CN105806905B - 基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器及其构建方法和应用，生物传感器包括肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II；其构建方法为：将巯基修饰的DNA通过化学键合固定在电极上，在所述DNA上依次通过互补修饰MUC1适体和含亚甲基蓝探针的CEA适体，即得。该生物传感器可以用来分别检测两种不同肿瘤标志物，也可以在同一界面上连续检测两种不同肿瘤标志物，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。
Description
技术领域
本发明涉及基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器及其构建方法和应用，属于电化学生物传感器领域。
背景技术
人体MUC1是一种众所周知的肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤中均有过量表达，如：乳腺癌，胃，大肠癌，肺癌，前列腺等。表皮细胞从良性到恶性转变的典型变化是在细胞表面顶尖分布，过量表达MUC1且异常糖基化。癌胚抗原CEA是一种糖蛋白类的肿瘤标志物，在许多肿瘤细胞中广泛分布。可以根据其血清含量初步判断肿瘤的存在，评价疗效，预估癌细胞生长状况。因此对这两种肿瘤标志物的检测对癌细胞的侦探和检测有十分重要的作用。但是在已有的检测方法中，一般是对这两种标志物的单一检测，为了更好的评估疾病的发展情况，对这两种标志物的检测显得尤为重要。
发明内容
针对现有的肿瘤标志物的检测方法存在的缺陷，本发明的第一个目的是在于提供一种信号强、特异性高、灵敏度高，且可以用于检测一种或同时连续检测两种肿瘤标志物的生物传感器。
本发明的第二个目的是在于提供一种操作简单、重复性好的构建所述生物传感器的方法。
本发明的第三个目的是在于提供一种所述生物传感器的应用，该生物传感器可以分别检测两种肿瘤标志物，也可以在同一界面上连续检测两种肿瘤标志物，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器，该生物传感器包括肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II。
优选的方案，肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II通过互补修饰在DNA上，所述DNA固定在电极上。
优选的方案，肿瘤标志物适体I为MUC1适体。
优选的方案，肿瘤标志物适体II为CEA适体。
本发明还提供了一种构建所述的基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器的方法，该方法是将巯基修饰的DNA通过化学键合固定在电极上，在所述DNA上依次通过互补修饰肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II。
优选的方案，包括以下步骤：
(1)将电极置于浓度为1～10μM的巯基修饰的DNA溶液中，反应14～16h，用水冲洗，去除电极表面游离的巯基修饰的DNA；
(2)将电极置于MCH溶液中，封闭0.5～2h，依次用酒精和水冲洗；
(3)将电极置于浓度为1～10μM的MUC1适体溶液中，反应1～2h，用水冲洗，去除游离的MUC1适体；
(4)在避光环境中，将电极置于浓度为1～10μM的含亚甲基蓝探针的CEA适体溶液中，反应2～3h后，用水冲洗，即得。
本发明的方法通过MCH封闭电极，能够使得修饰的DNA保持其竖直的结构，有利于CEA适体和MUC1适体的连接和起到支撑作用。电极一般采用金电极，巯基修饰的DNA主要通过巯基与金电极键合，形成Au-S键，实现DNA在金电极上的固定。采用的亚甲基蓝探针(MB)是还原性物质，所以在PBS中测量方波，在-0.276V左右会有明显的亚甲基蓝的峰。
本发明还提供了所述基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器在检测肿瘤标志物中的应用，应用于检测肿瘤标志物适体I对应的肿瘤标志物I，或者检测肿瘤标志物适体II对应的肿瘤标志物II，或者连续检测肿瘤标志物适体I对应的肿瘤标志物I和肿瘤标志物适体II对应的肿瘤标志物II。
优选的方案，将生物传感器用于检测肿瘤标志物I，根据肿瘤标志物I加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物I的含量；
或者，将生物传感器用于检测肿瘤标志物II，根据肿瘤标志物II加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物II的含量；
或者，将生物传感器用于连续检测肿瘤标志物I和肿瘤标志物II，肿瘤标志物I和肿瘤标志物II依次加入，根据肿瘤标志物I加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物I的含量，根据肿瘤标志物II加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物II的含量。
较优选的方案，肿瘤标志物I为MUC1。
较优选的方案，所述的肿瘤标志物II为CEA。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
(1)本发明的生物传感器同时修饰两种肿瘤标志物适体(aptamer)用来检测肿瘤标志物，根据MB的电化学信号的大小来检测肿瘤标志物的含量，具有灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。
(2)本发明的生物传感器利用两种肿瘤标志物适体来检测肿瘤标志物，可以在检测出一种肿瘤标志物的基础上，继续检测另一种肿瘤标志物，实现了基于同一界面，两种目标物的同时检测，具有检测更简单、检出限更低、灵敏度高、特异性强的特点，特别是前一种标志物检测后的界面能提高第二种标志物的检测灵敏度。
(3)本发明的生物传感器引入适体，稳定性好，且适体能够更准确地测定肿瘤标志物的量。适体相比较于抗体，其处理过程更为简单，且易合成，易修饰信号分子，能够更容易检测其出所需的电化学信号。
(4)本发明的生物传感器构建方法简单、重复性好。
附图说明
【图1】为构建生物传感器的过程示意图；
【图2】为生物传感器构建过程的EIS表征；
【图3】为在构建的生物传感器表面加入一系列不同浓度的MUC1后的SWV图；
【图4】为在一定的浓度范围内MUC1的线性关系图；
【图5】为在构建的生物传感器表面加入一系列不同浓度的CEA后的SWV图；
【图6】为在一定的浓度范围内CEA的线性关系图；
【图7】为在构建的生物传感器表面先加入一定浓度的MUC1再加入不同浓度的CEA的线性关系图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
1、在电极上构建的生物传感器的方法，步骤如下：
在室温下，电极上修饰10μM的DNA1 16h，然后用二次水冲洗，去除没有修饰上的残留的DNA1，然后在将电极放在MCH中，加入MCH的目的是为了封闭电极上未反应的位点以及使得修饰的DNA1呈直立结构，在MCH中封闭1h后，先用酒精冲洗，再用二次水冲洗干净；然后在电极上修饰10μM DNA2，在室温条件下放置2h，随后用二次水冲洗去除未反应的DNA2；再在电极上修饰10μM的DNA3-MB，由于亚甲基蓝见光容易分解，所以从这一步开始，所有的操作过程都是在黑暗条件下进行的，修饰2h后，用二次水冲洗。由此说明双功能的电化学生物传感器已经构建。随后在生物传感器表面加入一系列不同浓度的MUC1和CEA。
2、对肿瘤标志物MUC1的定量分析步骤如下：
分别配置不同浓度的MUC1，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于DNA2是肿瘤标志物MUC1的aptamer，它能够和蛋白形成稳定的聚合结构从而脱落至溶液中，使得DNA3上的MB距离电极更近，根据DNA3上亚甲基蓝信号变化的增加量来定量分析MUC1。
3、对肿瘤标志物CEA的定量分析步骤如下：
分别配置不同浓度的CEA，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于DNA3是肿瘤标志物CEA的aptamer，它能够和蛋白形成稳定的聚合结构从而脱落至溶液中，使得电极上MB的减少，根据亚甲基蓝信号变化的减小量来定量分析CEA。
4、对肿瘤标志物MUC1和CEA的连续检测的步骤如下：
先在以上构建的生物传感器表面加入一定浓度的MUC1，依此次检测的亚甲基蓝信号为初始信号，然后加入不同浓度的CEA，反应一段时间后检测其亚甲基蓝信号的大小。根据亚甲基蓝信号的变化量来定量检测CEA。
从图2可以看出随着电极表面构建的越多，其电流越小，阻抗值越来越大，表明生物传感器的成功构建；
从图3可以看出随着加入的肿瘤标志物MUC1的量逐渐增多，其响应信号逐渐增大。
从图4可以看出在一定的浓度范围内MUC1与其所对应的响应信号有一定的线性关系；
从图5可以看出随着加入的肿瘤标志物CEA的量逐渐增多，其响应信号逐渐增大。
从图6可以看出在一定的浓度范围内CEA与其所对应的响应信号有一定的线性关系。
从图7可以看出在加入一定浓度的MUC1后，再加入不同浓度的CEA后，在一定范围内有很好的线性关系。
Claims (7)
1.一种基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于：包括肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II；
肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II通过互补修饰在DNA上，所述DNA固定在电极上。
2.根据权利要求1所述基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于：所述的肿瘤标志物适体I为MUC1适体；所述的肿瘤标志物适体II为CEA适体。
3.构建权利要求1或2任一项所述的基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器的方法，其特征在于：将巯基修饰的DNA通过化学键合固定在电极上，在所述DNA上依次通过互补修饰肿瘤标志物适体I和含亚甲基蓝探针的肿瘤标志物适体II，即得。
4.根据权利要求3所述的构建基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将电极置于浓度为1～10μM的巯基修饰的DNA溶液中，反应14～16h，用水冲洗；
(2)将电极置于MCH溶液中，封闭0.5～2h，依次用酒精和水冲洗；
(3)将电极置于浓度为1～10μM的MUC1适体溶液中，反应1～2h，用水冲洗；
(4)在避光环境中，将电极置于浓度为1～10μM的含亚甲基蓝探针的CEA适体溶液中，反应2～3h后，用水冲洗，即得。
5.权利要求1或2所述基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器在检测肿瘤标志物中的应用，其特征在于：应用于连续检测肿瘤标志物适体I对应的肿瘤标志物I和肿瘤标志物适体II对应的肿瘤标志物II。
6.根据权利要求5所述基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器在检测肿瘤标志物中的应用，其特征在于：将生物传感器用于连续检测肿瘤标志物I和肿瘤标志物II，肿瘤标志物I和肿瘤标志物II依次加入，根据肿瘤标志物I加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物I的含量，根据肿瘤标志物II加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物II的含量。
7.根据权利要求6所述基于亚甲基蓝探针同时检测两种肿瘤标志物的生物传感器在检测肿瘤标志物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤标志物I为MUC1；所述的肿瘤标志物II为CEA。
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