低成本的检测。
本发明比色法可以根据检测物改变核酸适配体的序列实现通用性，检测范围广，由于核酸适配体为一段通过体外筛选技术得到的寡核苷酸序，由于不同的检测物可以与其相应的核酸适配体特异性结合，所以就本发明比色法而言，只需更换不同的适配体序列就可以实现其他物质的检测。
本发明用于检测鼠伤寒沙门氏菌成本低无需标记、可直接检测菌体无需DNA提取、操作简单、检测结果裸眼可见无需专业的分析仪器设备。
本发明所述比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用首先通过鼠伤寒沙门氏菌与DNA1-DNA2复合体孵育暴露出引发链，引发链引发立足点介导的链置换反应自组装形成Y形结构，然后通过在Y形结构末端应用切刻内切酶信号放大反应使比色信号探针SP不能形成G-四链体结构。最后在样品中加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、H2O2，通过紫外-可见光谱测定信号值，建立吸光强度与细菌浓度间的定量关系，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的定性定量分析。
本发明用于检测鼠伤寒沙门氏菌抗干扰能力强且可应用于实际样品检测分析。
附图说明
图1为比色法检测鼠伤寒沙门氏菌的原理图，当目标物(鼠伤寒沙门氏菌)不存在时，比色信号探针SP稳定存在，末端的G-四链体序列由于相互“临近”而形成G-四链体结构，溶液呈现出绿色。而目标物存在时，会与DNA1中的适配体序列结合，导致DNA1-DNA2复合体结构不稳定而解旋，暴露出DNA1中引发链序列。引发链引发立足点介导的链置换反应自组装形成Y形结构，Y形结构的每一个分支末端与含有G-四链体序列的信号探针结合，信号探针在切刻内切酶的作用下被酶切成两段，使G-四链体序列“远离”而不能形成G-四链体结构。因此，随着检测体系中目标物浓度的增加，溶液呈现出由绿色到无色的颜色变化，实现可视化的定性定量鼠伤寒沙门氏菌。
图2为本发明的比色法对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的显色图，鼠伤寒沙门氏菌的浓度依次为1×107CFU mL-1、1×106CFU mL-1、1×105CFU mL-1、1×104CFU mL-1、1×103CFUmL-1、1×102CFU mL-1，可以看出，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度的减小，溶液绿色越来越深，因此可以通过裸眼观察溶液颜色变化和深浅判断鼠伤寒沙门氏菌的浓度大小。
图3为本发明对鼠伤寒沙门氏菌检测的抗干扰实验。比色法对仅存在鼠伤寒沙门氏菌和其他非目标干扰菌(铜绿假单胞杆菌、志赫氏菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌)同时存在时的信号响应误差不超过10％，说明该比色法对鼠伤寒沙门氏菌的检测具有很强的抗干扰能力。
图4为本发明的比色法对不同加标浓度的实际样品检测结果。可以看出，牛奶和猪肉样品中的加标回收率范围在95％～108％，相对标准偏差的范围在4.1％～6.7％。此外，平板计数法检测结果与该比色法检测结果相比，误差不超过9.2％。表明该比色法可以对实际样品进行检测分析。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1：
基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，该比色法通过Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系和G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系实现，其中，传感体系包括针对目标细菌的DNA1和DNA2、组装形成Y形结构的3个茎环结构(HPA、HPB、HPC)、比色信号探针SP、切刻内切酶Nt.BbvCI以及反应缓冲体系；所述DNA1和DNA2、3个茎环结构以及比色信号探针SP序列如序列表所示。
其中，DNA1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；DNA2具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；茎环结构HPA具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；茎环结构HPB具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；茎环结构HPC具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；比色信号探针SP具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
所述比色检测体系包括氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、H2O2。
在具体实现时，该比色法包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，所述制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系的具体方法为：
1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6加入反应缓冲体系中在85～95℃(优选为95℃)条件下加热5～10分钟(优选为5min)，自然冷却到室温；
2)经步骤1)后，在其所得体系继续加入3个茎环结构(HPA、HPB、HPC)、比色信号探针SP在85～95℃(优选为95℃)条件下加热5～10分钟(优选为5min)，自然冷却到室温；
3)经步骤2)后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃(优选为37℃)条件下孵育30～60分钟(优选为30min)。
实施例2：
本实施例是在上述实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：还包括制备G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系：在所述步骤3)所得体系内加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟(优选为10min)，再加入H2O2，混匀后立即观察颜色变化。
实施例3：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述的氯化血红素的浓度为0.2～1.6μM(优选为0.8μM)，所述的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度为0.5～3.5mM(优选为3mM)，所述的H2O2的浓度为2～6mM(优选为4.4mM)。
实施例4：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述DNA1与DNA2摩尔比为1:2～6，优选的DNA1与DNA2摩尔比为1:3；所述的3个茎环结构的浓度，即HPA、HPB、HPC都浓度皆为50～200nM，优选的3个茎环结构都浓度为100nM；所述比色信号探针SP浓度为100～500nM，优选都比色信号探针SP浓度为300nM；所述切刻内切酶Nt.BbvCI浓度为1～10U mL-1(优选为5U mL-1)。
实施例5：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述3个茎环结构采用HPA、HPB、HPC构成。
实施例6：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步为更好都实现本发明所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，特别采用下述设置方式：所述反应缓冲体系包括20～60mM(优选为50mM)醋酸钾、5～30mM(优选为20mM)Tris-醋酸、5～20mM(优选为10mM)醋酸镁，且反应缓冲体系pH 7～9(优选为pH7.9)。
实施例7：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，采用所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用，包括下述步骤：
(1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6加入反应缓冲体系中在85～95℃(优选为95℃)条件下加热5～10分钟(优选为5min)，自然冷却到室温；然后加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，混合均匀，在30～～40℃(优选为37℃)条件下孵育30～120分钟(优选为30min)；然后加入50～200nM(优选为100mM)的茎环结构HPA、50～200nM(优选为100mM)的茎环结构HPB、50～200nM(优选为100mM)的茎环结构HPC与100～500nM(优选为300mM)的比色信号探针SP在85～95℃(优选为95℃)条件下加热5～10分钟(优选为5min)，自然冷却到室温；然后加入1～10U mL-1(优选为5U mL-1)的切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃(优选为37℃)条件下孵育30～60分钟(优选为30min)；
(2)取步骤(1)所得体系加入0.2～1.6μM氯化血红素和0.5～3.5mM2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟(优选为10min)；
(3)向步骤(2)所得的反应体系中加入2～6mM H2O2，混匀后，立即观察溶液颜色变化。
当目标物(即鼠伤寒沙门氏菌)不存在时，比色信号探针SP稳定存在，末端的G-四链体序列由于相互“临近”而形成G-四链体结构，溶液呈现出绿色。而目标物存在时，会与DNA1中的适配体序列结合，导致DNA1-DNA2复合体结构不稳定而解旋，暴露出DNA1中引发链序列。引发链引发立足点介导的链置换反应自组装形成Y形结构，Y形结构的每一个分支末端与含有G-四链体序列的比色信号探针SP结合，比色信号探针SP在切刻内切酶的作用下被酶切成两段，使G-四链体序列“远离”而不能形成G-四链体结构。因此，随着检测体系中目标物浓度的增加，溶液呈现出由绿色到无色的颜色变化，实现可视化定性定量鼠伤寒沙门氏菌。该比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用检出限低至42CFU mL-1，具有强抗干扰能力，并且该比色法在乳制品和肉类中依然具有良好的检测性能。
实施例8：
本实施例是在实施例1～6任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在鼠伤寒沙门氏菌检测的抗干扰性能中的应用。
抗干扰性能分析：浓度为1×108CFU mL-1的铜绿假单胞杆菌、志赫氏菌、大肠杆菌(ATCC 25922)以及肠炎沙门氏菌分别与浓度为1×106CFU mL-1鼠伤寒沙门氏菌混合均匀后，用本发明比色法检测上述4种样品，最后用紫外-可见光谱仪测定信号值。
实施例9：
本实施例是在实施例1～6任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在牛奶样品和猪肉样品分析中的应用。
实际样品处理具体为：将脱脂奶粉溶于反应缓冲体系制备成6.25g/L的牛奶缓冲液，牛奶缓冲液8000rpm离心20分钟除去蛋白质沉淀，然后将牛奶缓冲液煮沸灭菌冷却至室温后，即得牛奶缓冲液，备用。取一片无菌猪肉浸泡于反应缓冲体系1小时，浸泡过后的溶液作为猪肉缓冲液备用。以上两种缓冲液(牛奶缓冲液、猪肉缓冲液)中加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌后，用本发明比色法进行检测。
实施例10：
基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，包括：
(1)将50nM都DNA1与150nM都DNA2溶于反应缓冲液(pH 7.9)中在95℃条件下加热5分钟，自然冷却到室温；反应缓冲液(pH 7.9)由50mM醋酸钾,20mM Tris-醋酸,10mM醋酸镁组成；
(2)在上述体系中继续加入3个茎环结构(HPA、HPB、HPC)、比色信号探针SP95℃条件下加热5分钟，自然冷却到室温；
(3)然后在上述体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在37℃条件下孵育30分钟；
(4)然后在上述体系中加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10分钟，具体的为：5.4μL 20μM的氯化血红素和20.25μL浓度为20mM的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10分钟；最后再加入H2O2，混匀后立即观察颜色变化。
其中，氯化血红素的浓度为20μM，2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度为20mM，H2O2的浓度为200mM。
实施例11：
实际样品的前处理：将脱脂奶粉溶于反应缓冲液(反应缓冲体系)制备成6.25g/L的牛奶缓冲液，牛奶缓冲液8000rpm离心20分钟除去蛋白质沉淀，然后将牛奶缓冲液煮沸灭菌冷却至室温后备用。取一片无菌猪肉浸泡于反应缓冲液(反应缓冲体系)1小时，浸泡过后的溶液作为猪肉缓冲液备用。
实际样品的检测：
(1)50nM的DNA1与150nM的DNA2于反应缓冲液中在95℃条件下加热5分钟，自然冷却到室温；然后加入含有不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的牛奶缓冲液或猪肉缓冲液，混合均匀，在37℃条件下孵育30分钟；然后加入100nM的HPA、HPB、HPC与200nM的比色信号探针SP在95℃条件下加热5分钟，自然冷却到室温；然后加入5U mL-1的切刻内切酶Nt.BbvCI在37℃条件下孵育30分钟。
(2)向上述100μL体系中加入5.4μL浓度为20μM的氯化血红素和20.25μL浓度为20mM的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10分钟。
(3)向上述135μL反应体系中加入3μL浓度为200mM的H2O2，混匀后，立即观察溶液颜色变化。
实际样品检测结果如图4所示，本发明比色法对不同加标浓度的样品溶液的结果，由图4可知，本发明比色法可以检测出牛奶样品和猪肉样品中的鼠伤寒沙门氏菌。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 段忆翔
<110> 四川大学
<120> 基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用
<130> F202000056
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatgatcac tctaccatga tcgtaacata tggcggcgtc acccgacggg gacttgacat 60
tatgacag 68
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgggtgacg ccgccatatg ttac 24
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgctgaggta ttgttacgat catggtagag tgatcatggc catgatcgtc tacccatgat 60
cactctacca tgatc 75
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgctgaggta ttagagtgat catgggtaga cgatcatggc catgatcgta acaccatgat 60
cgtctaccca tgatc 75
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgctgaggta tgtagacgat catggtgtta cgatcatggc catgatcact ctaccatgat 60
cgtaacacca tgatc 75
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggtagggcg ggtccaacgg atcatggtac ctcagcgttg gatggg 46
Claims (8)
1.基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，其特征在于：所述制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系的具体方法为：
1)将DNA1与DNA2溶于反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；
2)经步骤1)后，在其所得体系继续加入茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC、比色信号探针SP后85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；
3)经步骤2)后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟；
所述传感体系包括针对目标细菌的DNA1和DNA2、组装形成Y形结构的3个茎环结构、比色信号探针SP、切刻内切酶Nt.BbvCI以及反应缓冲体系；所述3个茎环结构分别为茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC，所述DNA1和DNA2、3个茎环结构以及比色信号探针SP序列如序列表所示；
其中，DNA1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；DNA2具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；茎环结构HPA具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；茎环结构HPB具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；茎环结构HPC具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；比色信号探针SP具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述比色检测体系包括氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、H2O2。
2.如权利要求1所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：还包括制备G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系：在所述步骤3)所得体系内加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟，再加入H2O2，混匀后立即观察颜色变化。
3.如权利要求2所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述的氯化血红素的浓度为0.2～1.6μM，所述的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度为0.5～3.5mM，所述的H2O2的浓度为2～6mM。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述DNA1与DNA2摩尔比为1:2～6；所述的3个茎环结构的浓度为50～200nM；所述比色信号探针SP浓度为100～500nM；所述切刻内切酶Nt.BbvCI浓度为1～10UmL-1。
5.根据权利要求1或2或3所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述反应缓冲体系包括20～60mM醋酸钾、5～30mM Tris-醋酸、5～20mM醋酸镁，且反应缓冲体系pH7～9。
6.采用如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用，其特征在于：包括下述步骤：
(1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6加入反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，混合均匀，在30～～40℃条件下孵育30～120分钟；然后加入50～200nM的茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC与100～500nM的比色信号探针SP在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入1～10UmL-1的切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟；
(2)取步骤(1)所得体系加入0.2～1.6μM氯化血红素和0.5～3.5mM2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟；
(3)向步骤(2)所得的反应体系中加入2～6mMH2O2，混匀后，立即观察溶液颜色变化。
7.如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在鼠伤寒沙门氏菌检测的抗干扰性能中的应用。
8.如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在牛奶样品和猪肉样品分析中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| Jiangtao Ren等.Versatile G-quadruplex-mediated strategies in label-free biosensors and logic systems.Analyst.2015,第2556–2572页. * |
| Xin Li等.Metallo-Toehold-Activated Catalytic Hairpin Assembly Formation of Three-Way DNAzyme Junctions for Amplified Fluorescent Detection of Hg2+.ACS Applied Materials & Interfaces.2017,第1-18页. * |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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