CN102262117A - 检测核因子-kappaB的生物电化学传感器、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测核因子-kappaB（NF-κB）的新型生物电化学传感器、其制备方法及其应用。该新型生物电化学传感器为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有DNA链。该传感器能成功识别最低浓度为0.1nM的NF-κB，线性检测范围是0.1nM~10nM。本发明的新型生物电化学传感器基于NF-κB与目标DNA的特异性结合，综合运用了NickingEnzyme（NEase）和金纳米颗粒的双重信号放大特性，以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使NF-κB的检测简便可行，同样的原理还可推广到其它生物分子的检测，应用前景广泛。

Description

检测核因子-kappaB的生物电化学传感器、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型生物电化学传感器、其制备方法及其应用，特别是一种检测核因子-kappaB（NF-κB）的新型生物电化学传感器、其制备方法及其应用。

发明背景

核因子-κB（Nuclear Factor-kappa B, NF-κB）是高等动物体内一个重要而保守的具有多向转录调节作用的蛋白质。1986年，Baltimore等人首次发现小鼠B淋巴细胞内含有一种能够与免疫球蛋白κ轻链基因增强子B位点进行特异性结合的核蛋白，因此将其命名为核因子-κB。NF-κB在高等动物体内分布广泛，并参与了细胞因子、趋化因子、黏附分子、生长因子、免疫受体、氧化应激酶相关酶系、转录因子等多种蛋白的表达调控，控制着许多重要的生理病理反应过程。它能够与多种细胞基因的启动子和增强子序列位点发生特异性结合，并促进其转录和表达，从而参与很多免疫和炎症反应相关的基因转录的调控。它的异常激活或完全抑制与多种疾病的产生有关，并在控制细胞凋亡、肿瘤发生及发展、耐药性方面均起着极其重要的作用。NF-κB已成为炎症和癌症等疾病治疗中的一个重要靶点，因此，检测NF-κB对于治疗这些疾病具有重要意义。

生物电化学传感器主要由生物分子识别和信息转换部件两部分组合构成。其设计原理是待测物通过生物分子识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测量的电信息，再经过放大信号处理，进行信号输出。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极（也称对电极）和参比电极，电流流经工作电极和对电极。电化学方法作为一种分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。

生物传感器近几十年来得到迅速的发展，其优势也非常明显，但在其研制过程中有诸多难点需要解决，比如生物分子的固定化，好的传感器要求表面牢固固定的生物分子达到一定数量并保持良好的生物活性，而且具有稳定性和耐用性；再加对于灵敏度和选择性的要求，尽管生物传感器中所用生物分子本身具有良好的选择性，但由于检测体系的复杂性，不可避免地会产生干扰。纳米材料为发展新型高灵敏、高稳定性、低成本的生物传感器提供了新的途径。纳米材料，包括新型的纳米生物材料和纳米复合材料由于其特殊的结构层次，具有很强的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性，可以固定更多的生物分子，长久保持其生物活性，因此可以提高传感器中活性生物分子的固载量，从而提高传感器的灵敏度。

最常见的定性和定量分析NF-κB的技术是凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）。它是一种经典的研究DNA结合蛋白与其靶DNA相互作用的技术，但是这种方法相对耗时，并且需要用到同位素或是荧光分子标记的DNA探针，这样的修饰技术不仅对实验者有一定的危害，实验成本也增加很多，另外实验仪器也相对昂贵。其他分析技术还包括了报告基因检测技术、酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）以及荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。近年来，如电化学传感器技术日渐成熟，有望成为研究DNA结合蛋白与其靶DNA相互作用的新的快速检测方法。本发明主要利用了Nicking Enzyme酶切反应可以产生类似于PCR反应的扩增效应以及金纳米颗粒比表面积大，可以负载更多的DNA的特性来构建的生物电化学传感器。关于研究DNA结合蛋白与其靶DNA相互作用的电化学生物传感器的文章已有很多，但是，针对NF-κB的DNA生物传感器还未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测NF-κB的生物电化学传感器，该传感器通过对DNA的直接检测，实现对于NF-κB浓度的间接检测。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

本发明的目的之三在于提供该传感器在检测NF-κB中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：设计一条Target DNA单链，上面包含NF-κB的结合位点，同时还有Nicking Enzyme（NEase）的酶切位点，并且酶切位点位于NF-κB识别序列中。另有一条与Target DNA单链完全互补的Complementary DNA单链，两者杂交形成双链，NEase只切割双链DNA中的一条单链，在本发明中只切割Target DNA单链，留下未被切割的Complementary DNA单链。NEase的酶切作用可产生类似于PCR反应的扩增效应：当样品中不存在NF-κB的时候，NEase通过识别双链酶切位点，将样品体系中的Target DNA单链全部酶切；当样品中存在NF-κB的时候，NF-κB与DNA双链的结合位点结合，由于NF-κB的结合位点与NEase的酶切位点重合，因此阻碍了NEase的酶切位点，抑制了NEase的酶切作用，NEase不能切断检测体系中的Target DNA，样品体系中会剩余大量的Target DNA。在后续的电化学检测体系中，我们又设计了两段DNA，分别与Target DNA的5’端和3’端互补，其中Capture DNA与Target DNA的3’端互补，并且通过巯基修饰固定到金电极上，而Report DNA则与Target DNA的5’端互补，并且通过巯基连到金纳米颗粒上用于放大信号,这样就组成了一个三明治式的信号放大体系。当样品中不存在NF-κB的时候，NEase可以将样品体系中的Target DNA全部酶切，没有Target DNA连接到金电极上固定的Capture DNA，金纳米颗粒修饰的Report DNA也不能连接到金电极表面，因此金电极表面的DNA量少，检测得到的电信号较小；当样品中大量存在NF-κB的时候，NF-κB与双链DNA链结合，抑制了NEase的酶切作用，样品体系中会剩余大量的Target DNA，这些Target DNA通过与金电极上的Capture DNA杂交，再通过杂交金纳米颗粒修饰的Report DNA，使得电极表面固定了大量的DNA，待测液中的电活性探针分子氯化六氨合钌（RuHex，[Ru(NH₃)₆]³⁺）与这些DNA结合，通过计时电量法测得的电量很大，因此检测到的电信号较大，从而反映出电极上Report DNA的数量，间接测得NF-κB的浓度。

    根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测核因子-kappaB的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有Capture DNA链，该Capture DNA链的序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTGGGAAAG-3’。

一种制备上述的检测核因子-kappaB的生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将处理过的金电极置于1 M H₂SO₄中，在0-1.5 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，至达到稳定；

b.在氮气中吹干步骤a所得金电极后，将该金电极置于含有固定缓冲溶液中，该固定缓冲溶液含有浓度为0.2 μM的Capture DNA链, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM TCEP, and 0.1 M NaCl (pH 7.4)，倒置16小时，再浸入1 mM MCH水溶液中2小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到Capture DNA链修饰的金电极；

c.将步骤b所得金电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器。

一种检测核因子-kappaB的方法，采用上述的生物电化学传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将1 μL，2 μM的Target DNA和1 μL 0.2 μM Complementary 的TE缓冲液；混合后，于37 ℃杂交30 min，再加入1 μL待检测溶液，再向体系中加入1 μL NEase(2U)和1 μL NEase buffer(10×)，58 ℃保温反应30 min，得到待检测样品溶液；所述的Target DNA链的序列为：5’-AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3’；所述的Complementary DNA链的序列为：5’-TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3’；所述的TE缓冲液为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH-8.0；

b. 将步骤a所得待检测的10 μL样品溶液用杂交缓冲液稀释至50 μL，所述的杂交缓冲液为：0.25 M NaCl，pH 7.4的10 mM PBS；

c.将传感器中的工作电极浸入到待检测样品的溶液中，37 ℃保温1 h，然后用超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质，再将电极浸入到连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒的溶液中，37 ℃保温1 h；再用超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质；所述的Report DNA的序列为：5’ -TCCCG ATCCTT-(CH₂)₆-SH-3’；

d.将步骤c所得工作电极浸入检测缓冲液中，进行电化学扫描，电化学检测相关参数以及缓冲溶液：使用含有50 μM RuHex的10 mM Tris–HCl (pH 7.4)作为检测缓冲液，循环伏安法和计时电量法进行电化学扫描；参数设置：循环伏安法，扫描速率为100 mV/s，扫描电压为-0.45 V～0.05 V；计时电量法，脉冲宽度为250 ms，扫描电压为-0.45 V～0.05 V。

上述的连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒的制备方法为：

a.将9 μL 1 mM的3’端巯基修饰的Report DNA与1.5 μL 10 mM的TCEP溶液和1 μL ，pH 5.2的500 mM醋酸-醋酸钠溶液混合1 h，然后将3 mL 14 nM 的金纳米颗粒溶液和巯基活化的DNA分子混合，金纳米颗粒与Report DNA的摩尔比在1：80至1：200之间，在室温下背光处放置16 h以上；逐滴加入30 μL 500 mM Tris-HAc（pH 8.2）后摇匀，再逐滴加入300 μL 1 M NaCl，完成DNA在金纳米颗粒上的自组装，放置24 h以上；

b用300 μL 100 mM NaCl， 25 mM Tris acetate，pH 8.2的缓冲液洗步骤a所得金纳米颗粒，除去未修饰到金纳米颗粒表面的DNA，最终的沉淀溶解于300 μL 300 mM NaCl， 25 mM Tris acetate，pH 8.2的缓冲液中，得到连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒；所述Report DNA链为: 5’ -TCCCG ATCCTT-(CH₂)₆-SH-3’。

本发明构建了一种检测NF-κB的新型生物电化学传感器，将金纳米颗粒应用于DNA的电化学检测来放大信号，另外NEase本身还具有类PCR扩增效应，双重放大的信号使得NF-κB的检测取得了满意的结果。该发明所检测的NF-κB的Tatget DNA是一段NF-κB和NEase识别位点有一定重合的核酸序列，理论上，可以将NF-κB的识别序列改成其他特定蛋白质的识别序列，用于检测其他疾病相关的蛋白质，应用前景广泛。

本发明的生物电化学传感器检测体系结合了NF-κB识别DNA结合序列的特异性、金纳米颗粒修饰DNA放大信号以及电化学检测方法高灵敏度的特点，给NF-κB的快速定量检测带来极大的方便。

附图说明

图1为在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM RuHex溶液中，金电极检测（a）未浸泡待测液时循环伏安曲线，（b）100 nM ERα和（c）10 nM NF-κB的循环伏安曲线。

图2为在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM RuHex溶液中，金电极检测NF-κB，待测液中是（a）未经金纳米颗粒修饰的Report DNA和（b）经金纳米颗粒修饰的Report DNA的循环伏安曲线。

图3为在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μM RuHex溶液中，金电极检测不同浓度的NF-κB (曲线从a到h，NF-κB浓度依次为0, 0.1, 1, 2, 5, 7.5, 10, 15 nM)的计时电量曲线。

图4为检测不同浓度的NF-κB(浓度依次为0, 0.1, 1, 2, 5, 7.5, 10, 15 nM)得到的NF-κB浓度与电量增加值的关系曲线，其中插入图是NF-κB浓度为0.1 nM ~ 10 nM的范围内，NF-κB的浓度和电量的增加值关系曲线。

具体实施方式

实施例一：金电极的修饰

金电极首先在5000目的金相砂纸上打磨，再用粒径由大到小1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝粉末的悬浊液抛光，使金电极表面成光滑镜面，取出分别在无水乙醇和超纯水中超声5min，然后将金电极放入0.5 M的H₂SO₄中进行循环伏安扫描（0 - 1.5 V电压范围），扫速设置为100 mV/s，约20圈达到稳定。然后在氮气中吹干电极，得到表面清洁的裸金电极，可用于下一步的DNA修饰。将金电极浸入含有2 μM Capture DNA的溶液（其中包含10 mM Tris-HCl、 1 mM EDTA、0.1 M NaCl和10 mM TCEP，pH 7.4）中16个小时， 然后再将其浸入含有1 mM的巯基己醇的溶液中2个小时，然后用足量的超纯水冲洗电极，除去物理吸附在电极表面的物质。将修饰好的电极用氮气吹干，即得到Capture DNA共价修饰的金电极。

实施例二：金纳米颗粒的制备以及Report DNA的修饰

    制备金纳米颗粒所用到的玻璃仪器均用王水（盐酸：硝酸＝3：1（v/v））浸泡30分钟，大量自来水冲洗后，再用双蒸水洗净并烘干。直径为13 nm的金纳米颗粒的制备采用柠檬酸钠还原法（参考文献：Grabar, K. C.; Freeman, R. G.; Hommer, M. B.; Natan, M. J. Anal. Chem. 1995, 67, 735-743.）。此法是在加热煮沸条件下以柠檬酸钠作为还原剂和稳定剂将氯金酸还原生成金纳米颗粒。具体方法是，将容积为250 ml的圆底烧瓶装上冷凝管，加入100 ml浓度为0.01 %的HAuCl₄，加热至沸腾，在剧烈搅拌溶液的同时迅速加入3.5 ml浓度为1 %的柠檬酸钠，继续搅拌，保持溶液沸腾15分钟，至溶液的颜色变为酒红色，停止加热，继续搅拌10分钟，然后停止搅拌，室温下避光放置过夜，用0.22 μm的滤纸过滤，再置于4 ^oC保存。所得的金纳米颗粒浓度约为3.5 nM，直径约为13 nm，修饰前通过离心浓缩为14 nM浓度。

在用Report DNA对金纳米颗粒进行修饰时，先将9 μL 1 mM的3’端巯基修饰的DNA与1.5 μL 10 mM的TCEP溶液和1 μL 500 mM醋酸-醋酸钠溶液（pH 5.2）混合，活化巯基1 h，然后将3 mL 14 nM 的金纳米颗粒溶液和巯基活化的DNA分子混合，在室温下暗处放置16 h以上。逐滴加入30 ul 500 mM Tris-HAc（pH 8.2）后摇匀，再逐滴加入300 μL 1 M NaCl，完成DNA在金纳米颗粒上的自组装，放置24 h以上。用100 mM NaCl， 25 mM Tris acetate， pH 8.2的缓冲液洗金纳米颗粒两遍，除去未修饰到金纳米颗粒表面的DNA，最终的沉淀溶解于300 mM NaCl， 25 mM Tris acetate， pH 8.2的缓冲液中，制备好的DNA修饰的金纳米颗粒放在4 ℃冰箱中保存备用。

实施例三：待检测样品的制备

将包含NF-κB 结合位点的Target DNA (1 μL, 2 μM) 和与之互补的Complementary DNA（1 μL, 0.2 μM）均匀混合在Eppendorf管里，37 ℃杂交30 min。再向样品体系中加入不同浓度的NF-κB (1 μL)，在37 ℃保温30 min。最后加入NEase(1 μL, 2 U)，反应样品终体积为10 μL，在58 ℃保温30 min。   

实施例四：检测NF-κB的流程

将待检测的10 μL样品用杂交缓冲液（0.25 M NaCl，10 mM PBS，pH 7.4）稀释至50 μL，将Capture DNA修饰过的金电极浸入到装有50 μL的样品溶液中，37 ℃保温1 h，然后用足量的超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质，再将电极浸入到连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒的50 μL溶液中，37 ℃保温1 h。再用足量的超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质。将电极浸入检测缓冲液中，进行电化学扫描。相关核酸序列如下：

Target DNA: 5’-AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3’；

Report DNA: 5’ -TCCCG ATCCTT-(CH₂)₆-SH-3’ ；

Capture DNA: 5’-SH-(CH₂)₆-TTGGGAAAG-3’；

Complementary DNA: 5’-TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3’。

电化学检测相关参数以及缓冲溶液：使用含有50 μM RuHex的10 mM Tris–HCl (pH 7.4)作为检测缓冲液，循环伏安法和计时电量法进行电化学扫描。参数设置：循环伏安法，扫描速率为100 mV/s，扫描电压为-0.45 V～0.05 V；计时电量法，脉冲宽度为250 ms，扫描电压为-0.45 V～0.05 V。

实施例五：生物电化学传感器选择性的研究

选用另外一种不能与目标双链DNA特异结合的蛋白质ERα作为对照，采用循环伏安法，对于所设计的电化学传感器的选择性进行研究。按上述检测流程，用Capture DNA修饰好的金电极分别浸入含有NF-κB和ERα的待测液中一段时间，再经处理后，在CHI660c电化学工作站上分别测定它们在含50 μM RuHex的10 mM Tris–HCl (pH 7.4)缓冲液中的循环伏安曲线。实验结果参见图1，b为100 nM ERα，c为10 nM NF-κB，c的电信号远大于b，因为NF-κB可以特异结合目标双链DNA，抑制酶切反应，检测体系中剩余大量的Target DNA，得到的电信号较大；而ERα由于不能特异结合目标双链DNA，因此对酶切反应的抑制作用很小，检测体系中大量的Target DNA都被NEase切断，得到的电信号较小。由此可知此传感器对于NF-κB确实具有良好的选择性。

实施例六：生物电化学传感器放大信号的研究

    将未经金纳米颗粒修饰的Report DNA和修饰到金纳米颗粒上的Report DNA作比较，采用循环伏安法，对于所设计的电化学传感器的信号放大效果进行研究。同样检测50 μL含NF-κB的样品，将Capture DNA修饰好的金电极，浸入样品一段时间后，再分别浸入未经金纳米颗粒修饰的Report DNA和修饰到金纳米颗粒上的Report DNA，进行电化学循环伏安法扫描。实验结果参见图2，a为未经金纳米颗粒修饰的Report DNA，b为修饰到金纳米颗粒上的Report DNA，b的电信号远大于a，说明金纳米颗粒确实放大了产生的电信号。

实施例七：检测不同浓度的NF-κB

检测NF-κB的流程依前所述，而当检测完一个浓度的NF-κB样品溶液后，将金电极浸在80℃的热水中10min，通过热变性能够去除金电极表面杂交的Target DNA。不同NF-κB浓度的样品溶液可以按照这个步骤依次检测。电化学检测相关参数以及缓冲溶液：使用含有50 μM RuHex的10 mM Tris–HCl (pH 7.4)作为检测缓冲液，计时电量法进行电化学扫描。

实验结果参见图3和图4。在图3中，随着NF-κB浓度由a（0 nM）增加到h（15 nM），计时电量法得到的电信号也随之增加。图4是以NF-κB的浓度为横坐标，以计时电量法测得的电量相对于NF-κB的浓度为零时的电量增加值为纵坐标作图，从图4的插图中可以观察到，NF-κB的浓度在0.1 nM ~ 10 nM范围内，电量增加值与其浓度呈良好的线性关系，由此可以用于NF-κB的定量检测。

本发明中，检测NF-κB的生物电化学传感器能成功识别最低浓度为0.1 nM的NF-κB，线性检测范围是0.1 nM ~ 10 nM。

Claims (4)

1.一种检测核因子-kappaB的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有Capture DNA链，该Capture DNA链的序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTGGGAAAG-3’。

2.一种制备根据权利要求1所述的检测核因子-kappaB的生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将处理过的金电极置于1 M H₂SO₄中，在0-1.5 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，至达到稳定；

b.在氮气中吹干步骤a所得金电极后，将该金电极置于含有固定缓冲溶液中，该固定缓冲溶液含有浓度为0.2 μM的Capture DNA链, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM TCEP, and 0.1 M NaCl (pH 7.4)，倒置16小时，再浸入1 mM MCH水溶液中2小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到Capture DNA链修饰的金电极；

c.将步骤b所得金电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器。

3.一种检测核因子-kappaB的方法，采用根据权利要求1所述的生物电化学传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将1 μL，2 μM的Target DNA和1 μL 0.2 μM Complementary 的TE缓冲液；混合后，于37 ℃杂交30 min，再加入1 μL待检测溶液，再向体系中加入1 μL NEase(2U)和1 μL NEase buffer(10×)，58 ℃保温反应30 min，得到待检测样品溶液；所述的Target DNA链的序列为：5’-AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3’；所述的Complementary DNA链的序列为：5’-TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3’；所述的TE缓冲液为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH-8.0；

b. 将步骤a所得待检测的10 μL样品溶液用杂交缓冲液稀释至50 μL，所述的杂交缓冲液为：0.25 M NaCl，pH 7.4的10 mM PBS；

c.将传感器中的工作电极浸入到待检测样品的溶液中，37 ℃保温1 h，然后用超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质，再将电极浸入到连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒的溶液中，37 ℃保温1 h；再用超纯水冲洗金电极，除去物理吸附在电极表面的物质；所述的Report DNA的序列为：5’ -TCCCG ATCCTT-(CH₂)₆-SH-3’；

d.将步骤c所得工作电极浸入检测缓冲液中，进行电化学扫描，电化学检测相关参数以及缓冲溶液：使用含有50 μM RuHex的10 mM Tris–HCl (pH 7.4)作为检测缓冲液，循环伏安法和计时电量法进行电化学扫描；参数设置：循环伏安法，扫描速率为100 mV/s，扫描电压为-0.45 V～0.05 V；计时电量法，脉冲宽度为250 ms，扫描电压为-0.45 V～0.05 V。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒的制备方法为：

a.将9 μL 1 mM的3’端巯基修饰的Report DNA与1.5 μL 10 mM的TCEP溶液和1 μL ，pH 5.2的500 mM醋酸-醋酸钠溶液混合1 h，然后将3 mL 14 nM 的金纳米颗粒溶液和巯基活化的DNA分子混合，金纳米颗粒与Report DNA的摩尔比在1：80至1：200之间，在室温下背光处放置16 h以上；逐滴加入30 μL 500 mM Tris-HAc（pH 8.2）后摇匀，再逐滴加入300 μL 1 M NaCl，完成DNA在金纳米颗粒上的自组装，放置24 h以上；

b用300 μL 100 mM NaCl， 25 mM Tris acetate，pH 8.2的缓冲液洗步骤a所得金纳米颗粒，除去未修饰到金纳米颗粒表面的DNA，最终的沉淀溶解于300 μL 300 mM NaCl， 25 mM Tris acetate，pH 8.2的缓冲液中，得到连接巯基修饰的Report DNA的金纳米颗粒；所述Report DNA链为: 5’ -TCCCG ATCCTT-(CH₂)₆-SH-3’。

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