CN110423798A

CN110423798A - 一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法

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Publication number: CN110423798A
Application number: CN201910710468.2A
Authority: CN
Inventors: 周楠迪; 蔡蓉凤; 张钟文; 田亚平
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110423798B

Abstract

一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，属于分析化学及环境污染检测技术领域。本发明采用具有特殊切割位点的切刻内切酶Nb.bpu10I和强链置换效应的Bsm DNA聚合酶通过链置换扩增反应获得大量单链DNA扩增序列。将扩增序列加入到电极系统中，与MB序列完全互补，打开三链结构，使G四链体电化学信号释放。通过电化学信号与金黄色葡萄球菌数量的关联，实现了对湖水中的金黄色葡萄球菌的数量检测。本发明方法具有回收率高，灵敏度高，特异性强等优点。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法

技术领域

本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，具体涉及一种基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关技术对金黄色葡萄球菌检测的电化学方法，属于分析化学及环境污染检测技术领域。

背景技术

随着国民生活水平的提升，生态和食品安全问题愈发受到人们的重视。依据世界卫生组织（World health organization，WHO）的调查结果显示，食源性疾病在世界范围内的发病率、死亡率都不容小觑。金黄色葡萄球菌广泛地存在于自然环境，是世界公认的食源性致病菌之一，据研究调查显示约有25%~50%的金黄色葡萄球菌存在于人类鼻腔之中，其产生的肠毒素将引起急性肠胃炎，甚至造成重大的致死性系统性疾病。美国疾病预防控制中心报告，在美国，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的细菌性食物中毒事件占33%，加拿大则更多，为45%，其他如芬兰、匈牙利等一些欧洲国家占50% 以上；在我国，约25%的细菌性食物中毒事件也是由金黄色葡萄球菌引起的，这给人们的日常生活，社会发展都造成了巨大伤害。传统的金黄色葡萄球菌检测方法包括微生物学培养法，快速测试片法等，虽然技术成熟，准确性较高，设备易得，但往往需要专业工作人员操作实验，检测周期长，效率低，耗费大量人力物力；新型金黄色葡萄球菌检测方法如酶底物快速检测法，实时荧光定量PCR法等虽然检测流程较短，但依旧回避不了成本较高、灵敏度较低、重复性较差等等诸多问题。

目前，生物传感器因其具备良好的选择性，高稳定性，高特异性，高灵敏度等优点而受到广泛的关注，成为研究的热点。DNA生物传感器根据其换能器的不同可以分为荧光、比色、电化学发光和电化学生物传感器。在这些DNA生物传感器中，电化学生物传感器因其简单、快速、灵敏度高等特点而具有广阔的应用前景。该类传感器以适配体作为生物识别元件，以电极为理化换能器，当适配体与靶分子特异性结合后，发生构象变化，引起对应的电化学信号波动，进而达成对靶分子的定量分析。

最近，基于Hoogsteen和Watson−Crick互补配对原理，一种三螺旋分子开关已被研究并应用于DNA生物传感器。三链DNA是指当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘧啶区可结合形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘧啶链上的碱基形成氢键。根据第三条链的来源，三链又可分为分子内和分子间两大类：分子内的三链DNA是由一条链通过自身回折形成的，分子间的又分为两种：（1）由一条单链与发夹结构或环状单链所形成；（2）由一条单链与线状双链形成。三螺旋构象的性质与其携带的任何特定的结合序列无关，使三螺旋生物传感策略具有普遍适用性。与传统的双链DNA生物传感器相比，基于三螺旋构象的生物传感器具有一些独特的优点。

发明内容

本发明的目的是克服传统检测方法的不足，提供一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其具有高灵敏、高特异性、准确的优点。

本发明的技术方案，关键技术包括磁珠靶标置换系统；Nb.bpu10I切刻内切酶与Bsm DNA聚合酶双酶偶联体系的构建；三螺旋分子开关的设计及G四链体信号释放。包含内容为：将生物素修饰的适配体和cDNA序列高温变性，复性后在适宜温度下形成部分互补双链结构。该混合溶液加入链霉亲和素磁珠体系中共同孵育，通过生物素-链霉亲和素的结合使部分互补双链修饰到磁珠表面。同时，电极上修饰包含有G四链体结构的捕获探针序列，与MB序列茎端互补形成三螺旋结构而捕获MB序列，此时G四链体结构未能形成，电化学信号关闭。在金黄色葡萄球菌存在的情况下，磁珠上部分互补双链中适配体与金黄色葡萄球菌结合，使cDNA释放。加入含有引物，Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm DNA聚合酶的溶液中，促发链置换扩增反应，实现单链DNA的循环放大。扩增的单链DNA与电极上MB序列形成完全互补序列双链，从而破坏了三螺旋结构，使剩下的捕获序列释放G四链体电化学信号（图1）。最后，建立电化学信号强度与金黄色葡萄球菌数量间的线性关系，利用该线性关系的标准曲线计算样品中的金黄色葡萄球菌含量。

所述基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关的检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，具体步骤如下：

（1）磁珠靶标置换系统：将1 μmol•L^-1 适配体序列与1 μmol•L^-1 cDNA在95℃高温变性5 min 后缓慢降温至37℃复性，形成部分互补双链。取100 μL磁珠悬液，磁性分离后用1 mLPBS缓冲液清洗3次。去除PBS缓冲液，加入200 μL部分互补双链，置于37℃摇床，220 r·min^-1 孵育45 min，使部分互补双链DNA偶联到磁珠表面。

将含有不同浓度的金黄色葡萄球菌样品在3000 r·min^-1离心5 min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次，最后重悬于PBS缓冲液。取100 μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液加入修饰有部分互补双链DNA的磁珠中，混匀，在37℃摇床中，220 r·min^-1孵育45 min；使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有游离cDNA的上清液。

（2）链置换扩增体系：取上述步骤（1）溶液加入5 μmol•L^-1 引物序列，2.5 mmol•L^-1 游离的脱氧核糖核苷三磷酸，0.0625 U•μL^-1 Nb.bpu10I切刻内切酶，0.025 U•μL^-1 Bsm聚合酶，1×Buffer R，混匀后37℃孵育1 h。

（3）金电极三螺旋序列修饰与封闭：取适量粒径为0.5 µm和0.05 µm的氧化铝粉末分别用双蒸水分散于两块不同的抛光布上，匀速打磨直至金电极表面洁净平滑。用0.5mol•L^-1的H₂SO₄溶液对电极表面进行电化学清洗，其参数设置为：扫描范围-0.35~ -1.5 V，扫描速率0.1 V·s^-1，样品间隔为0.01 V。

分别取0.5 μmol·L^-1捕获探针和0.5 μmol·L^-1MB序列混合，于37℃水浴120min，以形成三链体DNA结构。将获得的混合溶液浸没金电极表面，28℃环境下自组装18 h，然后用PBS缓冲液洗去多余DNA。立即将金电极放入1 mmol•L^-1 巯基己醇MCH溶液，室温暗处反应60 min，冲洗电极。

使用电化学阻抗谱（EIS）检测表征每一步电极修饰情况。将电极置于0.1 mmol·L^-1 [Fe(CN)₆] ^3-/4-中，扫描频率：0.1 Hz~10 kHz。

（4）电化学信号释放：将步骤（2）链置换扩增后的混合溶液置80℃孵育20 min灭活Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm聚合酶。然后将混合溶液浸没金电极，并在37℃孵育120 min并冲洗干净。完成杂交后的金电极在G四链体形成液中浸没反应30 min，确保捕获探针能够形成G四链体结构。加入 0.2 mmol•L^-1血红素储存液至溶液中继续进行反应1 h，从而得到G4-hemin复合物。提前向检测液中通入氮气30 min除去氧气，之后将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描（扫描电压：-0.6 ~ 0.15 V）。

（5）实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的水样以步骤（1）~（4）所述操作，测定出相应的电流值，从标准曲线中计算出相应的菌浓度。

所述适配体序列SEQ ID NO.1具体为

5’-GCAATGGTAC GGTACTTCCT CGGCACGTTC TCAGTAGCGC TCGCTGGTCA TCCCACAGCTACGTCAAAAG TGCACGCTAC TTTGCTAA-3’。

所述cDNA序列SEQ ID NO.2具体为

5’-(T)₄₀TTCCTAAGCT TAGCAAAGTA GCGTGCACTG CT-3’。

所述引物序列SEQ ID NO.3具体为

5’-(T)₄₀TTCCTAAGCA GTGCACGCTA CTTTGCTAAG CT -3’。

所述捕获探针序列SEQ ID NO.4具体为

5’-HS-(CH₂)₆-AATTGGGTAG GGCGGGTTGG GC-3’。

所述MB序列SEQ ID NO.5具体为

5’-CCATCCCGCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TCGCCCTACC-3’。

步骤所述序列购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

步骤所述PBS缓冲液配方：1 mol•L^-1 NaCl和1 mmol•L^-1 MgCl₂·6H₂O, pH 7.4。

步骤（1）所述不同浓度的金黄色葡萄球菌浓度具体为3×10³~6×10⁷ CFU·mL^-1。

步骤（2）所述的链置换扩增体系中Nb.bpu10I切刻内切酶，Bsm DNA聚合酶和Buffer R购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

步骤（4）所述G四链体形成液配方10 mmol•L^-1 HEPES和40 mmol•L^-1 KCl, pH8.0。

步骤（4）所述检测液配方20 mmol•L^-1 HEPES和40 mmol•L^-1 KCl, pH 8.0。

本发明的有益效果：本发明构建了一个基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关的金黄色葡萄球菌电化学检测方法。通过适配体捕获金黄色葡萄球菌释放cDNA，加入引物后引发链置换扩增术扩增单链DNA序列，该序列能与电极三链“帽子”结构结合，释放G四链体信号。链置换扩增术能够使该传感器检测范围扩大，提高检测灵敏度。该方法相比于检测金黄色葡萄球菌的传统方法，特异性强，灵敏度高。

附图说明

图1 基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关的金黄色葡萄球菌电化学检测原理图。

图2 金黄色葡萄球菌检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的应用原理作进一步的描述。

本发明实施实例中所用的核酸序列如表1所示。

表1

实施例1. 金黄色葡萄球菌浓度标准曲线的绘制

将含有不同浓度金黄色葡萄球菌的样品在3000 r·min^-1离心5 min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次后重悬于PBS缓冲液中。将1μmol·L^-1适配体序列与1μmol·L^-1cDNA在95℃高温变性5min 后缓慢冷却至37℃孵育120min。取100μL磁珠悬液，置磁力架，磁性分离后用1mL PBS缓冲液清洗磁珠3次。加入200μL部分互补双链，置37℃摇床，220 r·min^-1孵育45min。磁珠清洗后重悬于100μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液，同时用100μL PBS缓冲液代替菌液作为无菌液的对照组，混匀，置37℃摇床中，220 r·min^-1孵育45 min，使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有cDNA序列的上清液。加入5μmol•L^-1 引物序列，2.5mmol•L^-1 dNTPs，0.0625 U•μL^-1 Nb.bpu10I，0.025 U•μL^-1 Bsm聚合酶，1× buffer R，混匀后37℃孵育1h。

取适量粒径为0.5µm和0.05µm的氧化铝粉末打磨抛光金电极，直至金电极表面洁净平滑。打磨后的金电极用0.5 mol•L^-1的H₂SO₄溶液对电极表面进行电化学清洗。将0.5μmol·L^-1捕获探针与0.5 μmol·L^-1MB序列在37℃孵育120 min以形成电极表面的三链体DNA结构。将混合溶液浸没金电极表面，在28℃环境下自组装 18 h。而后将金电极放入1mmol•L^-1 MCH溶液，室温暗处反应60 min。封闭完成之后用PBS缓冲液在室温下冲洗多余的MCH溶液，加入链置换扩增后的混合溶液浸没电极，并在37℃孵育120min。完成杂交后的金电极在G四链体形成液中浸没反应30 min，确保捕获探针能够形成G四链体结构。最后在0.2 mmol•L^-1 血红素储存液中继续进行反应1 h，得到 G4-hemin复合物。将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描（扫描电压：-0.6~0.15V），读取不同浓度金黄色葡萄球菌溶液样品对应的峰电流值。根据峰电流与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。如图2所示，电化学信号强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增加，其线性回归方程是y=29.06*logx+326.69，R²为0.9951，其中y表示峰电流（nA），x表示Log ([金黄色葡萄球菌]/CFU/mL)，该方法的检测限为39 CFU·mL^-1。

实施例2. 实际水样中金黄色葡萄球菌含量的测定

为了进一步验证该方法在测定实际样品中金黄色葡萄球菌含量时的准确性，选用了无预处理的太湖水。将培养的金黄色葡萄球菌以3000 r·min^-1离心5 min，并用PBS缓冲液洗涤3次以除去培养基。然后将沉淀物以3×10³ CFU·mL^-1和6×10⁷ CFU·mL^-1的浓度溶解在100 μL水样中。将1 μmol·L^-1适配体序列与1 μmol·L^-1cDNA在95℃高温变性5 min 后缓慢冷却至37℃孵育120 min。取100 μL磁珠悬液，置磁力架，磁性分离后用1 mL PBS缓冲液清洗磁珠3次。加入200 μL部分互补双链，置37℃摇床，220 r·min^-1孵育45 min。磁珠清洗后重悬于100 μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液，同时用100 μL PBS缓冲液代替菌液作为无菌液的对照组，混匀，置37℃摇床中，220 r·min^-1孵育45 min，使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有cDNA序列的上清液。加入5 μmol•L^-1 引物序列，2.5 mmol•L^-1dNTPs，0.0625 U•μL^-1 Nb.bpu10I，0.025 U•μL^-1 Bsm聚合酶，1x buffer R，混匀后37℃孵育1 h。

取适量粒径为0.5 µm和0.05 µm的氧化铝粉末打磨抛光金电极，直至金电极表面洁净平滑。打磨后的金电极用0.5 mol•L^-1的H₂SO₄溶液对电极表面进行电化学清洗。将0.5μmol·L^-1捕获探针与0.5 μmol·L^-1MB序列在37℃孵育120 min以形成电极表面的三链体DNA结构。将混合溶液浸没金电极表面，在28℃环境下自组装 18 h。而后将金电极放入1mmol•L^-1 MCH溶液，室温暗处反应60 min。封闭完成之后用PBS缓冲液在室温下冲洗多余的MCH溶液，然后加入链置换扩增后的混合溶液浸没电极，并在37℃孵育120 min。完成杂交后的金电极在G四链体形成液中浸没反应30 min，确保捕获探针能够形成G四链体结构。最后在 0.2 mmol•L^-1 血红素储存液中继续进行反应1 h，得到 G4-hemin 复合物。将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描（扫描电压：-0.6 ~ 0.15 V）。使用电化学工作站读取含有金黄色葡萄球菌样品的所得的DPV曲线中的峰电流，代入标准曲线可计算出金黄色葡萄球菌浓度。具体测试数据如表2所示。

表2

注：样品1和样品2为太湖水样品。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法

<141> 2019-08-02

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 适配体序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gcaatggtac ggtacttcct cggcacgttc tcagtagcgc tcgctggtca tcccacagct 60

acgtcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> cDNA序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

ttcctaagct tagcaaagta gcgtgcactg ct 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ttcctaagca gtgcacgcta ctttgctaag ct 32

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 捕获序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aattgggtag ggcgggttgg gc 22

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> MB序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ccatcccgct tttttttttt tttttttttt tcgccctacc 40

Claims

1.一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征是：基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关；步骤如下：

首先将生物素修饰的适配体和cDNA序列高温变性，复性后在适宜温度下形成部分互补双链结构；将互补双链溶液加入链霉亲和素磁珠体系中共同孵育，通过生物素-链霉亲和素的结合使部分互补双链修饰到磁珠表面；

同时，电极上修饰包含有G四链体结构的捕获探针，与MB序列茎端互补形成三螺旋结构而捕获MB序列，此时G四链体信号关闭；在金黄色葡萄球菌存在的情况下，磁珠上部分互补双链中适配体与金黄色葡萄球菌结合，使cDNA释放；

将引物，Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm DNA聚合酶加入到cDNA溶液中，Bsm DNA聚合酶通过聚合反应合成完全互补的双链，Nb.bpu10I切刻内切酶在双链分子切割位点处形成切口，Bsm DNA聚合酶从断裂位点处继续合成DNA链，替换旧链，实现循环放大扩增出大量单链DNA；

该单链DNA与电极上MB序列形成完全互补序列双链，从而破坏了电极上原有的三螺旋结构，使得捕获探针释放G四链体电化学信号；建立电化学信号强度与金黄色葡萄球菌数量间线性关系的标准曲线，利用该标准曲线计算样品中的金黄色葡萄球菌含量。

2.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）磁珠靶标置换系统：将1 μmol•L^-1 适配体序列与1 μmol•L^-1 cDNA在95℃高温变性5min 后缓慢降温至37℃复性，形成部分互补双链；取100 μL磁珠悬液，磁性分离后用1 mLPBS缓冲液清洗3次；去除PBS缓冲液，加入200 μL部分互补双链，置于37℃摇床，220 r·min^-1 孵育45 min，使部分互补双链的DNA偶联到磁珠表面；

将含有金黄色葡萄球菌的样品在3000 r·min^-1离心5 min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次，最后重悬于PBS缓冲液；取100μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液加入修饰有部分互补双链DNA的磁珠中，混匀，在37℃摇床中220 r·min^-1孵育45 min；使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有游离cDNA的上清液；

（2）链置换扩增体系：取上述步骤（1）溶液加入5μmol•L^-1 引物序列，2.5 mmol•L^-1 游离的脱氧核糖核苷三磷酸，0.0625U•μL^-1 Nb.bpu10I切刻内切酶，0.025 U•μL^-1 Bsm聚合酶，1×Buffer R，混匀后37℃孵育1 h；

（3）金电极三螺旋序列修饰与封闭：取粒径为0.5µm和0.05µm的氧化铝粉末分别用双蒸水分散于两块不同的抛光布上，匀速打磨直至金电极表面洁净平滑；

用0.5mol•L^-1的H₂SO₄溶液对电极表面进行电化学清洗，其参数设置为：扫描范围-0.35~-1.5 V，扫描速率0.1 V·s^-1，样品间隔为0.01 V；

分别取0.5 μmol·L^-1捕获探针和0.5 μmol·L^-1MB序列混合，于37℃水浴120 min，以形成三螺旋DNA结构；将获得的混合溶液浸没金电极表面，28℃下自组装18h，然后用PBS缓冲液洗去多余DNA；立即将金电极放入1 mmol•L^-1 巯基己醇MCH溶液，室温暗处反应60 min，冲洗电极；

使用电化学阻抗谱EIS检测表征每一步电极修饰情况；将电极置于0.1 mmol·L^-1 [Fe(CN)₆] ^3-/4-中，扫描频率：0.1 Hz~10 kHz；

（4）电化学信号释放：将步骤（2）链置换扩增后的混合溶液置80℃孵育20min灭活Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm聚合酶；然后将混合溶液浸没金电极，并在37℃孵育120min并冲洗干净；完成杂交后的金电极在G四链体形成液中浸没反应30min，确保捕获探针能够形成G四链体结构；加入0.2mmol•L^-1血红素储存液至溶液中继续进行反应1h，从而得到G4-hemin复合物；提前向检测液中通入氮气30min除去氧气，之后将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描；扫描电压-0.6~ 0.15V；

（5）实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的水样以步骤（1）~（4）所述操作，测定出相应的DPV峰电流值，从标准曲线中计算出相应的菌浓度。

3.根据权利要求1或2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：所述适配体序列如SEQ ID No.1所示； cDNA序列如SEQ ID No.2所示；引物序列如SEQ ID No.3所示；捕获探针如SEQ ID No.4所示；MB序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：步骤（1）中所述含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液中的菌浓度为3×10³~6×10⁷ CFU·mL^-1。

5.根据权利要求2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：步骤（3）所述捕获探针为5’端修饰HS-(CH₂)₆的DNA序列。