JP2010537650A - 細菌及び真菌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
Clin. Microbiol. 41:763-766; Grijalva et al., 2003, Heart 89:263-268)。
rDNA領域(Anthony et al. 2000)、16S−23S rDNAスペーサー領域におけるtRNA遺伝子、及び、アドヘシン(adhesin)、溶血素(hemolysin)又は種々の毒素などの病原菌特異的遺伝子(Belanger et al., 2002, J. Clin. Microbiol.
40(4):1436-1440(非特許文献1); Depardieu et al., 2004, J. Clin.
Microbiol. 40(4):1436-1440(非特許文献2); Kaltenboeck and Wang,
2005, Adv. Clin. Chem. 40:219-259(非特許文献3); Patel et al.,
2007, J. Clin. Microbiol. 35(3):703-707(非特許文献4); Sakai et
al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(12):5739-5744(非特許文献5))がある。さらに識別するために、例えば16S
rDNA PCR増幅産物の塩基配列決定が続いてもよい(Unemo et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7):2926-2934(非特許文献6))。国際公開第97/07238号パンフレット(特許文献1)には、真菌リボゾームの18S
rDNAのすべての型を増幅するプライマーを用いて、カンジダ属(Candida)やアスペルギルス属(Aspergillus)などの真菌を検出する方法が開示されている。分子生物学におけるこれらの検出法及び識別法は、現在のところどれも日常的には使用されず、又は標準法として確立されていない。
et al., 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72(2):994-1000; Rebuffo-Scheer et al.,
2007, Circulation 111:1352-1354)及びSERS技術(表面増強ラマン散乱;Kahraman
et al., 2007, Appl. Spectrosc. 61(5):479-485; Naja et al., 2007, Analyst
132(7):679-686)が含まれ、過去10年間で個々の生細胞のスペクトルでさえも得ることができる検出感度レベルを達成している。しかしながら実際には、識別するための分光分析データを得るためには、純粋培養において最大1000個までの細胞が必要である。このことが、これらの技術を特定の敗血症病原菌の迅速診断に不適切なものにしている(Kirschner, 2004, 博士論文、ベルリン大学)。
a)試料物質中に含まれる細菌及び真菌DNAの濃縮;
b)(i)〜(vii)の群の少なくとも2つの群より選ばれるプライマー対を用いる、ステップa)で得られたDNAの増幅:
(i)複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(ii)複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iii)選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iv)選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(v)選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(vi)選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;及び
(vii)選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;並びに任意に、
c)ステップb)で生成された増幅産物の検出。
a)試料物質中に含まれる細菌及び真菌DNAの濃縮手段;
b)(i)〜(vii)の群の少なくとも2つの群より選ばれるプライマー対を含むDNAの増幅手段:
(i)複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(ii)複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iii)選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iv)選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(v)選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(vi)選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;及び
(vii)選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;並びに任意に、
c)b)のプライマー対を用いて生成された増幅産物の検出手段;
を含む。
rDNA遺伝子、23S rRNA遺伝子及び16S/23S間隙領域の配列がある。細菌リボゾーム16S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である:
5'-TAAGTCCSGCAACGAGCGCA-3'(SEQ ID No.1)(順方向プライマー)
5'-GTGACGGGCGGTGWGTACAA-3'(SEQ ID No.2)(逆方向プライマー)
ここでSは塩基C(シトシン)又はG(グアニン)を表し、またWは塩基A(アデニン)又はT(チミン)を表す。少なくとも1つプライマー対(i)を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に細菌が存在することを示す。
rDNAに対する遺伝子配列がある。真菌18S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である:
5'-caactttcgatggtaggat-3'(SEQ ID No.3)(順方向プライマー)
5'-atcgtcttcgatcccctaac-3'(SEQ ID No.4)(逆方向プライマー)
このプライマー対は増幅により約670〜690塩基対の長さを持つ増幅産物を与える。少なくとも1つプライマー対(ii)を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に真菌が存在することを示す。
5'-TTTAGGGCTAGCCTCAAGTGA-3'(SEQ ID No.5)(順方向プライマー)
5'-CACTTCTAAGCGCTCCACAT-3'(SEQ ID No.6)(逆方向プライマー)
このプライマー対はブドウ球菌に特異的な23S領域の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、増幅により418塩基対の長さを持つブドウ球菌特異的な増幅産物を与える。少なくとも1つプライマー対(iii)を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に特定の細菌属が存在することを示す。例えば、上記プライマー対を用いた増幅産物はスタフィロコッカス属(ブドウ球菌属)の細菌の存在を示す。
5'-GCATCAGTGACAGAGAGTGTTGAC-3'(SEQ ID No.7)(順方向プライマー)
5'-TTATACTCGTGGTGCTGGTAAGC-3'(SEQ ID No.8)(逆方向プライマー)
このプライマー対はemp遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、948塩基対の長さを持つ増幅産物を生成する。少なくとも1つプライマー対(iv)を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に特定の細菌種が存在することを示す。例えば、上記プライマー対を用いた増幅産物はスタフィロコッカス・アウレウス(黄色ブドウ球菌)種の細菌の存在を示す。
5'-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3'(SEQ ID No.9)(順方向プライマー)
5'-GGGACCAACATAACCTAATA-3'(SEQ ID No.10)(逆方向プライマー)
このプライマー対はmecA遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、222塩基対の長さを持つ増幅産物を生成する。少なくとも1つのプライマー対(v)を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に含まれる細菌又は真菌について抗菌剤又は抗真菌剤耐性が存在することを示す。例えば上記プライマー対の使用により、メチシリン耐性のあることが示される。
primers)及びFRETプローブ(国際公開第97/46707号パンフレット、国際公開第97/46712号パンフレット及び国際公開第97/46714号パンフレットを参照)が含まれる。FRETプローブは、示された参考文献に記載されているように、融解曲線分析についても使用することができる。
特発性細菌性腹膜炎(SBP)の病原菌の検出
試料採取
試料は、フリードリッヒ−シラー大学(イエナ、ドイツ)の胃腸病学、肝臓学及び感染症学部門の内科外来からもたらされた。腹水は、企画研究に関する現地倫理委員会の承認後、SBPが疑われる患者75名から採取された。判断基準として全細胞数を計測し、細胞数が250細胞/μlの場合、好中球数を測定した。腹水培養は、5mlの腹水を播種した血液培養ボトル(好気性/嫌気性)で調製した。全DNAはナノドロップ(Nanodrop、登録商標)装置を用いて抽出後測定した。好中球数が判断基準の閾値を超える、若しくは腹水培養が陽性である、若しくは他の兆候(例えば血液培養を介して)が全身性感染を指し示す、又は以下に記載する第二段階において実施される16S−rDNA−qPCRが標的配列のコピー数を著しく増加させる患者14例(女性6例(平均年齢67才)、男性8例(平均年齢57.6才))のサブグループを選択した。
全DNAの単離は、ルックスター(LOOXSTER、登録商標)を用いて製造者仕様書に従って行った。
100μlのリゾチーム溶液を、解凍した腹水試料に添加し(終濃度1mg/ml)、短時間のボルテックス後、37℃で1時間インキュベーションした。5mlの溶解緩衝液Aと100μlのプロテアーゼ溶液を添加し、短時間のボルテックス後、50℃で1時間インキュベーションした。この試料を20秒間ボルテックスし、50ml容チューブの膜に注いだ。
チューブは3000×gで2分間遠心分離した。チューブを交換し、5mlの溶解緩衝液Bを加えてもう一度遠心分離した。再び5mlの溶解緩衝液Bを加え、もう一度遠心分離した。
チューブを交換し、2.5mlの溶解緩衝液Cを膜に注いで、室温で2分間インキュベーションした。チューブは3000×gで1分間遠心分離にかけ、さらに2.5mlの溶解緩衝液Cを膜に注いで、チューブをもう一度遠心分離にかけた。膜インサートは廃棄し、溶出液を新しい15ml容チューブに移した。
4mlのイソプロパノールを加えた後、注意深く混合し、3000×gで60分間遠心分離した。上清を除去し、沈渣を2mlの氷冷70%エタノールで洗浄した。チューブは3000×gで5分間の遠心分離にかけ、沈渣を室温で乾燥させた。DNAは200μlの蒸留水(DNA及びDNA分解酵素不含)に50℃で1時間溶解させた。原核生物及び真菌DNAの濃縮前に、16μlをqPCR分析のために取り置いた。残りの184μlを、184μlの2×緩衝液Dと混合した。
特定の細菌及び真菌のゲノムDNAの濃縮は、ルックスターキットを用いて製造者仕様書に従って行った。キットはカラム、採取チューブ及び試薬を含む。当該試薬はヒト及び細菌DNAからなる混合DNAを含む試料から原核生物DNAを濃縮するためのものであるが、真菌DNAの濃縮にも適している。実験方法を以下に要約する。
カラムは、ルックスターの製造者仕様書に従って調整した。緩衝液Dに溶解した368μlのDNAを、準備したカラムに添加した。マトリックス/DNA混合物はピペットで注意深く吸入吐出し、室温で30分間インキュベートした。カラムは室温、1000×gで30秒間遠心分離し、素通り画分は廃棄した。
カラムに300μlの緩衝液Dを2度加え、室温、1000×gで30秒間の遠心分離を2度行った。
カラムを新しい2ml容チューブに移し、300μlの緩衝液Dを加えた。マトリックス/DNA混合物はピペットで注意深く吸入吐出した。カラムは室温で5分間インキュベートし、室温、1000×gで30秒間遠心分離した。300μlの緩衝液Eを再びカラムに加え、1000×gで30秒間遠心分離した。溶出液の容量は600μlであった。
溶出されたDNAは、5μlの溶液G(Solution G)、60μlの酢酸ナトリウム(pH5.2)及び480μlのイソプロパノールを加えることにより沈殿させた。短時間(10秒間)のボルテックス後、試料を4℃、16000×gで60分間遠心分離し、上清は廃棄した。沈渣は1mlの氷冷70%エタノールで2回洗浄して、16000×gで5分間遠心分離し、上清は廃棄した。沈渣は室温で乾燥させ、DNA及びDNA分解酵素を含まない30μlの水に50℃、1時間で溶解した。DNA濃度はナノドロップ(Nanodrop、登録商標)装置を用いて測定した。
原核生物DNAの定量は、16S rDNA qPCRを用いて行った。全DNA濃度は、1反応あたり200ngの最適濃度に調整した。単離されたDNAの含量は低いが、濃縮あり及び濃縮なしでのこれら関連試料の濃度が同じであることは、ルックスターシステムにより調べた。DNA不含水による陰性対照は、細菌DNAの取り扱いのための閾値(切り捨て値)を決定するため、患者試料と同様にして実施した。潜在的なPCR阻害を確認するため、細菌DNA(105ゲノム複製物)を、それぞれの患者の試料の一定分量に添加した。テンプレートのない対照(NTC)も含めた。検出は、二本鎖DNA中にSYBR(登録商標)グリーンが取り込まれた結果としての蛍光に基づいた。25μlの反応容量は、10μlの200ng以下の全ゲノムDNA、12.5μlの2×QuantiTect(登録商標)SYBRグリーンPCRマスターミックス(キアゲン(QIAGEN)、登録商標)、並びに、それぞれ1.25μl(終濃度10pmol)の順方向プライマー及び逆方向プライマーで構成された。すべてのステップは、ロータージーン(Rotor-Gene)RG-3000 qPCR装置(コルベット・ライフサイエンス(Corbett Life Science)、シドニー、オーストラリア)を用い、2回繰り返して行った。始めのDNA変性を94℃で15分間行い、続いて94℃で30秒間、50℃で30秒間及び72℃で1分間のサイクルを45回行った。計算はロータージーン6ソフトウェアを用いて行った。
最適な治療方法のための細菌及び真菌病原体の同定は非定量的PCRによって行った。反応は、2つのプライマープール(プライマープールI及びII)を持つ2つの反応容器中で行った。当該プライマープールは、一般に細菌及び真菌に対して特異的な核酸配列、並びに特定の細菌及び真菌属、特定の細菌種、及び選択された耐性菌に対して特異的な核酸配列を持つプライマー対を含んでいた。下表は本試験で対象とされた細菌、真菌及び耐性菌の概要を示す。
多重PCRで得られたデータは、判断基準(250μl以上の腹水における増加した多形細胞数)及び腹水培養のデータと比較した。カラムに添加したDNA含量に依存したルックスター法の効率は、ルックスターの前後で、16S−rDNA
PCRを用いて測定した。図1に示されるように、原核生物及び真菌DNAの濃縮の濃縮係数は、DNA量が高くなるにつれて増加する。全血からは、20μg以上のDNAを単離することができる。DNA濃度が1μg未満から20μg超まで変動している腹水において、それぞれの場合について顕著な濃縮が観察された。
PCR及びゲル電気泳動による添加試料中の細菌及び真菌の検出
血液試料にスタフィロコッカス・アウレウス、エシェリキア・コリ及びクレブシエラ・ニューモニエの細菌DNAを添加した。全DNA調製及びルックスター(LOOXSTER、登録商標)による細菌DNAの濃縮は、実施例1に記載した通りに行った。
添加試料中のエシェリキア・コリの多重PCRとプローブに基づいた検出
血液試料に、実施例2に記載の通りにエシェリキア・コリの細菌DNAを添加した。全DNA調製及びルックスター(LOOXSTER、登録商標)による細菌DNAの濃縮は、実施例1に記載の通りに行った。エシェリキア・コリの検出のために、irp2遺伝子に向けられたプライマーとともに、ビオチン−16
dUTP存在下多重PCRを行った。
選択されたオリゴヌクレオチドすべてについて、NCBI−GenBank(nr、estヒト)に預けられた他のDNA配列すべてに対して、少なくとも7〜8塩基対のミスマッチ(温度差14〜16℃)があることに留意した。配列は下記の仕様のもと、アレイデザイナー(Arraydesigner、登録商標)プログラムを用いて計算した。
・プローブ長 35±5塩基
・融解温度 約70℃
・平衡GC含量(A/T:G/C=1:1)
・特定の病原菌検出の標的あたり2つの非重複プローブ
・ヒト及び他の細菌標的との交差反応の回避
・アレイ上のプローブの可動性に対してプローブの3’末端にポリ−T(10 T’s)
・DNAマイクロアレイ表面への結合のためのオリゴヌクレオチド3’末端でのアミノ基修飾
Chip Technologies)社、07749イエナ、ドイツ)に基づいた。アレイチューブの調製は、DNAマイクロアレイ上の個々のオリゴヌクレオチドの配置を示す図4に表示されたスポットプランに従って、クロンダイアグ社において行われた。加えて、ビオチンプローブはアレイの辺縁領域に固定化された(ビオチンマーカー)。これらは陽性対照としての機能を果たすが、これは、ビオチンとストレプトアビジンの反応が検出に用いられたため、スポットの形成はビオチンプローブのところで常に生じるであろうということによる。さらに、ビオチンプローブの強度は、存在する遺伝子プローブに対する試料量の比率に関する記載を可能にする。特異的遺伝子プローブにより生成したスポットの強度は、ビオチンプローブの強度を超えるべきではない。これはPCR断片によるアレイの過負荷を示し、偽陽性の結果の原因となるためである。
ビオチン標識増幅産物を直接ハイブリダイゼーションに使用した。このために、4μlのビオチン標識PCR産物を96μlのハイブリダイゼーション緩衝液に入れ、アレイ−チューブ(Array-Tubes、登録商標)外で95℃、5分間変性させ、その後直ちに氷上で120秒間冷却した。
全血試料中のストレプトコッカス・ピオゲネス(化膿性連鎖球菌)及びカンジダ・アルビカンスの検出のための非定量的及び定量的PCR
カンジダ・アルビカンス(ATCC MYA−2876)及びストレプトコッカス・ピオゲネス(Varia42440(微生物医学研究所、イエナ)、敗血症陽性の血液培養)の一夜培養(105細胞)を、健常ドナーの全血試料に添加した。2gのガラスビーズ(G8772ガラスビーズ、酸洗浄済み、425〜600μm、シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich Chemie GmbH)、Schellendorf、ドイツ)及び100μlのプロテアーゼを添加した後に、細胞を2分間で2回のボルテックスと、それぞれについて引き続く50℃で2分間のインキュベーションにより機械的に溶解させた。全DNAの単離はGenomic Maxi AX Bloodキット(A&A
Biotechnology, Gdynia, ポーランド)を用いて行い、細菌及び真菌DNAの濃縮は、実施例1に記載した通りにルックスター(LOOXSTER、登録商標)を用いて行った。
カンジダ・アルビカンス及びストレプトコッカス・ピオゲネスの同定は非定量的多重PCRにより行った。多重PCRバッチにおいて、ルックスターからの溶出液のDNA濃度を500ngに調整した(ナノドロップ(Nanodrop、登録商標)DNA濃度定量)。25μlの反応容量(いくつかの種特異的なプライマー対を含む2つのプライマープール、すなわち1試料あたり2反応バッチ)は、5μlの鋳型DNA、5μlの細胞培養用DNA不含水(PAA)、12.5μlの2×マルチプレックスPCRマスターミックス(キアゲン(QIAGEN、登録商標)、Hilden、ドイツ)及び2.5μlの10×プライマーミックス(終濃度10pmol)で構成された。95℃で15分間の最初の変性が、HotStarTaq(登録商標)DNAポリメラーゼ(キアゲン)の活性化に必要であった。全PCR温度サイクラープログラムは以下の表4に示される。
真菌及び細菌標的の定量化は、18S rDNA及び遺伝子特異的プライマーを用いて定量的PCR(それぞれqPCR及びリアルタイムPCR)により行った。全DNA量は1反応あたり200ngであった(ナノドロップDNA測定に基づくもの)。上記の通り、ルックスターにより濃縮したDNAを使用した。陰性対照(病原菌DNAに対する閾値又は切り捨て値を決定するためのもの)として、細胞培養用DNA不含水(PAA)を使用した。検出は、DNAへの蛍光色素SYBR(登録商標)グリーンの挿入に基づいた。25μlの反応バッチは、10μlのゲノムDNA(200ng)、12.5μlの2×QuantiTect(登録商標)SYBRグリーンPCRマスターミックス(キアゲン(QIAGEN、登録商標))、並びに、それぞれ1.25μl(終濃度10pmol)の順方向及び逆方向プライマーで構成された。カンジダ・アルビカンス検出には18S−rDNAプライマー対panfneu11/12を使用し、ストレプトコッカス・ピオゲネス検出には遺伝子特異的プライマー対sagAを使用した。
図7及び8は、ロータージーン6による評価後の結果を示す。相対的蛍光値(縦軸)はPCRサイクル(横軸)に関してプロットした。計算に用いた基本は、Ct値、すなわち蛍光閾値(「閾値」)が初めて増幅産物特異的な1本の蛍光曲線を超えるサイクル数の決定であった。
Claims (40)
- 試料物質中に含まれる細菌及び真菌の測定方法であって、下記のステップを含む測定方法:
a)試料物質中に含まれる細菌及び真菌DNAの濃縮;
b)(i)〜(vii)の群の少なくとも2つの群より選ばれるプライマー対を用いる、ステップa)で得られたDNAの増幅:
(i)複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(ii)複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iii)選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iv)選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(v)選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(vi)選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;及び
(vii)選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;並びに任意に、
c)ステップb)で生成される増幅産物の検出。 - 試料物質は環境試料、食品試料又は生物試料であって、特に臨床試料である、請求項1に記載の方法。
- 特に臨床試料である試料物質は、ヒト又は動物試料である、請求項1又は2に記載の方法。
- ヒト又は動物試料が、組織試料、体液又はこれらに由来する産物である、請求項3に記載の方法。
- 試料が体液又は体液に由来する産物であって、特に血液又血液産物、例えば全血、血漿、血清又は濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液及び滑液である、請求項4に記載の方法。
- 細菌及び/又は真菌DNAの濃縮が、試料物質から得られる全DNAを非メチル化CpGモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドと接触させることにより行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- (i)群の少なくとも1つのプライマー対が、細菌16S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- (ii)群の少なくとも1つのプライマー対が、真菌18S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)における増幅は、増幅産物が検出可能なマーカーにより標識される条件下で行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)における増幅は、非定量的PCRによって行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)における増幅は、定量的リアルタイムPCR(qPCR)によって行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)において得られる増幅産物の検出が、ゲル電気泳動法又はヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーション法によって行われる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)において得られる増幅産物の検出が、マイクロアレイによって行われる、請求項12に記載の方法。
- 治療決定の補助としての、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 未発見の感染症(SIRS)を含む炎症性疾患の病原菌及び/又は耐性菌を検出するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 敗血症の早期診断のための、請求項17に記載の方法。
- 突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項17に記載の方法。
- 心内膜炎の早期診断のための、請求項17に記載の方法。
- 試料物質中に含まれる細菌及び真菌を測定するための診断キットであって、
a)試料物質中に含まれる細菌及び真菌DNAの濃縮手段;
b)(i)〜(vii)の群の少なくとも2つの群より選ばれるプライマー対を含むDNAの増幅手段:
(i)複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(ii)複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iii)選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(iv)選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(v)選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;
(vi)選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;及び
(vii)選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも1つのプライマー対;並びに任意に、
c)b)のプライマー対を用いて生成される増幅産物の検出手段;
を含むキット。 - 細菌及び/又は真菌DNAの濃縮手段が、非メチル化CpGモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドを含む、請求項21に記載のキット。
- (i)群の少なくとも1つのプライマー対が、細菌16S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項21又は22に記載のキット。
- (ii)群の少なくとも1つのプライマー対が、真菌18S rDNAに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項21〜23のいずれか1項に記載のキット。
- DNAの増幅手段が、増幅中に検出可能なマーカーを含む増幅産物を与える手段を含む、請求項21〜24のいずれか1項に記載のキット。
- DNAの増幅手段が、非定量的PCRを行うための手段を含む、請求項21〜25のいずれか1項に記載のキット。
- DNAの増幅手段が、定量的リアルタイムPCR(qPCR)を行うための手段を含む、請求項21〜23のいずれか1項に記載のキット。
- b)のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、電気泳動ゲルの調製試薬を含む、請求項26に記載のキット。
- b)のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、マイクロアレイの実行手段を含む、請求項26に記載のキット。
- 試料物質中に含まれる病原性細菌及び真菌を測定するための、請求項21〜29のいずれか1項に記載のキット。
- 試料物質は環境試料、食品試料又は生物試料であって、特に臨床試料である、請求項21〜29のいずれか1項に記載のキット。
- 特に臨床試料である試料物質は、ヒト又は動物試料である、請求項31に記載のキット。
- ヒト又は動物試料が、組織試料、体液又はこれらに由来する産物である、請求項32に記載のキット。
- 試料が体液又は体液に由来する産物であって、特に血液又血液産物、例えば全血、血漿、血清又は濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液及び滑液である、請求項33に記載のキット。
- 濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項21〜34のいずれか1項に記載のキット。
- 未発見の感染症(SIRS)を含む炎症性疾患の病原菌及び/又は耐性菌を検出するための、請求項21〜34のいずれか1項に記載のキット。
- 感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項21〜34のいずれか1項に記載のキット。
- 敗血症の早期診断のための、請求項37に記載のキット。
- 突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項37に記載のキット。
- 心内膜炎の早期診断のための、請求項37に記載のキット。
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