CN114965906B

CN114965906B - 一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法

Info

Publication number: CN114965906B
Application number: CN202210019960.7A
Authority: CN
Inventors: 刘芳; 孙芝兰; 王道营; 袁伟
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114965906A

Abstract

本发明提供一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法，属于食品检测技术领域。该检测方法包括：在裸金电极表面固定DNA正四面体；RCA模板和模板引物在T4 DNA连接酶的催化下，合成环状DNA模板；进行滚环扩增反应，得RCA反应溶液；将RCA反应溶液滴加到修饰后的金电极表面，进行偶联，滴加含有氯化血红素的溶液，得到检测电极；将待检样品滴加至检测电极，浸泡反应，收集电极表面残留液；将表面残留液与TMB进行反应，检测紫外吸光度值，根据标准曲线计算菌浓度；将反应后的电极浸泡在含苯胺的缓冲液中反应，然后检测电流值，根据标准曲线计算菌浓度。本发明方法能够快速、准确、高灵敏度地检测目标菌。

Description

一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法。

背景技术

铜绿假单胞菌在日常饮食中经常污染凉拌菜、熟肉制品、桶装水等产品，对人类健康产生潜在威胁，因此对其进行快速分析准确检测具有重要意义。目前国内对于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)等食源性致病菌的检测手段，主要包括传统的培养法(平板计数法)、以核酸为分析目标的检测方法(PCR、DNA生物传感等)及以多肽、蛋白质为分析目标的检测方法(免疫传感器、质谱分析等)等。其中平板计数法虽然准确但是耗时长不利于快检；PCR虽然达到了快速检测但是无法高灵敏检测；而质谱分析技术则需要专业仪器和专业人员才可以操作不利于实际操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法，能够快速、准确、高灵敏度地检测铜绿假单胞菌。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法，包括如下步骤：

(1)在裸金电极表面固定由核酸片段Tetra-A-aptamer、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH形成的DNA正四面体，得到修饰了DNA纳米探针的金电极；

(2)RCA模板和模板引物在T4 DNA连接酶的催化下，合成环状DNA模板；以环状DNA模板为模板，以捕获探针为引物进行滚环扩增反应，得到RCA反应溶液；

(3)将RCA反应溶液滴加到修饰了DNA纳米探针的金电极表面，进行偶联；在偶联后的电极表面，滴加含有氯化血红素的溶液，得到检测电极；

(4)将待检样品滴加至检测电极，浸泡反应，收集电极表面残留液；

(5)将步骤(4)所得电极表面残留液与TMB进行反应，检测紫外吸光度值，根据标准曲线1计算铜绿假单胞菌浓度；和/或将步骤(4)反应后的电极浸泡在含有苯胺的缓冲液中，进行反应，然后检测电流值，根据标准曲线2计算铜绿假单胞菌浓度；

所述核酸片段Tetra-A-aptamer、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH和Tetra-D-SH的序列如SEQ ID NO:1-4所示；RCA模板的序列如SEQ ID NO:5所示；所述模板引物序列如SEQ ID NO:6所示，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明中，所述标准曲线1的横坐标为铜绿假单胞菌浓度的对数值，纵坐标为紫外吸光度值。

在本发明中，所述标准曲线2的横坐标为铜绿假单胞菌浓度的对数值，纵坐标为电流值。

在本发明中，所述含有氯化血红素(Hemin)的溶液是pH7.4的PBS缓冲液中添加有75μM的氯化血红素和100mM的KCl。

在本发明中，所述含有苯胺的缓冲液是pH 4.3、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液中含有200mM苯胺和20mM的过氧化氢。

在本发明中，步骤(4)中反应时间为2小时。

采用本发明方法检测P.aeruginosa，简单、快速、灵敏、准确。本发明方法，首先，将四条核酸序列(其中三条修饰巯基，一条含有铜绿假单胞菌特异性适配体)，自组装形成DNA纳米探针；紧接着将其固定在金电极表面；随后通过碱基互补配对在探针表面固定经过滚环扩增后的含有G四链体(G4)的DNA序列；紧接着，向金电极表面添加待测样品，竞争DNA纳米探针上的适配体；对上述电极继续加入氯化血红素(Hemin)，使其嵌入在金电极表面的G四链体的内部，形成具有类辣根过氧化物酶活性的物质。接下来，收集金电极表面反应完成后的反应液，进行双信号的采集工作。电化学信号：将金电极与苯胺聚合缓冲液反应，并检测聚苯胺的电化学信号；紫外可视化信号：向反应液中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、Hemin，十分钟后观察颜色变化并检测吸光度值。通过双模式信号采集获得两个标准曲线，可以提高检测的准确率以及灵敏度，避免不稳定的问题。具体原理见图1。

附图说明

图1本发明方法检测铜绿假单胞菌的原理示意图(Capture DNA：捕获DNA；Hemin：氯化血红素；P.aeruginosa：铜绿假单胞菌；Circle template：环状DNA模板；TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺；H₂O₂：双氧水；Aniline：苯胺)

图2(A)和(B)分别为本发明检测方法中的电化学信号值的标准曲线和紫外强度的标准曲线；(C)不同浓度铜绿假单胞菌显色图。(a-j：0，1，10，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，和10⁸CFU·mL^-1)。

图3聚苯胺修饰后金电极的扫描电镜图。

图4(A)和(B)显示了本发明检测方法的特异性。1：铜绿假单胞菌；2：混合菌，3：恶臭假单胞菌，4：大肠杆菌，5：产气荚膜梭菌，6：荧光假单胞菌。

图5本发明方法的检测结果示意图，DNA+G4为对照检测方法1，Single DNA+RCA为对照检测方法2，DNA+RCA为本发明检测方法。

具体实施方式

实施例1修饰了DNA纳米探针的金电极及RCA反应溶液的制备

1.修饰了DNA纳米探针的金电极的制备

首先将核酸片段Tetra-A-aptamer(SEQ ID NO:1)、Tetra-B-SH(SEQ ID NO:2)、Tetra-C-SH(SEQ ID NO:3)、Tetra-D-SH(SEQ ID NO:4)分别用TE buffer(pH 8.0、浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液中添加有终浓度为1mM的EDTA)稀释成50μM的溶液，-20℃冷冻待用。取一EP管，加入50μM Tetra-A-Aptamer、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH溶液各1μL，1μL 500mM的TCEP(三羧基乙基膦)水溶液，45μL的TM buffer(pH 8.0、浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液中添加有终浓度为50mM的MgCl₂)，混匀后在95℃水浴中加热10min，4℃下冷却30min，形成DNA正四面体，得到DNA纳米探针溶液。在裸金电极表面滴加20μL的DNA纳米探针溶液，室温下孵育12h，制得修饰了DNA纳米探针的金电极。

Tetra-A-aptamer的序列如下：

5’-CCCCCGTTGCTTTCGCTTTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTTCTTGAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3’；

Tetra-B-SH的序列如下：

5’-HS-(CH₂)₆-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3’；

Tetra-C-SH的序列如下：

5’-HS-(CH₂)₆-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3’；

Tetra-D-SH的序列如下：

5’-HS-(CH₂)₆-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’。

2.滚环扩增(RCA)反应溶液的制备

i)环状DNA模板的制备过程

RCA模板(SEQ ID NO:5)和模板引物(SEQ ID NO:6)在T4 DNA连接酶的催化下，合成得到环状DNA模板。具体方法如下：在10μL的1×T4 DNA连接酶反应缓冲液中加入5μL浓度为100μM的模板引物和终浓度为100μM的RCA模板，将溶液加热到95℃并解链5min，然后慢慢冷却到室温，以便RCA模板和模板引物发生杂交。随后加入10μL T4 DNA连接酶，混合物在16℃孵育过夜，然后在65℃加热10min，RCA模板与引物末端相连形成环状DNA模板。为了消除过多的单链DNA及非特异性杂交链，加入5U ExoⅠ和5U ExoⅢ，在37℃下反应6h，80℃加热20min，最终制得环状DNA模板。

RCA模板序列如下：

5’-PO₄ ^3-TTCAGGTAGTGCATCACCCTCCCACCCCTCCCACCCCTATATCGGAGC-3’。

模板引物序列如下：5’-TTACTACCTGAAGCTCCGATATTT-3’。

ii)G四链体(G4)的合成

G四链体的大量合成依赖于RCA模板。RCA反应体系为200μL，具体包含10μL环状DNA模板(标题i中方法制备)、10μL浓度为5μM的捕获探针(SEQ ID NO:7)、phi29 DNA聚合酶1μL(10000U)、20μL浓度为2.5μM的dNTPs(三磷酸碱基脱氧核苷酸)、20000μg·mL^-1的BSA水溶液1μL，以1×phi29聚合酶缓冲液补足体积至200μL，在25℃金属浴中过夜，以环状DNA模板为模板，以捕获探针为引物进行滚环扩增(RCA)反应，得到富含G四链体的RCA反应溶液，缩写为RCA反应溶液。

其中，捕获探针序列如下：5’-GCGAAAGCAACGGGGCACTACCTGAAGCTCC-3’。

上述T4 DNA连接酶、1×T4连接酶反应缓冲液、ExoⅠ、ExoⅢ、phi29 DNA聚合酶、1×phi29聚合酶缓冲液以及dNTPs均购自上海生工试剂有限公司。

实施例2采用修饰了DNA纳米探针的金电极和RCA反应溶液检测铜绿假单胞菌的方法

1.制作标准曲线

(1)在室温下，将20μL的RCA反应溶液(实施例1制备)滴加到修饰了DNA纳米探针的金电极(实施例1制备)表面，偶联4h。偶联结束后，向金电极表面滴加20μL含有75μM氯化血红素(Hemin)的溶液(具体来说是pH7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液中添加有75μM的氯化血红素和100mM的KCl)，氯化血红素嵌入进RCA反应液中的G四链体(G4)，从而在金电极表面形成形成类辣根过氧化物酶(Hemin-G4-DNAzyme)，得到检测电极。在室温下，将生理盐水梯度稀释的P.aeruginosa菌悬液滴加20μL至检测电极，浸泡反应2h，P.aeruginosa与捕获探针竞争结合Tetra-A-aptamer顶端的适配体(aptamer)，反应结束后收集电极表面残留液，待用。

(2)检测电化学信号值的标准曲线制作及结果

将步骤(1)中反应完成后的金电极浸泡在500μL苯胺沉积缓冲液(pH 4.3、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液中含有200mM苯胺和20mM过氧化氢，新配置)中2h后，使用辰华电化学工作站(CHI 760e)进行差分脉冲伏安法(DPV)信号的采集。菌浓度与电流相应值成负相关，菌浓度越低，电流值越高，通过这种方式极大的提高了灵敏度。以菌浓度C_P.aeruginosa(单位：CFU·mL^-1)的对数值lg C_P.aeruginosa为横坐标(x)，DPV信号值(电流强度，单位是：μA)为纵坐标(y)，建立标准曲线(图2(A))，结果为y＝-0.03732x+0.74807，R²＝0.980。线性检测范围为1-10⁸CFU·mL^-1，检测限为0.033CFU·mL^-1(S/N＝3)。

通过扫描电镜图观察聚合后的电极(图3)，发现一方面表面棒状形态的铜绿假单胞菌被成功吸附在金电极表面；另一方面看出聚合后的聚苯胺在金电极表面的颗粒状。

(3)检测紫外强度的标准曲线制作及结果

在步骤(1)收集的电极表面残留液中加入混合显色缓冲液(pH7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液中添加有终浓度为1mM的TMB、10mM的H₂O₂)，室温下反应10min后，用2mM H₂SO₄水溶液终止反应。最后，用肉眼观察颜色的变化，并通过酶标仪的全波长扫描采集紫外吸光度值。经分析，铜绿假单胞菌的浓度与吸光度值成正相关。以菌浓度(单位：CFU·mL^-1)的对数值lg C_P.aeruginosa为横坐标(x)，紫外吸光度值为纵坐标(y)，建立标准曲线(图2(B))，结果为y＝0.04007x+0.33208，R²＝0.992。线性检测范围均为1-10⁸CFU·mL^-1，检测限为0.033CFU·mL^-1(S/N＝3)。另外，当目标菌浓度为10CFU·mL^-1及以上时，肉眼可观察到随着菌浓度的增加，蓝色不断加深。TMB是3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

(4)样品检测及浓度计算

按照标准曲线制作方法，以待测样本代替不同浓度的铜绿假单胞菌，其余步骤不变，检测电化学和紫外信号。将检测到的电化学和紫外信号数值代入各标准曲线中，获得待测样本中P.aeruginosa的浓度。

采用本发明方法，通过电化学信号值和紫外信号检测P.aeruginosa，可以很好地进行相互验证，以此避免单一检测信号不稳定的现象。

实施例3本发明方法检测P.aeruginosa的特性

本实施例考察实施例2中检测P.aeruginosa方法(缩写为本发明检测方法)的特性。

(1)特异性

配制浓度为10⁸CFU·mL^-1的恶臭假单胞菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、荧光假单胞菌的悬液，10²CFU·mL^-1的铜绿假单胞菌悬液，混合菌悬液(恶臭假单胞菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、荧光假单胞菌浓度均为10⁸CFU·mL^-1；铜绿假单胞菌的悬液浓度为10²CFU·mL^-1)的来考察本发明检测方法的特异性。结果如图4(A和B)所示，本发明检测方法的特异性良好，铜绿假单胞菌及混合菌均可观察到蓝色，其余未添加铜绿假单胞菌的样本为无色。上述结果说明，本发明通过电化学信号值和紫外信号均可以特异性地检测P.aeruginosa。

(2)回收率

采用本发明检测方法对以鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉为模型的样品进行测试，以假单胞菌筛选培养基法为对照，计算回收率。样品前处理步骤如下：取10g的样品，先在样品表面注入终浓度为10²CFU·mL^-1的铜绿假单胞菌，充分抹匀后，加入90mL生理盐水后，均质5min，离心，取上清液作为样品。结果如表1，本发明方法电化学信号的检测，回收率在85-146％之间；紫外信号检测，回收率在87-109％。假单胞菌筛选培养基法的回收率在160-494％。

表1实际样品检测结果

(3)本发明检测方法的准确性

对照检测方法1：采用本发明中修饰了DNA纳米探针的金电极(实施例1制备)，将5μM捕获探针10μL代替20μL的RCA反应溶液(实施例1制备)滴加到修饰了DNA纳米探针的金电极，其他不变，得到了对照检测电极1。其他检测方法同本发明中检测方法。

对照检测方法2：采用Tetra-A-aptamer代替DNA纳米探针溶液，固定在金电极上，其他同本发明检测方法。

采用本发明检测方法和对照检测方法1、2检测10²CFU·mL^-1的铜绿假单胞菌悬浮液，分别得到电化学信号值和紫外信号，结果见图5。可以看到，本发明检测方法的检测结果与对照检测方法1对比，即使构建有稳定的DNA探针信号检测依旧不理想，本发明方法采用RCA反应液可以分别将紫外信号和电化学信号分别提高接近6倍和3倍的灵敏度。当与对照检测方法2对比发现，本发明方法利用的DNA探针由于其结构的稳定性，可以将紫外信号和电化学信号均提高3倍左右。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法

<130> 20220110

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tetra-A-aptamer

<400> 1

cccccgttgc tttcgctttt cctttcgctt ttgttcgttt cgtccctgct tcctttcttg 60

aaaaaacatt cctaagtctg aaacattaca gcttgctaca cgagaagagc cgccatagta 120

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tetra-B-SH

<400> 2

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tetra-C-SH

<400> 3

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tetra-D-SH

<400> 4

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RCA模板

<400> 5

ttcaggtagt gcatcaccct cccacccctc ccacccctat atcggagc 48

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 模板引物

<400> 6

ttactacctg aagctccgat attt 24

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 捕获探针

<400> 7

gcgaaagcaa cggggcacta cctgaagctc c 31

Claims

1.一种基于双信号模式传感器的铜绿假单胞菌检测方法，其特征在于包括如下步骤：

在裸金电极表面固定由核酸片段Tetra-A-aptamer、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH、Tetra-D-SH形成的DNA正四面体，得到修饰了DNA纳米探针的金电极；

RCA模板和模板引物在T4 DNA连接酶的催化下，合成环状DNA模板；以环状DNA模板为模板，以捕获探针为引物进行滚环扩增反应，得到RCA反应溶液；

将RCA反应溶液滴加到修饰了DNA纳米探针的金电极表面，进行偶联；在偶联后的电极表面，滴加含有氯化血红素的溶液，得到检测电极；

将待检样品滴加至检测电极，浸泡反应，收集电极表面残留液；

将步骤（4）所得电极表面残留液与TMB进行反应，检测紫外吸光度值，根据标准曲线1计算铜绿假单胞菌浓度；和/或将步骤（4）反应后的电极浸泡在含有苯胺的缓冲液中，进行反应，然后检测电流值，根据标准曲线2计算铜绿假单胞菌浓度；

所述核酸片段Tetra-A-aptamer、Tetra-B-SH、Tetra-C-SH和Tetra-D-SH的序列是SEQID NO:1-4；RCA模板的序列是SEQ ID NO:5；所述模板引物序列是SEQ ID NO:6，所述捕获探针的序列是SEQ ID NO:7；所述标准曲线1的横坐标为铜绿假单胞菌浓度的对数值，纵坐标为紫外吸光度值；所述标准曲线2的横坐标为铜绿假单胞菌浓度的对数值，纵坐标为电流值。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述含有氯化血红素（Hemin）的溶液是pH7.4的PBS缓冲液中添加有75 μM的氯化血红素和100 mM的KCl。

3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述含有苯胺的缓冲液是pH 4.3、100 mM醋酸-醋酸钠缓冲液中含有200 mM苯胺和20 mM的过氧化氢。

4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于步骤（4）中反应时间为2小时。