CN108107037A - 基于核酸酶保护法和电化学发光原理的食源性致病菌检测方法 - Google Patents

基于核酸酶保护法和电化学发光原理的食源性致病菌检测方法 Download PDF

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CN108107037A CN201711380513.XA CN201711380513A CN108107037A CN 108107037 A CN108107037 A CN 108107037A CN 201711380513 A CN201711380513 A CN 201711380513A CN 108107037 A CN108107037 A CN 108107037A
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Abstract

本发明公开了一种快速检测食源性致病菌的方法。该方法首先通过不对称PCR扩增出目标单链DNA；基于单链特异性核酸酶可以特异性酶切单链DNA的原理设计与食源性致病菌特征序列完全互补的电化学发光核酸探针；目标单链DNA与电化学发光核酸探针杂交，并加入单链特异性核酸酶进行酶切；酶切产物与磁珠孵育连接后进行电化学发光检测。根据电化学发光信号的有无与强度，对实际样品中食源性致病菌进行定性分析和定量检测。本发明的检测方法快速、简便、特异性高。

Description

基于核酸酶保护法和电化学发光原理的食源性致病菌检测 方法
技术领域
本发明属于食源性致病菌检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于核酸酶保护法和电化学发光原理的快速检测食源性致病菌的方法。
背景技术
近年来，食源性致病菌由于其高致病性与易传染性，在全球范围内引发多起食品安全事件，引起了人们的极大关注。快速、高特异性的食源性致病菌检测方法，对于快速诊断致病原因、预防食物中毒以及保证公众食品安全具有重要意义。
传统的食源性致病菌检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，具有操作耗时繁琐、检测灵敏度低以及易出现假阴性结果等缺点，在诊断致病原因和应对食品公共安全事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。
而目前较为快速的食源性致病菌检测方法如免疫学检测技术、代谢学检测技术等由于局限于对其外部形态及生理特性做常规检验，因而不可避免带来检测灵敏度低以及假阳性等问题。
随着分子生物学技术的飞速发展，现今食源性致病菌的检测方法由于结合了核酸检测的高灵敏度以及高特异性得到了长足的发展。现有的基于核酸检测的食源性致病菌检测方法主要有聚合酶链式反应和基于核酸扩增的荧光检测技术，这些技术检测速度较快，但是PCR扩增易出现假阳性结果。
电化学发光检测技术，由于无背景光源干扰，因此具有高灵敏度，同时兼具优良的时间和空间分辨能力以及宽的测量线性范围等优点，因而广泛用于核酸以及蛋白质等生物分子的检测。核酸酶保护法，由于核酸酶识别并酶切底物的高特异性，因此近年来有与电泳技术结合应用于核酸检测，也有一些与荧光检测技术结合用于核酸检测的报道。而将电化学发光技术和核酸酶保护法结合应用于核酸检测尚未有报道。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的快速检测食源性致病菌的方法，该检测方法是基于核酸酶保护法和电化学发光方法，具有高特异性的特点。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种快速检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品基因组DNA；
(2)、根据目标食源性致病菌基因序列设计引物，并通过不对称PCR扩增获取目标食源性致病菌单链DNA；
(3)、根据步骤(2)获得的目标食源性致病菌单链DNA序列，设计一段与之完全互补的特异性DNA序列，且在所述特异性DNA序列的5’端修饰发光标记物，在所述特异性DNA序列的3’端修饰生物素，制成电化学发光核酸探针；
(4)、将步骤(3)的电化学发光核酸探针与步骤(2)获得的目标食源性致病菌单链DNA在50-60℃杂交30-60min；所述电化学发光核酸探针的量为100fmol-100pmol，目标食源性致病菌的单链DNA的量为0.1fmol-100pmol；
(5)、将步骤(4)的杂交产物与单链特异性核酸酶在20-60℃反应10-40min，反应结束后加入1-20mM EDTA盐溶液使单链特异性核酸酶失活；
(6)、将步骤(5)的酶切产物与链霉亲和素修饰磁珠在37℃孵育10-40min，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中；
(7)、对孵育后的磁珠进行电化学发光检测，根据电化学发光信号值是否高于阈值，判断待检测样品中是否含有目标食源性致病菌DNA；并根据标准曲线对阳性样品中的目标食源性致病菌DNA进一步进行定量分析。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述不对称PCR中，上下游引物的体积比为10：1～200：1。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述目标食源性致病菌为单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、蜡状芽孢杆菌或霍乱弧菌等病原菌。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述发光标记物为三联吡啶钌、鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类或量子点等基团。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述电化学发光核酸探针的末端修饰氨基、羧基、或巯基等活性基团，便于核酸探针和发光标记物连接。
在其中一些实施例中，步骤(5)中，所述单链特异性核酸酶为S1核酸酶或绿豆芽核酸酶等核酸酶。
在其中一些实施例中，步骤(5)中，去上清液后，还包括用Tris–HCl、PBS等缓冲液清洗磁珠的步骤，洗去杂交产物中双链DNA中单链部分的降解产物、单链DNA的降解产物以及未结合的电化学发光核酸探针降解产物。
在其中一些实施例中，步骤(6)中，所述电化学发光检测中的工作电极和参比电极之间的电压为0.8-1.5V。
本发明是将电化学发光检测方法快速灵敏的优点和核酸酶保护法特异性强的优势相结合，提出一种基于核酸酶保护法快速检测食源性致病菌的高特异性电化学发光方法，并将该法应用于食源性致病菌的检测。
本发明的检测方法的原理为：通过不对称PCR扩增目标食源性致病菌基因获取目标食源性致病菌单链DNA，采用核酸酶保护法原理设计与目标食源性致病菌单链DNA完全互补的特异性序列，并且在该特异性序列的5’端修饰上发光基团以及3’端修饰上生物素，制备成电化学发光核酸探针，待测样品基因组DNA通过不对称PCR得到的单链DNA与电化学发光核酸探针杂交，得到的杂交产物与单链特异性核酸酶反应，酶切产物与磁珠孵育连接，通过磁吸附进行分离富集，最终对酶切产物进行电化学发光检测，由于目标单链DNA与电化学发光核酸探针形成双链，保护电化学发光核酸探针免受单链特异性核酸酶的酶切，保留了电化学发光基团，因而产生电化学发光信号；根据电化学发光信号的有无和强度对目标食源性致病菌DNA进行定性分析与定量检测，最终实现食源性致病菌的检测。
与现有的食源性致病菌检测技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明检测方法中，食源性致病菌引物是根据9类食源性致病菌的16S rDNA基因的保守区域设计的，具有通用性高的优点；
2、本发明检测方法中，检测食源性致病菌的电化学发光核酸探针序列是根据9类食源性致病菌的16S rDNA基因的可变区域设计的，具有特异性强的优点；
3、本发明检测方法中，只有当待测样品基因组DNA通过不对称PCR得到的单链DNA能与电化学发光核酸探针完全互补配对形成双链DNA时，才会产生电化学发光信号，保证了本发明检测方法的特异性；且电化学发光技术灵敏度高，测量准确性高；
4、本发明检测方法中所使用的单链特异性核酸酶在室温下即能够对单链DNA进行精准酶切，降低了检测的设备要求与检测成本，操作简便，容易实现。
附图说明
图1为本发明中的检测食源性致病菌方法的流程图；
图2为本发明中单链特异性核酸酶的酶切效果图；其中泳道M:marker A；1:探针酶切；2:探针无酶切；3：探针：目标＝2:1酶切；4：探针：目标＝2:1无酶切；5：探针：目标＝1：1酶切；6：探针：目标＝1:1无酶切；
图3为本发明中单链特异性核酸酶的酶切效果图；其中，泳道1：无酶切探针+30bp目标单链杂交产物；2：酶切探针+30bp目标单链杂交产物；3：酶切探针+50bp目标单链杂交产物；4：无酶切探针+50bp目标单链杂交产物；
图4为本发明实施例1中电化学发光检测金黄色葡萄球菌的结果图；
图5为本发明实施例1的特异性检验结果图；
图6为本发明实施例1的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
本发明提出一种基于核酸酶保护法快速检测食源性致病菌的高特异性电化学发光方法，利用单链特异性核酸酶能够特异性酶切单链DNA的特性，通过不对称PCR扩增目标单链DNA，针对PCR扩增得到的目标单链DNA的特征序列进行检测，从而实现对食源性致病菌的检测。
图1为本发明的快速检测食源性致病菌的方法流程图。本发明的快速检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品基因组DNA；
(2)、根据目标食源性致病菌基因序列(为单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌和蜡状芽孢杆菌等9类食源性致病菌)设计引物，引物的设计主要利用Primer premier 5.0设计以及Gene bank BLAST特异性分析；并通过不对称PCR(上、下游引物按照10:1至200：1比例进行不对称PCR)扩增获取目标食源性致病菌单链DNA，其含有目标食源性致病菌的特征序列；
(3)、根据步骤(2)获得的目标食源性致病菌单链DNA，设计一段与之完全互补、而不与其他序列互补的特异性DNA序列，且在所述特异性DNA序列的5’端修饰发光基团(三联吡啶钌、鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类或量子点类基团)，在所述特异性DNA序列的3’端修饰生物素(便于之后连接链霉亲和素包被的磁珠)，制成电化学发光核酸探针，末端还可以修饰氨基、羧基、或巯基等活性基团，便于核酸探针和发光标记物连接；
(4)、取10-50μl Tris-HCl(pH 7.1,20mM Tris–HCl,140mM NaCl,5mM KCl,1mMCaCl2,1mM MgCl2)杂交液，加入步骤(3)的电化学发光核酸探针与步骤(2)获得的目标食源性致病菌的单链DNA，在50-60℃杂交20-60min，获取电化学发光核酸探针杂交产物；所述电化学发光核酸探针的量为100fmol-100pmol，目标食源性致病菌的单链DNA的量为0.1fmol-100pmol；
(5)、取10-20μl单链特异性核酸酶反应缓冲液(30mM CH3COONa,pH4.6,280mMNaCl,1mM ZnSO4)，加入步骤(4)的杂交产物与10-50U单链特异性核酸酶(180U/μl)在20-60℃震荡孵育反应10-30min，单链特异性核酸酶仅能特异性酶切杂交产物中的单链部分，而不会酶切杂交产物中的双链部分，反应结束后加入1-20mM EDTA盐溶液使单链特异性核酸酶失活；
单链特异性核酸酶能特异性酶切单链DNA的结果如图2和图3所示。
图2中1、3、5泳道分别是空白对照(纯水替代目标食源性致病菌单链DNA与单链电化学发光核酸探针经杂交后进行酶切的产物)、5pmol目标食源性致病菌单链DNA与单链电化学发光核酸探针经杂交后进行酶切的产物、10pmol目标食源性致病菌单链DNA与单链电化学发光核酸探针经杂交后进行酶切的产物，由三条泳道的比对结果可以看出，加入的目标食源性致病菌单链DNA可以与单链电化学发光核酸探针杂交形成双链DNA，从而保护电化学发光核酸探针免于被酶切，因此第3和第5泳道都在30bp附近出现明亮的条带，而第1泳道中由于没有加入目标食源性致病菌单链DNA，没有形成双链DNA，因此被酶切，没有出现条带。第2、4、6泳道分别是未加入目标食源性致病菌单链DNA杂交的电化学发光核酸探针、加入5pmol目标食源性致病菌单链DNA杂交的电化学发光核酸探针、加入10pmol目标食源性致病菌单链DNA杂交的电化学发光核酸探针，由于目标食源性致病菌(所用的目标食源性致病菌序列来源于金黄葡萄球菌)单链DNA为50bp的单链，因此与30bp的电化学发光核酸探针杂交形成的双链条带出现在50bp附近，泳道4与6均在50bp附近出现条带，而泳道3与5在30bp附近出现条带，说明单链特异性核酸酶能特异性酶切杂交产物中的单链部分；泳道1中没有出现条带，泳道2在25bp附近出现条带，说明单链特异性核酸酶能特异性酶切单链DNA；
图3中，泳道1为没有进行酶切的电化学发光核酸探针与完全互补目标食源性致病菌单链DNA的杂交产物，而泳道2为酶切处理的电化学发光核酸探针与完全互补目标食源性致病菌单链DNA的杂交产物，泳道1和2的条带的亮度和位置一致，说明单链特异性核酸酶不会酶切双链DNA以及修饰的基团；泳道3为酶切处理后的电化学发光核酸探针与标准品目标食源性致病菌单链DNA的杂交产物，不完全互补的双链DNA经由酶切后形成30bp完全互补的双链DNA，因而泳道3与泳道1和2条带位置一致；而泳道4为没有酶切的电化学发光核酸探针与标准品目标食源性致病菌单链DNA的杂交产物，由于杂交产物为50bp的目标食源性致病菌单链DNA与30bp的电化学发光核酸探针形成的不对称双链DNA，因而在50bp附近出现条带；图3说明了单链特异性核酸酶可以特异性识别单链DNA以及双链DNA中的单链部分并酶切，且不会对修饰基团产生影响；
(6)、将10-50μl上述的酶切产物，加入链霉亲和素包被磁珠(7.2mg/mL,磁珠的目的就是分离富集目标分子，去除杂质)，在37℃振荡孵育10-40min，然后置于磁分离器中，磁分离去上清液，并用Tris–HCl清洗3次(洗去杂交产物中双链DNA中的单链部分的降解产物、单链DNA的降解产物以及未结合的电化学发光核酸探针降解产物)，最后分散到Tris–HCl溶液，得到连有酶切产物功能化的磁珠；
(7)、收集磁珠并将其分散于缓冲液中，将孵育后的磁珠和三丙胺(TPA)加入样品池中；
(8)、置于工作电极下方的磁片将磁珠吸附于工作电极表面，并给工作电极和参比电极间施加电压，进行电化学发光检测，根据电化学发光信号值是否高于阈值，判断待检测样品中是否含有目标食源性致病菌DNA；并根据标准曲线对阳性样品中的目标食源性致病菌DNA进行定量检测。
实施例1采用本发明的检测方法对食源性金黄色葡萄球菌检测
金黄色葡萄球菌能在食品如肉制品、乳制品、海鲜类、罐头食品中生长和繁殖，可以分泌多种毒力因子，如肠毒素、毒素休克综合症毒素-1、表皮剥脱毒素、葡萄球菌溶素和凝固酶等，可以引起食物中毒、骨髓炎、毒素休克综合症、心内膜炎和坏死性肺炎等严重疾病，可造成人和多种动物的感染、死亡。对食源性金黄色葡萄球菌进行核酸检测可快速准确地诊断致病原因、保证食品安全以及预防肠道传染病和食物中毒。
1、菌株培养
金黄色葡萄球菌采用10-15％NaCl肉汤培养。
2、目标DNA提取
采用水煮裂解法提取金黄色葡萄球菌菌株标本DNA。具体步骤如下：
取过夜培养的1ml菌液离心获得菌体，或从营养琼脂平板上获得菌苔；用100μl无菌水悬浮菌体，并100加℃热10min，冷却至室温后，14000rpm离心8min，取上清液作为PCR扩增的模板。
3、不对称PCR扩增
根据设计好的金黄色葡萄球菌的上游引物序列位于16S RNA的679～696处，序列为5’-CGCACATCAGCGTCAGTT-3’(SEQ ID No:1)，下游引物位于16S rDNA的1032～1053处，序列为5’-ATACGTAGGTGGCAAGCGTTAT-3’(SEQ ID No:2)；F'：R'＝100：1进行非对称PCR扩增得到目标金黄色葡萄球菌单链DNA。
PCR采用25μl反应体系，内含10×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.6)，1.5mM MgCl2，0.4μM引物，0.2mM dNTP，1μl Taq酶，1μl DNA模板。PCR产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收，最后通过电泳估算DNA含量。
4、电化学发光核酸探针与金黄色葡萄球菌单链DNA进行杂交
取12μl Tris–HCl(pH 7.1,20mM Tris–HCl,140mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl2,1mMMgCl2)杂交液，加入4μl的电化学发光核酸探针(5’端修饰六碳氨基用于标记三联吡啶钌，3’端修饰生物素，)与4μl金黄色葡萄球菌单链DNA(设置三个组：1、无加入金黄色葡萄球菌单链DNA的空白对照组；2、加入5pmol金黄色葡萄球菌单链DNA的实验组；3、加入10pmol金黄色葡萄球菌单链DNA的实验组)，55℃下震荡孵育30min，获得杂交产物；
5、取10μl上述的杂交产物加入到含有1μL 10U/μL单链特异性核酸酶(宝生物工程(大连)有限公司)的反应缓冲液(30mM CH3COONa,pH4.6,280mM NaCl,1mM ZnSO4)中，并在23℃振荡温育15分钟。反应结束时，加入20mM EDTA盐溶液，70℃下振荡温育10min至单链特异性核酸酶失活。
6、取20μl上述酶切产物加入链霉亲合素包被的磁珠(7.2mg/mL)于37℃振荡孵育30min，然后置于磁分离器，磁分离去上清，并用Tris–HCl清洗3次，最后分散到Tris-HCl溶液，最后得到酶切产物的功能化磁珠。
7、对富集得到的酶切产物的功能化磁珠进行电化学发光检测
取20μl酶切产物的功能化磁珠和2μl三丙胺加入检测样品池，并给定工作电极和参比电极间1.25V电压，进行电化学发光检测。根据电化学发光信号是否高于阈值判断待测样品是否含有金黄葡萄球菌成分，并制作标准曲线，根据电化学发光强度对金黄葡萄杆菌作定量检测。
结果如图4所示，图中方形为无加入金黄色葡萄球菌单链DNA的空白对照组，圆形是加入5pmol金黄色葡萄球菌单链DNA的实验组，三角形是加入10pmol金黄色葡萄球菌单链DNA的实验组，由图可知加入随着金黄色葡萄球菌单链DNA量的增加，被保护的电化学发光核酸探针增加，电化学发光信号随之增大。说明本发明检测方法是准确可行的。
实施例1本发明检测方法的特异性实验
结果如图5所示，其中Control组为没有加入金黄葡萄球菌目标单链DNA的空白对照组，Escherichia coli组为加入10pmol大肠杆菌单链DNA的实验组，Listeria组为加入10pmol单增李斯特杆菌单链DNA的实验组，Target组为加入10pmol金黄葡萄球菌目标单链DNA的实验组，Mixture组为加入大肠杆菌单链DNA、单增李斯特杆菌单链DNA和金黄葡萄球菌目标单链DNA各10pmol的干扰组。由图可知只有加入了金黄葡萄球菌目标单链DNA的Target组与Mixture组的电化学发光值超过阈值，而Escherichia coli组和Listeria组的电化学发光值均低于阈值，说明本发明检测方法的高特异性。
实施例1本发明检测方法的灵敏度实验
如图6所示，空白对照组的电化学发光强度为665.33±31.08cps，阈值为758.59cps，当加入金黄葡萄球菌目单链DNA为0.1fmol时电化学发光强度为892±12.53cps，高于阈值，因此检测限为0.1fmol。由图可知本发明检测方法在0.5fmol-500fmol呈良好的线性关系，R2＝0.9914。
以上所述实施例仅表达了本发明的1种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种快速检测食源性致病菌的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(人工序列)
<400> 4
cgcacatcag cgtcagtt 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(人工序列)
<400> 2
atacgtaggt ggcaagcgtt at 22

Claims (8)

1.一种快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品基因组DNA；
(2)、根据目标食源性致病菌基因序列设计引物，并通过不对称PCR扩增获取目标食源性致病菌单链DNA；
(3)、根据步骤(2)获得的目标食源性致病菌单链DNA序列，设计一段与之完全互补的特异性DNA序列，且在所述特异性DNA序列的5’端修饰标记发光物，在所述特异性DNA序列的3’端修饰生物素，制成电化学发光核酸探针；
(4)、将步骤(3)的电化学发光核酸探针与步骤(2)获得的目标食源性致病菌单链DNA在50-60℃杂交20-60min；所述电化学发光核酸探针的量为100fmol-100pmol，目标食源性致病菌单链DNA的量为0.1fmol-100pmol；
(5)、将步骤(4)的杂交产物与单链特异性核酸酶在20-60℃反应15-30min，反应结束后加入1-20mM EDTA盐溶液使单链特异性核酸酶失活；
(6)、将步骤(5)的酶切产物与链霉亲和素修饰的磁珠在37℃孵育10-40min，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中；
(7)、对孵育后的磁珠进行电化学发光检测，根据电化学发光信号值是否高于阈值，判断待检测样品中是否含有目标食源性致病菌DNA；并根据标准曲线对阳性样品中的目标食源性致病菌DNA进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(2)中所述不对称PCR中，上下游引物的体积比为10：1～200：1。
3.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目标食源性致病菌为单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、蜡状芽孢杆菌或霍乱弧菌等病原菌。
4.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发光基团为三联吡啶钌、鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类或量子点等基团。
5.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述电化学发光核酸探针的末端修饰氨基、羧基、或巯基等。
6.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述单链特异性核酸酶为S1核酸酶或绿豆芽核酸酶等核酸酶。
7.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(5)中，去上清液后，还包括用Tris–HCl、PBS等缓冲液清洗磁珠的步骤。
8.根据权利要求1所述的快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述电化学发光检测中的工作电极和参比电极之间的电压为0.8-1.5V。
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