CN114354701B - 基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法及其应用，特点是包括DNA链的杂交预处理的步骤；金黄色葡萄球菌触发的tDNA样品制备的步骤；核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备的步骤；最后取Fe3O4@H1‑H2纳米粒子分散液滴加到磁性玻碳电极表面，在磁力作用下被牢固吸附，即得到基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器，其检测方法以Fe3O4@H1‑H2修饰的MGCE为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.4的PBS缓冲溶液，采用快速扫描循环伏安法检测金黄色葡萄球菌，优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的方法，尤其是涉及一种基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌（SA）是一种广泛存在于环境中的食源性致病菌，是革兰氏阳性菌代表，广泛存在于自然环境中，常寄生于人和动物的皮肤、咽喉、肠胃、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。人类摄入这种污染物可导致严重的细菌感染，并可能导致致命的结果。金黄色葡萄球菌具有在高盐浓度（高达15%）和高温（需要80 °C以上30分钟才能完全杀死）下存活的能力，对我们的社会和畜牧业造成了极大的危害和经济损失。传统的微生物培养检测方法需要长达一周的处理时间和熟练的操作人员，限制了该方法的广泛适用性。因此，开发一种快速，高效，简单，特异性的金黄色葡萄球菌检测方法具有相当重要的意义。
核酸外切酶III（Exo III）是一种不依赖核酸序列的酶，它具有3'→5'外切脱氧核糖核酸酶活性，可以特异性地切割双链DNA的平末端或凹陷的3'末端，非常适合开发多功能的核酸扩增检测传感平台。到目前为止，Exo III已经被广泛应用或与一些DNA组装技术如杂交链式反应相结合，开发出多种酶辅助目标触发信号扩增的DNA生物传感器或纳米传感器，优选的提高检测简单性和灵敏度。催化发夹组装（CHA）是具有快速响应和低背景的高效无酶信号放大的工具。因此，在电化学生物传感器中有效应用CHA技术不仅可以简化操作过程，而且可以显著提高检测性能，尤其是灵敏度。
快速扫描伏安技术（FSCV）是一种比较新的功能强大的电化学分析技术，是以高扫描速率呈现的具有亚秒分辨率的电化学方法，该方法原理简单、快速、灵敏度高、具有良好的信号放大能力，能够输出清晰稳定的伏安信号。因此，适用于痕量分析物的检测。目前，国内外还没有公开任何将EXO III辅助目标触发信号扩增、CHA循环信号放大、FSCV三种技术结合从而实现目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学生物传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于目标触发连续多级信号放大检测SA的电化学传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）DNA链的杂交预处理
将10~20 μmol/L的DNA2溶液和10~20 μmol/L的金黄色葡萄球菌适配体（Aptamer）溶液等体积混合后，通过PCR仪依次在95℃下加热5 min、65 °C下加热30 min、50℃下加热30 min、37℃下加热15 min、22℃下加热30 min、4℃下加热30 min，缓慢降至室温，形成Aptamer- DNA2双链结构，将10~20 μmol/L的HP、H1和H2溶液分别置于95℃变形5~10 min之后缓慢降至室温，形成发夹结构；
（2）金黄色葡萄球菌（SA）触发的tDNA样品制备
a. 将300~500 μL 800 nmol/L生物素化的DNA1溶液与100~200 μL 2.5 mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1 h，磁分离并用洗涤缓冲液洗涤3次后，将所得的磁珠-DNA1偶联物分散在200~300 μL的反应缓冲液中，加入300~500 μL 600 nmol/LHP溶液并孵育40 min，磁分离以去除过量的HP后，分散在200~300 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP偶联物分散液；
b. 将200~300 μL SA样品与100~200 μL 400 nmol/L Aptamer-DNA2溶液混合，并在37 ℃下孵育15 min，再加入所得的磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，孵育2 h后磁分离，重新分散在200~300 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP-DNA2偶联物分散液后，加入10~15 μL2 U/μL Exo III和4 μL 10×Exo III反应缓冲液并在37 ℃下孵育40 min，磁分离后取上清液，立即加热至70 ℃并保持20 min使Exo III失活，即得到SA触发的tDNA样品，保存在4℃下备用；
（3）核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备
取1~2 mL的氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液，加入100~150 μL 2 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h，通过磁力清洗后，重新分散于1~2 mL 反应缓冲溶液中并加入50~60 μL 5 μmol/L NH2修饰的H1，37 ℃孵育6 h，即得核酸功能化Fe3O4纳米粒子Fe3O4@H1分散液；
（4）电化学生物传感器的构建
a. 取200 μL的tDNA样品加入到1~2 mL的Fe3O4@H1分散液中，37 ℃孵育2 h以完成H1和tDNA的杂交，再加入5~10 μL 5 μmol/L Fc修饰的H2，37 ℃孵育2 h以完成CHA循环，得到Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液；
b. 取5~7 μL的Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液滴加到磁性玻碳电极（MGCE）表面，在磁力作用下被牢固吸附，即得到基于酶辅助目标触发信号扩增、CHA和FSCV三重信号放大输出检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器。
优选的，步骤（1）中所述的DNA2序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGC-3'；所述的金黄色葡萄球菌适配体（Aptamer）的序列为：5'-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'；所述的HP序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGCGGTGTAACCTGGTTAATCGCTGTCAGTAGCGCTC-3'。
优选的，步骤（2）中所述的生物素化的DNA1的序列为：5'-GTCATTCAGCGATTAACCAGGTTACACCGCTGTACAGTCAAAAAAA-Biotin-3'。
优选的，步骤（2）中所述的洗涤缓冲液的配方如下：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA,1 M NaCl，0.05% Tween-20；步骤（2）和步骤（3）中所述的反应缓冲液的配方如下：20 mMHEPES，100 mM MgAC2，pH=7.2。
优选的，步骤（3）中所述的氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液的制备方法如下：将0.2~0.3 g FeCl3·6H2O、0.6~0.7 g NH4Ac和0.07~0.09 g柠檬酸钠添加到12~15mL乙二醇中，在氮气氛围140~160 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190~210 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子，通过磁力清洁后，将获得的Fe3O4纳米粒子与150~200 μL APTES一起分散在10~20 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，通过磁力清洗后重新分散于40~60 mL水中，即得到氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液。
优选的，步骤（3）中所述的NH2修饰的H1的序列为：5'-NH2-TTTCTACTGAGAATTACAGCGATGTTTGTGTGGCTGTAATTCTCAGTAGCGCTC-3'。
优选的，步骤（4）中所述的Fc修饰的H2的序列为：5'-ACAGCGATGTGAGCGCTAGAGAGAAATACAGCAGCGCAAACATCGCTGTAATTCTCAGTAG-Ferrocene-3'。
上述制备方法制备得到的电化学传感器用于检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：快速扫描循环伏安技术检测金黄色葡萄球菌：以Fe3O4@H1-H2修饰的MGCE为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.4的PBS缓冲溶液，采用快速扫描循环伏安法（FSCV），电位范围为-0.5~1.2 V，电位扫描速度为100~1000 V/s，测定不同浓度tDNA条件下对应的氧化峰值电流，根据不同浓度SA下的电流值得到FSCV法的工作曲线，对待测溶液中SA浓度进行定量检测。当加入的SA浓度越高，得到的tDNA浓度越高，相同时间内CHA循环效率越高，接近电极表面的信号分子二茂铁越多，电流信号越强。
发明原理：本发明利用Exo III的特异性识别切割及DNA自主装原理，构建了一种灵敏、准确、简单、快速的基于目标触发连续信号放大检测食源性致病菌SA的电化学传感器。连续信号放大包含三个过程：首先，在链霉亲和素磁珠上固定DNA1，将发夹探针HP与固定在磁珠上的DNA1杂交。借助磁清洁去除多余的HP后，获得的含有突出3'末端的部分双链DNA（DNA1-HP）不能被Exo III酶切。目标检测物SA的加入会导致Aptamer-DNA2复合体展开并导致Aptamer与SA的结合及DNA2的释放，进而在Exo III的存在下触发酶辅助的循环信号放大过程。DNA2中与Aptamer杂交的区域可以与HP的3'突出末端识别配对，使得DNA1-HP具有3'平末端。因此，可以启动Exo III 3'→5'的切割功能使得DNA2被重新释放并引发新的切割反应。同时，Exo III继续向下切割HP，使得另一个与DNA2序列近似相同的DNA3（经过Exo III切割后释放的发夹探针HP中的DNA片段及几个未被切割的碱基组成的DNA片段，DNA3长度与DNA2近似相同）片段也被释放出来，并作为新的激活序列触发Exo III的切割，实现第一级信号放大。
其次，由于连续的切割和解离过程，磁分离去除磁珠-DNA偶联物后，上清液中产生的大量tDNA能够触发第二级信号放大过程CHA循环，更多的末端修饰信号分子Fc的H2被H1捕获，电流信号增加。
最后，采用自带电流放大效果的FSCV技术进行电化学测试，在使用常规工作电极的条件下，相比较CV技术可提供在0.01~10 V/s的稳定扫描速率，FSCV技术可提供的扫描速率为10~1000 V/s，电极电位的扫描速率越大，完成扫描所需的时间t越短；相同条件下，信号分子被固载到电极上的量是一定的，每个分子发生氧化还原时得失电子数是一致的，这就意味着其氧化或还原时得失总电量Q大致是相同的；根据Q = I×t，时间t越小，电流I自然也就越大。因此，可以建立电流信号与tDNA浓度的定量关系，并用于间接检测SA的浓度。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）选择性高：利用具有高特异性、高亲和性的核酸适配体，实现SA的特异性识别；
（2）灵敏度高：利用DNA自组装触发Exo III独特的切割功能实现第一步信号放大，采用CHA技术实现第二步信号放大，并且利用FSCV这一灵敏度极高的自带信号放大特点的检测方法检测电流信号；
（3）操作方便：采用氨基化四氧化三铁作为H1的基底，不仅能够提供较大的电化学活性面积有助于H1的组装及CHA循环效率，而且由于四氧化三铁的磁性，制备的电化学传感器能够一步吸附，快速、方便，有助于实验的快速操作。
附图说明
图1为基于目标触发连续多级信号放大检测SA的电化学传感器的流程图；
图2为电化学信号强度和SA浓度的关系图；
图3为不同SA浓度与电流值线性关系图；
图4为该传感器分别对空白、106 CFU/mL哈氏弧菌、106 CFU/mL阴沟肠杆菌、106CFU/mL黄海希瓦氏菌、106 CFU/mL创伤弧菌和106 CFU/mL副溶血弧菌、103 CFU/mL金黄色葡萄球菌和含103 CFU/mL金黄色葡萄球菌的混合细菌测得的电流信号图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
实施例1
一种基于目标触发连续多级信号放大检测SA的电化学传感器的制备方法，如图1所示包括以下步骤：
（1）DNA链的杂交预处理
将15 μmol/L的DNA2溶液和15 μmol/L的金黄色葡萄球菌适配体（Aptamer）溶液等体积混合后，通过PCR仪依次在95℃下加热5 min、65℃下加热30 min、50℃下加热30 min、37℃下加热15 min、22℃下加热30 min、4℃下加热30 min，缓慢降至室温，形成Aptamer-DNA2双链结构，将15 μmol/L的HP、H1和H2溶液分别置于95℃变形5~10 min之后缓慢降至室温，形成发夹结构，其中DNA2序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGC-3'；所述的金黄色葡萄球菌适配体（Aptamer）的序列为：5'-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTC
ATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'；
（2）金黄色葡萄球菌（SA）触发的tDNA样品制备
a. 将400 μL 800 nmol/L生物素化的DNA1溶液与150 μL 2.5 mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1 h，磁分离并用洗涤缓冲液洗涤3次后，将所得的磁珠-DNA1偶联物分散在200~300 μL的反应缓冲液中，加入400 μL 600 nmol/L HP溶液并孵育40 min，磁分离以去除过量的HP后，分散在250 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP偶联物分散液；
b. 将250 μL SA样品与150 μL 400 nmol/L Aptamer-DNA2溶液混合，并在37 ℃下孵育15 min，再加入所得的磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，孵育2 h后磁分离，重新分散在250 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP-DNA2偶联物分散液后，加入12 μL 2 U/μL ExoIII和4 μL 10×Exo III反应缓冲液并在37 ℃下孵育40 min，磁分离后取上清液，立即加热至70 ℃并保持20 min使Exo III失活，即得到SA触发的tDNA样品，保存在4 ℃下备用；其中生物素化的DNA1的序列为：5'-GTCATTCAGCGATTAACCAGGTTACACCGCTGTACAGTCAAAAAAA-Biotin-3'；HP序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGCGGTGTAACCTGGTTAATCGCTGTCAGT
AGCGCTC-3'；洗涤缓冲液的配方如下：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween-20；反应缓冲液的配方如下：20 mM HEPES，100 mM MgAC2，pH=7.2；
（3）核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备
取1.5mL的氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液，加入130 μL 2 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h，通过磁力清洗后，重新分散于1.5 mL 反应缓冲溶液中并加入55 μL5 μmol/L NH2修饰的H1，37 ℃孵育6 h，即得核酸功能化Fe3O4纳米粒子Fe3O4@H1分散液；其中氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液的制备方法如下：将0.25 g FeCl3·6H2O、0.65 g NH4Ac和0.08 g柠檬酸钠添加到13 mL乙二醇中，在氮气氛围150 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在200 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子，通过磁力清洁后，将获得的Fe3O4纳米粒子与180 μL APTES一起分散在15 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，通过磁力清洗后重新分散于40~60 mL水中，即得到氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液；NH2修饰的H1的序列为：5'-NH2-TTTCTACTGAGAATTACAGCGATGTTTGTGTGGCTGTAATTCTCAGTAGCGCTC-3'；
（4）电化学生物传感器的构建
a. 取200 μL的tDNA样品加入到1.5 mL的Fe3O4@H1分散液中，37 ℃孵育2 h以完成H1和tDNA的杂交，再加入8 μL 5 μmol/L Fc修饰的H2，37 ℃孵育2 h以完成CHA循环，得到Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液，其中的Fc修饰的H2的序列为：5'-ACAGCGATGTGAGCGCTAGAGAGAAATACAGCAGCGCAAACATCGCTGTAATTCTCAGTAG-Ferrocene-3'；
b. 取6 μL的Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液滴加到MGCE表面，在磁力作用下被牢固吸附，即得到基于酶辅助目标触发信号扩增、CHA和FSCV三重信号放大输出检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（1）DNA链的杂交预处理中：将10μmol/L的DNA2溶液和10 μmol/L的金黄色葡萄球菌适配体（Aptamer）溶液等体积混合后，通过PCR仪依次在95 ℃下加热5 min、65 ℃下加热30 min、50℃下加热30 min、37℃下加热15 min、22℃下加热30 min、4 ℃下加热30min，缓慢降至室温，形成Aptamer-DNA2双链结构，将10 μmol/L的HP、H1和H2溶液分别置于95℃变形5~10 min之后缓慢降至室温，形成发夹结构。
步骤（2）金黄色葡萄球菌（SA）触发的tDNA样品制备中：将300 μL 800 nmol/L生物素化的DNA1溶液与100 μL 2.5 mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1 h，磁分离并用洗涤缓冲液洗涤3次后，将所得的磁珠-DNA1偶联物分散在200 μL的反应缓冲液中，加入300 μL 600 nmol/L HP溶液并孵育40 min，磁分离以去除过量的HP后，分散在200μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP偶联物分散液；将200 μL SA样品与100 μL 400 nmol/L Aptamer-DNA2溶液混合，并在37 ℃下孵育15 min，再加入所得的磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，孵育2 h后磁分离，重新分散在200 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP-DNA2偶联物分散液后，加入10 μL 2 U/μL Exo III和4 μL 10×Exo III反应缓冲液并在37 ℃下孵育40 min，磁分离后取上清液，立即加热至70 ℃并保持20 min使Exo III失活，即得到SA触发的tDNA样品，保存在4 ℃下备用。
步骤（3）核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备中：取1 mL的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液，加入100 μL 2 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h，通过磁力清洗后，重新分散于1mL 反应缓冲溶液中并加入50 μL 5 μmol/L NH2修饰的H1，37 ℃孵育6 h，即得核酸功能化Fe3O4纳米粒子Fe3O4@H1分散液；其中氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液的制备方法如下：将0.2 gFeCl3·6H2O、0.6 g NH4Ac和0.07 g柠檬酸钠添加到12 mL乙二醇中，在氮气氛围140 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190 ℃下加热17h，即得Fe3O4纳米粒子，通过磁力清洁后，将获得的Fe3O4纳米粒子与150 μL APTES一起分散在10 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，通过磁力清洗后重新分散于40 mL水中，即得到氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液。
步骤（4）电化学生物传感器的构建中：取200 μL的tDNA样品加入到1 mL的Fe3O4@H1分散液中，37 ℃孵育2 h以完成H1和tDNA的杂交，再加入5 μL 5 μmol/L Fc修饰的H2，37℃孵育2 h以完成CHA循环，得到Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液；取5μL的Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液滴加到MGCE表面。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（1）DNA链的杂交预处理中：将20 μmol/L的DNA2溶液和20 μmol/L的金黄色葡萄球菌适配体溶液等体积混合后，通过PCR仪依次在95℃下加热5 min、65℃下加热30 min、50℃下加热30 min、37 ℃下加热15 min、22 ℃下加热30 min、4℃下加热30 min，缓慢降至室温，形成Aptamer- DNA2双链结构，将20 μmol/L的HP、H1和H2溶液分别置于95 ℃变形5~10 min之后缓慢降至室温，形成发夹结构。
步骤（2）金黄色葡萄球菌（SA）触发的tDNA样品制备中：将500 μL 800 nmol/L生物素化的DNA1溶液与200 μL 2.5 mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1 h，磁分离并用洗涤缓冲液洗涤3次后，将所得的磁珠-DNA1偶联物分散在300 μL的反应缓冲液中，加入500 μL 600 nmol/L HP溶液并孵育40 min，磁分离以去除过量的HP后，分散在300μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP偶联物分散液；将200~300 μL SA样品与200 μL 400nmol/L Aptamer-DNA2溶液混合，并在37 ℃下孵育15 min，再加入所得的磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，孵育2 h后磁分离，重新分散在200~300 μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP-DNA2偶联物分散液后，加入15 μL 2 U/μL Exo III和4 μL 10×Exo III反应缓冲液并在37℃下孵育40 min，磁分离后取上清液，立即加热至70 ℃并保持20 min使Exo III失活，即得到SA触发的tDNA样品，保存在4 ℃下备用。
步骤（3）核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备中：取2 mL的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液，加入150 μL 2 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h，通过磁力清洗后，重新分散于2 mL反应缓冲溶液中并加入60 μL 5 μmol/L NH2修饰的H1，37 ℃孵育6 h，即得核酸功能化Fe3O4纳米粒子Fe3O4@H1分散液；其中氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液的制备方法如下：将0.3 g FeCl3·6H2O、0.7 g NH4Ac和0.09 g柠檬酸钠添加到15 mL乙二醇中，在氮气氛围160 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在210 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子，通过磁力清洁后，将获得的Fe3O4纳米粒子与200 μL APTES一起分散在20 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，通过磁力清洗后重新分散于60 mL水中，即得到氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液。
步骤（4）电化学生物传感器的构建中：取200 μL的tDNA样品加入到2 mL的Fe3O4@H1分散液中，37 ℃孵育2 h以完成H1和tDNA的杂交，再加入10 μL 5 μmol/L Fc修饰的H2，37℃孵育2 h以完成CHA循环，得到Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液；取7 μL的Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液滴加到MGCE表面。
具体实施例二
一种利用上述具体实施例1制备方法制备得到的电化学传感器用于检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：快速扫描循环伏安技术检测金黄色葡萄球菌：以Fe3O4@H1-H2修饰的MGCE为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.4的PBS缓冲溶液，采用快速扫描循环伏安法（FSCV），电位范围为-0.5~1.2 V，电位扫描速度为100~1000 V/s，测定不同浓度tDNA条件下对应的氧化峰值电流，根据不同浓度SA下的电流值得到FSCV法的工作曲线，对待测溶液中SA浓度进行定量检测。当加入的SA浓度越高，得到的tDNA浓度越高，相同时间内CHA循环效率越高，接近电极表面的信号分子二茂铁越多，电流信号越强。
如图2所示，在1000 V/s的电极电位扫描速度下，FSCV检测不同浓度（0.1 ~ 108 CFU/mL）的金黄色葡萄球菌存在时传感器的电流，随着金黄色葡萄球菌浓度增大，电流强度依次增大。
如图3所示，不同金黄色葡萄球菌浓度下的电流强度（y）-浓度对数（x）线性关系，线性方程为y = 0.3384 + 0.09070*x，相关系数R2 = 0.9957，线性关系良好，可以用于未知样品中金黄色葡萄球菌检测。
具体实施例三
如图4所示，利用具体实施例一制备的传感器分别对浓度为106 CFU/mL哈氏弧菌、阴沟肠杆菌、黄海希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和103 CFU/mL金黄色葡萄球菌和含103CFU/mL金黄色葡萄球菌的混合细菌溶液进行FSCV检测的电流信号响应进行比较分析，当金黄色葡萄球菌存在时，检测的电流信号强度远远大于干扰细菌电流响应，表明该传感器对金黄色葡萄球菌具有特异性检测。
具体实施例四
基于信噪比S/N = 3，我们得到该方法检测金黄色葡萄球菌的检测限（LOD）约为0.3 CFU/mL，说明该传感器有着超高的灵敏度，具有较好的准确度。
除上述实施例外，将检测目标物金黄色葡萄球菌替换为其它菌种，且相应的置换成适配体和DNA序列，即可获得基于目标触发连续多级信号放大检测相应菌株的电化学传感器。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)DNA链的杂交预处理
将10～20μmol/L的DNA2溶液和10～20μmol/L的金黄色葡萄球菌适配体溶液等体积混合后，通过PCR仪依次在95℃下加热5min、65℃下加热30min、50℃下加热30min、37℃下加热15min、22℃下加热30min、4℃下加热30min，缓慢降至室温，形成Aptamer-DNA2双链结构，将10～20μmol/L的HP、H1和H2溶液分别置于95℃变形5～10min之后缓慢降至室温，形成发夹结构，其中所述的DNA2序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGC-3'；
所述的金黄色葡萄球菌适配体的序列为：
5'-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCA TCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'；所述的HP序列为：5'-GAGCGCTACTGAGAATTACAGCGGTGTAACCTGGTTAA
TCGCTGTCAGTAGCGCTC-3'；
(2)金黄色葡萄球菌触发的tDNA样品制备
a.将300～500μL 800nmol/L生物素化的DNA1溶液与100～200μL 2.5mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1h，磁分离并用洗涤缓冲液洗涤3次后，将所得的磁珠-DNA1偶联物分散在200～300μL的反应缓冲液中，加入300～500μL 600nmol/L HP溶液并孵育40min，磁分离以去除过量的HP后，分散在200～300μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，其中所述的生物素化的DNA1的序列为：5'-GTCATTCAGCGATTAACCAGGTTACACCGCTGTACAGTCAAAAAAA-Bioti n-3'；
b.将200～300μL SA样品与100～200μL 400nmol/L Aptamer-DNA2溶液混合，并在37℃下孵育15min，再加入所得的磁珠-DNA1-HP偶联物分散液，孵育2h后磁分离，重新分散在200～300μL反应缓冲液中，即得磁珠-DNA1-HP-DNA2偶联物分散液后，加入10～15μL 2U/μLExo III和4μL 10×Exo III反应缓冲液并在37℃下孵育40min，磁分离后取上清液，立即加热至70℃并保持20min使Exo III失活，即得到SA触发的tDNA样品，保存在4℃下备用；
(3)核酸功能化Fe3O4纳米粒子的制备
取1～2mL的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液，加入100～150μL 2wt％戊二醛溶液，室温反应6h，通过磁力清洗后，重新分散于1～2mL反应缓冲溶液中并加入50～60μL 5μmol/LNH2修饰的H1溶液，37℃孵育6h，即得核酸功能化Fe3O4纳米粒子Fe3O4@H1分散液，其中所述的NH2修饰的H1的序列为：5'-NH2-TTTCTACTGAGAATTACAGCGATGTTTGTGTGGCTGTAATTCTCAGTAGCGCTC-3'；
(4)电化学生物传感器的构建
a.取200μL的tDNA样品加入到1～2mL的Fe3O4@H1分散液中，37℃孵育2h以完成H1和tDNA的杂交，再加入5～10μL 5μmol/L Fc修饰的H2，37℃孵育2h以完成CHA循环，得到Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液，其中所述的Fc修饰的H2的序列为：
5'-ACAGCGATGTGAGCGCTAGAGAGAAATACAGCAGCGCAAACATCGCTGT AATTCTCAGTAG-Ferrocene-3'；
b.取5～7μL的Fe3O4@H1-H2纳米粒子分散液滴加到磁性玻碳电极表面，在磁力作用下被牢固吸附，即得到基于酶辅助目标触发信号扩增、CHA和FSCV三重信号放大输出检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的洗涤缓冲液的配方如下：50mM Tris-HCl,2mM EDTA,1M NaCl,0.05％Tween-20；步骤(2)和步骤(3)中所述的反应缓冲液的配方如下：20mM HEPES,100mM MgAC2，pH＝7.2。
3.根据权利要求1所述的基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液的制备方法如下：将0.2～0.3g FeCl3·6H2O、0.6～0.7g NH4Ac和0.07～0.09g柠檬酸钠添加到12～15mL乙二醇中，在氮气氛围140～160℃下剧烈搅拌1h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190～210℃下加热17h，即得Fe3O4纳米粒子，通过磁力清洁后，将获得的Fe3O4纳米粒子与150～200μL APTES一起分散在10～20mL乙醇中，超声处理1h，然后在室温下搅拌6h，通过磁力清洗后重新分散于40～60mL水中，即得到氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液。
4.一种权利要求1-3中任一项制备方法制备得到的电化学传感器用于检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：快速扫描循环伏安技术检测金黄色葡萄球菌：以Fe3O4@H1-H2修饰的MGCE为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH＝7.4的PBS缓冲溶液，采用快速扫描循环伏安法，电位范围为-0.5～1.2V，电位扫描速度为100～1000V/s，测定不同浓度tDNA条件下对应的氧化峰值电流，根据不同浓度SA下的电流值得到FSCV法的工作曲线，对待测溶液中SA浓度进行定量检测。
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2021
- 2021-12-15 CN CN202111535914.4A patent/CN114354701B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Fluorometric aptamer assay for ochratoxin A based on the use of single walled carbon nanohorns and exonuclease III-aided amplification;Hua Wu等;Microchimica Acta;第185卷;27 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114354701A (zh) | 2022-04-15 |
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