CN105241945B

CN105241945B - 一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用

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Publication number: CN105241945B
Application number: CN201510642797.XA
Authority: CN
Inventors: 云雯; 桑革; 蔡定洲; 廖俊生; 姜交来; 卢铁城; 王欢; 张光辉; 胡梅娟
Original assignee: Institute of Materials of CAEP
Current assignee: Institute of Materials of CAEP
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105241945A

Abstract

本发明公开了一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用，目的在于解决现有方法检测铀酰离子存在分析成本高、设备造价昂贵、仪器笨重等缺陷的问题。本发明属于铀酰离子检测领域，该传感器包括金电极、设置在金电极上的敏感层。本发明首次提出了利用DNA酶和目标催化发卡组装放大策略来探测铀酰离子的方法，其基于UO₂ ²⁺‑特异性DNA酶和目标催化发卡组装技术来实现UO₂ ²⁺的超灵敏探测。本发明通过结合目标催化发卡组装的放大技术，UO₂ ²⁺选择性得到了极大改善。经过优化后，该传感器探测限值为2 pM，远远低于其他方法的探测限值。本发明提供了一种简单、方便、在线和实时探测铀的超灵敏的传感器及检测铀酰离子的方法，对于铀酰离子的检测，具有重要的意义。

Description

一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及电化学传感器领域，尤其铀酰离子检测领域，具体为一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用。

背景技术

铀是重要的天然放射性元素、核燃料，铀经浓缩后，广泛应用于核电和武器领域。铀具有高毒性和放射性的特点，在过去半年里引起了很大关注。

铀的大规模应用使得人类有很大机会暴露在铀环境中，给自身带来了长期的健康危害(参考文献：Zoriy,P.,Ostapczuk,P.,Dederichs,H.,J.,Lennartz,R.,&Zoriy,M.(2010).Journal of environmental radioactivity,101(5),414-420；M.,A.G.,&Grahek,(2009).Talanta,80(1),352-362.；Jones,A.D.,Miller,B.G.,Walker,S.,Anderson,J.,Colvin,A.P.,Hutchison,P.A.,&Soutar,C.A.(2007).Environmental research,104(2),216-223.)。为了保护人类健康和环境，有必要发展日常和有效监测铀的技术。

铀酰离子作为铀在水溶液中存在的最稳定的化学形式，其具有很好的生物相容性，给人类健康带来了极大的威胁。目前，实验室中最常用的铀酰离子探测方法主要包括：原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，这些方法具有高选择性、高灵敏度的特点。然而，现有方法存在分析成本高、设备造价昂贵、仪器笨重等缺陷，根本不适合现场实时探测，仍然很有必要发展一种简单、便携、可实时在线探测铀的方法。

因此，目前迫切需要一种简单、便携的铀酰离子检测装置，以实现其的实时、快速在线检测。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对目前主要采用原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等方法检测铀酰离子，存在分析成本高、设备造价昂贵、仪器笨重等缺陷，根本不适合现场实时探测的问题，提供一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用。一方面，本发明提供一种用于铀酰离子检测的传感器及其制备方法；另一方面，本发明提供一种检测铀酰离子的方法。本发明首次提出了利用DNA酶和目标催化发卡组装放大策略来探测铀酰离子的方法，其基于UO₂ ²⁺-特异性DNA酶和目标催化发卡组装技术来实现UO₂ ²⁺的超灵敏探测。本发明通过结合目标催化发卡组装的放大技术，UO₂ ²⁺选择性得到了极大改善。经过优化后，该传感器探测限值为2pM，远远低于其他方法的探测限值。本发明提供了一种简单、方便、在线和实时探测铀的超灵敏的传感器及检测铀酰离子的方法，对于铀酰离子的检测，具有重要的意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于铀酰离子检测的传感器，包括金电极、设置在金电极上的敏感层，所述敏感层包括通过Au-S键修饰到金电极表面的H1。

所述H1由巯基修饰的碱基序列组成。

所述H1的序列为HS-(CH₂)₆ATAGTGAGTTGTAGAAGTCACTATCCATTGACTTCTACAACT。

前述用于铀酰离子检测的传感器的制备方法，包括如下步骤：将H1加热形成H1发卡结构，同时将干净的金电极放入硫酸溶液中进行电化学清洗，并用氮气干燥，再将干燥的金电极插入到H1发卡结构溶液中静置2～6小时，得第一金电极，然后用6-巯基正己醇浸泡第一金电极1～5h，去除第一金电极上特异性吸附的DNA，即得传感器。

将H1加热至80-95℃保温3-9min后，冷却至室温，形成H1发卡结构。

将金电极用氧化铝粉末抛光后，依次采用超纯水、无水乙醇超声洗涤，得到干净的金电极，再将干净的金电极放入硫酸溶液中进行电化学清洗。

将金电极用氧化铝粉末抛光后，依次采用超纯水、无水乙醇超声洗涤3-5min，氧化铝粉末的粒径为0.04-0.1μm。

将干净的金电极放入0.3～0.8mol/L的硫酸溶液中进行电化学清洗，并用氮气干燥，再将干燥的金电极插入到50～150μM的H1溶液中中静置2～6小时，得第一金电极。

前述用于铀酰离子检测的传感器的应用，将该传感器用于铀酰离子的检测。

前述用于铀酰离子检测的传感器的应用，包括如下步骤：

(1)将H2加热至80-95℃保温3-9min后，冷却至室温，形成H2发卡结构，备用；

(2)将传感器浸泡于PBS缓冲液中，备用；

(3)向反应器中加入巯基修饰的底物DNA、酶链DNA、第一缓冲液，混合均匀，得第一溶液，备用；

(4)将待测样品加热至70-100℃后，在1～4h内冷却至室温，将冷却后的待测样品加入第一溶液中，室温反应6～18min，得第二溶液；

(5)将步骤2的传感器在35～40℃下浸泡于第二溶液20～40min，得第一传感器，然后用超纯水洗涤第一传感器表面，再向第一传感器上滴加第一反应液，使第一传感器与第一反应液在35～40℃下1.5-3.5h，得到第二传感器；

(6)将第二传感器浸泡于第二缓冲液中5-20min，然后将浸泡后的第二传感器用超纯水清洗，去除第二传感器上非特异性吸附的亚甲基蓝；

(7)将步骤6处理后的第二传感器进行方波伏安法测试，测定电流强度；

(8)根据步骤7测定的结果，得出铀酰离子浓度；

所述第一缓冲液为含NaCl的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，2-(N-吗啡啉)乙磺酸的摩尔浓度为5-15mmol/L，NaCl的摩尔浓度为0.2-0.5mol/L，该第一缓冲液的pH值为4-6；

所述步骤5中，第一反应液为含H2发卡结构和NaCl的PBS反应液，其中PBS的浓度为40～60mmol/L，其中NaCl的浓度为0.3～0.7mol/L，第一反应液的pH值为6.8-7.8；

所述步骤6中，第二缓冲溶液为含亚甲基蓝的PBS缓冲液，PBS的摩尔浓度为8-12mmol/L，亚甲基蓝的摩尔浓度为15-25μmol/L；

所述H2的序列为AGAAGTCAATGGATAGTGACTTCTACAACTCACTATCCATTG；

所述巯基修饰的底物DNA的序列为ACTTCTACAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG；

所述酶链DNA的序列为CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT。

所述步骤3中，向反应器中加入巯基修饰的底物DNA、与巯基修饰的底物DNA等摩尔量的酶链DNA、第一缓冲液，混合均匀，得第一溶液。

所述第一缓冲液为含NaCl的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，2-(N-吗啡啉)乙磺酸的摩尔浓度为10mmol/L，NaCl的摩尔浓度为0.3mol/L，该第一缓冲液的pH值为5.5。

所述步骤5中，第一反应液为含H2发卡结构和NaCl的PBS反应液，其中PBS的浓度为50mmol/L，其中NaCl的浓度为0.5mol/L，第一反应液的pH值为6.8-7.8。

所述步骤7中，将步骤6处理后的第二传感器进行方波伏安法测试，扫描电压范围为-0.40到0.00V，扫描振幅为50mV，得到电流强度。

所述步骤8中，制作标准曲线，将步骤7测定的结果与标准曲线进行对比，得出铀酰离子浓度。

针对前述问题，本发明提供一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用。本发明以铀酰特异性DNA酶为基础进行设计，其包括金电极、设置在金电极上的敏感层，敏感层包括通过Au-S键修饰到金电极表面的H1，H1由巯基修饰的碱基序列组成，其序列为HS-(CH2)6ATAGTGAGTTGTAGAAGTCACTATCCATTGACTTCTACAACT。

同时，本发明提供基于前述传感器在检测铀酰离子的应用，具体为采用该传感器检测铀酰离子的方法。本发明利用铀酰离子特异性DNA酶和两个无标记分子发卡探测铀酰离子，其结合了DNA酶的高特异性和目标催化发卡组装的等温和无酶优点，能够实现铀酰离子的超灵敏探测。其中，铀酰离子特异性DNA酶由酶链DNA(记为E-DNA)和底物DNA(记为S-DNA)组成；H1和H2在使用前先分别加热至80-95℃反应3-9min，逐渐冷却至室温，形成发卡结构。该传感器中，H1由巯基修饰的碱基序列组成，其通过Au-S键修饰到金电极表面。当有铀酰离子存在时，铀酰离子会催化DNA酶剪切S-DNA，释放S-DNA碎片链，释放的S-DNA碎片和固定在金电极表面的发卡H1杂交，打开H1，杂交部分生成双链，打开的H1诱导发卡H2杂交。S-DNA碎片自发地从发卡H1分离，继续触发下一个杂交循环过程。再将MB嵌入双链DNA(dsDNA)的小沟里，产生电化学信号。UO₂ ²⁺浓度不同，DNA酶剪切释放的S-DNA碎片量不同，一定时间内通过目标催化发卡组装生成的dsDNA的量也不相同，导致产生的MB的信号不同。基于此，本发明通过监测MB电化学信号的变化可以间接探测UO₂ ²⁺。由于信号放大和高特异性DNA酶的集成，本发明的传感器具有超高的铀酰离子探测灵敏度。可见，本发明具有分析成本低的优点，同时解决了设备造价昂贵、仪器笨重等缺陷，能够满足现场实时探测的需要，具有较好的应用前景。

综上所述，本发明提出了一种新颖的基于UO₂ ²⁺-特异性DNA酶和目标催化发卡组装技术来实现超灵敏探测UO₂ ²⁺的传感方法，通过结合目标催化发卡组装的放大技术，UO₂ ²⁺选择性得到了极大改善。经过优化后，本发明的传感器探测限值为2pM，远远低于其他方法的探测限值。

本发明首次提出了利用DNA酶和目标催化发卡组装放大策略来探测铀酰离子的方法，同时通过选用相应的特异性酶，这种方法有望用于探测其他金属离子和小分子。此外，基于电化学方法便宜、容易使用和易于小型化的独特优点，本发明有望发展为一种可用来评估环境污染和监测环境修复的在线和实时探测铀酰离子的便携式商业传感器。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为铀酰离子传感器制作、检测过程示意图。

图2为不同浓度的铀酰离子溶液的SWV图。

图3为标准曲线图。

图4为干扰离子测试结果图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

(一)原料

本发明的实施例中，所有化学试剂(硝酸铀酰、寡核苷酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和PBS缓冲液、亚甲基蓝(MB)和6-巯基正己醇(MCH))均为分析纯。将硝酸铀酰配制成10mM(即10mmol/L)储备液，使用前稀释至指定浓度。实验用水为超纯水(18.2MΩ·cm)。寡核苷酸购自生工生物工程上海(股份)有限公司，其序列如表1所示。

表1E-DNA、S-DNA和H₁、H₂分子发卡序列

(二)仪器

电化学工作站为CHI660D，使用经典的三电极系统进行电化学测量，金电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极。方波伏安法(SWV)测量在10mM PBS缓冲液(pH 7.2)中进行。

实施例1

(1)制备传感器

H1和H2在使用前先分别加热至90℃反应5min，逐渐冷却至室温，形成H₁发卡结构和H₂发卡结构。将金电极(直径d＝3mm)用粒径为0.04-0.1μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光后，依次用超纯水、无水乙醇超声洗涤3min，接着在0.5mol/L H₂SO₄溶液中进行电化学清洗，然后用氮气干燥。然后，将干燥的金电极插入到100μM H1发卡结构溶液中静置3小时，得第一金电极，然后用1mM(即1mmol/L)MCH(6-巯基正己醇)浸泡第一金电极2h，去除第一金电极上特异性吸附的DNA，即得传感器。将传感器(即修饰好的电极)浸泡于PBS缓冲液中，备用。

(2)杂交反应

DNA酶剪切和目标催化发卡组装反应，如图1所示。

在1.5mL离心管中加入40μL 100μM巯基修饰的底物DNA和等摩尔量的酶链DNA，然后加入700μL含300mM NaCl的10mM MES缓冲液(pH 5.5)，旋涡振荡，混合均匀，得第一溶液。待测样品被加热到80-100℃3-8分钟，随后1-3小时冷却到室温。将冷却后的待测样品加入第一溶液中，室温反应10min，得第二溶液。

将前述步骤制备的传感器浸泡在35～40℃的第二溶液中20-40min，与释放的DNA碎片进行杂交反应，得第一传感器。然后用超纯水洗涤第一传感器表面，再向第一传感器上滴加10μL H2反应液(50mM PBS含0.5M NaCl，pH 7.2)，在35～40℃条件下反应2h，得到第二传感器。铀酰离子浓度不同，释放的S-DNA碎片含量不同，一定时间内触发目标催化发卡组装反应生成的dsDNA量不同。

(3)MB嵌入和电化学检测

MB是一种有机染料，由于其与ssDNA和dsDNA的不同交互作用，常被用作电子传递介质。MB的电化学信号大小反应了杂交反应的程度。将第二传感器浸泡于20μM MB的10mMPBS缓冲液中反应10min，MB则会嵌入到dsDNA的碱基对中。再将嵌入MB后的第二传感器用超纯水清洗10s，去除非特异性吸附的MB，随后将电极转入到10mM PBS缓冲液中(pH 7.2)进行SWV测试，扫描电压范围从-0.40到0.00V，扫描振幅为50mV。

(4)UO₂ ²⁺电化学生物传感器的性能分析

在前述最优化的条件下，用SWV测量来评估传感器的性能。图2为在10mM PBS中，UO₂ ²⁺浓度分别为(曲线a)10pM、(曲线b)50pM、(曲线c)100pM、(曲线d)250pM、(曲线e)500pM、(曲线f)1000pM时，采用SWV(即方波伏安法)测定的信号强度。图2中，从上至下依次为曲线a至f。标准曲线绘制时，可也采用浓度为(a)8-12pM、(b)38-52pM、(c)90-100pM、(d)230-250pM、(e)380-500pM、(f)1000pM的已知浓度的铀酰离子溶液进行测定。

图3为图2中所测得的电流与铀酰离子浓度的标准曲线图，峰电流强度随着UO₂ ²⁺浓度的增加而增加，且在10pM～1nM范围内展现出很好的线性关系。线性函数表达式为I＝-0.459-0.0036C(I为电流强度(μA)，C为UO₂ ²⁺浓度)，线性相关系数为R²＝0.993。探测限值的计算值为2pM(3倍空白信号)，远远低于美国环保署(USEPA)规定的环境中UO₂ ²⁺存在的最大水平(130nM)。因此，本发明提出的传感器完全满足监测UO₂ ²⁺的需要。

(5)传感器的选择性分析

对于传感器来说，特异性是一个十分重要的指标，因此，本申请评估了Mg²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Sn²⁺对传感器传感性能的影响，图4为干扰离子测试结果图。如图4所示，约为UO₂ ²⁺浓度100倍的干扰离子的SWV信号强度大大低于UO₂ ²⁺。实验结果表明：本申请的传感器具有很好的UO₂ ²⁺选择性，可以从复杂的金属离子样品中区分UO₂ ²⁺。

(6)传感器的重复性

为了进一步估算本申请提出的传感器的重复性，计算了六组1nM UO₂ ²⁺的平行试验的相对标准偏差(RSD)。批间和批内的相对标准偏差分别为6.2％和7.3％，结果表明：本发明的UO₂ ²⁺传感器满足了重复性要求。

(7)河水中的UO₂ ²⁺分析

为了验证本发明的生物传感器在河水中的实用性，将河水过滤后作为溶液载体，并向溶液中加入已知一定量的UO₂ ²⁺进行测量。本申请测量了三个含0.02nM，0.4nM和1nMUO₂ ²⁺的样品，测量结果如表2所示。

表2本发明探测河水中UO₂ ²⁺的测定结果

样品	加入量/nM	测得量/nM	Recovery/％	RSD/％
					1	0.02	0.017	85.0	6.56
2	0.400	0.399	99.8	5.41
					3	1.000	0.900	90.0	4.72

测量结果表明：本发明的回收率范围为85.0％-99.8％，RSD为4.72％-6.56％。结果表明，本发明有望用于实际样品分析。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

序列表

<110> 中国工程物理研究院材料研究所

<120> 一种用于铀酰离子检测的传感器、其制备方法及应用

<140> 201510642797.X

<141> 2015-09-30

<160> 4

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：H1的序列

<400> 1

ATAGTGAGTT GTAGAAGTCA CTATCCATTG ACTTCTACAA CT 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：H2的序列

<400> 2

AGAAGTCAAT GGATAGTGAC TTCTACAACT CACTATCCAT TG 42

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：巯基修饰的底物DNA序列

<400> 3

ACTTCTACAA CTCACTATrAG GAAGAGATGG ACGTG 35

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：酶链DNA序列

<400> 4

CACGTCCATC TCTGCAGTCG GGTAGTTAAA CCGACCTTCA GACATAGTGA GT 52

Claims

1.一种用于铀酰离子检测的传感器，其特征在于，包括金电极、设置在金电极上的敏感层，所述敏感层包括通过Au-S键修饰到金电极表面的H1，将H1加热形成H1发卡结构；

所述H1的序列为HS-(CH₂)₆ATAGTGAGTTGTAGAAGTCACTATCCATTGACTTCTACAACT。

2.用于权利要求1所述传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将H1加热形成H1发卡结构，同时将干净的金电极放入硫酸溶液中进行电化学清洗，并用氮气干燥，再将干燥的金电极插入到H1发卡结构溶液中静置2~6小时，得第一金电极，然后用6-巯基正己醇浸泡第一金电极1~5h，即得传感器。

3.根据权利要求2所述传感器的制备方法，其特征在于，将金电极用氧化铝粉末抛光后，依次采用超纯水、无水乙醇超声洗涤，得到干净的金电极，再将干净的金电极放入硫酸溶液中进行电化学清洗。

4.根据权利要求2或3所述传感器的制备方法，其特征在于，将干净的金电极放入0.3~0.8mol/L的硫酸溶液中进行电化学清洗，并用氮气干燥，再将干燥的金电极插入到50~150μM 的H1溶液中中静置2~6小时，得第一金电极。

5.根据权利要求1所述用于铀酰离子检测的传感器的应用，其特征在于，将该传感器用于铀酰离子的检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将H2加热至80-95℃保温3-9min后，冷却至室温，形成H2发卡结构，备用；

（2）将传感器浸泡于PBS缓冲液中，备用；

（3）向反应器中加入巯基修饰的底物DNA、酶链DNA、第一缓冲液，混合均匀，得第一溶液，备用；

（4）将待测样品加热至70-100℃后，在1~4h内冷却至室温，将冷却后的待测样品加入第一溶液中，室温反应6~18min，得第二溶液；

（5）将步骤（2）的传感器在35~40℃下浸泡于第二溶液20~40min，得第一传感器，然后用超纯水洗涤第一传感器表面，再向第一传感器上滴加第一反应液，使第一传感器与第一反应液在35~40℃下1.5-3.5h，得到第二传感器；

（6）将第二传感器浸泡于第二缓冲溶液中5-20min，然后将浸泡后的第二传感器用超纯水清洗，去除第二传感器上非特异性吸附的亚甲基蓝；

（7）将步骤（6）处理后的第二传感器进行方波伏安法测试，测定电流强度；

（8）根据步骤（7）测定的结果，得出铀酰离子浓度；

所述第一缓冲液为含NaCl的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，2-(N-吗啡啉)乙磺酸的摩尔浓度为5-15 mmol/L，NaCl的摩尔浓度为0.2-0.5mol/L；

所述步骤（5）中，第一反应液为含H2发卡结构和NaCl的PBS反应液，其中PBS的浓度为40~60mmol/L，其中NaCl的浓度为0.3~0.7mol/L，第一反应液的pH值为6.8-7.8；

所述步骤（6）中，第二缓冲溶液为含亚甲基蓝的PBS缓冲液，PBS的摩尔浓度为8-12mmol/L，亚甲基蓝的摩尔浓度为15-25μmol/L；

所述H2的序列为AGAAGTCAATGGATAGTGACTTCTACAACTCACTATCCATTG；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，向反应器中加入巯基修饰的底物DNA、与巯基修饰的底物DNA等摩尔量的酶链DNA、第一缓冲液，混合均匀，得第一溶液。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述步骤（5）中，第一反应液为含H2发卡结构和NaCl的PBS反应液，其中PBS的浓度为50mmol/L，其中NaCl的浓度为0.5mol/L，第一反应液的pH值为6.8-7.2。

9.根据权利要求6~7任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤（8）中，制作标准曲线，将步骤（7）测定的结果与标准曲线进行对比，得出铀酰离子浓度。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤（8）中，制作标准曲线，将步骤（7）测定的结果与标准曲线进行对比，得出铀酰离子浓度。