CN101825597A - Dna适体修饰的生物电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器及其制备方法。该新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有DNA适体链。本发明的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器结合了DNA适体高特异性以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使癌细胞的早期诊断成为可能。

Description

DNA适体修饰的生物电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器及其制备方法。

发明背景

癌症，是当今社会中存在的严重威胁人类身体健康的疾病之一。其中，急性淋巴细胞白血病对于孩子们身体健康的威胁尤其明显。据文献报道，在患急性淋巴细胞白血病病人中有接近三分之二是儿童。并且，在现有的治疗手段中，低治愈率以及高复发率也是癌症治疗过程中存在的问题。然而，若在癌症早期即能被诊断出来的话，则将大大提高病人的存活率，并且也有研究证明，早期诊断和及时治疗是提高病人存活率的有效方法之一。因此，针对癌症的分子水平特征，进行癌症早期诊断的研究就显得极为重要。

电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和参比电极，电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学作为一种分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。具体包括以下几种方法：

1.循环伏安法是最常用的一种方法，它在解释电子传递机理方面有独特的优势；

2.示差脉冲法则拥有更高的灵敏度，因此常用作检测；交流阻抗法在表面表征方面具有独特的优势，因而常用来辅助表征电极的表面状态。

3.在表面表征方面，显微镜技术具有直观可靠的优点。

近来，研究人员报道了一种称作适体的分子探针。适体为单链DNA、RNA或是经过修饰的核酸，是通过一种体外选择过程SELEX(指数富集的配体系统进化)产生的。在SELEX技术中，能从大量的单链随机寡核苷酸文库中筛选出能与靶物质高特异性、高亲和力结合的核酸配基，即为适体。在已经报道的文献中，适体可以结合小分子物质诸如三磷酸腺苷(ATP)，或是大分子物质如蛋白质，甚至可以与细胞特异性结合。由于具有高特异性识别靶物质、低分子量、合成简便、易于修饰、低毒性、高稳定性等特点，适体越来越多被应用于各项研究以及生物传感器的设计。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器。用以癌细胞的早期诊断。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有DNA适体链。

上述的DNA适体链为带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链。

上述的带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链为：5’-HS-(CH₂)₆-ATCTA ACTGCTGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3’。

一种制备上述的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将处理过的金电极置于1M H₂SO₄中，在0-1.5V电压范围内进行循环伏安扫峰，扫速设置为100mv/s，至达到稳定；然后在氮气中吹干该金电极后，将该金电极置于含有巯基DNA适体链的溶液的Eppendorf管中，该溶液含有浓度为0.05pM～50pM的HS-DNA适体，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl和0.5μM的pH为8.0的TCEP，倒置16小时，再浸入1mM MCH水溶液中2小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到DNA适体修饰的金电极，该金电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器；所述的HS-DNA适体为：5’-HS-(CH₂)₆-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACGGTTAG A-3’。

本发明第一次在金电极表面修饰上带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链，用于特异性识别和检测靶细胞，在检测过程中，K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]作为具有电活性的探针，来表征信号。当样品中存在靶细胞的时候，适体链与靶细胞特异结合，使电极表面与K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]之间的电子传递受到阻碍，因此检测到的电信号较低；而当样品中没有靶细胞或是存在其他参照细胞(如HL-60原髓白血病细胞)的时候，适体链不会与其特异性结合，因此K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的电信号较高。这一检测体系结合了DNA适体高特异性以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使癌细胞的早期诊断成为可能。

附图说明

图1为在10mM Tris-HCl，5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](pH 7.0)的缓冲液中，修饰了不同浓度的DNA适体的金电极的循环伏安图。

图2为在10mM Tris-HCl，5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](pH 7.0)的缓冲液中，CCRF-CEM细胞(细胞数量：250,000)与DNA适体不同反应时间的示差脉冲图。

图3为在10mM Tris-HCl，5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](pH 7.0)的缓冲液中，HL-60细胞(细胞数量：250,000)与DNA适体不同反应时间的示差脉冲图。

图4为在10mM Tris-HCl，5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](pH 7.0)的缓冲液中，CCRF-CEM细胞(细胞数量：250,000)与DNA适体不同反应时间的交流阻抗图。

图5为在10mM Tris-HCl，5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](pH 7.0)的缓冲液中，HL-60细胞(细胞数量：250,000)与DNA适体不同反应时间的交流阻抗图。

图6为CCRF-CEM细胞(a)与HL-60细胞(b)在修饰了DNA适体的镀金云母片上的显微镜图。

具体实施方式

实施例一：金电极的修饰

在进行适体修饰之前，先在细砂纸上打磨金电极，然后再在Al₂O₃粉末上打磨，之后分别在无水乙醇以及超纯水中超声5分钟。为了更好地除去残留在金电极表面的杂质，将电极置于1M H₂SO₄中，在0-1.5V电压范围内进行循环伏安(CV)扫峰，扫速设置为100mv/s，约20圈达到稳定。然后在氮气中吹干电极，进行适体修饰。将金电极分别置于含有巯基DNA适体链(5’-HS-(CH₂)₆-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3’)的Eppendorf管中，其中含有浓度范围为：0.05pM、0.5pM、5pM以及50pM的HS-DNA适体，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl和0.5μM TCEP(pH 8.0)，倒置16小时。之后，再浸入1mM MCH水溶液中2小时。电极修饰完毕后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，得到编号分别为A、B、C、D的经修饰的金电极。

实施例二：细胞的培养及处理

CCRF-CEM细胞(人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞)和HL-60细胞(人原髓细胞白血病细胞)都购于中科院上海细胞所。这两种细胞均在37摄氏度，5％CO₂的培养箱中培养，培养基为含有10％胎牛血清的1640培养基，在细胞长至对数生长期末端时收集，进行细胞检测研究。检测前用血球计数板计数，每次使用细胞浓度一般在10⁵左右。

实施例三：修饰到金电极上的适体浓度的优化

循环伏安法，采用的电化学探针是5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]。对上述编号为A、B、C、D的金电极做电化学探针检测，结果如图1。从循环伏安图的结果中可以观察到，随着适体浓度的不断降低，K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]与金电极表面的电化学传递变得更加容易，从而信号也在不断地增大，其中B号金电极表面与K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的电化学传递最佳，得到了较好的峰形，之后当适体浓度进一步降低时，信号没有明显的增大。

实施例四：适体应用于癌细胞检测的生物传感器的构建

将编号为B的金电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器，进行靶细胞的检测，使用的参照细胞为HL-60细胞(人原髓细胞白血病细胞)。

采用示差脉冲法对含有靶细胞的样品溶液进行检测，图2为检测结果。从图中可以观察到，随着靶细胞和DNA适体反应时间的延长，检测信号不断降低，尤其是从0小时至2小时之间，信号降低明显。之后，随着反应时间的继续增加，虽然信号仍有所降低，但差值并不显著，因此，鉴于2小时的反应时间便能达到比较好的检测信号，在之后的相关研究中，使用的适体与细胞反应时间固定在2小时。

为了进一步证明此信号的变化是由于修饰在金电极上的DNA适体特异性结合靶细胞所引起的，因而进行了之后的参照实验。图3即为使用此检测体系检测HL-60细胞的结果图，从图中可以观察到，即使将工作电极浸入HL-60细胞悬浮液长达2小时，检测峰值几乎没有发生明显的降低，说明DNA适体并没有特异性结合HL-60细胞，电信号的微小降低可能是由于HL-60细胞少量、非特异性地吸附到金电极表面。该对照实验表明，利用这一体系可以特异性识别靶细胞并将之与其它非靶标细胞有效区分开来，实现在复杂体系中检测靶细胞的目的，为癌症早期诊断提供了可能性。

图4和5分别展示的是CCRF-CEM以及HL-60细胞悬浮液的交流阻抗检测结果图。DNA适体在特异性识别了靶细胞(CCRF-CEM)并与之结合以后，便会引起金电极表面阻抗值的变化，使得阻抗值变大。图4是含有靶细胞CCRF-CEM的样品液的检测图，从图中可以观察到，随着细胞与适体反应时间的增加，电极表面的阻抗值增大，在两者反应2小时后的阻抗值变化明显；同样，图5显示，工作电极浸入HL-60细胞悬浮液2小时后的阻抗值增大并不明显，阻抗值的微小增大可能是由细胞非特异性吸附至电极表面所引起的。这个结果与示差脉冲结果一致，从阻抗变化的角度支持了这一体系可以用于癌细胞的检测。

实施例五：修饰于金电极上的适体特异性结合靶细胞的直观证明

为了更加直观地证明靶细胞CCRF-CEM确实被特异性结合在经适体修饰过的金电极表面，本发明借助显微镜拍照来进一步观察细胞是否被适体链特异性识别并结合至金电极上。

首先要对云母片进行镀金处理，来模拟金电极表面的情况。之后，按照修饰金电极的方法对镀金云母片进行DNA适体的修饰。接着，将修饰好了的镀金云母片分别浸入含有靶细胞CCRF-CEM的样品液以及含有HL-60细胞的悬浮液，培育2小时后，轻轻冲洗干净，放到显微镜下观察、拍照，结果如图6。在图6(a)中，靶细胞CCRF-CEM特异性地被DNA适体所识别，从而结合到镀金云母片上，在显微镜下可以明显观察到有很多细胞结合到镀金云母片表面；相反，在图6(b)中几乎看不到细胞，说明HL-60细胞由于无法被适体特异性识别，所以并没有结合到镀金云母片表面。可见，修饰到金基底上的DNA适体确实能够特异性识别靶细胞并与之结合，从而使适体应用于构建电化学传感器成为可能。

上述结果证明了基于适体特性及电化学方法所设计的这一检测方案，可以针对癌细胞分子水平上的差异性，对癌细胞进行有效检测，从而达到早期检测癌症的目的。

Claims (4)

1.一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有DNA适体链。

2.根据权利要求1所述的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器，其特征在于所述的DNA适体链为带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链。

3.根据权利要求2所述的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器，其特征在于所述的带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链为：5’-HS-(CH₂)₆-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCGGGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3’。

4.一种制备根据权利要求1所述的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将处理过的金电极置于1M H₂SO₄中，在0-1.5V电压范围内进行循环伏安扫峰，扫速设置为100mv/s，至达到稳定；然后在氮气中吹干该金电极后，将该金电极置于含有巯基DNA适体链的溶液的Eppendorf管中，该溶液含有浓度为0.05pM～50pM的HS-DNA适体，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl和0.5μM的pH为8.0的TCEP，倒置16小时，再浸入1mM MCH水溶液中2小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到DNA适体修饰的金电极，该金电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器；所述的HS-DNA适体为：5’-HS-(CH₂)₆-ATCTA ACTGC TGCGCCGCCG GGAAAATACT GTACG GTTAG A-3’。

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