JP2017506912A - 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
NAATは、数時間で汚染結果を与えることが知られている。しかしながら、この技術は、高い技術力を必要とするプロトコールの複雑性または偽陽性の問題などのいくつかの欠点を有し、未だサンプル調製方法によって制限されている。
イムノアッセイは、標的微生物を捕捉および/または検出するために、特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用に依存する。イムノアッセイの効率および成功は、試験で使用される抗体の品質に依存する。抗体を使用することの1つの欠点は、それらが生産される方法(動物内、または細胞培養による)に起因するバッチ間の再現性の問題である。
DNAアプタマーは、既に微生物(S.aureusを含む)の検出のために使用されてきた。さらに、蛍光標識DNAアプタマーはまた、蛍光ベースの方法を使用した全細菌細胞(whole bacterial cell)の検出について報告されている:
WO 2013/064818 A1は、サンプル中の病原性細菌の検出のための蛍光標識アプタマーを開示している。
Ochsner at al.(2013, Diagn Microbiol Infect Dis. 76, 278-285)は、Clostridium difficile毒素、すなわち微生物タンパク質に特異的なSOMAmerの特性評価を記載している。
全細菌細胞を検出するためのSOMAmerの使用は、従来技術において記載されていない。
驚くべきことに、特異性の高い蛍光標識SOMAmerが、蛍光ベースの方法を介して複雑なサンプル中の微生物を検出するための極めて有効なツールであることが見出された。
a)蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)と共にサンプルをインキュベートするステップ、
b)任意にサンプルを洗浄するステップ、
c)蛍光ベースの検出方法により、サンプルを分析するステップ
を含む、サンプル中の微生物を検出する方法に関する。
本発明を実施するために必要な慣用の化学的、微生物学的および分子生物学的方法は、当業者に知られており、また、標準的な文献中にも見出し得る。
それは、例えば、Salmonella spp.(Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidisなど)、Escherichia coli、Listeria spp、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Pseudomonas、Campylobacter、Shigella、Streptococcus、 Mycobacterium、Burkholderia、Legionella、Yersinia、Clostridium、CorynebacteriumおよびVibrioからなる群から選択され得る。
本発明の好ましい態様において、微生物は、Staphylococcus aureusである。
本発明に係るSOMAmerは、抗体と類似の様式で使用し得る。抗体と同様に、SOMAmerは標的結合特異性を提供する。
配列同一性の比較は、目視によって、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて実施し得る。これら商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、2以上の配列間の同一性の%を計算し得る。
標識は、SOMAmerの5’または3’末端のいずれかに取り付けることができる。好ましい態様において、標識は、SOMAmerの5’末端に取り付けられる。当業者は、核酸鎖に蛍光標識を取り付けるための技術をよく知っている。これらの方法のいずれか、例えば、Schubert et al, 1990, Nucleic Acids Research 18,3427に記載されているものを、SOMAmerへ蛍光標識を取り付けるために本発明において利用し得る。原理的には、蛍光標識は、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後に取り付けることができる。
典型的には、インキュベーションのための期間は、1分から60分の間、好ましくは5分から30分の間である。
本発明に従って使用されるSOMAmerの濃度は、当業者によって決定され得る。
典型的に、洗浄は、サンプルを遠心分離し、ペレットをバッファー中に再懸濁することを意味する。洗浄ステップは、1回行うか、または複数回、例えば、2回、3回または4回反復することができる。
蛍光顕微鏡法は、画像化された特徴が小さく、光学的拡大を介して得られる蛍光イメージングシステムの一例である。
標的分析物を含有し得る試料は、適切な孔サイズ(すなわち、細菌については0.4μm)を有するブラックメンブランフィルター(例えばポリエステルまたはポリカーボネート)上で濾過される。次いで、保持された細胞は、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬(例えばSOMAmer)で標識される。フィルターは、その後、一連の検出ユニットにより膜上の蛍光イベント(例えば標識された微生物)を検出することを可能にするレーザーによりスキャンされる。これは膜上の標的分析物の検出および計数を可能にする(Reynolds and Fricker 1999, J Appl Microbiol 86, 785−795、Vanhee et al. 2009, Nat Protoc 4, 224-231)。
−励起:488nm(青色レーザー)+発光:530nm(フルオロセイン、Alexa Fluor(登録商標)488)、585nm(R−フィコエリトリン−R−PE)および>670nm(ペリジニン クロロフィル−PerCP)
−励起:532〜561nm(緑色および黄色/緑色レーザー)+発光:560(Alexa Fluor(登録商標)532)、585(R−PE−R−フィコエリトリン)
−励起:635nm(赤色レーザー)+発光:660nm(アロフィコシアニン−APC/シアニン5−Cy5/eFluor(登録商標)660/Alexa Fluor(登録商標)647)
−溶液中での並外れた熱安定性
−より低い分子量
−より高い多重化能
−熱、乾燥および溶媒に対する化学的安定性
−可逆的な再生
−試薬製造の容易性
−一貫したロット間の性能
−より低いコスト
SOMAmer、蛍光標識およびそれらの好ましい態様は上記のとおり定義されている。
さらなる態様において、本発明は、上で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの、サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するための使用に関する。
本発明はまた、上記で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの少なくとも1つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサーに関する。
所望の標的または標的ドメインをコードする遺伝子の関連部分を、S.aureus NRS384(USA300)のゲノムDNAから、表1に示されるプライマーによりPCR増幅し、pCR-Script SK+(Stratagene)中にクローニングした。clfA遺伝子は、アミノ末端にStrep−タグおよびカルボキシ末端にHis10−タグを保有する発現ベクターpET-51b(EMD-Novagen)にBamHI-SacIカセットとして移される。プラスミドを、遺伝子同一性、および、HisタグおよびStrepタグに関するベクターがコードする配列とのクローン化DNA断片の適切な遺伝子融合を確認するために配列決定する。
5−ベンジルアミノカルボニル−dU(BndU)、5−ナフチルメチルアミノカルボニル−dU(NapdU)、および5−トリプタミノカルボニル−dU(TrpdU)による別々のライブラリーを、S.aureusタンパク質とのSELEXのために使用する。各選択は、PCR増幅のために必要な固定配列に挟まれた40個の連続するランダムに選択した位置を含む1nmol(1014〜1015)の配列から開始する。SELEXは、基本的に記載されたとおりに行う(Gold et al. 2010, PLoS One 5: e15004、Ochsner et al. 2013, Diagn Microbiol Infect Dis.、Vaught et al. 2010, J Am Chem Soc 132: 4141-4151)。pH7.5の40mMのHEPES、0.1MのNaCl、5mMのKCl、5mMのMgCl2および0.05%のTween−20からなるバッファーSB18TをSELEXおよびその後の結合アッセイにわたって使用する。
合成SOMAmerは、標準的なホスホラミダイト化学を介して、1μmolスケールで48〜50マーとして調製し、HPLCで精製する。それらは、5’ビオチン−dAまたは5’フルオロセイン−ビオチン−dA、および、3’→5’エキソヌクレアーゼに対する追加の安定性ための3’末端の反転dTヌクレオチド(3’idT)を含む。
SOMAmerは、結合アッセイの前に、95℃で5分間の加熱を介して正しく折り畳まれ、その後、10〜15分間かけて室温まで冷却される。
親和性(Kd’s)は、段階希釈したタンパク質(0.001〜100nM)およびフィルタープレート上に分離するためのZorbax PSM-300A(Agilent Technologies)樹脂による、放射性標識SOMAmer(10〜20pM)の平衡溶液結合アッセイにより、記載されたとおりに決定する(Gold et al. 2010)。
クローニングの前に、SOMAmerのプールはまた、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliおよびP.aeruginosaをコントロールとして使用し、2時間の平衡結合アッセイにおいてS.aureusへの特異的結合について試験する。
プールの親和性アッセイにより、BndU、NapdUまたはTrpU修飾ssDNAにより得られた合計22プールのSOMAmerの成功した選択を確認し、プールの親和性は0.13〜8.90nMの範囲である。S.aureus細胞への特異的結合が観察されるが、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliまたはP.aeruginosaへの結合は観察されない。
各プールからの48個のクローンについて決定された配列のアラインメントは、共通の配列パターンを共有するマルチコピークローンおよびファミリーを示す。代表的なクローンを親和性アッセイにおいてスクリーニングし、最良のSOMAmerのKd’sは、0.03〜2.17nMの範囲である(表2)。
SOMAmerの配列は表3にリストされている。
フローサイトメトリー実験における使用のために、5’ABflT(ビオチンおよびフルオレセイン)を含む48マーとして上記のようにプロテインA(SpA)に対するSOMAmerを合成する。活性は、4520−8(配列番号3)(Kd=0.17nM)および4531−56(配列番号1)(Kd=0.09nM)について確認される。
トリプケースソイブロス(TSB;bioMerieux, Craponne, France)にStaphylococcus aureus DSM 1104(またはATCC25923)の凍結保存培養物を接種し、振盪しながら32.5℃で一晩インキュベートする。次いで、一晩培養物を、ワーキング培養物がOD600にて0.8(約108細菌ml−1)に達するまで、新鮮なTSB中32.5℃にて振盪しながら継代培養し、チューブあたり約107細胞のアリコートに分割する。細菌を、2分間、10000gの遠心分離によって回収する。
蛍光標識されたSpA SOMAmer 4520−8(配列番号3)および4531−56(配列番号1)を、フローサイトメトリーによるS.aureusの検出についてそれらの効率を評価するために使用する。どちらのSOMAmerもS.aureus全細胞を染色することに良好に機能する。
細胞の100%は、0.07μmoll−1の低いSpA SOMAmer濃度で早くも染色されるが、平均蛍光強度は、0.7μmoll−1および7μmoll−1の高い試薬濃度において大幅に増加する(図1a)。データは、蛍光標識SOMAmerによる、極めて豊富な細胞表面成分の飽和度の予期された増加と一致する。陰性集団(未染色細胞)と陽性集団(染色細胞)との間のフローサイトメトリーによる正確な区別を確保するSpA SOMAmerの最小濃度は0.07μmoll−1に設定することができる(図1b)。
本発明に係るSOMAmerの、特有の遅いオフレート特性により、これらの試薬は、標準的なRNAまたはDNAアプタマーと比較して、より優れた親和性およびより良好な力学的特性を有するはずである。この見解を証明するために、本発明に係るSpA SOMAmerを、S.aureusに特異的なDNAアプタマー(未知標的抗原)と比較する。
本発明のアプタマーおよび標準アプタマーの両方についてのプロトコールは、例4に記載したものと同様である(標準アプタマーの例外:アッセイの前にアプタマーの加熱なし;結合バッファーとしてPBSを使用)。
S.aureus DSM 1104を用いて得られたフローサイトメトリーの結果:
Claims (17)
- サンプル中の微生物を検出する方法であって
a)蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)と共にサンプルをインキュベートするステップ、
b)任意にサンプルを洗浄するステップ、
c)蛍光ベースの検出方法によってサンプルを分析するステップ
を含む、前記方法。 - 微生物が、Staphylococcus aureusであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 蛍光ベースの検出方法が、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー、蛍光ベースの分析方法および蛍光イメージングシステムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- サンプルが、臨床サンプル、食品または飼料サンプル、飲料サンプル、医薬品サンプル、パーソナルケアまたは化粧品サンプルおよび/または水サンプルであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- SOMAmerが、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- SOMAmerが、配列番号15および配列番号15からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその断片またはそれに少なくとも80%同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- SOMAmerが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも80%同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- SOMAmerが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1〜5および7のいずれか一項に記載の方法。
- SOMAmerが、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 蛍光標識が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、ペリジニンクロロフィル(PerCP)、R−フィコエリトリン、クマリン色素および量子ドットからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)であって、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含む、前記SOMAmer。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも80%同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のSOMAmer。
- 配列番号15および配列番号16からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも80%同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のSOMAmer。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のSOMAmer。
- サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するための、請求項11から14のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerの使用。
- 請求項11〜14のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerの少なくとも1つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサー。
- 請求項11〜14のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerを少なくとも1つ含むキット。
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