DE102007041864A1 - Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Bestimmung von pathogenen Pilzen in einem Probenmaterial, beipielsweise Blut. Bei dem Verfahren wird die bakterielle DNA zunächst aus der Gesamt-DNA des Probenmaterials angereichert, und dann wird die angereicherte DNA mit spezifischen Primerpaaren amplifiziert. Der Nachweis der erhaltenen Amplifikate ermöglicht die genaue Identifizierung von in dem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen und deren Resistenzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel erlauben eine Früherkennung von Entzündungskrankheiten, insbesondere mit nicht nachgewiesener Infektion (SIRS), und von Infektionskrankheiten wie Sepsis, spontaner bakterieller Peritonitis und Endokarditis.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Bakterien, Pilzen und deren Antibiotika- oder Antimykotikaresistenzen in Probenmaterial durch Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen.
  • Die Bestimmung von pathogenen Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, in einem Probenmaterial ist auf zahlreichen Gebieten und insbesondere in der Medizin von großer Bedeutung. Bakterielle Kontaminationen von Thrombozytenkonzentraten sind beispielsweise ein entscheidender Faktor für die transfusionsassoziierte Morbidität und Mortalität und derzeit die häufigste infektiöse Komplikation in der Transfusionsmedizin. Eine frühe Erkennung von mit Infektionen assoziierten mikrobiellen Erregern ist für eine schnelle und wirksame antimikrobielle Therapie unerlässlich, beispielsweise bei Patienten mit Sepsis, spontaner bakterieller Peritonitis (SBP) und Endokarditis. In diesem Zusammenhang stellen auch die zunehmenden Infektionen mit unbekannten Erregern in Krankenhäusern, besonders auf Intensivstationen, ein schwerwiegendes Problem dar, deren Ursache häufig in einer geschwächten Immunabwehr der Patienten und den immer häufigeren invasiven Maßnahmen liegt, die mit einem erhöhten Infektionsrisiko verbunden sind, die aber auch eine Folge mangelnder Hygiene sein können.
  • Die Mikroorganismen, die zu diesen Infektionen führen, sind in den meisten Fällen unbekannt und können zahlreichen unterschiedlichen Gattungen und Spezies angehören. Um eventuelle Kontaminationen oder Infektionen rasch feststellen zu können, ist es daher erforderlich, das Probenmaterial auf möglichst viele in Frage kommende Mikroorganismen gleichzeitig zu testen. Dies ist insbesondere bei klinischen Proben von großer Bedeutung, wenn wirksame therapeutische Maßnahmen, beispielsweise eine auf den jeweiligen Erreger abgestimmte Antibiotikatherapie, vom Ergebnis der Analyse abhängen.
  • Der Nachweis der mikrobiellen Erreger einer Infektionskrankheit erfolgt häufig über eine Blutkultur oder eine andere Kultur einer Körperflüssigkeit, gefolgt von einer biochemischen Typisierung und dem Nachweis von Antibiotikaresistenzen. Blutkulturen werden aber bislang mit einem hohen Prozentsatz falsch-negativ getestet, so dass Patienten einer antibiotischen Behandlung ohne gesicherten mikrobiologischen Befund unterzogen werden. (Bosshard et al., 2003, CID 37: 167–172; Gauduchon et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41: 763–766; Grijalva et al., 2003, Heart 89: 263–268).
  • Neben der mikrobiologischen Diagnostik existieren für einige spezielle Anwendungen zusätzliche spezifische Nachweise wie z. B. die proteinbiochemische Antigen-Detektion über direkte Immunfluoreszenztechniken, Agglutinations-Tests oder ELISA für die Diagnose von Sepsis oder Meningitis, die durch Meningokokken, Haemophilus influenzae, Gruppe A/B Streptokokken (McLellan et al., 200Infect. Immun. 69(5): 2943–2949) oder Pneumokokken ausgelöst werden.
  • Eine schnelle und elegante Methode zur Diagnose bakterieller Infektionen ist die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain-Reaction, PCR), bei der spezifische Regionen des bakteriellen Genoms (z. B. hoch variable 16S oder 23S rDNA Regionen (Anthony et al. 2000), tRNA-Gene in der 16S–23S rDNA-Spacer-Region sowie andere erregerspezifischer Gene, wie z. B. für Adhäsine, Hämolysine oder verschiedene Toxine (Bélanger et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40(4): 1436–1440; Depardieu et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 40(4): 1436–1440; Kaltenboeck und Wang, 2005, Adv. Clin. Chem. 40: 219–259; Patel et al., 2007, J. Clin. Microbiol. 35(3): 703–707; Sakai et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(12): 5739–5744) amplifiziert werden. Eine Sequenzierung (z. B. von 16S-rDNA-PCR-Amplifikaten) kann zur weiteren Differenzierung angeschlossen werden (Unemo et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7): 2926–2934;). Die WO 97/07238 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Pilzen wie Candida und Aspergillus mit Primern zur Amplifikation aller Typen fungaler ribosomaler 18S-rDNA. Keines der molekularbiologischen Nachweis- und Differenzierungsverfahren wird derzeit routinemäßig eingesetzt bzw. ist als Standardverfahren etabliert.
  • Um die erforderlichen Sensitivitäten für klinische Proben zu erreichen, wird die dafür notwendige Template-DNA von Bakterien gewonnen, die aus positiven Blutkulturen isoliert wurden. Bei einer Nichtkultivierbarkeit der nachzuweisenden Erreger (z. B. nach einer der Blutprobennahme vorausgehenden Antibiotikatherapie) bleibt folglich auch der molekularbiologische Nachweis negativ. Das geringe Verhältnis prokaryontischer zu humaner DNA in klinischen Proben kann bei Verzicht auf einen Vorkultivierungsschritt über Anreicherungen der bakteriellen Nukleinsäuren erhöht werden. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise in der EP-A-1 400 589 , der WO-A-2005/085440 und der WO-A-2006/133758 beschrieben.
  • Zur Spezies-Differenzierung eignen sich mittlerweile auch Raman-/FTIR-Techniken (Fouriertransformation Infrarot Spektroskopie; Rebuffo et al., 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72(2): 994–1000; Rebuffo-Scheer et al., 2007, Circulation 111: 1352–1354) und SERS-Techniken (Surface Enhanced Raman Scattering; Kahraman et al., 2007, Appl. Spectrosc. 61(5): 479–485; Naja et al., 2007, Analyst 132(7): 679–686), die in der letzten Dekade ein Empfindlichkeitsniveau erreicht haben, das sogar Spektren von einzelnen lebenden Zellen erhalten werden können. Praktisch werden aber bis zu 1000 Zellen in Reinkultur benötigt um spektroskopische Daten für Differenzierungen zu erhalten, was diese Verfahren zur schnellen Diagnose spezifischer Sepsis-Erreger ungeeignet macht (Kirschner, 2004, Dissertation Univ. Berlin).
  • An die Diagnose des pathogenen Erregers schließt sich eine an den Erreger angepasste Antibiotikatherapie an. Ist die Bestimmung des kausalen Erregers bzw. vorliegender Resistenzen nicht möglich, muss jedoch empirisch und langwierig mit Breitband-Antibiotika therapiert werden.
  • Der Stand der Technik weist jedoch einige Nachteile auf. So bleiben beispielsweise bei Sepsis-Fällen mit nicht-kultivierbaren Erregern bzw. bei Blutentnahmen nach erfolgter Vorbehandlung mit (Breitband-)Antibiotika Blutkulturen negativ (bis zu 90% aller bakteriellen Sepsis Fälle sind Blutkultur-negativ). Eine nachfolgende molekularbiologische Differenzierung auf Basis der Extraktion prokaryontischer DNA aus positiven Blutkulturen ist folglich theoretisch nur in ≤ 10% der Sepsis-Fälle möglich. Aufgrund des umfangreichen Erregerspektrums und des Auftretens bislang nicht beschriebener Erregertypen führt die Generierung einzelner hochspezifischer Primer und Sonden außerdem nur bedingt zu einer eindeutigen Identifizierung des Erregers. Eine Differenzierung auf Typenebene und die Erstellung eines Antibiogramms erfordert eine Vielzahl ausgewählter Primer/Sonden und eine Kombination aus PCR- und Hybridisierungstechniken. Da nicht alle Antibiotika-Resistenzen genom-codiert vorliegen oder ihre Codierung bekannt ist, führt der genotypische Nachweis von Resistenzmarkern auch nur bedingt zum Erfolg und muss durch eine zeitlich aufwendige phänotypische Untersuchung ergänzt werden (Gradelski et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39(8): 2961–2963). Voraussetzung hierfür ist wiederum, wie oben beschrieben, die Kultivierbarkeit des Erregers. Bei Mehrfachinfektionen kann eine Sequenzierung von 16S-rDNA-Amplifikaten ferner durch Sequenz-Überlagerungen zu nicht-interpretierbaren Ergebnissen führen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren und Mittel bereitzustellen, die eine einfach durchzuführende und zuverlässige Bestimmung von Bakterien und Pilzen erlauben, die gegebenenfalls in einem Probenmaterial vorliegen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren und Mittel bereitzustellen, mit denen sich pathogene Bakterien und Pilze in einem Probenmaterial frühzeitig bestimmen lassen, so dass rasche therapeutische Maßnahmen eingeleitet werden können, die auf die nachgewiesenen Erreger abgestimmt sind.
  • Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß mit dem Verfahren nach Anspruch 1 und dem Kit nach Anspruch 21 gelöst.
  • Erfindungsgemäß wurde überraschend gefunden, dass sich durch die Kombination eines Anreicherungsschritts für bakterielle und fungale DNA aus Gesamt-DNA mit einem Amplifikationsschritt mit ausgewählten Primerpaaren nicht nur die Sensitivität des Nachweises einzelner Bakterien und Pilze erheblich steigern lässt, sondern dass sich auf diese Weise auch zahlreiche verschiedene Gattungen und Spezies von Bakterien und Pilzen nebeneinander nachweisen lassen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Bestimmen von in einem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Anreichern von in dem Probenmaterial enthaltener bakterieller und fungaler DNA;
    • b) Amplifizieren der in Schritt a) erhaltenen DNA unter Verwendung von Primerpaaren, die ausgewählt sind aus wenigstens zwei der Gruppen (i) bis (vii):
    • (i) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Bakterienfamilien spezifisch ist;
    • (ii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Pilzfamilien spezifisch ist;
    • (iii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakteriengattung spezifisch ist;
    • (iv) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakterienspezies spezifisch ist;
    • (v) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für die Ausprägung einer ausgewählten Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz spezifisch ist;
    • (vi) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzgattung spezifisch ist; und
    • (vii) wenigstens einem Primerpaar, zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzspezies spezifisch ist; und, gegebenenfalls,
    • c) Nachweisen der bei Schritt b) gebildeten Amplifikate.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostischer Kit zum Bestimmen von in einem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen, wobei der Kit umfasst:
    • a) Mittel zum Anreichern von in dem Probenmaterial enthaltener bakterieller und fungaler DNA;
    • b) Mittel zum Amplifizieren von DNA, wobei die Mittel Primerpaare enthalten, die ausgewählt sind aus wenigstens zwei der Gruppen (i) bis (vii):
    • (i) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Bakterienfamilien spezifisch ist;
    • (ii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Pilzfamilien spezifisch ist;
    • (iii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakteriengattung spezifisch ist;
    • (iv) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakterienspezies spezifisch ist;
    • (v) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für die Ausprägung einer ausgewählten Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz spezifisch ist;
    • (vi) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzgattung spezifisch ist; und
    • (vii) wenigstens einem Primerpaar, zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzspezies spezifisch ist, und, gegebenenfalls,
    • c) Mittel zum Nachweisen der mit den Primerpaaren b) gebildeten Amplifikate.
  • Das Probenmaterial umfasst jedes Material, in dem Bakterien und Pilze vorkommen können. Üblicherweise ist das Probenmaterial eine Umweltprobe, eine Lebensmittelprobe oder eine biologische Probe, beispielsweise eine klinische Probe. Die biologische Probe kann eine pflanzliche Probe sein, typischerweise ist die biologische oder klinische Probe aber eine humane oder tierische Probe, insbesondere eine Probe von einem Säuger. Typischerweise ist die Probe eine humane oder eine tierische Gewebeprobe oder Körperflüssigkeit. Die Gewebeprobe kann beispielsweise eine Biopsie sein. Bevorzugt ist die Probe eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt, beispielsweise Vollblut, Serum, Plasma, Thrombozytenkonzentrat, Zerebrospinalflüssigkeit, Liquor, Urin und Pleural-, Aszites-, Perikardial-, Peritoneal- oder Synovialflüssigkeit. Das Probenmaterial kann in üblicher Weise gewonnen werden, beispielsweise kann eine klinische Probe durch Biopsie, Blutentnahme oder Punktion gewonnen werden.
  • Die Anreicherung prokaryontischer und fungaler DNA aus dem Probenmaterial erfolgt nach Extraktion von Gesamt-DNA aus dem Probenmaterial. Dementsprechend kann der erfindungsgemäße Kit auch Mittel zur Extraktion von Gesamt-DNA aus den in dem Probenmaterial enthaltenen Zellen enthalten, wie sie beispielsweise nachfolgend beschrieben sind. Zur Extraktion der Gesamt-DNA vor dem eigentlichen Anreicherungsschritt werden die in der Probe vorhandenen Zellen einschließlich der darin enthaltenen Bakterien- und Pilzzellen zunächst aufgebrochen oder lysiert. Aufbrechen und Lyse von Zellen können in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch durch Hochdruckhomogenisatoren oder bevorzugt mittels Glasperlen und Vortexbehandlung, chemisch durch Lösungsmittel, Detergenzien oder Alkali, enzymatisch durch lytische Enzyme, oder Kombinationen dieser Verfahren. Die enzymatische Lyse von Bakterienzellen ist bevorzugt, wobei zum Aufschluss üblicherweise Lysozym oder Mutanolysin verwendet werden, vorteilhaft in Kombination mit Alkali, Detergenzien und proteolytischen Enzymen. Der Aufschluss von Pilzzellen erfolgt üblicherweise mechanisch, beispielsweise mittels Vortexen mit Glaskügelchen, vorteilhaft in Kombination mit Alkali, Detergenzien und weiteren proteolytischen Enzymen. Der Aufschluss kann aber auch enzymatisch erfolgen, wobei als Enzym beispielsweise Zymolase verwendet werden kann. Die Extraktion von Gesamt-DNA kann dann in an sich bekannter Weise mittels Adsorption an eine DNA-bindende Matrix erfolgen. Kits zur Isolierung von Gesamt-DNA sind kommerziell erhältlich und können nach den Vorschriften der Hersteller verwendet werden. Beispielsweise sind Komponenten, die zur Isolierung von Gesamt-DNA benötigt werden, in dem LOOXSTER®-Kit zur Anreicherung von bakterieller und fungaler DNA aus Gesamt-DNA enthalten. Nach Elution von der Matrix wird eine Probe mit Gesamt-DNA erhalten, in der sich die DNA in wässriger Lösung befindet.
  • Die eigentliche Anreicherung bakterieller und fungaler DNA aus der Probe mit Gesamt-DNA erfolgt mit Hilfe von Mitteln, die bakterielle und fungale DNA spezifisch binden, insbesondere mit Proteinen und Polypeptiden, die bakterielle und fungale DNA spezifisch binden. Üblicherweise erfolgt die Anreicherung prokaryontischer und fungaler DNA nach den in der EP-A-1 400 589 , der WO-A-2005/085440 und der WO-A-2006/133758 beschriebenen Verfahren, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird und deren Beschreibung Bestandteil der vorliegenden Offenbarung bildet. Die dort beschriebenen Verfahren und Mittel erlauben es, das geringe Verhältnis von prokaryontischer und fungaler DNA im Verhältnis zu anderer in der Probe enthaltener DNA, insbesondere humaner oder tierischer DNA, zu erhöhen. Hierbei wird die nach der Präparation von Gesamt-DNA in Lösung befindliche DNA mit einem Protein oder einem Polypeptid in Kontakt gebracht, das fähig ist, an nicht-methylierte CpG-Motive zu binden. Da nicht-methylierte CpG-Motive in bakterieller und fungaler DNA deutlich häufiger vorkommen als in höherer eukaryontischer DNA, wie humaner oder tierischer DNA, werden bakterielle und fungale DNA bevorzugt an diese Proteine oder Polypeptide gebunden. Das Protein oder Polypeptid kann an einen Träger, beispielsweise Mikropartikel, gekoppelt sein. Auf diese Weise lässt sich der gebildete Protein/Polypeptid-DNA-Komplex leicht von humaner oder tierischer DNA abtrennen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation oder magnetische Verfahren. Die selektive Bindung prokaryontischer und fungaler DNA an diese Proteine und Polypeptide führt zu einer Anreicherung der DNA um das 5-fache oder mehr. Kits zur Anreicherung bakterieller und fungaler DNA aus Gesamt-DNA, die auch Mittel zur Präparation von Gesamt-DNA umfassen, sind im Handel unter dem Markennamen LOOXSTER® (SIRS-LAB GmbH, 07745 Jena, Deutschland) erhältlich.
  • Die an bakterieller und fungaler DNA angereicherte DNA wird anschließend mittels nicht-quantitativer oder quantitativer Amplifikationsverfahren, insbesondere nicht-quantitativer oder quantitativer PCR (Polymerase Chain Reaction – Polymerase-Kettenreaktion) in Gegenwart eines Sets oder Pools von unterschiedlichen Primerpaaren amplifiziert, die eine spezifische Amplifikation von Regionen bestimmter Nukleinsäuresequenzen erlauben, die für Bakterien, Pilze oder Antibiotika- oder Antimykotikaresistenzen spezifisch sind. Nukleinsäuresequenzen, die für Bakterien, Pilze oder ausgewählte Gattungen und Spezies davon oder für Antibiotika- und Antimykotika-Resistenzen spezifisch sind, sind aus öffentlich zugänglichen Genbanken, wie GenBank und TIGR, oder anderen kommerziellen Genbanken erhältlich, und der Fachmann kann entsprechende zugehörige Primer routinemäßig und ohne unzumutbaren Aufwand entwerfen, beispielsweise mit Hilfe der öffentlich zugänglichen Website „Primer3" (siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi des MIT) oder anderer kommerzieller Software.
  • Erfindungsgemäß wird die Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren aus wenigstens zwei der obigen Gruppen (i) bis (vii) durchgeführt, die so gewählt sind, dass sie bei der Amplifikation zu Amplifikaten mit einer bestimmten, vorher bekannten Länge führen. Die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (i) gebildeten Amplifikaten der erwarteten Länge zeigt dann die Anwesenheit von Bakterien an; die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (ii) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit von Pilzen an; die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (iii) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit wenigstens einer bestimmten Bakteriengattung an; die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (iv) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit wenigstens einer bestimmten Bakterienspezies an; die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (v) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit wenigstens einer bestimmten Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz an; die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (vi) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit wenigstens einer bestimmten Pilzgattung an; und die Anwesenheit von mit wenigstens einem Primerpaar (vii) gebildeten Amplifikaten zeigt die Anwesenheit wenigstens einer bestimmten Pilzspezies an.
  • Primerpaare der Gruppe (i) sind generische Primer, die spezifisch an eine hoch konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Bakterienfamilien gemeinsam ist. Bakterienfamilien, die bei Infektionen und Kontaminationen besonders häufig vorkommen und auf deren Anwesenheit daher vorteilhaft mit Primerpaaren der Gruppe (i) getestet werden kann, sind beispielsweise Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Staphylococcaceae, Listeriaceae, Neisseriaceae, Pasteurellaceae, Legionellaceae, Burkholderiaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Moraxellaceae, Enterococcaceae und/oder Bacteroidaceae. Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die in allen Bakterienfamilien hoch konserviert sind, sind die Sequenzen des 16S-rDNA-Gens, des 23S-rRNA-Gens und der 16S/23S-Interspace-Region. Ein Beispiel für ein Primerpaar, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die bakterielle ribosomale 16S-rDNA hybridisiert und erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist das Primerpaar:
    Figure 00090001
    wobei S die Basen C oder G und W die Basen A oder T repräsentiert. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit wenigstens einem Primerpaar (i) gebildet werden, zeigt allgemein die Anwesenheit von Bakterien in dem Probenmaterial an.
  • Primerpaare der Gruppe (ii) sind generische Primer, die an eine hoch konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Pilzfamilien gemeinsam ist. Familien von Pilzen, die bei Kontaminationen und Infektionen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher vorteilhaft mit Primerpaaren der Gruppe (ii) getestet werden kann, sind beispielsweise Pilze der Familie Trichocomaceae und der Candida-Familie. Ein Beispiel für eine in allen Pilzfamilien hoch konservierte Nukleinsäuresequenz ist die Sequenz des Gens für die fungale 18S-rDNA. Ein Beispiel für ein Primerpaar, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die fungale 18S-rDNA hybridisiert und erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist das Primerpaar:
    Figure 00100001
    das bei der Amplifikation zu Amplifikaten mit einer Länge von etwa 670–690 bp führt. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit wenigstens einem Primerpaar (ii) gebildet werden, zeigt allgemein die Anwesenheit von Pilzen in dem Probenmaterial an.
  • Primerpaare der Gruppe (iii) sind Primer, die an eine hoch konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Bakterienspezies einer bestimmten Gattung, aber nicht allen Bakteriengattungen einer Familie gemeinsam ist. Bakteriengattungen, die bei Infektionen und Kontaminationen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher vorteilhaft mit Primerpaaren der Gruppe (iii) getestet werden kann, sind beispielsweise Bakterien der Gattungen Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterococcus spp, Escherichia spp, Pseudomonas spp, und Enterobacter spp. Ein Beispiel für ein Primerpaar, das gattungsspezifisch an DNA von Bakterien der Gattung Staphylococcus hybridisiert und erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist das Primerpaar:
    Figure 00100002
    das spezifisch an eine Nukleinsäuresequenz der 23S-Region hybridisiert, die für Staphylokokken spezifisch ist und bei der Amplifikation zu einem staphylokokkenspezifischen Amplifikat mit einer Länge von 418 bp führt. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit wenigstens einem Primerpaar (iii) gebildet werden, zeigt die Anwesenheit einer bestimmten Gattung von Bakterien in dem Probenmaterial an. Beispielsweise zeigen Amplifikate mit dem obigen Primerpaar die Anwesenheit von Bakterien der Gattung Staphylococcus an.
  • Primerpaare der Gruppe (iv) sind Primer, die an eine konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Bakterien einer bestimmten Spezies, aber nicht allen Bakterienspezies einer Gattung gemeinsam ist. Bakterienspezies, die bei Kontaminationen und Infektionen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher mit Primerpaaren der Gruppe (iv) vorteilhaft getestet werden kann, sind beispielsweise Bakterienspezies der oben genannten Bakteriengattungen, beispielsweise Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptokokken der Viridans-Gruppe, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Burkholderia cepacia, Prevotella melaninogenica, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes und Enterobacter cloacae. Nicht einschränkende Beispiele für konservierte speziesspezifische Nukleinsäuresequenzen sind das emp-Gen von Staphylococcus aureus, das irp2-Gen von Escherichia coli und das ureA-Gen von Klebsiella pneumoniae. Ein Beispiel für ein Primerpaar, das speziesspezifisch an DNA von Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus hybridisiert und erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist das Primerpaar:
    Figure 00110001
    das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des emp-Gens hybridisiert und zur Bildung eines Amplifikats mit einer Länge von 948 bp führt. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit wenigstens einem Primerpaar (iv) gebildet werden, zeigt die Anwesenheit einer bestimmten Bakterienspezies in dem Probenmaterial an. Beispielsweise zeigen Amplifikate mit dem obigen Primerpaar die Anwesenheit von Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus an.
  • Primerpaare der Gruppe (v) sind Primer, die die Amplifikation einer für eine gewählte Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz spezifischen Nukleinsäuresequenz, beispielsweise der Nukleinsäuresequenz eines entsprechenden Resistenzgens, erlauben. Antibiotika- und Antimykotikaresistenzen, die bei Kontaminationen und Infektionen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher vorteilhaft mit Primerpaaren der Gruppe (v) getestet werden kann, sind beispielsweise Methicillin-Resistenzen, beispielsweise Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA). Beispiele für hoch konservierte, für die Ausprägung von Antibiotika- und Antimykotikaresistenzen spezifische Nukleinsäuresequenzen sind Nukleinsäuresequenzen der Gene für die Methicillin-Resistenz, wie mecA. Ein Beispiel für ein Primerpaar, das spezifisch ein an der Methicillin-Resistenz beteiligtes Gen, mecA, hybridisiert und erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist das Primerpaar:
    Figure 00120001
    das spezifisch an eine Nukleinsäuresequenz des mecA-Gens hybridisiert und zur Bildung eines Amplifikats mit einer Länge von 222 bp führt. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit wenigstens einem Primerpaar (v) gebildet werden, zeigt das Vorliegen von Antibiotika- oder Antimykotikaresistenzen bei den in dem Probenmaterial enthaltenen Bakterien oder Pilzen an. Beispielsweise zeigt die Verwendung des obigen Primerpaares eine Methicillin-Resistenz an.
  • Analog zu den oben für die für Bakteriengattungen oder Bakterienspezies beschriebenen Primerpaare sind Primerpaare der Gruppe (vi) Primer, die an eine hoch konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Pilzspezies einer Gattung, aber nicht allen Pilzgattungen einer Familie gemeinsam ist. Gattungen von Pilzen, die bei Kontaminationen und Infektionen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher vorteilhaft mit solchen Primern getestet werden kann, sind beispielsweise Pilze der Gattungen Aspergillus und Candida. Entsprechend sind Primerpaare der Gruppe (vii) Primer, die an eine hoch konservierte Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die einer Vielzahl oder allen Pilzen einer bestimmten Spezies, aber nicht allen Pilzspezies einer Gattung gemeinsam ist. Pilzspezies, die bei Kontaminationen und Infektionen besonders häufig auftreten und auf deren Anwesenheit daher mit solchen Primern vorteilhaft getestet werden kann, sind beispielsweise Spezies Aspergillus fumigatus und Candida albicans. Der Nachweis von Amplifikaten, die nach Amplifikation mit dem wenigstens einen Primerpaar (vi) oder (vii) gebildet wurden, zeigt also die Anwesenheit einer bestimmten Gattung bzw. Spezies von Pilzen in dem Probenmaterial an.
  • Die Familien, Gattungen und Spezies von Bakterien und Pilzen sowie die Antibiotika- und Antimykotika-Resistenzen, auf die mit den obigen Kombinationen getestet werden kann, unterliegen grundsätzlich keiner Einschränkung, und die oben angegebenen Familien, Gattungen und Spezies sowie die angegebenen Primerpaare stellen lediglich beispielhafte Ausführungsformen für das erfindungsgemäße Verfahren dar. Wie oben ausgeführt sind Nukleinsäuresequenzen, die für Bakterien, Pilze oder bestimmte Gattungen und Spezies davon oder für Antibiotika- und Antimykotika-Resistenzen spezifisch sind, aus öffentlich zugänglichen Genbanken erhältlich, und entsprechende zugehörige Primer können vom Fachmann routinemäßig und ohne unzumutbaren Aufwand konstruiert werden.
  • Der Amplifikationsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird parallel mit wenigstens zwei Primerpaaren, d. h. als Multiplex-Verfahren durchgeführt. Erfindungsgemäß kann zur Amplifikation eine beliebige Kombination der Gruppen (i) bis (vii) von Primerpaaren verwendet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Amplifikation wenigstens Primerpaare aus den Gruppen (i) und (ii) verwendet. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsform werden zur Amplifikation wenigstens Primerpaare aus den Gruppen (i) und (ii), (iii), (iv) und (v); (i), (iii) und (iv); (i), (ii), (iii) und (iv); und (i), (ii), (iii), und (v) verwendet. Besonders bevorzugt wird die Amplifikation mit Primerpaaren aus den Gruppen (i) bis (vi), ganz besonders bevorzugt mit Primerpaaren aus allen Gruppen (i) bis (vii) durchgeführt. Die Anzahl der Primerpaare insgesamt und der aus jeder Gruppe eingesetzten Primerpaare unterliegt keiner besonderen Einschränkung und hängt im wesentlichen nur von den in der zu untersuchenden Probe vermuteten Mikroorganismen und der Therapierelevanz und dem gewünschten Umfang, insbesondere der gewünschten Detailgenauigkeit der Untersuchungsergebnisse ab. So ist es beispielsweise bei einem Test klinischer Proben auf Infektionen nicht erforderlich, auf sämtliche Streptokokkenspezies zu testen, da das Therapieschema für sämtliche Streptokokken im Wesentlichen gleich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne weiteres mit 150 unterschiedlichen Primerpaaren oder mehr durchgeführt werden und wird üblicherweise mit wenigstens 10, bevorzugt mit wenigstens 20, und besonders bevorzugt mit wenigstens 30 und mehr unterschiedlichen Primerpaaren durchgeführt.
  • Die Multiplex-Amplifikation kann mittels beliebiger nicht-quantitativer oder quantitativer Amplifikationsverfahren erfolgen. Bevorzugt wird die Amplifikation mittels nicht-quantitativer PCR oder (quantitativer) Real-Time-PCR (nachfolgend auch als qPCR bezeichnet) durchgeführt. Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden für PCR beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • Die Multiplex-PCR kann in ein oder mehreren Reaktionsgefäßen durchgeführt werden. Aus praktischen Gründen wird die Multiplex PCR häufig in mehreren Reaktionsgefäßen durchgeführt, insbesondere wenn bei der Amplifikation sehr viele unterschiedliche Primerpaare verwendet werden. Im Allgemeinen enthält dann jedes Reaktionsgefäß andere Primerpaare. Vorzugsweise wird die Multiplex-PCR in ein oder zwei Reaktionsgefäßen durchgeführt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amplifikation mittels nicht-quantitativer PCR durchgeführt. Die Durchführung erfolgt in dem Fachmann an sich bekannter Weise unter geeigneten Amplifikationsbedingungen, d. h. unter sich zyklisch verändernden Reaktionsbedingungen, welche die in vitro-Vervielfältigung des Ausgangsmaterials in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Allgemeinen besteht die PCR aus einer Anzahl von 25 bis 50 Zyklen, die in einem Thermocycler durchgeführt werden. Nach der Initialisierung besteht jeder Zyklus aus den Schritten Denaturierung, Primerhybridisierung (Annealing) und Elongation (Extension), die bei Temperaturen durchgeführt werden, die von den gewählten Primerpaaren und den eingesetzten Enzymen abhängen. Im Reaktionsgemisch liegen die Bausteine für die selektiv vervielfältigten Nukleinsäureabschnitte, den Amplifikaten, in Form der Desoxynukleotidtriphosphate zusammen mit den Primerpaaren, die sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern, und einer geeigneten, gewöhnlich hitzebeständigen Polymerase vor. Die Wahl geeigneter Amplifikationsbedingungen, beispielsweise Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen, Dauer und Temperatur der einzelnen sich zyklisch wiederholenden Reaktionsschritte in Abhängigkeit von den gewählten Primerpaaren und den eingesetzten Enzymen ist für den Fachmann Routine.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikation unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen die Amplifikate mit einem nachweisbarer Marker markiert werden. Dies lässt sich beispielsweise erreichen, indem die bei der PCR eingesetzten Nukleotide ein oder mehrere mit einem detektierbaren Marker versehene Nukleotide umfassen, die bei der Amplifikation in das Amplifikat eingebaut werden und den Nachweis dieses Amplifikats über diesen Marker erlauben. Gemäß einer Ausführungsform werden als detektierbarer Marker radioaktive Marker, beispielsweise 32P, 14C, 125I, 33P oder 3H, verwendet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als detektierbare Marker nicht radioaktive Marker, insbesondere Farb- oder Fluoreszenzmarker, Enzym- oder Immunmarker, Quantum Dots oder andere, beispielsweise durch eine Bindungsreaktion nachweisbare Moleküle wie Biotin verwendet, deren Detektion in einer dem Fachmann allgemein bekannten Weise erfolgen kann. Besonders bevorzugt sind Farb- und Fluoreszenzmarker sowie Biotinmarker. Ganz besonders bevorzugt werden bei der PCR biotinylierte Nukleotide eingesetzt, beispielsweise Biotin-dUTP, was zu einem biotinylierten Amplifikat führt, das beispielsweise über die Bildung an Streptavidin nachgewiesen werden kann. Die Wahl geeigneter Marker ist für den Fachmann Routine.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Amplifikation mittels Real-Time-PCR (qPCR) durchgeführt. Das Verfahren der qPCR ist dem Fachmann allgemein bekannt und wird beispielsweise in der US-A-2006/0099596 ausführlich beschrieben. Bei der qPCR wird die Bildung der PCR-Produkte in jedem Zyklus der PCR verfolgt. Hierzu wird die Amplifikation gewöhnlich in Thermocyclern gemessen, die mit geeigneten Mitteln zum Monitoring von Fluoreszenzsignalen während der Amplifikation ausgestattet sind Geeignete Geräte hierfür sind im Handel erhältlich, beispielsweise unter der Bezeichnung Roche Diagnostics LightCyclerTM.
  • Der Nachweis der gebildeten Amplifikate kann sowohl mit nicht-markierten als auch mit markierten Amplifikaten erfolgen.
  • Enthalten die erhaltenen Amplifikate keine nachweisbaren Marker, kann ihr Nachweis beispielsweise anhand ihrer bekannten Größe durch Auftrennung mittels Gelelektrophorese und anschließende Visualisierung, beispielsweise durch Anfärben mit Ethidiumbromid und UV-Licht, erfolgen. Die Gelelektrophorese kann in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise durch Agarosegelelektrophorese oder Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE). Bevorzugt wird die Gelelektrophorese auf Agarosegelen durchgeführt. Bei der Gelelektrophorese werden die aufgetrennten Amplifikate zur Größenbestimmung mit einer Leiter von DNA-Markern verglichen. Zweckmäßig erfolgt der Vergleich mit einer DNA-Leiter, die eine Mischung der DNA-Fragmente umfasst, die bei der Amplifikation erwartet werden. Das Vorliegen von Amplifikaten in der Amplifikationsmischung, die in ihrer Größe mit den DNA-Markern übereinstimmen, zeigt die Anwesenheit der Mikroorganismen an, für die diese Fragmentlängen spezifisch sind.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform enthalten die bei der PCR generierten Amplifikate einen detektierbaren Marker. In diesem Fall wird der Nachweis bevorzugt mit Hybridisierungstechniken (Arrays), beispielsweise mit einem Mikroarray wie einem DNA-Mikroarray durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt der Nachweis über einen Mikroarray. Hierbei wird die bei der PCR erhaltene Amplifikationsmischung, die bei Anwesenheit von Bakterien und Pilzen in der getesteten Probe markierte, beispielsweise biotinylierten Amplifikate enthält, mit einem Satz polynukleotid-basierter Sonden, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die zu den gegebenenfalls bei der PCR erhaltenen Amplifikaten komplementär sind und auf einem festen Träger, beispielsweise einem Glasträger, an definierten Positionen eines Rasters ("Spots") aufgebracht sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, in Kontakt gebracht. Die Wahl von Parametern zur Einstellung geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist dem Fachmann allgemein bekannt. Hierbei handelt es sich um physikalische und chemische Parameter, die die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Der Fachmann ist in der Lage, im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und der Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abzustimmen. Die spezifische Hybridisierung von Amplifikaten an die Polynukleotidsonden kann nach Abwaschen nicht gebundener Nukleinsäuren mit einem Lesegerät ausgelesen werden. Beispielsweise kann der Nachweis einer spezifischen Hybridisierung eines biotinylierten Amplifikats mit den immobilisierten Sonden mittels Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat. Die durch enzymatische Umsetzung des zugegebenen Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) an den einzelnen Spots gebildeten Farbpräzipitate werden mit einem Analysegerät detektiert und ausgelesen. Die Technologie der Mikroarrays ist dem Fachmann allgemein bekannt. Sondensysteme, wie sie im Prinzip zum Nachweis der bei der erfindungsgemäßen PCR erhaltenen Amplifikate verwendet werden können, sind im Handel erhältlich, beispielsweise unter dem Markennamen AT®-System (Clondiag Chip Technologies, 07749 Jena, Deutschland). Der Fachmann ist aufgrund seines Fachwissens ohne weiteres in der Lage, Mikroarrays zu entwickeln, die für spezielle Nachweise von Mikroorganismen ausgelegt sind.
  • Bei der qPCR erfolgt der Nachweis der Amplifikate bei den einzelnen Amplifikationszyklen. Beispielsweise können die Amplifikate mit Farbstoffen nachgewiesen werden, die an doppelsträngige DNA binden. Diese Farbstoffe zeigen bei Anregung mit einer geeigneten Wellenlänge eine höhere Fluoreszenzintensität, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Der Nachweis mit doppelstrangbindenden Farbstoffen ist beispielsweise in der EP-A-0 512 334 beschrieben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Amplifikate mit fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden nachgewiesen, die nur dann Fluoreszenzsignale emittieren, wenn sie an die Targetnukleinsäure gebunden sind. Beispiele für Sonden, die zum Nachweis bei der qPCR verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise TaqManTM-Sonden (siehe z. B. EP-A-0 543 942 und US-A-5,210,015 ), Molecular Beacons (siehe US-A-5,118,801 ), Scorpion-Primer, Lux®-Primer und FREI-Sonden (siehe WO 97/46707 , WO 97/46712 und WO 97/46714 ). FREI-Sonden können, wie in der angegebenen Literatur beschrieben, auch zur Schmelzkurvenanalyse verwendet werden.
  • Sowohl bei nicht quantitativer als auch bei quantitativer Amplifikation kann zur weiteren Differenzierung eine Sequenzierung angeschlossen werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel können auf zahlreichen Gebieten Anwendung finden und können allgemein zur Bestimmung von Bakterien und/oder Pilzen und/oder deren Resistenzen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Untersuchung von jedem gewünschten Probenmaterial, in dem Bakterien und Pilze, insbesondere pathogene Bakterien und Pilze, vorkommen können, beispielsweise einer Umweltprobe, einer Lebensmittelprobe oder einer biologische Probe, beispielsweise eine klinischen Probe. Die biologische Probe kann eine pflanzliche Probe sein, typischerweise ist die biologische oder klinische Probe aber eine humane oder tierische Probe, insbesondere eine Probe von einem Säuger. Typischerweise ist die Probe eine humane oder eine tierische Gewebeprobe, beispielsweise eine Biopsie, oder eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt. Bevorzugt ist die Probe eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt, beispielsweise Blut oder ein Blutprodukt, wie Vollblut, Serum, Plasma, Thrombozytenkonzentrat, Zerebrospinalflüssigkeit, Liquor, Urin und Pleural-, Aszites-, Perikardial-, Peritoneal- oder Synovialflüssigkeit. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis von pathogenen Bakterien, Pilzen und/oder Antibiotika- und Antimykotikaresistenzen in klinischen Proben verwendet werden. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis von Kontaminationen in Thrombozytenkonzentraten verwendet werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Früherkennung von Erregern und/oder Resistenzen von Entzündungskrankheiten mit nicht nachgewiesener Infektion (auch als „systemisches inflammatorisches Response Syndrom", SIRS, bezeichnet, entsprechend den Kriterien der Konsensuskonferenz des American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference, ACCP/SCCM", Crit. Care Med. 1992; 274: 968–974) verwendet werden. Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Früherkennung von Infektionskrankheiten, insbesondere systemischen Infektionen verwendet werden. Gemäß einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Früherkennung von Sepsis verwendet werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Früherkennung von spontaner bakterieller Peritonitis verwendet werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Früherkennung von Endokarditis verwendet werden. In all diesen Fällen werden die Primer vorzugsweise so gewählt, dass sie an Nukleinsäuresequenzen der in dem Probenmaterial erwarteten Mikroorganismen oder Resistenzen hybridisieren und deren Amplifikation ermöglichen. So werden beispielsweise zur Früherkennung von Sepsis vorzugsweise Primer verwendet, die spezifisch an Nukleinsäuresequenzen der in 3A gezeigten Mikroorganismen hybridisieren.
  • Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung also Verfahren und Mittel zur Bestimmung von pathogenen Pilzen in einem Probenmaterial, beispielsweise Blut. Bei dem Verfahren wird die bakterielle DNA zunächst aus der Gesamt-DNA des Probenmaterials angereichert, und dann wird die angereicherte DNA mit spezifischen Primerpaaren amplifiziert. Der Nachweis der erhaltenen Amplifikate ermöglicht die genaue Identifizierung von in dem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen und deren Resistenzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine einfache und rasche Bestimmung von Bakterien und Pilzen in Probenmaterialien ermöglichen. Überraschend wurde gefunden, dass sich durch die einfache Kombination eines spezifischen Anreicherungsschritts für bakterielle und fungale DNA im Verhältnis zu anderer DNA im Probenmaterial, insbesondere humaner DNA, mit einem Amplifikationsschritt nicht nur die Nachweisempfindlichkeit für einzelne Bakterien und Pilze erheblich steigern lässt, sondern dass sich auf diese Weise sogar zahlreiche verschiedene Gattungen und Spezies von Bakterien und Pilzen parallel mit hoher Sensitivität nachweisen lassen. Dies ermöglicht eine gleichzeitige rasche und zuverlässige Bestimmung von Krankheitserregern und erlaubt es dem behandelnden Arzt, die Therapie ohne Zeitverlust optimal auf die nachgewiesenen Pathogene abzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine wichtige Hilfe bei der Entscheidung des Arztes über die geeignete therapeutische Behandlung dar. Da das erfindungsgemäße Verfahren mit Primern durchgeführt wird, die den generellen Nachweis von Bakterien und/oder Pilzen erlauben, lässt sich außerdem selbst dann noch eine Infektion nachweisen, wenn es sich bei den Erregern um bislang selten oder noch gar nicht aufgetretene Bakterien und Pilze handelt.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren näher beschrieben.
  • 1 zeigt eine graphische Darstellung der Abhängigkeit der Anreicherung von prokaryontischer und fungaler DNA vom Anfangsgehalt der Gesamt-DNA;
  • 2 zeigt eine Agarosegelelektrophorese zum Nachweis von E. coli in Aszitesflüssigkeit mittels Multiplex-PCR nach Anreicherung prokaryontischer und fungaler DNA;
  • 3 zeigt den Nachweis von bakterieller DNA nach DNA-Anreicherung und Multiplex-PCR mit 50 verschiedenen Primerpaaren aus einer mit der DNA verschiedener Mikroorganismen versetzten Blutprobe; 3A zeigt die Liste der Mikroorganismen, gegen die die eingesetzten Primer gerichtet waren; 3B zeigt die Aufnahme eines Agarosegels mit PCR-Amplifikaten der gespikten Mikroorganismen; 3C zeigt die Gelbelegung für 3B;
  • 4 zeigt das Spottingschema für die Sonden eines Mikroarrays für einen beispielhaften Sonden-basierten Nachweis biotinylierter PCR-Amplifikate, die für bestimmte Bakterien, Pilze und Resistenzen spezifisch sind;
  • 5 zeigt eine photographische Aufnahme des Mikroarray von 4 nach Hybridisierung mit dem biotinylierten, E. coli-spezifischen PCR-Amplifikat irp2;
  • 6 zeigt eine Agarosegelelektrophorese einer Multiplex-PCR von mechanisch lysierten Vollblutproben gesunder Spender, die mit Übernachtkulturen von C. albicans und S. pyogenes versetzt wurden;
  • 7 zeigt eine qPCR-Auswertung von mechanisch lysierter Vollblutprobe eines gesunden Spenders, die mit einer Übernachtkultur von C. albicans versetzt wurde; und
  • 8 zeigt eine qPCR-Auswertung von mechanisch lysierter Vollblutprobe eines gesunden Spenders, die mit einer Übernachtkultur von S. pyogenes versetzt wurde.
  • Die nachfolgenden Beispiele stellen lediglich Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dar und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Nachweis von Erregern von spontaner bakterieller Peritonitis SBP)
  • Probennahme
  • Die Proben stammten von der Klinik für Innere Medizin, Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Infektiologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland. Aszitesflüssigkeit wurde nach Zustimmung der örtlichen Ethikkommission zum Ablauf der Studie von 75 Patienten mit Verdacht auf SBP entnommen. Als Goldstandard wurde die Gesamtzellzahl gemessen, und in Fällen, bei denen die Anzahl 250 Zellen/μl überstieg, wurde die Anzahl neutrophiler Zellen bestimmt. Asziteskulturen wurden in Blutkulturflaschen angelegt (aerob/anaerob), die mit 5 ml Aszites inokuliert wurden. Gesamt-DNA wurde nach Extraktion mit einem Nanodrop®-Gerät bestimmt. Es wurde eine Untergruppe aus 14 Patienten (6 Frauen (Durchschnittsalter 67 Jahre), 8 Männer (Durchschnittsalter 57,6 Jahre) ausgewählt, bei der die Anzahl neutrophiler Zellen den Schwellenwert des Goldstandards überstieg, oder die Asziteskultur positiv war, oder andere Hinweise (z. B. über eine Blutkultur) auf eine systemische Infektion deuten, oder die in einem zweiten Schritt wie nachfolgend beschrieben durchgeführte 16S-rDNA-qPCR signifikant erhöhte Kopienzahlen der Zielsequenz lieferte.
  • Zur Probenverarbeitung für den Nukleinsäuretest (NAT) wurden 50 ml Aszites in 50 ml-Falcon-Röhrchen gegeben. Die Zellen wurde gezählt und abzentrifugiert. Das Pellet wurden in 5 ml des verbleibenden Überstands resuspendiert und bei –80°C aufbewahrt.
  • Isolierung von Gesamt-DNA aus Aszites-Proben
  • Die Isolierung von Gesamt-DNA erfolgte mit LOOXSTER® nach den Angaben des Herstellers.
  • Zelllyse
  • Zu der aufgetauten Aszitesprobe wurden 100 μl Lysozym-Lösung (Endkonzentration 1 mg/ml) gegeben und nach kurzem Vortexen wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Es wurden 5 ml Lysis-Puffer A und 100 μl Proteaselösung zugegeben und nach kurzem Vortexen wurde 1 h bei 50°C. die Probe wurde 20 s vortexbehandelt und auf die Membran eines 50 ml-Röhrchens aufgebracht.
  • Bindung und Waschen
  • Das Röhrchen wurde 2 min bei 3.000 × g zentrifugiert. Das Röhrchen wurde gewechselt, es wurden 5 ml Puffer B zugegeben, und es wurde nochmals zentrifugiert. Es wurden erneut 5 ml Puffer B zugegeben und nochmals zentrifugiert.
  • Elution
  • Das Röhrchen wurde gewechselt, es wurden 2,5 ml Puffer C auf die Membran gegeben und es wurde 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Röhrchen wurde 1 min bei 3.000 × g, es wurden weitere 2,5 ml Puffer C auf die Membran gegeben, und das Röhrchen wurde erneut zentrifugiert. Der Membraneinsatz wurde verworfen und das Eluat ein frisches 15 ml-Röhrchen überführt.
  • Fällung
  • Es wurden 4 ml Isopropanol zugegeben und dann wurde vorsichtig gemischt und 60 min bei 3.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet mit 2 ml eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Das Röhrchen wurde 5 min bei 3.000 × g zentrifugiert und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 200 μl destilliertem Wasser (DNA- und DNase-frei) bei 50°C 1 h gelöst. 16 μl wurden zur qPCR-Analyse vor Anreicherung prokaryontischer und fungaler DNA entnommen. Die restlichen 184 μl wurden in 184 μl 2 × Puffer D eingemischt.
  • Anreicherung prokaryontischer und fungaler DNA
  • Die Anreicherung spezifischer genomischer bakterieller und fungaler DNA erfolgte mit dem LOOXSTER®-Kit nach den Angaben des Herstellers. Der Kit enthält Säulen, Sammelröhrchen und Reagenzien zur Anreicherung prokaryontischer DNA aus Proben mit gemischter DNA aus humaner und bakterieller DNA, die auch zur Anreicherung fungaler DNA geeignet sind. Die Versuchsdurchführung ist nachfolgend zusammengefasst.
  • Bindung
  • Die Säulen wurden nach den Angaben in LOOXSTER® konditioniert. 368 μl der in Puffer D gelösten DNA wurden auf die vorbereitete Säule gegeben Die Mischung aus Matrix/DNA wurde vorsichtig auf- und abpipettiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde bei Raumtemperatur 30 s bei 1.000 × g zentrifugiert und der Durchfluss wurde verworfen.
  • Waschen
  • Es wurden 2 × 300 μl Puffer D auf die Säule gegeben und dann wurde bei Raumtemperatur zweimal 30 s bei 1.000 × g zentrifugiert.
  • Elutionsschritt
  • Die Säule wurde in ein neues 2 ml-Röhrchen überführt und es wurden 300 μl Puffer D zugegeben. Die Mischung aus Matrix/DNA wurde vorsichtig auf- und abpipettiert. Die Säule wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und bei Raumtemperatur 30 s bei 1.000 × g zentrifugiert. Es wurden erneut 300 μl Puffer E auf die Säule gegeben und dann wurde 30 s bei 1.000 × g zentrifugiert. Das Volumen des Eluats betrug 600 μl.
  • Fällung
  • Die eluierte DNA wurde durch Zugabe von 5 μl Lösung G, 60 μl NaAc, pH 5,2, und 480 μl Isopropanol gefällt. Nach kurzem Vortexen (10 s) wurde die Probe bei 4°C 60 min bei 16.000 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde 2× mit 1 ml eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, 5 min bei 16.000 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet und in 30 μl DNA- und DNase-freiem Wasser bei 50°C 1 h gelöst. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Nanodrop®-Gerät bestimmt.
  • Real Time-PCR mit 16S-Primern
  • Die Quantifizierung prokaryontischer DNA erfolgte mittels 16S-rDNA-qPCR. Die Gesamt-DNA-Konzentration wurde auf eine optimale Konzentration von 200 ng/Reaktion eingestellt. Obwohl der Gehalt an isolierter DNA gering war, wurden gleiche Konzentrationen dieser relevanten Proben mit und ohne Anreicherung durch das LOOXSTER®-System untersucht. Eine negative Kontrolle mit DNA-freiem Wasser wurde analog den Patientenproben laufen gelassen, um eine Schwelle (Cut off) für das Handling bakterieller DNA zu bestimmen. Ein Aliquot der Probe eines jeden Patienten wurde mit Bakterien-DNA versetzt (105 Genomkopien), um eine potenzielle Hemmung der PCR festzustellen. Kontrollen ohne Template (NTC) wurden ebenfalls aufgenommen. Der Nachweis basierte auf Fluoreszenz als Folge des Einbaus von SYBR® Green in Doppelstrang-DNA. 25 μl Reaktionsvolumen bestanden aus ≤ 200 ng Gesamtgenom-DNA in 10 μl, 12,5 μl 2 × QuantiTect® SYBR® Green PCR Master Mix (QIAGEN®), und 1,25 μl (10 pmol Endkonzentration) von jeweils Vorwärts- und Rückwärtsprimer. Alle Schritte wurden doppelt mit einem Rotor-Gene RG-3000 qPCR-Gerät (Corbett Life Science, Sydney, Australien) durchgeführt. Eine DNA-Denaturierung zu Beginn wurde 15 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 45 Zyklen von 94°C für 30 s, 50°C für 30 s, 72°C für 1 min. The Berechnung erfolgte mit der Rotor-Gene 6-Software.
  • Multiplex-PCR
  • Die Identifizierung der bakteriellen und fungalen Pathogene für einen optimalen therapeutischen Ansatz erfolgte mittels nicht-quantitativer Multiplex-PCR. Die Reaktion wurde in zwei Reaktionsgefäßen mit zwei Primerpools (Primerpools I und II) durchgeführt, die Primerpaare mit Nukleinsäuresequenzen enthielten, die für Bakterien und Fungi generell sowie für bestimmte Bakterien- und Pilzgattungen, bestimmte Bakterienspezies sowie ausgewählte Resistenzen spezifisch waren. Die nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die von diesem Versuch abgedeckten Bakterien, Pilze und Resistenzen.
  • Tabelle 1: Getestete Bakterien, Pilze und Resistenzen
  • Bakterien:
    • Burkholderia cepacia
    • Enterobacter aerogenes
    • E. cloacae
    • E. faecium
    • E. faecalis
    • Escherichia coli ,
    • Klebsiella oxytoca
    • Klebsiella pneumoniae
    • Morganella morganii
    • Prevotella spp
    • P. melanogenica
    • Proteus mirabilis
    • Pseudomonas aeruginosa
    • Staphylococcus spp
    • Staphylococcus aureus
    • Staphylococcus haemolyticus
    • Stenotrophomonas maltophila
    • Streptokokken der Viridans-Gruppe
    • S. pneumoniae
    • S. pyogenes
  • Fungi:
    • Fungi spp
    • Aspergillus fumigatus
    • Candida albicans
  • Resistenzen:
    • Methicillin
  • Die DNA-Konzentration wurde auf eine optimale Konzentration von ≤ 500 ng/Reaktion eingestellt. Wenn der isolierte DNA-Gehalt unzureichend war, wurden geringere Konzentrationen zur LOOXSTER®-Behandlung eingesetzt. Die Reaktionsvolumina von 25 μl bestanden aus einer variablen Menge Template-DNA, 12,5 μl 2 × Multiplex PCR Master Mix (Quiagen®), 2,5 μl Primer-Mix (10 pmol Endkonzentration, eingesetzt als Primerpools I und II) und DNA- und DNase-freiem Wasser. Eine anfängliche DNA-Denaturierung erfolgte 15 min bei 95°C zur Aktivierung von HotStar Taq® DNA-Polymerase (Quiagen®), gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für 30 s, 59°C für 1,5 min und 72°C für 45 s. Das Programm endete mit einem terminalen Hybridisierungsschritt 72°C für 10 min. Alle Schritte wurden mit einem Mastercycler® Gradient S (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Die Proben wurden auf einem 2%igen Agarosegel analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die bei der Multiplex-PCR erhaltenen Daten wurden mit dem Goldstandard (erhöhte Anzahl polymorpher Zellen im Aszites ≥ 250/μl) und denen der Asziteskulturen verglichen. Die Effizienz des LOOXSTER®-Verfahrens abhängig vom DNA-Gehalt, der auf die Säule aufgetragen wurde, wurde mittels 16S-rDNA-PCR vor und nach LOOXSTER® bestimmt (1). Wie in 1 gezeigt ist, nimmt der Konzentrationsfaktor für die Anreicherung von prokaryontischer und fungaler DNA mit höheren DNA-Mengen zu. Aus Vollblut können mehr als 20 μg DNA isoliert werden. Bei Aszitesflüssigkeiten mit schwankenden DNA-Konzentrationen von < 1 bis > 20 μg wurde in jedem Fall eine signifikante Anreicherung beobachtet.
  • Bei 19 Proben, die von der obigen Untergruppe aus 14 Patienten mit Verdacht auf SBP stammten, war die Multiplex-PCR in allen Fällen positiv, bei denen die Asziteskulturen positiv waren und bei denen eine erhöhte Anzahl neutrophiler Zellen gezählt wurde. Außerdem wurde nachgewiesen, dass ein Patient mit E. faecalis, E. coli und E. faecium mehrfachinfiziert war, bei dem die Asziteskultur und auch die Gesamtzellzahl negativ waren (< 250 Zellen/μl). Tabelle 2 fasst die Ergebnisse der Studie an den 19 Proben zusammen, und Tabelle 3 gibt eine Auswahl der Fallberichte für Patienten wieder, bei denen SBP durch das bei der Studie verwendete erfindungsgemäße Verfahren bestätigt wurde. 2 gibt zeigt die Gelelektrophorese einer Multiplex-PCR auf einem Agarosegel zum Nachweis einer E. coli-Infektion in zwei Proben von Aszitesflüssigkeit, die Patient 1 innerhalb von 2 Tagen entnommen worden waren. Die Spuren 1 und 2 zeigen mit Primerpool I getestete Proben. Die Banden bei 218 bp sind für E. coli-Amplikons spezifisch. Tabelle 2: Statistik der Aszites-Studie
    Polymorphe neutrophile Zellen
    Multiplex-PCR negativ positiv NPV/PPV
    negative 15 0 100%
    positive 1 3 75%
    Spez./Sens. 93,75% 100%
    • NPV/PPV:
    vorhergesagter negativ/positiv-Wert
    Spez./Sens.:
    Spezifität und Sensitivität von Multiplex-PCR verglichen mit Goldstandard
    Tabelle 3: Ausgewählte Fallberichte aus der Untergruppe mit 14 Patienten
    Patient Ascites-Kultur1 Gesamtzellzahl Anzahl neutrophile Zellen qPCR-16S-rDNA Kopien Multiplex-PCR Blutkultur (optional) Anmerkung (Diagnose; Antibiose)
    Schwelle - ≥ 2502 ≥ 2503 ≥ 50% über Mittelwert4 - -
    1 E. coli, S. haemolyticus 9.700 6.220 ja E. coli negativ Sepsis; kont. Therapie mit Ceftazidim
    2 negativ 90 ja E. faecalis, E. coli, E. faecium E. faecalis pyic Peritonitis; Therapie mit Ceftriaxon/Metronidazol; nach Pathogendetektion in Kultur Änderung auf Tazobac
    3 E. coli 740 390 nein E. coli E. coli Sepsis; kont. Therapie mit Ciprofloxacin
    • 1Pathogene in Fällen positiver Asziteskulturen durch Kulturverfahren spezifiziert
    • 2Schwellenwert für die Bestimmung der Anzahl neutrophiler Zellen
    • aGoldstandartschwelle für SBP-Diagnose
    • 4qPCR-Cut off
  • Das nukleinsäurebasierte PCR-Verfahren lieferte in allen drei ausgewählten Fällen positive Resultate. Die Gesamtzellzahl und die Anzahl neutrophiler Zellen waren erhöht, und die Asziteskulturen waren in zwei Fällen positiv. Zusätzlich brachte die Multiplex-PCR in einem Fall (Patient 2), bei dem weder Zellzahl noch die mittels qPCR bestimmte Kopienzahl erhöht waren, eine Mehrfachinfektion zu Tage. Der Patient wurde anfänglich mit Ceftriaxon/Metronidazol behandelt. Drei Tage nach Entnahme von Blut und Aszitesflüssigkeit war die Blutkultur positiv für E. faecalis, während die parallelen Asziteskulturen negativ blieben. Daher wurde die Therapie auf Tazobac umgestellt, das das Wachstum von E. faecium nicht hemmt. Außerdem wurden bei Wundabstrichen E. coli, E. faecalis und E. faecium gefunden. Die gleichen drei Organismen (E. coli, E. faecalis und E. faecium) wurden aber auch mit Multiplex-PCR gefunden. Dies zeigt, das Multiplex-PCR innerhalb von etwa 6 h die gleichen Resultate liefert wie Blut- und Asziteskulturen innerhalb einiger Tage. Die Verwendung einer Multiplex-PCR in Kombination mit einer Anreicherung bakterieller und fungaler DNA aus Gesamt-DNA ermöglichen also eine rasche und frühe Pathogendetektion sowie eine geeignete und frühe Antibiotikatherapie.
  • Weder das aktuelle Goldstandardverfahren noch eine 16S-rDNA-qPCR sind also in diesem Fall alleine ausreichend, um eine SBP zu diagnostizieren, ganz zu schweigen davon, dass diese Verfahren keine Information über eine spezifische Antibiotikabehandlung liefern.
  • Beispiel 2
  • Nachweis von Bakterien und Pilzen in gespikten Proben mittels PCR und Gelelektrophorese
  • Eine Blutprobe wurde mit bakterieller DNA von S. aureus, E. coli und K. pneumoniae versetzt (gespikt). Gesamt-DNA-Präparation und Anreicherung von Bakterien-DNA mit LOOXSTER® erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die erhaltenen DNA-Proben wurden mit 50 Sepsis-spezifischen Primerpaaren, die für bestimmte Nukleinsäuresequenzen der in 3A gezeigten Bakterien und Pilze spezifisch waren, wie in Beispiel 1 beschrieben in verschiedenen Ansätzen mittels nicht quantitativer Multiplex-PCR amplifiziert. Die Proben wurden auf einem 2%igen Agarosegel analysiert. 3B zeigt ein entsprechendes Agarosegel mit PCR-Amplifikaten (Amplikons) der zugesetzten Bakterien-DNA. 3C zeigt die zugehörige Gelbelegung und die erwarteten Amplifikatgrößen für die ausgewählten PCR-Targets (M ist Marker).
  • Der Versuch zeigt, dass sich die drei Bakterienspezies S. aureus, E. coli und K. pneumoniae nach DNA-Anreicherung und Multiplex-PCR mit spezifischen Primerpaaren spezifisch nachweisen ließen.
  • Beispiel 3
  • Multiplex-PCR und Sonden-basierter Nachweis von Escherichia coli in gespikten Proben
  • Eine Blutprobe wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit bakterieller DNA von E. coli gespikt. Gesamt-DNA-Präparation und Anreicherung von Bakterien-DNA mit LOOXSTER® erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben. Zum Nachweis von E. coli wurde eine Multiplex-PCR in Anwesenheit von Biotin-16-dUTP mit Primern gegen das Gen irp2 durchgeführt.
  • Der erfolgreiche Einbau des markierten Nukleotids wurde mittels Southern-Blot nachgewiesen. Zum Blotten wurden zwei Lagen Whatman-Filterpapier und eine Nitrocellulosemembran in 0,5 × TBE-Puffer getränkt und der Reihenfolge nach auf die Anode (–) gelegt. Dann wurde das Gel auf die Membran gelegt und mit zwei Lagen Whatman-Filterpapier, getränkt in 0,5 × TBE, abgedeckt. Zuletzt wurde die Kathode (+) aufgelegt und das Gerät 12 min bei 2 A angeschlossen. Zur Fixierung wurde UV-Crosslinking eingesetzt. Die Membran wurde 1 min bei 150 mJ/cm2 mit UV-Licht bestrahlt und danach 30 min an der Luft getrocknet. Anschließend wurde die Membran mit Blockingpuffer 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Danach wurde die Membran 3 mal 5 min mit TEST-Puffer gewaschen. Die Membran wurde mit Streptavidin-HRP einer Verdünnung 1:2000 mit Blocking-Lösung behandelt. Es erfolgte eine Inkubation von 30 min bei Raumtemperatur. Es entstand ein typisches Streptavidin-Biotin Konjugat. Danach wurde die Membran 3 mal 5 min mit TEST-Puffer gewaschen und das Substrat auf die Membran gegeben. Als Substrat wurde TMB verwendet. Die Entwicklung des Blots dauerte 10 min. Es bildete sich ein blauer Farbstoff an den Stellen, an denen das Biotin eingebaut wurde (nicht gezeigt). Das erwartete 200 bp-irp2-Amplifikat wurde auch mittels Gelelektrophorese nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).
  • Die Anwesenheit des biotinylierten 200 bp-irp2-Amplifikat wurde anschließend wie folgt über einen Sonden-basierten Assay (Mikroarray) nachgewiesen.
  • Sondendesign und Chip-Herstellung
  • Bei allen ausgewählten Oligonukleotiden wurde darauf geachtet, dass mindestens 7–8 Basenfehlpaarungen (Temperaturunterschied 14–16°C) zu allen anderen DNA-Sequenzen, welche in der NCBI-GenBank (nr, est human) hinterlegt sind, vorhanden waren. Die Sequenzen wurden mit dem Programm Arraydesigner® unter folgenden Vorgaben berechnet:
    • • Sondenlänge 35 ± 5 Basen
    • • Schmelztemperatur ca. 70°C
    • • ausgeglichener GC-Gehalt (A/T:G/C = 1:1)
    • • 2 nicht-überlappende Sonden je Target für den spezifischen Erregernachweis
    • • Vermeidung von Kreuzreaktionen zu Human und anderen bakteriellen Targets
    • • Poly-T (10 T's) am 3'-Ende der Sonden für die Beweglichkeit der Sonden auf dem Array
    • • Aminomodifizierung am 3'-Ende der Oligonukleotide zur Kopplung an die Oberfläche des DNA-Mikroarrays
  • Kreuzreaktionen wurden mit definierten Primern aller genutzten Targets durch rechnergestützten Abgleich der Sonde gegen alle Primer/Amplifikate der eingesetzten Targets ausgeschlossen.
  • Die Detektion der PCR-Fragmente basierte auf dem AT®-System (Clondiag Chip Technologies, 07749 Jena, Deutschland). Die Herstellung der Arraytubes erfolgte bei Clondiag nach dem in 4 gezeigten Spottingschema, das die Anordnung der einzelnen Oligonukleotide auf dem DNA-Mikroarray zeigt. Dabei wurden zusätzlich Biotinsonden auf dem Randbereich des Arrays immobilisiert (Biotin Marke). Diese dienen als Positiv-Kontrolle, da durch die Reaktion des Biotins mit dem zur Detektion eingesetzten Streptavidin sich an diesen Sonden immer ein Spot bildet. Des Weiteren lassen sich aus der Intensität der Biotinsonden Aussagen über das Verhältnis Probenmenge zu vorhandenen Gensonden treffen. Die Intensität der Spots, die durch die spezifischen Gensonden entstehen, sollte die Intensität der Biotinsonden nicht überschreiten, da dies auf eine Überladung des Arrays mit den PCR-Fragmenten hindeutet und zu falsch positiven Ergebnissen führen kann.
  • Hybridisierung
  • Biotinylierte Amplifikate wurden direkt zur Hybridisierung verwendet. Dazu wurden 4 μl des biotinylierten PCR-Produktes in 96 μl Hybridisierungspuffer aufgenommen und außerhalb des Array-Tubes® 5 min bei 95°C denaturiert und danach sofort 120 s auf Eis gekühlt.
  • Die Array-Tubes® wurden zweimal vorgewaschen. Sämtliche verwendeten Lösungen wurden nach Ablauf der Reaktionszeit mit einer Plastik-Pasteurpipette vorsichtig entfernt. Durch Zugabe von 500 μl Aqua bidest erfolgte eine Denaturierung 5 min bei 50°C und 550 rpm auf dem Thermomixer. Danach wurden 500 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und 5 min bei 50°C und 550 rpm inkubiert. Anschließend wurden 100 μl der denaturierten Probe 60 min bei 50°C und 550 rpm in dem AT®-System hybridisiert. Nach drei Waschschritten, erstens mit 500 μl Waschlösung 1 (5 min bei 40°C und 550 rpm) zweitens mit 500 μl Waschlösung 2 (5 min bei 30°C und 550 rpm) und zuletzt mit 500 μl Waschlösung 3 (5 min bei 30°C und 550 rpm) wurden 100 μl eines frisch präparierten 2%-igen Blockingpuffers für 15' bei 30°C und 550 rpm auf den Array gebracht, um dessen Hintergrundsignal abzuschwächen. Von der frisch hergestellten Streptavidin-HRP-Konjugatlösung wurden anschließend 100 μl auf das Array pipettiert und für 15 min bei 30°C und 550 rpm konjugiert. Danach wurde mit 500 μl Waschlösung 1 (5 min bei 30°C und 550 rpm) gewaschen. Durch Zugabe von 500 μl Waschlösung 2 erfolgte der zweite Waschschritt 5 min bei 20°C und 550 rpm. Zuletzt wurde das AT® mit 500 μl Waschlösung 3 versetzt, und 5 min bei 20°C und 550 rpm inkubiert. Das Array-Tube® wurde in den temperierten Ausleseschacht (25°C) des AT®-Readers eingelegt, in welchem unter Sichtkontrolle über die CCD-Kamera des Readers die letzte Waschlösung entfernt und die Kamera des Readers fokussiert wurde. Unmittelbar darauf erfolgte durch Zugabe von 100 μl Peroxidase Substrat (TMB) die Detektion. Es wurden 60 Bilder, daß heißt alle 10 Sekunden ein Bild, aufgenommen. Die CCD-Kamera misst die Transmission von Weißlicht durch das Array-Tubes®. Die so gewonnenen Daten wurden mit der Software IconoClust® ausgewertet.
  • 5 stellt eine photographische Aufnahme des Hybridisierungsergebnisses des Einzelansatzes des biotinylierten irp2 von E. coli dar. Es zeigt sich, dass das 200 bp-Amplifikat des irp2-Gens ohne Kreuzreaktion zu anderen Sonden nachgewiesen werden konnte.
  • Beispiel 4
  • Nicht quantitative und quantitative PCR zum Nachweis von Streptococcus pyogenes und Candida albicans in Vollblutproben
  • Vollblutproben gesunder Spender wurden mit Übernachtkulturen (105 Zellen) von C. albicans [ATCC MYA-2876] und S. pyogenes [Varia 42440 (Institut für Medizinische Mikrobiologie, Jena), positive Blutkultur eines Septikers] versetzt. Die Zellen wurden nach Zugabe von 2 g Glas-Beads (G8772 Glas-Beads, säuregewaschen, 425–600 μm, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schellendorf, Deutschland) und 100 μl Protease mechanisch durch 2 × 2 min Vortexen mit jeweils anschließender 2-minütiger Inkubation bei 50°C lysiert. Die Isolation von Gesamt-DNA erfolgte mit dem Genomic Maxi AX Blood-Kit (A&A Biotechnology, Gdynia, Polen) und die Anreicherung von bakterieller und fungaler DNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit LOOXSTER® durchgeführt.
  • Nicht quantitative PCR
  • Die Identifizierung von C. albicans und S. pyogenes erfolgte durch nicht quantitative Multiplex-PCR. Die DNA-Konzentration der LOOXSTER®-Eluate im Multiplex-PCR-Ansatz wurde auf 500 ng eingestellt (NanoDrop®-DNA-Konzentrationsbestimmungen). Die 25 μl Reaktionsvolumen (zwei Primer-Pools mit mehreren Spezies-spezifischen Primerpaaren, d. h. zwei Reaktionsansätze pro Probe) bestanden aus 5 μl Template-DNA, 5 μl DNA-freiem Zellkulturwasser (PAA), 12,5 μl 2 × Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN®, Hilden, Deutschland) und 2,5 μl 10 × Primer Mix (10 pmol Endkonzentration). Eine initiale Denaturierung bei 95°C für 15 min wurde für die Aktivierung der HotStarTaq® DNA-Polymerase (QIAGEN®) benötigt. Das vollständige PCR-Thermozykler-Programm findet sich in der untenstehenden Tabelle 4. Tabelle 4: Thermozykler-Programm
    Hauptabschnitt Teilabschnitt Temperatur [°C] Zeit [s] Zyklen
    Initialdenaturierung 95 900 1
    Amplifikation Denaturierung 94 45
    Annealing 59 30 30
    Extension 72 45
    Finalextension 72 600 1
  • Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Mastercycler® ep Gradient S (Eppendorf AG, Hamburg) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5%igen Agarosegelen aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt, die eine Aufnahme des entsprechenden Agarosegels zeigt, wobei: M: DNA-Marker (Angabe in bp), 1: Primer-Pool 1 und aufgearbeitete C. albicans-Blutprobe, 2: Primer-Pool 2 und aufgearbeitete C. albicans-Blutprobe, 3: Primer-Pool 1 und Zellkulturwasser (NTC), 4: Primer-Pool 1 und aufgearbeitete S. pyogenes-Blutprobe, 5: Primer-Pool 2 und aufgearbeitete S. pyogenes-Blutprobe, 6: Primer-Pool 2 und Zellkulturwasser (NTC). Spur 4 zeigt die Amplikons von sagH (662 bp) und slo- (737 bp) zum Nachweis von S. pyogenes (#) und Spur 2 zeigt das TEF2-Amplikon zum Nachweis von C. albicans (*).
  • Die Ergebnisse zeigen, dass sich C. albicans und S. pyogenes in Blutproben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren spezifisch nachweisen lassen.
  • Real-Time-PCR (qPCR) nach mechanischer Zelllyse
  • Die Quantifizierung fungaler und bakterieller Targets erfolgte über quantitative PCR (qPCR bzw. Real-Time-PCR) mit Hilfe von 18S-rDNA- und genspezifischen Primern. Die Gesamt-DNA-Menge betrug 200 ng/Reaktion (auf Basis von NanoDrop®-DNA-Messungen). Es wurde die wie oben beschrieben über LOOXSTER® angereicherte DNA eingesetzt. Als Negativkontrolle (zur Bestimmung des Schwellenwertes (Threshold) oder "Cut Off" für Erreger-DNA) wurde DNA-freies Zellkulturwasser (PAA) eingesetzt. Die Detektion basiert auf der Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR® Green in DNA. Der 25 μl-Reaktionsansatz bestand aus 10 μl genomischer DNA (200 ng), 12,5 μl 2 × QuantiTect® SYBR® Green PCR Master Mix (QIAGEN®) und 1,25 μl (10 pmol Endkonzentration) jedes Vorwärts- und Rückwärts-Primers. Zum Nachweis von C. albicans wurde das 18S-rDNA-Primerpaar panfneu11/12, für S. pyogenes das genspezifische Primerpaar sagA eingesetzt.
  • Alle Reaktionsschritte wurden in zwei Parallelen in einem Rotor-GeneTM RG 3000 (Corbett Life Science, Sydney, Australien) durchgeführt. Das Thermocycler-Programm findet sich in nachstehender Tabelle 5. Die Auswertung erfolgte mittels der System-kompatiblen Rotor-Gene 6 Software. Tabelle 5: qPCR-Thermozykler-Programm
    Hauptabschnitt Teilabschnitt Temperatur [°C] Zeit [S] Zyklen
    Initialdenaturierung 94 900 1
    Denaturierung 94 30
    Amplifikation Annealing 55 30 45
    Extension 72 60
    Schmelzkurvenanalyse 50–95 30 beim 1. Schritt, 5 bei nächsten Schritten (1 Grad/Schritt) 1
  • Ergebnisse
  • In den 7 und 8 finden sich die Ergebnisse nach Rotor-Gene 6-Auswertung. Es wurden relative Fluoreszenzwerte (Ordinate) gegen PCR-Zyklen (Abzisse) abgetragen. Als Berechnungsgrundlage dient die Ermittlung des Ct-Wertes, d. h. die Zyklenzahl, bei der erstmalig der Fluoreszenz-Schwellenwert ("Threshold") binnen einer Amplifikat-spezifischen Fluoreszenzkurve überschritten wird.
  • 7 zeigt die qPCR-Auswertung der mechanisch lysierter Vollblutprobe eines gesunden Spenders, die mit einer Übernachtkultur von C. albicans (ATCC MYA-2876) versetzt wurde. Es wurde die relative Fluoreszenz gegen die PCR-Zyklenanzahl abgetragen. Dargestellt ist die C. albicans-Standardreihe (schwarz) von 107 bis 102 Kopien. Die Wiederfindungsrate von der gespikten Zellzahl in Höhe von 105 der mechanisch aufgearbeiteten C. albicans-Probe beträgt ca. 14% (~ 102,9 Kopien entspricht ~ 490 pg fungaler DNA bei 35 fg pro Genomkopie).
  • 8 zeigt die qPCR-Auswertung der mechanisch lysierter Vollblutprobe eines gesunden Spenders, die mit einer Übernachtkultur von S. pyogenes [Varia 42440 (Institut für Medizinische Mikrobiologie, Jena), positive Blutkultur eines Septikers] versetzt wurde. Es wurde die relative Fluoreszenz gegen die PCR-Zyklenanzahl abgetragen. Dargestellt ist die S. pyogenes-Standardreihe (schwarz) von 107 bis 102 Kopien. Die Wiederfindungsrate von der gespikten Zellzahl in Höhe von 105 der mechanisch aufgearbeiteten S. pyogenes-Probe beträgt ca. 56% (~ 103,5 Kopien entspricht 112 pg bakterieller DNA bei 2 fg pro Genomkopie).
  • Die Ergebnisse zeigen, dass sich Bakterien und Pilze in Blutproben nach Anreicherung ihrer DNA über Proteine, die bakterielle und fungale DNA spezifisch binden, mittels qPCR nachweisen lassen, wobei die qPCR zudem eine Aussage über die Konzentration der Erreger in der Blutprobe zulässt.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (40)

  1. Verfahren zum Bestimmen von in einem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Anreichern von in dem Probenmaterial enthaltener bakterieller und fungaler DNA; b) Amplifizieren der in Schritt a) erhaltenen DNA unter Verwendung von Primerpaaren, die ausgewählt sind aus wenigstens zwei der Gruppen (i) bis (vii): (i) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Bakterienfamilien spezifisch ist; (ii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Pilzfamilien spezifisch ist; (iii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakteriengattung spezifisch ist; (iv) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakterienspezies spezifisch ist; (v) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für die Ausprägung einer ausgewählten Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz spezifisch ist; (vi) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzgattung spezifisch ist; und (vii) wenigstens einem Primerpaar, zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzspezies spezifisch ist; und, gegebenenfalls, c) Nachweisen der bei Schritt b) gebildeten Amplifikate.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Probenmaterial eine Umweltprobe, eine Lebensmittelprobe oder eine biologische Probe, insbesondere eine klinische Probe ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Probenmaterial, insbesondere die klinische Probe, eine menschliche oder tierische Probe ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die menschliche oder tierische Probe eine Gewebeprobe, eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt ist, insbesondere Blut oder ein Blutprodukt, wie Vollblut, Plasma, Serum oder Thrombozytenkonzentrat, Zerebrospinalflüssigkeit, Liquor, Urin, Pleuralflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Perikardialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und Synovialflüssigkeit.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Anreicherung der bakteriellen und/oder fungalen DNA durchgeführt wird, indem aus dem Probenmaterial gewonnene Gesamt-DNA mit einem Protein oder einem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, das fähig ist, an nicht-methylierte CpG-Motive zu binden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das wenigstens eine Primerpaar der Gruppe (i) ein Primerpaar ist, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die bakterielle 16S-rDNA hybridisiert.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das wenigstens eine Primerpaar der Gruppe (ii) ein Primerpaar ist, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die fungale 18S-rDNA hybridisiert.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Amplifikation in Schritt c) unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen die Amplifikate mit einem nachweisbaren Marker markiert werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Amplifikation in Schritt c) mittels nicht-quantitativer PCR durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Amplifikation in Schritt c) mittels Real-Time quantitative PCR (qPCR) durchgeführt wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Nachweis der bei Schritt c) erhaltenen Amplifikate mittels Gelelektrophorese oder nukleotidbasierten Hybridiserungsverfahren durchgeführt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Nachweis der bei Schritt c) erhaltenen Amplifikate mit einem Mikroarray durchgeführt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Hilfsmittel zur Therapieentscheidung.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis von Kontaminationen in Thrombozytenkonzentraten.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis von Erregern und/oder Resistenzen von Entzündungskrankheiten mit nicht nachgewiesener Infektion (SIRS).
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis von Infektionskrankheiten, insbesondere systemischen Infektionen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17 zur Früherkennung von Sepsis.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 zur Früherkennung von spontaner bakterieller Peritonitis.
  20. Verfahren nach Anspruch 17 zur Früherkennung von Endokarditis.
  21. Diagnostischer Kit zum Bestimmen von in einem Probenmaterial enthaltenen Bakterien und Pilzen, wobei der Kit umfasst: a) Mittel zum Anreichern von in dem Probenmaterial enthaltener bakterieller und fungaler DNA; b) Mittel zum Amplifizieren von DNA, wobei die Mittel Primerpaare enthalten, die ausgewählt sind aus wenigstens zwei der Gruppen (i) bis (vii): (i) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Bakterienfamilien spezifisch ist; (ii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine Vielzahl von Pilzfamilien spezifisch ist; (iii) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakteriengattung spezifisch ist; (iv) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Bakterienspezies spezifisch ist; (v) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für die Ausprägung einer ausgewählten Antibiotika- oder Antimykotikaresistenz spezifisch ist; (vi) wenigstens einem Primerpaar, das zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzgattung spezifisch ist; und (vii) wenigstens einem Primerpaar, zur spezifischen Amplifikation einer Region einer bestimmten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, die für eine ausgewählte Pilzspezies spezifisch ist, und, gegebenenfalls, c) Mittel zum Nachweisen der mit den Primerpaaren b) erhältlichen Amplifikate.
  22. Kit nach Anspruch 21, wobei die Mittel zur Anreicherung der bakteriellen und/oder fungalen DNA ein Protein oder ein Polypeptid umfassen, das fähig ist, an nicht-methylierte CpG-Motive zu binden.
  23. Kit nach einem der Ansprüche 21 oder 22, wobei das wenigstens eine Primerpaar der Gruppe (i) ein Primerpaar ist, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die bakterielle 16S-rDNA hybridisiert.
  24. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei das wenigstens eine Primerpaar der Gruppe (ii) ein Primerpaar ist, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz des Gens für die fungale 18S-rDNA hybridisiert.
  25. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die Mittel zum Amplifizieren von DNA Mittel umfassen, durch die die Amplifikate bei der Amplifikation mit einem nachweisbaren Marker versehen werden.
  26. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Mittel zum Amplifizieren von DNA Mittel zur Durchführung einer nicht-quantitativen PCR umfassen.
  27. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Mittel zum Amplifizieren von DNA Mittel zur Durchführung einer Real-Time quantitative PCR (qPCR) umfassen.
  28. Kit nach Anspruch 26, wobei die Mittel zum Nachweisen der mit den Primerpaaren b) erhältlichen Amplifikate Mittel zur Herstellung von Elektrophoresegelen umfassen.
  29. Kit nach Anspruch 26, wobei die Mittel zum Nachweisen der mit den Primerpaaren b) erhältlichen Amplifikate Mittel zur Durchführung eines Mikroarrays umfassen.
  30. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 29 zum Bestimmen von in einem Probenmaterial enthaltenen pathogenen Bakterien und Pilzen.
  31. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 29, wobei das Probenmaterial eine Umweltprobe, eine Lebensmittelprobe oder eine biologische Probe, insbesondere eine klinische Probe ist.
  32. Kit nach Anspruch 31, wobei das Probenmaterial, insbesondere die klinische Probe, eine menschliche oder tierische Probe ist.
  33. Kit nach Anspruch 32, wobei die menschliche oder tierische Probe eine Gewebeprobe, eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt ist.
  34. Kit nach Anspruch 33, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit oder ein davon abgeleitetes Produkt ist, insbesondere Blut oder ein Blutprodukt, wie Vollblut, Plasma, Serum oder Thrombozytenkonzentrat, Zerebrospinalflüssigkeit, Liquor, Urin, Pleuralflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Perikardialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und Synovialflüssigkeit.
  35. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 34 zum Nachweis von Kontaminationen in Thrombozytenkonzentraten.
  36. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 34 zum Nachweis von Erregern und/oder Resistenzen von Entzündungskrankheiten mit nicht nachgewiesener Infektion (SIRS).
  37. Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 34 zum Nachweis von Infektionskrankheiten, insbesondere systemischen Infektionen.
  38. Kit nach Anspruch 37 zur Früherkennung von Sepsis.
  39. Kit nach Anspruch 37 zur Früherkennung von spontaner bakterieller Peritonitis.
  40. Kit nach Anspruch 37 zur Früherkennung von Endokarditis.
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