CN109946279B - 一种铀酰离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种铀酰离子的检测方法。其基于熵驱动的扩增和DNA酶循环剪切扩增方法,即铀酰离子特异性DNA酶的剪切产生DNA片段以启动熵驱动的扩增,从熵驱动的扩增释放的两个DNA序列是部分互补的,它们可以形成Mg2+特异性DNA酶的完整酶链,形成的酶链可以在金纳米粒子上循环剪切羧基荧光素标记的探针,导致羧基荧光素从金纳米粒子中离开并恢复荧光信号,该荧光信号与铀酰离子的浓度呈线性关系,通过荧光信号即可推算出铀酰离子浓度。该方法对铀酰离子具有良好选择性,最低检测限可低至13pM,且已成功用于实际水样中的铀酰离子检测。
Description
技术领域
本发明涉及铀酰离子的检测领域,特别是熵催化和循环剪切放大的铀酰离子检测技术。
背景技术
铀被用作核电站和核武器的能源。它也被用于工业和医疗领域。由于在这些地区广泛使用铀,暴露于铀的机会显着增加。铀的开采和加工会造成大面积的铀污染。在土壤,水和人体中发现了痕量的铀污染。由于放射性高,半衰期长,铀污染可能对人类健康造成长期和严重的不利影响。美国环境保护署(US EPA)已确定铀的最大污染物水平(MCL)为130nM。因此,开发一种对铀的测定具有高灵敏度和选择性的方法对公共安全和环境保护具有重要意义。
铀酰离子是水中铀的最稳定状态。到目前为止,一些仪器分析方法,如电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和原子发射光谱法是标准实验室中最常用的铀定量分析技术。然而,这些方法需要昂贵的设备和熟练的操作员。此外,样品制备耗时且繁琐。最近,DNA酶被用作金属离子检测的生物传感器探针,包括Pb2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Cu2+和UO2 2+。DNA酶由酶链(E-DNA)和底物链(S-DNA)组成,对靶金属离子具有高结合亲和力和特异性。但基于DNA酶的传感器的灵敏度与那些基于商业仪器的方法仍有差距。为了提高灵敏度,一些策略已被用于信号放大,包括基于酶和无酶的策略。无酶策略可以在等温和无酶条件下显着提高的灵敏度。然而,这些无酶扩增策略可能导致循环泄漏,导致高背景和假阳性。熵驱动的扩增由熵增加而不是来自碱基对形成的自由能提供动力。整个过程熵驱动扩增的碱基对数量不变。因此,熵驱动放大可以避免那些循环泄漏的缺点,并提供更可靠的结果。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种熵驱动的扩增和DNA酶循环剪切扩增方法,用于铀酰离子的检测。
本发明的检测原理为:铀酰离子特异性DNA酶的剪切产生DNA片段以启动熵驱动的扩增,从熵驱动的扩增释放的两个DNA序列是部分互补的,它们可以形成Mg2+特异性DNA酶的完整酶链,形成的酶链可以在金纳米粒子上循环剪切羧基荧光素标记的探针,导致羧基荧光素从金纳米粒子中离开并恢复荧光信号,该荧光信号与铀酰离子的浓度呈线性关系,通过荧光信号即可推算出铀酰离子浓度。
具体而言,提前形成铀酰离子特异性DNA酶。铀酰离子特异性DNA酶的底物链(CTTCTACAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG)在铀酰离子存在下裂解,从DNA酶释放DNA片段。释放的DNA片段可以与序列Q(ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCTCCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT)的DNA复合物的前端结合(表示为结构域4*),从而通过链置换反应取代序列R(TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT).然后加入燃料链(ATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGGAGAACTTCTACAACT)并与序列Q的结构域2*(ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCT CCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT)结合,导致序列S(TTTTGTCAGCGATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGG)和DNA片段从序列Q(ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCT CCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT)的置换反应。释放的DNA片段可以催化下一轮熵驱动的扩增。释放的序列S(TTTTGTCAGCGATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGG)和序列R(TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT)是部分互补的。它们可以形成Mg2+特异性DNA酶的完整酶链DNA。将羧基荧光素标记的UO2 2+特异性DNA酶的底物链固定在金纳米粒子上。金纳米粒子显着抑制羧基荧光素的荧光信号。利用Mg2+辅助,形成的Mg2+特异性DNA酶的酶链可以循环剪切金纳米粒子上的羧基荧光素标记的底物链。羧基荧光素标记的底物链被剪切然后离开金纳米粒子的表面,导致荧光信号的显著增加。两种放大方法相辅相成,显著提高该策略的灵敏度。
本发明技术方案详述如下:
一种铀酰离子的检测方法,包括如下步骤:
(1)金纳米粒子的修饰,合成的金纳米粒子与羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链一起孵育;
(2)将铀酰离子特异性DNA酶底物链和铀酰离子特异性DNA酶的酶链加热并在吗啉乙磺酸缓冲液(MES)中缓慢冷却,然后加入待测铀酰离子溶液用于DNA酶裂解反应,将反应后的溶液加入到Tris-HCl缓冲溶液,并加入DNA复合物和燃料链,反应后的溶液加入含有MgCl2的Tris-HCl溶液中,最后加入步骤(1)的修饰后的金纳米粒子;其中,DNA复合物是通过将序列S,R和Q在Tris-HCl缓冲溶液中加热到90摄氏度,逐渐冷却至室温形成DNA复合物结构。
(3)通过石英比色皿从500nm至600nm测量荧光信号;
(4)计算铀酰离子浓度,用标准曲线法,通过荧光强度计算铀酰离子浓度。
优选的,羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链为:HS-AAAAAAAAATTCTCTCTrAGGACAAAAAAA-FAM,铀酰离子特异性DNA酶的底物链为:CTTCTACAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG,序列S:TTTTGTCAGCGATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGG,序列Q:ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCT CCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT;序列R:TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT;燃料链为:ATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGGAGAACTTCTACAACT。
优选的,步骤(1)具体为:使用柠檬酸盐还原HAuCl4来合成金纳米粒子,将1μM羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链与10nM金纳米粒子一起孵育12小时,然后,加入0.05%吐温20,然后以12,000rpm离心15分钟分离游离的羧基荧光素标记的Mg2+特异性DNA酶的底物链,最后,将修饰的金纳米粒子分散在10mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中。
优选的,步骤(2)具体为:将100nM铀酰离子特异性DNA酶底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶的酶链加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM吗啉乙磺酸缓冲液(MES)(pH=5.5)中缓慢冷却,然后加入待测铀酰离子溶液用于室温下20分钟的DNA酶裂解反应,将反应后的溶液加入含有5mM MgCl2和0.1M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.5)中,再加入50nM DNA复合物和50nM燃料链反应60分钟,反应后的溶液加入含有10mM MgCl2和0.1MNaCl的50mM Tris-HCl溶液(pH=7.5)中,最后加入步骤(1)的修饰后的金纳米粒子再反应1小时。
一种检测水样中铀酰离子的方法,包括以下步骤:
(1)将水样离心并用0.22μm膜过滤,然后在测试前将pH调节至5.5;
(2)采用前述方法之一对步骤(1)所得水样进行检测。
本发明创造性地将熵驱动的扩增和DNA酶循环剪切扩增有机结合,承前启后地对荧光信号进行放大。使得荧光强度和浓度之间存在良好的线性关系,范围为30pM至5nM。检测限低至13pM。该方法在环境水样中具有实际应用前景。
附图说明
图1为本发明检测过程示意图。
图2分别为:(A)金纳米粒子的TEM图像。(B)用羧基荧光素标记的底物链修饰的金纳米粒子和金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。(C)不同状态样品的荧光强度。
图3为空白溶液和各金属离子所产生的荧光信号对比图。
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
提供一种熵驱动的扩增和DNA酶循环剪切扩增相结合用于检测铀酰离子的方法,本发明检测过程参见图1。具体步骤为:(1)使用柠檬酸盐还原HAuCl4来合成金纳米粒子,将1μM羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链与10nM金纳米粒子一起孵育12小时,然后,加入0.05%吐温20,然后以12,000rpm离心15分钟分离游离的羧基荧光素标记的Mg2+特异性DNA酶的底物链,最后,将修饰的金纳米粒子分散在10mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中。
用TEM表征合成的金纳米粒子(图2A)。金纳米粒子的平均直径约为13nm。还测量了用羧基荧光素标记的底物链修饰的金纳米粒子和金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。
如图2B所示,与裸金纳米粒子相比,金纳米粒子修饰的羧基荧光素标记的底物链在260nm附近具有吸收峰,表示FAM标记的底物链已经在金纳米粒子表面成功修饰。用羧基荧光素标记的底物链修饰的金纳米粒子的稳定性通过520nm处的吸光度监测,并且520nm处的吸光度在pH=7.5的缓冲溶液中稳定2小时。
(2)测量步骤(1)的修饰金纳米粒子上Mg2+特异性DNA酶的底物链的覆盖度;通过从金纳米粒子完全置换底物链来测量金纳米粒子上Mg2+特异性DNA酶的底物链的覆盖度。简言之,将底物链修饰的金纳米粒子与巯基己醇(20mM)在室温下孵育24小时。使用离心以12,000rpm从金纳米粒子上去除Mg2+特异性DNA酶的置换的底物链15分钟。通过具有已知浓度的Mg2+特异性DNA酶的底物链的标准线性校准曲线,由Mg2+特异性DNA酶的底物链的荧光强度计算上清液中Mg2+特异性DNA酶的底物链浓度。
(3)将100nM铀酰离子特异性DNA酶底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶的酶链加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM吗啉乙磺酸缓冲液(MES)(pH=5.5)中缓慢冷却,然后加入待测铀酰离子溶液用于室温下20分钟的DNA酶裂解反应,将反应后的溶液加入含有5mMMgCl2和0.1M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.5)中,再加入50nM DNA复合物和50nM燃料链反应60分钟,反应后的溶液加入含有10mM MgCl2和0.1M NaCl的50mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)中,最后加入步骤(1)的修饰后的金纳米粒子再反应1小时。
(4)通过石英比色皿从500nm至600nm测量荧光信号;
(5)计算铀酰离子浓度:用标准曲线法,通过荧光强度计算铀酰离子浓度。
其中,羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链为:HS-AAAAAAAAATTCTCTCTrAGGACAAAAAAA-FAM,铀酰离子特异性DNA酶的底物链为:CTTCTACAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG,序列S:TTTTGTCAGCGATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGG,序列Q:ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCT CCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT;序列R:TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT;燃料链为:ATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGGAGAACTTCTACAACT。
对比例1
为体现上述实施例的技术效果,特提供以下对比例:对比例1:空白样品,即待测铀酰离子溶液中铀酰离子浓度为零,其余测试过程和上述实施例相同;对比例2:舍去铀酰离子特异性DNA酶,其余测试过程和上述实施例相同;对比例3:燃料链为实施例1中燃料链浓度的一半,其余测试过程和上述实施例相同;对比例4:修饰金纳米粒子上Mg2+特异性DNA酶的底物链的覆盖度为实施例1中浓度的一半,其余测试过程和上述实施例相同;对比例5:测试过程和实施例1相同。
结果显示在图2C中,1号为对比例1的荧光强度信号,空白样品(不含铀酰离子)具有非常低的荧光强度(样品1)。这是因为在不存在铀酰离子的情况下,铀酰离子特异性DNA酶的底物链不能被剪切。2号为对比例2的荧光强度信号,在没有铀酰离子特异性DNA酶,获得与对比例1相似的荧光强度。由于没有DNA酶的存在,不能启动熵驱动的扩增反应。3号为对比例3的荧光强度信号,由于不完全的熵驱动的扩增反应,仅具有一半浓度的燃料链时,显示出相对弱的荧光强度。4号为对比例4的荧光强度信号,由于修饰金纳米粒子上Mg2+特异性DNA酶的底物链的覆盖度为实施例1中浓度的一半,只提供的少量荧光团,获得的信号与样品3的信号类似。5号为实施例1的荧光强度信号,熵驱动的扩增和DNA酶循环剪切扩增方法极大地增强了荧光信号。
对比例2
为了评价该方法的特异性,评价了其他金属离子对荧光强度的影响,包括Cu2+,Fe2 +,Ca2+,Co2+,Pb2+,Mg2+,Sn2+和Zn2+。评价方法为将实施例1中铀酰离子分别替换为Cu2+,Fe2+,Ca2+,Co2+,Pb2+,Mg2+,Sn2+和Zn2+。检测结果如图3所示,只有铀酰离子可以产生显著的荧光强度。即使浓度高达铀酰离子的10倍,其他金属离子的干扰和空白信号相当,可忽略不计。这些结果表明,在存在其他金属离子的情况下,所提出的策略可以容易地区分铀酰离子。这可归因于铀酰离子特异性DNA酶对铀酰离子的特异性识别能力。
实施例2
为了进一步验证实际应用的可行性,该策略用于检测水样(自来水,湖水和涪江)中的铀酰离子。首先将水样离心并用0.22μm膜过滤。然后在测试前将pH调节至5.5。通过检测水样以及掺入不同浓度的铀酰离子的水样获得回收率。结果如表1所示,采用该方法可直接检测水样中的铀酰离子,回收率为95.0-109.4%,相对标准偏差(RSD)为6.2-9.4%。该结果对于实际样品检测的要求是令人满意的。
表1测定不同样品的铀酰离子含量
可见,本发明的测试过程中每个步骤相互关联形成一个整体,缺一不可。由此而产生的熵驱动的扩增联合DNA酶循环剪切扩增的铀酰离子检测方法,对铀酰离子具有良好选择性,且已成功用于实际水样中的实际应用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种铀酰离子的检测方法,包括如下步骤:
(1)金纳米粒子的修饰,合成的金纳米粒子与羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链一起孵育;
(2)将铀酰离子特异性底物链和铀酰离子特异性DNA酶的酶链加热并在吗啉乙磺酸缓冲液(MES)中缓慢冷却,然后加入待测铀酰离子溶液用于DNA酶裂解反应,将反应后的溶液加入到Tris-HCl缓冲溶液,并加入DNA复合物和燃料链,反应后的溶液加入含有MgCl2的Tris-HCl溶液中,最后加入步骤(1)的修饰后的金纳米粒子;其中,DNA复合物是通过将序列S,R和Q在Tris-HCl缓冲溶液中加热到90摄氏度,逐渐冷却至室温形成DNA复合物结构;
(3)通过石英比色皿从500nm至600nm测量荧光信号;
(4)计算铀酰离子浓度,用标准曲线法,通过荧光强度计算铀酰离子浓度,
其特征在于步骤(1)中羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链为:HS-AAAAAAAAATTCTCTCTrAGGACAAAAAAA-FAM,步骤(2)中铀酰离子特异性DNA酶的底物链为:CTTCTACAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG,序列S:TTTTGTCAGCGATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGG,序列Q:ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCTCCTACGTCTATTCGGCTTCCGGAT;序列R:TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT;燃料链为:ATCCGGAAGCCGAATAGACGTAGGAGAACTTCTACAACT。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)具体为:使用柠檬酸盐还原HAuCl4来合成金纳米粒子,将1μM羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链与10nM金纳米粒子一起孵育12小时,然后,加入0.05%吐温20,然后以12000rpm离心15分钟分离游离的羧基荧光素标记的具有巯基基团的Mg2+特异性DNA酶的底物链,最后,将修饰的金纳米粒子分散在10mM的pH=7.5的Tris-HCl溶液中。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于步骤(2)具体为:将100nM铀酰离子特异性DNA酶底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶的酶链加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM的pH=5.5的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中缓慢冷却,然后加入待测铀酰离子溶液用于室温下20分钟的DNA酶裂解反应,将反应后的溶液加入含有5mM MgCl2和0.1M NaCl的25mM的pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中,再加入50nM DNA复合物和50nM燃料链反应60分钟,反应后的溶液加入含有10mM MgCl2和0.1M NaCl的50mM的pH=7.5的Tris-HCl溶液中,最后加入步骤(1)的修饰后的金纳米粒子再反应1小时。
4.一种检测水样中铀酰离子的方法,包括以下步骤:
(1)将水样离心并用0.22μm膜过滤,然后在测试前将pH调节至5.5;
(2)采用如权利要求1-3之一的方法对步骤(1)所得水样进行检测。
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