CN102608180B - 检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法。该传感器为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有模板DNA，模板DNA的序列为：5’-CCTACGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAAAAAAAAAAA-C₆-SH-3’。本发明利用银离子与胞嘧啶亲和力强的特点，又结合了电化学检测灵敏、方便的优势，巧妙地检测了银离子，线性范围在10pM～100nM之间，检出限约为3.3pM。

Description

检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是一种检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法。

技术背景

银作为一种非常重要的过渡金属，广泛用于各种领域，例如化妆品、珠宝、货币，用作催化剂以及导体等。银离子对于某些细菌、病毒、藻类有着一定的毒害作用，其原理是银离子可以抑制含有游离巯基蛋白酶的活性，从而抑制其生物学功能。作为人体组成的微量元素，少量的银离子对人无害，但是随着银在工业中的广泛使用，银离子废液的排放对于水源以及土壤的污染日益严重，越来越多的银离子富集于人体内，对人体造成危害。WHO规定银离子对人体的安全值为0.05 ppm以下，饮用水中的安全值为0.05 mg/L，由此可见，对于银离子的准确检测是非常必要的。现今检测银离子的技术主要包括电感耦合等离子体技术、原子吸收光谱法以及溶出伏安法，前两者对于仪器设备以及操作者具有很高的要求，后者在检测时常常需要汞离子的参与从而产生新的污染，因此，发明一种简单、安全的银离子检测方法显得非常迫切。

电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器，主要由生物分子识别和信息转换部件两部分组合构成。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极（也称对电极）和参比电极，其中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学方法作为一类分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。其中，计时电量法因其灵敏度很高，常被用作定量检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测银离子的生物电化学传感器。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：金属参与的DNA碱基配对由于能够改变DNA的构象吸引了人们越来越多的关注。研究发现，银离子倾向与胞嘧啶错配的DNA结合，形成胞嘧啶-银离子-胞嘧啶结构，从而大大地增加错配DNA的稳定性。本发明设计一段3’末端含有巯基的模板DNA链，上面包含两段相似并与引物DNA不完全互补的重复序列以及一个核酸内切酶BasBI的酶切位点，该模板DNA链可以通过3’末端的巯基固定到金电极上；另外设计一条游离的引物DNA链，与模板DNA链仅有一个胞嘧啶错配不完全互补。当体系中含有银离子时，两条DNA链会形成胞嘧啶-银离子-胞嘧啶核酸金属复合物，此时模板DNA链与引物DNA链形成稳定的双链结构，被Bst核酸聚合酶所识别，从而开始复制，即以模板DNA链为模板，利用体系中的dNTP，将引物DNA链从5’端向3’端不断延伸加长。当引物DNA延伸完全后，Bst核酸聚合酶从双链上脱落，暴露出来的酶切位点被核酸内切酶BsaBI所识别，切割双链DNA的两条链，结果，双链DNA被切为两个部分，形成两个新的引物DNA。新的引物DNA在银离子的作用下，与模板DNA结合，重新开始新一轮反应，直至将模板DNA切割完毕。整个反应过程可以用电化学信号分子六氨合钌[Ru(NH₃)₆]³⁺来表征，[Ru(NH₃)₆]³⁺由于静电作用会吸附在DNA的磷酸骨架上，因此，[Ru(NH₃)₆]³⁺电化学信号的高低即可定量反应固定于金电极表面的DNA的多少，从而反应银离子浓度的高低。具体来说，最初，模板DNA固定在金电极表面，此时模板DNA是完整的，大量的[Ru(NH₃)₆]³⁺吸附在模板DNA上，从而产生很高的电化学信号；当有银离子存在，体系中发生了上述延伸和切割的循环反应，模板DNA被切割缩短，[Ru(NH₃)₆]³⁺所产生的电化学信号也相应变小，通过电化学信号改变的多少，我们可以计算出银离子的多少。 

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测银离子的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有模板DNA，对该修饰有模板DNA的金电极进行酶切处理，所用的反应缓冲溶液内含有100 nM 引物DNA，0.5 U/μL BsaBI核酸内切酶，0.05 U/μL Bst核酸聚合酶，50 μM dNTPs, 1 × NE缓冲4 ；所述的1 × NE缓冲4为：50 mM KAc, 20 mMpH 7.9的Tris-HAc, 10 mM Mg(Ac)₂，所述的引物DNA序列为：5’-CAGTCCTAGG-3’；以酶切处理过的金电极进行电化学测量，所用的电化学检测缓冲液为含50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺的10 mM Tris-HCl，pH=7.4的检测缓冲液；所述的模板DNA的序列为：5’-CCTA CGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAAAAAAAAAAA-C₆-SH -3’，该模板DNA在金电极上的修饰密度为：1.2×10¹²个分子/平方厘米～1.2×10¹³个分子/平方厘米。该序列是针对银离子与碱基的作用设计而成。设计原理根据银离子容易与胞嘧啶结合，使得具有一个胞嘧啶错配的两条游离DNA单链在有银离子存在的情况下可以形成稳定双链结构。此时稳定的双链可以被DNA核酸聚合酶识别，引起双链扩展延伸，之后被核酸内切酶识别切割，形成两条DNA片段。一条DNA片段为引物DNA，而另一条是新产生的能够和模板DNA互补配对的DNA片段，从而进行新一轮的切割，造成电化学信号的降低。设计好的DNA的序列可以直接交给核酸合成的公司。模板DNA在金电极上的修饰密度在1.2×10¹²个分子/平方厘米～1.2×10¹³个分子/平方厘米之间。 

一种制备上述的检测银离子的生物传感器的方法，其特征在于制备该传感器的工作电极的具体步骤为：

a.         将处理过的金电极置于0.5 M H₂SO₄中，在0～1.55 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定；

b.         用氮气吹干步骤a所得金电极后，将该金电极浸没在含有浓度为1 μM的模板DNA链、10 mM 的Tris-HCl、10 mM的 TCEP以及0.1 M的 NaCl，溶液的pH 为7.4的缓冲溶液中，倒置15～18小时后，再浸没在1 mM 巯基己醇水溶液中反应0.5～1.5小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到模板DNA链修饰的金电极。

上述的金电极的处理方法的具体步骤为：在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液，即浓硫酸：过氧化氢的体积比为3：1，反应2 min，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；将金电极在5000目砂纸上打磨5 min之后，在含有粒度分别为1 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝的砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声5 min，除去杂质。

一种检测银离子的方法，采用上述的检测银离子的生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将生物传感器中的工作电极金电极浸没在反应缓冲溶液和待测溶液按9：1的体积比形成的混合液中；所述的反应缓冲溶液内含有100 nM 引物DNA，0.5 U/μL BsaBI核酸内切酶，0.05 U/μL Bst核酸聚合酶，50 μM dNTPs, 1 × NE缓冲4 ；所述的为：50 mM KAc, 20 mMpH 7.9的Tris-HAc, 10 mM Mg(Ac)₂，在55～65度反应5～10分钟，用超纯水冲洗，用氮气吹干，得到酶切处理过的金电极；所述的引物DNA序列为：5’-CAGTCCTAGG-3’；

b. 在惰性气氛下，将步骤a所得的金电极放入电化学检测缓冲液中，所述的电化学检测缓冲液为含50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺的10 mM Tris-HCl，pH=7.4的检测缓冲液，采用循环伏安法或计时电量法进行电化学扫描，反应缓冲为添加50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺的10 mM pH 7.4 Tris-HCl；采用循环伏安法时的扫描速率为50 mV/s，扫描范围为-0.45 V～0.05 V；采用计时电量法时的脉冲周期为250 ms，初始电位0.2 V，终止电位-0.5 V。

本发明构建了一种检测银离子的生物电化学传感器，利用银离子与胞嘧啶亲和力强的特点，将银离子引发的核酸聚合酶活化反应与电化学检测灵敏、方便的优势联合运用在一起，通过指数型降解模板DNA，对银离子进行了非常灵敏的检测。对于其他一些与碱基有较强结合力并能稳定双链DNA结构的金属，例如汞离子，理论上也可以通过这种方法进行检测，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺溶液中，模板DNA修饰的金电极及其在无银离子存在条件下和有银离子存在条件下经过聚合酶反应和酶切反应处理后的循环伏安图。

图2为在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺溶液中，模板DNA修饰的金电极检测不同浓度银离子(从a到k分别为0 M、50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM以及1 μM)的计时电量曲线。

图3为不同银离子浓度(0 M、50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM以及1 μM)与电量差值的关系曲线。其中插入图为银离子浓度在10 pM到100 nM范围内的对数值与电量差值之间的关系曲线。

图4为分别存在1 μM银离子及1 μM其他金属离子的情况下，经过聚合酶反应和酶切反应处理后，在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺溶液中，模板DNA修饰的金电极经计时电量法检测得到的表面电量图。

具体实施方式

实施例一：模板DNA修饰的金电极制备

在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液(浓硫酸：过氧化氢=3：1)反应2 min，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。将金电极在5000目砂纸上打磨5 min之后，分别在含有氧化铝（粒度分别为1 μm，0.3 μm，0.05 μm）砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声5 min，除去杂质。将处理好的金电极放置在0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描。设置扫描电压范围0～1.55 V，扫描速度100 mV/s，设定20圈扫至循环伏安曲线稳定，用氮气吹干，得到表面处理干净的裸金电极，可用于巯基DNA的修饰。将该金电极浸泡在1 μM模板DNA溶液(10 mM Tris-HCl，10 mM TCEP，以及0.1 M NaCl (pH 7.4))倒置过夜16小时，再浸泡在1 mM巯基己醇溶液中反应1小时，用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到模板DNA修饰的金电极。

实施例二：检测银离子的流程

将模板DNA修饰的金电极放入含有100 nM 引物DNA，0.5 U/μL BsaBI核酸内切酶，0.05 U/μL Bst核酸聚合酶，50 μM dNTPs, 1 × NE 缓冲4 (50 mM KAc, 20 mM Tris-HAc (pH 7.9), 10 mM Mg(Ac)₂)的待测银离子反应液中60度反应7分钟，之后用超纯水冲洗，用氮气吹干，得到酶切处理过的金电极，放入电化学检测缓冲液中，进行电化学扫描。相关核酸序列如下：

模板DNA的序列为：5’-CCTACGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAA A AA AAAAAA-C₆-SH -3’

引物DNA序列为：5’-CAGTCCTAGG-3’

电化学检测相关参数以及缓冲液：在循环伏安及计时电量实验中，反应溶液为含50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺的10 mM Tris-HCl (pH 7.4)，其中循环伏安扫描速率为50 mV/s，扫描范围为-0.45 V～0.05 V。对于计时电量实验，脉冲周期为250 ms，初始电位0.2 V，终止电位-0.5 V。所有上述实验都先在缓冲液中通氮气15 min，除去溶液中的氧气后进行检测。

如图1所示，当溶液中没有银离子存在的情况下，加入引物DNA经过酶处理后所得的循环伏安曲线与模板DNA本身的结果相差不大，说明没有银离子的时候，由于双链DNA并不稳定，引物DNA没有与模板DNA杂交，核酸聚合酶以及核酸内切酶对模板DNA没有作用，因此电化学信号分子[Ru(NH₃)₆]³⁺仍然大量地静电吸附在核酸磷酸骨架上，电化学信号没有明显变化。然而，当体系中含有1 μM银离子时，银离子与胞嘧啶形成胞嘧啶-银离子-胞嘧啶的金属碱基复合物，大大增大了模板DNA与引物DNA杂交产生双链DNA的稳定性，于是核酸聚合酶与核酸内切酶发挥生物学功能，模板DNA不断被切割，在电极表面的模板DNA变得越来越短，此时结合到核酸骨架上的[Ru(NH₃)₆]³⁺也相应变少，得到的电化学信号也明显变小。

实施例三：不同浓度银离子的检测

将修饰了模板DNA的金电极浸泡在不同浓度银离子(0 M、50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM以及1 μM)反应液中，经过双酶反应后，放入检测缓冲液中采用计时电量法进行电化学检测。

如图2所示，随着银离子浓度的增大，计时电量法所得到的电化学信号逐渐变小，这是因为银离子越多，在相同时间内被切割的模板DNA也就越多，所以电化学信号越小。

将银离子浓度与计时电量的变化（减小）值作图即得图3。另外，图3的插入图显示，当银离子浓度在10 pM～100 nM之间变化时，银离子浓度的对数值与计时电量的差值呈现良好的线性关系，可以作为银离子定量检测的依据。银离子的最低检出限约为3.3 pM（信噪比为3）。

实施例四：生物电化学传感器特异性研究

为了验证本生物电化学传感器的特异性，我们用其他金属(Na⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Cr⁶⁺)作为对照，按照上述实验方法，将模板DNA修饰的金电极浸泡在同等浓度不同金属的检测液中进行双酶反应7 min，再放入电化学检测液中用计时电量法检测。如图4所示，当溶液中含有1 μM银离子时，所得的电化学信号最小，约为1.72 μC，而含其他金属时电化学信号都较大，与不含银离子时相近，说明本生物电化学传感器对于银离子具有很高的选择性和特异性。

以上结果表明，本生物传感器对于银离子具有很好的选择性和特异性，实验操作方便，检测结果灵敏。同样的原理可以推广到其他与碱基具有较强结合的金属检测中，应用前景广泛。 

序列表

<110>  上海大学

<120>  检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法

<160>  2

<210>  1

<211>  42

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

CCTAC GACTG GATGA CGATC CCTAC GACTG AAA A A  A AAA A  AA-C₆-SH     42 。 

<210>  2

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

CAGTC CTAGG                                                         10

Claims (3)

1.一种检测银离子的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有模板DNA，对该修饰有模板DNA的金电极进行酶切处理所用的反应缓冲溶液内含有100 nM 引物DNA，0.5 U/μL BsaBI核酸内切酶，0.05 U/μL Bst核酸聚合酶，50 μM dNTPs, 1 × NE缓冲4 ；所述的1 × NE缓冲4由50 mM KAc, 20 mM pH 7.9的Tris-HAc,和10 mM Mg(Ac)₂组成；所述的引物DNA序列为：5’-CAGTCCTAGG-3’；以酶切处理过的金电极进行电化学测量所用的电化学检测缓冲液为含50 μM [Ru(NH₃)₆]³⁺的10 mM Tris-HCl，pH=7.4的检测缓冲液；所述的模板DNA的序列为：5’-CCTA CGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAAAAAAAAAAA-C₆-SH -3’，该模板DNA在金电极上的修饰密度为：1.2×10¹²个分子/平方厘米～1.2×10¹³个分子/平方厘米。

2.一种制备根据权利要求1所述的检测银离子的生物电化学传感器的方法，其特征在于制备该传感器的工作电极的具体步骤为：

a．将处理过的金电极置于0.5 M H₂SO₄中，在0～1.55 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定；所述的金电极的处理方法的具体步骤为：在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液，即浓硫酸：过氧化氢的体积比为3：1，反应2 min，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；将金电极在5000目砂纸上打磨5 min之后，在含有粒度分别为1 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝的砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声5 min，除去杂质；

b. 用氮气吹干步骤a所得金电极后，将该金电极浸没在含有浓度为1 μM的模板DNA、10 mM 的Tris-HCl、10 mM的 TCEP以及0.1 M的 NaCl，溶液的pH 为7.4的缓冲溶液中，倒置15～18小时后，再浸没在1 mM 巯基己醇水溶液中反应0.5～1.5小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到模板DNA修饰的金电极。

3.一种检测银离子的方法，采用根据权利要求1所述的检测银离子的生物电化学传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：

a．将生物传感器中的工作电极金电极浸没在所述反应缓冲溶液和待测溶液按9：1的体积比形成的混合液中；在55～65度反应5～10分钟，用超纯水冲洗，用氮气吹干，得到酶切处理过的金电极； 

b．在惰性气氛下，将步骤a所得的金电极放入所述电化学检测缓冲液中，采用循环伏安法或计时电量法进行电化学扫描，采用循环伏安法时的扫描速率为50 mV/s，扫描范围为-0.45 V～0.05 V；采用计时电量法时的脉冲周期为250 ms，初始电位0.2 V，终止电位-0.5 V。